CN1155548A - [b9谷氨酸,b10门冬氨酸]人胰岛素 - Google Patents
[b9谷氨酸,b10门冬氨酸]人胰岛素 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1155548A CN1155548A CN 96116230 CN96116230A CN1155548A CN 1155548 A CN1155548 A CN 1155548A CN 96116230 CN96116230 CN 96116230 CN 96116230 A CN96116230 A CN 96116230A CN 1155548 A CN1155548 A CN 1155548A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- insulin
- b10asp
- b9glu
- beta
- pip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明为一种利用蛋白质工程方法获得的人胰岛素——[B9Glu,B10Asp]人胰岛素,其特征在于B链第9位与第10位均为酸性氨基酸,[B9Glu,B10Asp]人胰岛素的受体结合能力为猪胰岛素的34.4%,体内生物活力则与天然胰岛素基本相同。本发明很有希望作为单体速效胰岛素应用于临床。
Description
作为治疗糖尿病的特效药,胰岛素应用于临床已有70多年,是临床上用量最大的蛋白质类药物。胰岛素的生理功能在於保持人正常的血糖水平。通常,饭后30-60分钟内血胰岛素达到高峰,120-180分钟内恢复到基础水平,与进餐后的血糖高峰协调一致。目前临床上使用的含锌胰岛素制剂主要以六体等多聚体形式存在,而胰岛素是以单体形式表现其生理功能。因此,注射到皮下后需逐渐解离成单体,120分钟血中才出现高峰,并且此峰值一直持续到180-240分钟,造成病人一段时间内因血中胰岛素浓度过低而出现高血糖症状,随后又因血胰岛素浓度过高而表现为低血糖(Brange J,et al.,Diabetes Care,1990,13:923)。为了改善这种状况,改进胰岛素性能,以得到能迅速降低血糖水平的单体胰岛素制剂已成为临床治疗的迫切需要(Brange J,et.al.,Nature,1988,333:679;Brange J,et al.,Cur Opin Struct Biol,1991,934)。
胰岛素单体聚合为二体时由B12Val、B24与B25Pne、B16与B26Tyr等组成的疏水面、B链羧端反平行β折叠以及其它一些氢键等参与作用。三个二体依靠极性和非极性作用,以及配位键形成六体。因此,改变参与形成二体的氨基酸残基以阻碍二体的形成,即有可能获得单体胰岛素类似物。
胰岛素的三维结构分析表明,B9Ser位于形成胰岛素二聚体的疏水面内(Baker EN,et al.,Phi Trans Roy Soc London B.,1988,319:369),基于此,Brange等(Nature,1988,333:679)将B9的Ser改为Asp,以排斥二聚体的形成,获得在药剂浓度下以单体形式存在的胰岛素,成为临床需要的速效胰岛素(Kang S,et al.,Lancet,1990,335:303),本实验室用Glu取代B9Ser,得到了类似的结果。但它们的生物活力明显降低,约为天然胰岛素的二分之一。此外,本实验室用Asp代替B10His获得高活力[B10Asp]人胰岛素。Burke等(Biochem Biophys Res Comm,1990,173:982)用化学合成方法比较了一系列与B10Asp组合的胰岛素类似物,发现B10His被Asp取代后,能普遍提高相应的胰岛素类似物的生物活力。
基于以上结果,本发明利用蛋白质工程方法制备了单体胰岛素类似物——[B9 X,B10 Y]人胰岛素,其中X、Y均为酸性氨基酸(具体实施为[B9G1u,B10Asp]人胰岛素;含猪胰岛素前体(porcine insulinprecursor,PIP)突变基因的表达型质粒的酵母菌株Saccharomycescerevisiae YS92/pLL[B9E,B10D]PIP(XV-700-6B)(CCTCC N0.M95042)已保藏在中国典型培养物保藏中心(中国·武汉·武汉大学校内)。[B9G1u,B10Asp]人胰岛素的受体结合能力为猪胰岛素的34.4%,体内生物活力则与天然胰岛素基本相同。因此,本发明可望作为单体速效胰岛素应用于临床。
本发明的技术特征在下述的实施例中作具体描述。
本发明的附图作以下说明:
图1.猪胰岛素前体(PIP)基因的突变。
图2.突变胰岛素B链改变区域的DNA序列图谱。
图3.表达产物在Sephadex G-50柱(2.6×160cm)上的层析图谱。
峰3为[B9Glu,B10Asp]PIP。
图4.聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH8.3)图谱。
图4(a).Sephadex G-50纯化之[B9Glu,B10Asp]PIP(A)及进一步经HPLC纯化的[B9Glu,B10Asp]PIP(B)。
图4(b).B30Thr(But)-OBut[B9Glu,B10Asp]人胰岛素(A);[B9Glu,B10Asp]人胰岛素(B);对照(C):上面条带为B30Thr(But)-OBut人胰岛素,靠下条带为猪胰岛素。
图5.胰岛素HPLC图谱。
图5(a).纯化的[B9Glu,B10Asp]PIP。
图5(b)[B9Glu,B10Asp]人胰岛素。
图6.转肽反应混合物的HPLC图谱。
图7.[B9Glu,B10Asp]人胰岛素(o-o)和猪胰岛素(x-x)与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合曲线。
实施例1.猪胰岛素前体(PIP)基因的突变
采用标准的克隆步骤(Sambrook J,et al.(eds.)Molecularcloning:A laboratory manual,1989,2nd ed.,Cold SpringHarbor Laboratory,New York),突变的原理与步骤如图1所示。大肠杆菌JM103在2YT培养基中生长,用氯化钙方法转化。质粒pVT102-U为Thierry Vernet(Biotechnology Research Institute,Montreal)所赠,Saccharomyces cerevisiae XV700-6B(Leu2,Ura3,Pep4)为Michael Smith(University of British Columbia,Vancouver)所赠,在YPD培养基中生长,用醋酸锂方法转化。转化的酵母细胞用选择培养基(2%琼脂,0.75%酵母含氮碱基,2%葡萄糖和各100μg/ml的氨基酸)选择。
突变引物为5′-CTTGTGCGGTGAAGACTTGGTTGAGGC-3′,其中B9Ser和B10His密码子TCC和CAC,在引物中分别用Glu和Asp的密码子GAA和GAC代替。含尿嘧啶单链DNA按Sambrook等(Sambrook J,et al.(eds.Molecular cloning:A laboratory manual,1989,2nd ed.,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)方法制备,参照李等(李亦平等,生物工程学报,1987,3:90)方法,用缺口双链DNA方法进行基因的定位突变。
按Sanger等(Sanger FG,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1977,47:5463)方法测定突变子的DNA顺序,结果表明突变已正确发生(图2)。并将它转化到酵母菌。含突变基因的表达型质粒的酵母菌珠Saccharomyces cerevisiae YS92/pLL[B9E,B10D]PIP(XV-700-6B)(CCTCC NO:M95042)已保藏在中国典型培养物保藏中心(中国·武汉·武汉大学校内)。
实施例2.[B9Glu,B10ASp]PIP在酵母中的分泌表达及产物的分离纯化
将转化的酵母细胞接种于5ml不含琼脂的YPD培养基中,30℃培养一天后转接到250mlYPD培养基,30℃继续培养两天表达[B9Glu,B10Asp]PIP,表达产物分泌于发酵液中,表达量用胰岛素放射免疫药盒(上海生物制品研究所产品)测定。离心去菌体,用三氯乙酸沉淀,沉淀用离心收集后溶解并通过SephadexG-50柱(2.6 x 100cm)分离,用1mole/L醋酸洗脱。收集[B9Glu,B10Asp]PIP峰,冻干,进一步用HPLC分离获得HPLC纯(图5a)和电泳纯(图4a)的[B9Glu,B10ASp]PIP。
实施例3.[B9Glu,B10ASp]PIP的胰蛋白酶转肽及[B9Glu,B10Asp]人胰岛素的鉴定
将纯化的[B9Glu,B10Asp]PIP溶解於1,4-丁二醇/二甲基亚砜/水(体积比70∶15∶15),[B9Glu,B10Asp]PIP的浓度为50mg/ml,加克分子过量100倍的Thr(But)-OBut)。将溶液pH调至6.5,加TPCK-胰蛋白酶(为[B9Glu,B10Asp]PIP重量的五分之一)。反应液在25℃保温6小时,加丙酮使蛋白质沉淀。用半制备柱RP-300在Beckman HPLC仪器上分离(图6),其中峰1为未反应的[B9Glu,B10Asp]PIP,峰2为去B30[B9Glu,B10Asp]人胰岛素,峰3是转肽产物B30Thr(But)OBut[B9Glu,B10Asp]人胰岛素(图4b)。收集峰3,用三氟乙酸去保护基即得[B9Glu,B10Asp]人胰岛素(图4b,图5b)(蛋白浓度按276nm紫外吸收测定)。
取适量纯化的[B9Glu,B10Asp]人胰岛素样品,用5.7N HCl于110℃水解24小时,蒸干水解液,用氨基酸自动分析仪测定氨基酸组成。其氨基酸组成与理论值相符(表1)。
实施例4.[B9Glu,B10Asp]人胰岛素的生物活力测定
纯化的[B9Glu,B10Asp]人胰岛素与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合能力按冯等(冯佑民等,生物化学与生物物理学报,1982,14:137)方法测定,结果如图7所示。以取代125I-胰岛素50%时,所需未标记样品的量计算,[B9Glu,B10Asp]人胰岛素为猪胰岛素的34.4%。
表1. [B9Glu,B10Asp]人胰岛素的氨基酸组成分析
氨基酸 [B9Glu,B10Asp]人胰岛素
Asp 3.896(4)*
Thr 2.881(3)
Ser 2.189(2)
Glu 8.168(8)
Gly 4.000(4)
Ala 0.971(1)
Val 4.088(4)
Ile 1.998(2)
Leu 6.173(6)
Tyr 4.133(4)
Phe 2.877(3)
Lys 0.962(1)
His 0.906(1)
Arg 0.915(1)
*括号中为理论残基数。
[B9Glu,B10Asp]人胰岛素的整体活力用半定量小白鼠惊厥法测定,其整体活力与猪胰岛素相同(表2)。表2.猪胰岛素和[B9Glu,B10Asp]人胰岛素的体内小白鼠惊厥反应活力
测定
样品 浓度(μg) 反应活力*
猪胰岛素 1.0 10/10
0.5 8/10
0.25 2/10[B9Glu,B10Asp]人胰岛素 1.0 10/10
0.5 7/10
0.25 2/10
*产生反应小鼠数目/给药小鼠数目
Claims (6)
1.[B9Glu,B10Asp]人胰岛素,其特征在于胰岛素的B链第9位与第10位氨基酸均为酸性氨基酸。
2.根据权利要求1所述的胰岛素的B链第9位与第10位氨基酸均为酸性氨基酸,其特征在于B链第9位是G1u,B链第10位是Asp。
3.根据权利要求1、2所述的胰岛素,其特征在于可用蛋白质工程的方法来制得。
4.根据权利要求1、2所述的胰岛素,其特征在于也可用化学合成的方法来获得。
5.根据权利要求1至4所述的胰岛素,其特征在于类似物的体内生物活性与天然胰岛素相同。
6.根据权利要求2所述的胰岛素,其特征在于含突变基因的表达型质粒的酵母菌珠Saccharomyces cerevisiae YS92/pLL[B9E,B10D]PIP(XV-700-6B)(CCTCC No:M95042)。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN96116230A CN1069649C (zh) | 1996-01-25 | 1996-01-25 | [b9谷氨酸,b10门冬氨酸]人胰岛素 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN96116230A CN1069649C (zh) | 1996-01-25 | 1996-01-25 | [b9谷氨酸,b10门冬氨酸]人胰岛素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1155548A true CN1155548A (zh) | 1997-07-30 |
CN1069649C CN1069649C (zh) | 2001-08-15 |
Family
ID=5123352
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN96116230A Expired - Fee Related CN1069649C (zh) | 1996-01-25 | 1996-01-25 | [b9谷氨酸,b10门冬氨酸]人胰岛素 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1069649C (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101062948B (zh) * | 2006-04-29 | 2010-05-12 | 上海生物泰生命科学研究有限公司 | 单体速效胰岛素及其制法和用途 |
CN106749682A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-05-31 | 吉林大学 | 重组人胰岛素原融合蛋白及其制备方法和用途 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN86106584A (zh) * | 1986-10-06 | 1988-04-20 | 上海电焊机厂 | 外拉伸仿蜗角差型喉箍 |
HUT56857A (en) * | 1988-12-23 | 1991-10-28 | Novo Nordisk As | Human insulin analogues |
-
1996
- 1996-01-25 CN CN96116230A patent/CN1069649C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101062948B (zh) * | 2006-04-29 | 2010-05-12 | 上海生物泰生命科学研究有限公司 | 单体速效胰岛素及其制法和用途 |
CN106749682A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-05-31 | 吉林大学 | 重组人胰岛素原融合蛋白及其制备方法和用途 |
WO2018171535A1 (zh) * | 2017-03-24 | 2018-09-27 | 吉林大学 | 重组人胰岛素原融合蛋白及其制备方法和用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1069649C (zh) | 2001-08-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Brange et al. | Monomeric insulins obtained by protein engineering and their medical implications | |
CN1200949C (zh) | 共价桥接的胰岛素二聚物 | |
RU2529952C2 (ru) | Новые производные инсулина с сильно замедленным профилем время/действие | |
US8618048B2 (en) | Insulin analogues of prolonged activity | |
CN103443122B (zh) | 人胰岛素类似物及其酰化衍生物 | |
AU720966B2 (en) | Insulin derivatives | |
WO1992012999A1 (en) | Novel insulin analogs | |
JPH01156998A (ja) | 血清担体タンパク質との結合力が減少しているヒトインスリン様成長因子類以体及び酵母におけるそれらの産生 | |
JPH0615559B2 (ja) | 心房ペプチド | |
JPS6319520B2 (zh) | ||
US20100222256A1 (en) | Novel polypeptide anti-HIV agent containing the same | |
CN1304450B (zh) | 具有增强的锌结合力的新型胰岛素类似物 | |
CN1069649C (zh) | [b9谷氨酸,b10门冬氨酸]人胰岛素 | |
CN1150208C (zh) | 胸腺素α-1衍生物 | |
HU207099B (en) | Process for purifying reduced non glycosylated, recombinant human il and pharmaceutical composition comprising same | |
CN1061373C (zh) | 单体胰岛素的制备方法 | |
CN1861635A (zh) | 人胰高血糖素相关肽-2类似物 | |
CN101062948B (zh) | 单体速效胰岛素及其制法和用途 | |
CN110256579A (zh) | 植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用 | |
CN1781943A (zh) | 中国南海信号芋螺神经毒素及其编码序列和用途 | |
CN1896097A (zh) | 无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽和在制药中的应用 | |
RU2783776C1 (ru) | Новый пептид и его применение | |
CN113480628B (zh) | 一种贵州疣螈多肽tk-cath及其编码基因和应用 | |
CN107501395B (zh) | 泽陆蛙抗氧化肽及其基因和应用 | |
JP2006508695A (ja) | 単量体インスリン |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |