CN104592381A

CN104592381A - 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法

Info

Publication number: CN104592381A
Application number: CN201310527784.9A
Authority: CN
Inventors: 文良柱; 朱亮; 赵梅
Original assignee: Jiangsu Wanbang Biological Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wanbang Biological Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2015-05-06

Abstract

本发明属于多肽制备方法技术领域，特别涉及一种利拉鲁肽中间体即GLP-1（7-37）的制备方法。此发明采用基因重组技术，与化学合成相比，减少了杂质的产生，纯度和收率相对较高。其主要步骤包括：首先利用基因工程手段将带有hI-GLP-1（7-37）基因序列的质粒导入大肠杆菌细胞中，构建重组工程菌，经发酵诱导获得表达hI-GLP-1（7-37）融合蛋白，后再经复性、酶切转化和分离纯化后得到GLP-1（7-37）。

Description

一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法。

背景技术

糖尿病（Diatetes mellitus）是一组以胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用不足引起的血浆葡萄糖（血糖）水平升高为特征的代谢性疾病群。糖尿病因其因复杂，并发症多，治愈率低，成为国际一大医学难题，被世界卫生组织成为不死的癌症。而近年来，随着生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏、人口老龄化以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率增长迅速，且发病年龄日趋年轻化，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。根据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation）数据，预计到2030年全世界有糖尿病患者人数将直逼5亿。

利拉鲁肽是2010年FDA批准上市的用于治疗Ⅱ型糖尿病的每日给药一次的人胰高糖素样肽-1（GLP-1）类似物。它能够根据体内葡萄糖水平高低，按需促进胰岛β细胞分泌胰岛素，发挥降糖作用。临床证明，利拉鲁肽作为新一代的降糖新药，其优异的降糖效果和安全性正逐渐被认可。目前国内利拉鲁肽完全依赖进口，价格昂贵，因此迫切需要提供一种利拉鲁肽的制备方法，为广大糖尿病患者带来福音。

利拉鲁肽由诺和诺德公司开发研制，通过基因重组技术，利用酵母发酵生产获得。利拉鲁肽结构如下：

NH₂-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH

由以上结构式可知：利拉鲁肽分子式为C₁₇₂H₂₆₅N₄₃O₅₁，分子量为3751.20，是在天然GLP-1分子结构上更换了1个氨基酸（第34位的赖氨酸改为精氨酸），并在26位增加了1个16碳棕榈酰脂肪酸测链，即由多肽GLP-1（7-37）和N^α-alkanoyl-Glu(ONsu)-OtBu两部分组成，现有技术中中间体多肽GLP-1（7-37）的合成方法主要采用化学合成，存在杂质多、收率低的问题。

发明内容：

本发明提供一种利拉鲁肽中间体多肽GLP-1（7-37）的制备方法，通过基因重组技术，利用大肠杆菌发酵诱导表达获得hI-GLP-1融合蛋白，后经复性、酶切、分离等操作获得多肽GLP-1（7-37）。收率高、纯度高。

本发明采取的技术方案是，提供一种用于合成利拉鲁肽中间体多肽GLP-1的融合蛋白hI-GLP-1，包含SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码所述融合蛋白的编码基因。

所述的编码基因，包含SEQ ID NO.1所述的DNA序列。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。

所述重组载体，将编码基因插入质粒pET-27b(+)相应酶切位点。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的工程菌。

本发明还提供了一种利用所述编码基因合成利拉鲁肽中间体多肽的方法。

所述的合成利拉鲁肽中间体多肽的方法，其特征在于，

1、合成编码基因，所述编码基因包含SEQ ID NO.1所述的DNA序列；2、将编码基因连接到表达载体中；3、将带有编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，构建重组工程菌；4、重组工程菌发酵诱导表达包涵体形式的融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列；5、菌体破碎收集包涵体、包涵体洗涤、变性和复性；6、酶切、分离纯化获得多肽GLP-1（7-37）。

进一步地，所述的步骤2中表达载体的连接方式为：通过NdeI/XhoI酶切位点插入到质粒pET-27b(+)相应酶切位点中。

进一步地，所述步骤4中工程菌的发酵采取高密度发酵，具体方式为：接种步骤3所得的工程菌阳性克隆于10mL LB培养基中，30℃，250rpm振荡过夜培养后，按0.4%左右的比例接种于LB培养基250mL中，振荡培养至OD₆₀₀值达到2时作为种子液，接入12L的发酵培养基中进行高密度培养；初始发酵温度30℃，搅拌速度300rpm，通气量30L/min，pH为6.7，之后不断提高搅拌转速与通气量最大分别至1000rpm和80L/min以维持溶解氧始终在30%以上，搅拌转速和空气流量达到上限后，溶氧快速上升时，开始流加补料，当补料6h后，控制温度30℃、pH7.0左右、溶氧30%以上，加入异丙基硫代半乳糖苷进行6h的诱导后，出罐。

进一步地，所述步骤6中所述酶切、分离纯化的具体方式为：步骤5复性后的融合蛋白经肠激酶（1：200）在室温下酶解2小时后即可得到中间体多肽和连接肽的混合液，混合液使用Q-FF阴离子交换及反相填料分离即可获得纯度符合要求的中间体多肽样品， Q-FF阴离子交换纯化条件：缓冲液A-50mM Tris-HCl，pH8.0，缓冲液B-50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH8.0，线性梯度洗脱30CV；反相纯化的纯化条件：缓冲液A-10%ACN+50mM HAc，缓冲液B-50%ACN+50mM HAc，线性梯度洗脱20CV；质谱条件：离子源电压 5.5kV；辅助气 20单位；气帘气 25单位；CID电压 40eV；碰撞气体 N₂；注射泵进样速度 20μl/min；检测方式为正离子模式。

本发明所述的用所述编码基因合成利拉鲁肽中间体多肽的方法，收率高、纯度高。

附图说明

图1是重组质粒的构建；

图2是质粒酶切电泳图；

图3是编码hI-GLP-1融合蛋白的基因测序图第一页；

图4是编码hI-GLP-1融合蛋白的基因测序图第二页；

图5是发酵过程中菌体生长曲线图；

图6是纯化过程中取样电泳图；

图7是酶切前后的电泳图；

图8是酶切后混合液Q-FF纯化；

图9是酶切后混合液Q-FF纯化的电泳图；

图10是中间体多肽反相纯化；

图11是中间体多肽C8反相纯化电泳图；

图12中间体多肽质谱图。

具体实施例方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 重组工程菌的构建

利用常规的化学合成方法合成hI-GLP-1融合蛋白的基因，将获得的序列cDNA，通过NdeI/XhoI酶切位点插入到质粒pET-27b(+)相应酶切位点中，构建成的重组质粒如图1所示，重组质粒酶切后的电泳如图2所示，插入编码hI-GLP-1融合蛋白基因的重组质粒通过常规的化学转化法转化到宿主大肠杆菌中，构建重组工程菌。如图3-4所示，经测序，工程菌中的序列与设计一致。

实施例2 高密度发酵

接种实施例1所得的重组工程菌阳性克隆于10mL LB培养基中，30℃，250rpm振荡过夜培养后，按0.4%左右的比例接种于LB培养基250mL中，振荡培养至OD₆₀₀值达到2时作为种子液，接入12L的发酵培养基中进行高密度培养。初始发酵温度30℃，搅拌速度300rpm，通气量30L/min，pH为6.7，之后不断提高搅拌转速与通气量最大分别至1000rpm和80L/min以维持溶解氧始终在30%以上，因为高密度发酵需要大量的氧气，若供氧不足，不仅会抑制菌体呼吸作用，限制菌体生长繁殖，而且会积累有害物质对菌体产生毒害，降低蛋白表达量。因此，必须保证足够的供氧。一般DO≥20%~30%，DO也不能太高，长期超过60%，菌体可发生氧中毒。培养分为分批培养和分批补料两个阶段，搅拌转速和空气流量达到上限后，若溶氧快速上升时，开始流加补料。当补料6h后，控制温度30℃、pH7.0左右、溶氧30%以上，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行6h的诱导后，出罐，出罐后离心得菌体湿重178g/L。发酵过程中菌体生长曲线如图5所示。

本实施例的培养基配方及pH调节剂如下：

LB培养基：葡萄糖10g/L；酵母粉：15 g/L；氯化钠10g/L;

发酵培养基：葡萄糖10g/L；酵母粉：30 g/L；磷酸氢二钠4g/L；磷酸二氢钾4g/L；硫酸铵6g/L；七水硫酸镁10g/L；二水氯化钙0.02g/L；VB1微量；

补料培养基：酵母粉：20 g/L；葡萄糖：30 g/L；

pH调节剂：磷酸；氨水。

实施例3 多肽中间体的纯化

实施例2所得的出罐后离心收集菌体，按重量体积比1:10加入破碎缓冲液，高压均质机700bar压力下破碎两遍，离心收集包涵体沉淀，包涵体湿重为30g/L发酵液。将沉淀按重量体积比1:10加入洗涤缓冲液，室温磁力搅拌1小时，离心收集的沉淀用洗涤缓冲液洗涤两次。再用包涵体溶解缓冲液按重量体积比1:10溶解过夜。溶解后的包涵体经离心、超滤去除杂质后，如图9所示，稀释到蛋白浓度0.2mg/ml，在复性缓冲液中，4℃复性过夜，复性后的融合蛋白经肠激酶（1：200）在室温下酶解2小时后即可得到中间体多肽和连接肽的混合液。涉及到的电泳及图谱如图6所示，酶切前后的电泳图如图7所示。如图8-11所示，混合液使用Q-FF阴离子交换及反相填料分离即可获得纯度符合要求的中间体多肽样品，样品质谱结果如图12所示，Q-FF阴离子交换纯化条件：缓冲液A-50mM Tris-HCl，pH8.0，缓冲液B-50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH8.0，线性梯度洗脱30CV；反相纯化的纯化条件：缓冲液A-10%ACN+50mM HAc，缓冲液B-50%ACN+50mM HAc，线性梯度洗脱20CV；质谱条件：离子源电压 5.5kV；辅助气 20单位；气帘气 25单位；CID电压 40eV；碰撞气体 N₂；注射泵进样速度 20μl/min；检测方式为正离子模式。

本实施例所用的各种缓冲液配方如下：

破碎缓冲液：25mmol/L Tis-HCL + 5mmol/L EDTA，pH7.5；

洗涤缓冲液：2mol/L尿素 + 1.5% Triton；

包涵体溶解缓冲液：8mol/L尿素 + 10mmol/L EDTA+ 25mmol/L Tris-HCl，pH7.5；

复性缓冲液：0.2mol/L尿素+ 10mmol/L EDTA+ 25mmol/L Tris-HCl，GSH：GSSG=1mmol/L：0.3mmol/L，pH10。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏万邦生化医药股份有限公司

上海复星医药(集团)股份有限公司

<120> 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法

<130> 2013

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 739

<212> DNA

<213>

<400> 1

atgcgcctga actcggcccg ttttgtcaat caacatctgt gcggcagcca tctggtcgaa 60

gctctgtacc tggtttgcgg tgaacgcggc tttttctata ccgataaaga agcggaagac 120

ctgcaggttg gtcaagttga actgggcggt ggcccgggtg caggtagcct gcagccgctg 180

gctctggaag gtagcctgca gaagcgtggc attgtcgaac aatgctgtac gagcatctgc 240

tctctgtatc aactggaaaa ctactgtaat cgcggtgcggg cgccgatga cgatgacaaa 300

catgcagaag gtacctttac gagtgatgtt tcctcatatc tggaaggtca agctgcaaaa 360

gaatttatcg catggctggt tcgcggtcgc ggctga 396

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213>

<220>

<221> 前导肽

<222>

<400> 2

Met Arg Leu Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser

1 5 10 15

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe

20 25 30

Tyr Thr Asp Lys Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu

35 40 45

Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly

50 55 60

Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

65 70 75 80

Glu Asn Tyr Cys Asn Arg Gly Ala Gly Ala Asp Asp Asp Asp Lys His

85 90 95

Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln

100 105 110

Ala Ala Lys Glu Gln Ala Ala Lys Glu Gln Ile Ala Trp Leu Val Arg

115 120 125

Gly Arg Gly

130

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，包含SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，包含SEQ ID NO.1所述的DNA序列。

4.一种包含权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，将编码基因插入质粒pET-27b(+)相应酶切位点。

6.一种包含权利要求2或3所述编码基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述编码基因在合成利拉鲁肽中间体多肽中的应用。

8.权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1）合成编码基因，所述编码基因包含SEQ ID NO.1所述的DNA序列；

2）将编码基因连接到表达载体中；

3）将带有编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，构建重组工程菌；

4）重组工程菌发酵诱导表达包涵体形式的融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列；

5）菌体破碎收集包涵体、包涵体洗涤、变性和复性；

6）酶切、分离纯化获得多肽GLP-1（7-37）。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的步骤2）中表达载体的连接方式为：通过NdeI/XhoI酶切位点插入到质粒pET-27b(+)相应酶切位点中。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述步骤4）中工程菌的发酵采取高密度发酵，诱导表达所用的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷；所述步骤6）中分离纯化方法采用Q-FF阴离子交换及反相填料分离，具体条件为：Q-FF阴离子交换纯化条件：缓冲液A-50mM Tris-HCl，pH8.0，缓冲液B-50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH8.0，线性梯度洗脱30CV；反相纯化的纯化条件：缓冲液A-10%ACN+50mM HAc，缓冲液B-50%ACN+50mM HAc，线性梯度洗脱20CV。