CN111303275A - 一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用 - Google Patents

一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用。具体涉及到：优化适于大肠杆菌系统表达的rhGH的基因、并构建入适宜的表达载体和菌株；rhGH发酵工艺开发；rhGH纯化工艺开发，尤其是针对周质蛋白的提取工艺优化。本发明提供的rhGH分泌表达体系可以有效地实现rhGH的分泌，并且信号肽切除彻底。产出的rhGH具有良好的生理活性，工艺且具有培养基成分明确、成本低廉、易于放大和重复的特点，并且提供的周质蛋白提取方法重复性良好，提取效率高，选择性良好。纯化后的样品纯度、内毒素、HCP、DNA残留等可以满足药用标准。

Description

一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用
技术领域
本发明属于基因工程、蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人生长激素及其制备方法 与药物应用。
背景技术
人生长激素(Human Growth Hormone,hGH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种 单一肽链的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能。含有191个氨基酸残基，分子量为22k Da左右，分子中无糖基化。 人生长激素具有广泛的生理功能，几乎能影响所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组 织、脑组织及造血系统。
人生长激素(hGH)在人体生长发育过程中起着重要作用，能够促进骨骼、内脏和全身生长，还能促进蛋白质合成，加快脂肪和矿物质代谢。hGH原来仅用于生长激素缺 乏儿童矮小症，后因基因工程产品问世，临床用量足以保证，随后又将适应症范围扩大 到成人生长激素缺乏、Turner氏综合症、艾滋病消瘦、大面积创伤恢复等症状。随着临 床研究的不断深入，生长激素在抗衰老、骨质疏松症、心血管疾病治疗方面也有很好的 疗效。
生长激素的种族特异性很强，动物的生长激素人类是不能应用的，只有人类自身的 生长激素才具有临床治疗功能。因此过去临床应用只能从人脑垂体提取，来源十分有限， 价格也非常昂贵。到了上世纪70年代后期随着分子生物学的发展，特别是基因工程技术的发展，使得利用基因工程手段大规模生产重组人生长激素成为现实。应用DNA重 组技术，在大肠杆菌细胞中表达重组人生长激素，有两种不同的技术途径:一种是生产胞 内型的重组人生长激素；另一种是生产分泌型的重组人生长激素。
一般胞内型重组人生长激素表达后定位在大肠杆菌基因工程菌的细胞质中，具有很 高的产量，但是以无活性的包涵体形式存在，技术上可以通过包涵体复性的方法制备获得具有生理活性的rhGH，目前已经建立起比较完备的包涵体复性技术。但是由于大肠 杆菌自身表达的特点，胞内型rhGH的N端相比较天然hGH在一级结构上多出一个甲 硫氨酸，并且复性后无法通过体外切割的手段去除该氨基酸。已有研究表明甲硫氨酸的 存在可以诱导胞内型rhGH的抗体产生，进而影响药效。
分泌型rhGH的表达是通过在rhGH基因序列的N端加入信号肽的基因，表达后首 先在大肠杆菌胞质中形成可溶的信号肽-rhGH的融合蛋白，然后信号肽引导融合蛋白进 入大肠杆菌周质空间，在周质空间中由蛋白酶切除信号肽而获得与天然hGH一级结构 完全一致的rhGH，并且周质空间中的内环境可以介导形成完整活性的rhGH。但是大肠 杆菌周质空间比较有限，并且分泌效率一般不高，因此分泌型rhGH的产量一般不高。
发明内容
本发明旨在开发一种分泌型rhGH及其表达和纯化方法，要解决的主要技术问题是： 1、优化和构建适于大肠杆菌表达的rhGH的基因、载体和菌株，以实现高效分泌表达；2、开发产量高、成本低廉、易于放大的rhGH大肠杆菌菌株高密度发酵工艺；3、研发 周质蛋白提取和分离纯化工艺，确立易于放大、成本低廉、工艺简单的纯化方法，制备 高纯度、高生物活性的rhGH原蛋白。
本发明首先提供一种针对大肠杆菌表达系统密码子优化后的重组人生长激素的基 因序列，如SEQ ID NO：1所示，并且在该序列前还有如SEQ ID NO：2所示的OmpA3 信号肽基因序列。
所述重组人生长激素及OmpA3信号肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4所示。
本发明还提供一种用于携带和表达所述rhGH基因的表达载体，如pET、pDEST14 载体等。
本发明还提供一种用于所述rhGH重组表达质粒表达的大肠杆菌宿主，如 BL21(DE3)、BL21 AI等。
本发明还提供一种表达rhGH大肠杆菌的发酵表达方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵。所述的发酵包括如下步骤：
将种子液按照1-10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；
设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；
发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待OD600达到20左右时，开 始进行补料培养；
待菌体生长至0D600≈20-50之间向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM的L(+)-阿拉伯糖进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。
所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/L，磷酸二氢钾8-15g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，甘油20-40g/L，七水合硫酸镁1-4g/L。在发酵接种之前还要向分批 发酵培养基中加入1/1000(V/V)的微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。
所述补料培养基主要成分包括：甘油500g/L，七水合硫酸镁8-12g/L，酵母粉 30-50g，胰蛋白胨30-50g/L，在补料开始之前还要补料培养基中加入1/100(V/V)的上 述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。
所述微量元素母液成分包括：FeSO4·7H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 2.25g/L、 CuSO4·5H2O 15g/L、MnSO4·5H2O 5g/L、CaCl2·7H2O 1g/L、CoCl·6H2O 1g/L、 Na2MoO4·2H2O1.125g/L、H3BO3 0.0625g/L、HCl 41.75ml、Biotin 0.5g/L。
本发明通过转速/空气/高纯氧三者的关联将DO控制在30-50％之间，具体来说就是， 设定DO为30-45％之间，通过发酵罐控制系统在发酵初期设定空气通气量为0.3-1VVM，然后通过逐渐提高转速以维持DO稳定。当调节转速和空气量不足以维持DO在设定值 时，通过逐渐提高高纯氧的通气量来稳定DO。
本发明通过自动补加氨水的方法用于控制pH稳定，氨水的添加可以用来调节pH同时也可以作为氮源被大肠杆菌利用。
本发明还提供一种rhGH周质蛋白提取和粗纯方法，该方法可以有效地提取获得周质蛋白，并且很少将胞内蛋白提取出来。包括：发酵菌体-20℃冷冻24h以上→冷冻的 菌体2-8℃低温解冻8h以上→解冻后菌体使用高渗缓冲液(20mM Tris HCl pH8.0+20-30％蔗糖+1mM EDTA)重悬至100-150g/L，2-8℃静置30min-1h，离心收集上 清1和菌体沉淀1→将菌体沉淀1再次使用低渗缓冲液(20mM Tris HCl+5mM硫酸镁 +1mM EDTA)重悬至100g/L，2-8℃静置30min-1h，离心收集上清2。上清1和上清2 合并，过滤去除不溶性杂质即获得周质蛋白提取液。将周质蛋白提取液使用切向流超滤 系统浓缩至原体积的1/2至1/4，然后在搅拌混匀条件下向其中按250-280g/L(质量/初 始体积)缓慢加入硫酸铵颗粒进行盐析，2-8℃静置1h，然后离心收集沉淀，沉淀即为 粗纯的rhGH。使用复溶缓冲液(20mM Tris+0.8M硫酸铵+1mM EDTA，pH7.5)按2L/kg (起始发酵菌体湿重)将rhGH盐析沉淀复溶，2-8℃复溶30min以上，最终过滤获得清 液即为rhGH粗纯液。
本发明还提供一种rhGH粗纯液的层析纯化方法，具体包括：将rhGH粗纯液使用Phenyl Fast Flow(Phenyl FF)纯化，收集→将上步洗脱收集的样品超滤换液使用QHP (Qsepharose high performance)纯化，洗脱收集样品→将QHP纯化后样品超滤换液， 使用Q20(TSKgel SuperQ-5PW(20))层析纯化，收集纯品，最终进行质量分析。通过 该方法纯化后制备的rhGH纯品在纯度、内毒素残留、HCP、DNA残留、生物活性等指 标上均可以满足2015版《中国药典》关于重组人生长激素的质量要求。
本发明的主要优点在于：
1、提供的rhGH分泌表达体系可以有效地实现rhGH的分泌，并且信号肽切除彻 底。
2、提供的rhGH表达体系产出的rhGH具有良好的生理活性。
3、提供的rhGH大肠杆菌发酵方法具有培养基成分明确、成本低廉、易于放大和重复的特点。
4、提供的周质蛋白提取方法重复性良好，提取效率高，选择性良好。
5、提供的层析纯化方法具有步骤简单(离子交换+疏水层析)、易于放大、操作简单的特点，纯化后的纯品纯度、内毒素、HCP、DNA残留等可以满足药用标准。
附图说明
图1：OmpA3-rhGH全长基因的SOE PCR扩增琼脂糖凝胶电泳分析；Lane1：500bp DNALadder；Lane2：OmpA3-rhGH全长基因SOE PCR产物。
图2：分泌型rhGH单克隆PCR鉴定后的琼脂糖凝胶电泳图；Lane1：500bp DNALadder；Lane2-9：不同单菌落菌液对应的PCR产物。
图3：实施例2rhGH小试发酵表达鉴定，Lane1：高渗处理液上清；Lane2：低渗处 理液上清；Lane3：盐析上清；Lane4：盐析沉淀。
图4：实施例3中中试发酵菌体生长曲线。
图5：实施例3中中试发酵表达鉴定，Lane1：高渗处理液上清；Lane2：低渗处理 液上清；Lane3：盐析上清；Lane4：盐析沉淀。
图6：rhGH粗纯液层析纯化后非还原电泳分析，Lane1：Phenyl FF纯化后样品；Lane2：QHP纯化后样品；Lane3：Q20纯化后样品。
图7：rhGH N端5个氨基酸测序结果。
图8：不同批次纯化样品的纯度分析。
图9：不同批次纯化样品的宿主蛋白残留分析。
图10：rhGH生物活性测定
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明进行进一步的阐述，需理解，这些实施例仅用于对本发 明加以说明而不用于限制本发明。
实施例1 rhGH大肠杆菌菌株的构建
发明人将OmpA3信号肽和rhGH基因(GenBank登录号：NM_000515.4)进行直 接融合，并针对大肠杆菌密码子优化、mRNA自由能优化，并将优化后的OmpA3基因 (如SEQ IDNO：2所示)、rhGH基因(如SEQ ID NO：1所示)合并后委托金斯瑞生 物科技有限公司进行合成(记为OmpA3-rhGH)，合成后的基因被插入到了pUC57载体 构建成重组克隆质粒，记为pUC57-OmpA3-rhGH；该质粒pUC57-OmpA3-rhGH使用 分子克隆的手段被导入到大肠杆菌Top10(记为Top10-pUC57-OmpA3-rhGH)表达克 隆宿主中。为了将rhGH基因从pUC57载体克隆至pDEST14中，参见如下步骤：
1、取冻存于-80℃冰箱的Top10-pUC57-OmpA3-rhGH和DH5α-pDEST14(本实验 室保存)菌株甘油管，融化后接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃ 220rpm摇床过夜培养后使用质粒小提试剂盒进行质粒抽提(购自于天根生化科技有限 公司)。
2、设计rhGH基因扩增引物：
上游引物如SEQ ID NO:5所示；下游引物如SEQ ID NO:6所示。
以pUC57-OmpA3-rhGH重组质粒为模板，以上/下游引物为引物，使用Q5 DNA超 保真聚合酶(NEB)扩增获得rhGH基因，扩增后PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳分 析，分析结果如图1所示。使用DNA胶回收试剂盒切胶回收获得目的基因。
3、将rhGH PCR产物和pDONR221(购自Thermo Fisher Scientific，11789-020)入门质粒使用BP ClonaseTMII enzyme(购自Thermo Fisher Scientific，11789-020)在室温反应1h后，将反应产物转化至大肠杆菌Top10感受态细胞。转化完毕后，将感受态细 胞涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，37℃，过夜培养。从转化平板上 挑取单克隆接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养8h。 培养完毕后取出部分菌液进行PCR鉴定，并将阳性菌液进行质粒提取，命名为 pDONR221-rhGH。
4、将pDONR221-rhGH和pDEST14(购自Thermo Fisher Scientific，11801-016) 表达载体使用LR ClonaseTMII enzyme(购自Thermo Fisher Scientific，11824-026)在室 温反应1h后，将反应产物转化大肠杆菌BL21 AI感受态细胞(购自Thermo FisherScientific)。转化完毕后，将感受态细胞涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培 养基中，37℃，过夜培养。
5、从转化平板上挑取单克隆接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养8h。培养完毕后取出部分菌液，作为PCR扩增模板对单菌落进行 PCR鉴定，PCR引物为T7启动子通用引物。PCR扩增体系为50μl，所使用DNA聚合 酶为Taq DNA聚合酶(购自于天根生化科技有限公司)，所使用扩增条件按照说明书推 荐方案进行。PCR结束后，使用1％琼脂糖电泳凝胶进行分析，分析结果如图2所示。
6、使用质粒小提试剂盒进行质粒抽提，将所抽提质粒进行DNA测序。比对分析测序结果，测序结果正确的质粒对应菌株即为阳性的目标菌株，记为BL21 AI-pDEST14-OmpA3-rhGH。
实施例2 rhGH小试发酵(20L)
本实施例主要阐述了BL21 AI-pDEST14-OmpA3-rhGH菌株的30L发酵工艺，发酵 工艺中使用成分明确的甘油作为菌体代谢的碳源，使用氨水(发酵过程中既用于pH调 节也用做氮源用于菌体代谢)和磷酸氢二铵作为菌体代谢的氮源；同时为了促进菌体生 长，缩短发酵周期，提高发酵产量，培养基中还加入了酵母粉和蛋白胨等复合营养素。 本实施例主要介绍了rhGH 20L规模的发酵工艺条件，所使用发酵罐为Sartouris cplus发 酵罐，发酵初始体积为20L。
制备例1具体步骤如下：
1、发酵种子液的制备：将实施例1中构建好的rhGH大肠杆菌菌株冻存管使用三区划线的方法接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养进行 活化。
2、从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养8h，此为一级种子液。
3、将步骤2中的一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD600≈3-5之间，此为二级种子 液制备。
4、分批发酵培养基的成分：一水合柠檬酸1.5g/L，磷酸二氢钾13.3g/L，磷酸氢二铵4g/L，甘油30g/L，七水合硫酸镁1.5g/L；按照分批发酵培养基的成分称取20L量 的试剂，使用15L单蒸水溶解后，调节pH至6.5，定容至19L。将配好的分批发酵培养 基倒入发酵罐进行灭菌，冷却后，通过注射器向发酵罐中打入200ml上文中提到的微量 元素母液(过滤除菌)和终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素(过滤除菌)抗生素。按照 补料培养基的成分称取2000ml量的相关试剂(甘油500g/L，七水合硫酸镁12g/L，酵 母粉40g/L，蛋白胨40g/L)补料培养基，定容至2000ml后121℃，20min灭菌处理， 使用前还要向补料培养基中加入1/1000(V/V)的前述微量元素母液用于维持菌体正常 生长和代谢。
5、将制备好的二级种子液按照2.5％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基的 发酵罐中开始补料-分批高密度发酵培养，设定发酵温度为37℃、pH为7.0、DO 40％， pH使用氨水和磷酸(20％)进行关联调节，DO通过关联转速、通气量和高纯氧进行控 制。发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待OD600达到20左右时，开 始进行补料培养(补料培养基的流加速度维持在20-30g/h范围)。待菌体生长至 0D600≈20-30之间向发酵罐中加入终浓度为0.5mM的L(+)阿拉伯糖进行诱导表达，诱导 表达4h结束培养。使用离心法收集发酵液中的菌体，所收集得到菌体冻存于-20℃冰箱 中备用。
6、rhGH表达分析：取步骤5中预冻24h以上的菌体50g放入2-8℃条件下解冻12h→解冻后菌体使用高渗缓冲液(20mM Tris HCl pH8.0+20％蔗糖+1mM EDTA)重悬至 100g/L，2-8℃静置30min，离心收集上清1和菌体沉淀1→将菌体沉淀1再次使用0.5L 低渗缓冲液(20mM Tris HCl+5mM硫酸镁+1mM EDTA)重悬至100g/L，2-8℃静置 30min，离心收集上清2。上清1和上清2合并，过滤去除不溶性杂质即获得周质蛋白 提取液，然后在搅拌混匀条件下按280g/L(质量/初始体积)向其中缓慢加入硫酸铵颗 粒进行盐析，2-8℃静置1h然后离心收集沉淀，沉淀即为粗纯的rhGH。将rhGH盐析沉 淀使用100ml缓冲液复溶(20mM Tris+0.8M硫酸铵+1mM EDTA，pH7.5)，2-8℃复溶 30min以上，最终过滤获得清液即为rhGH粗纯液。取高渗处理液上清1、低渗处理液 上清2、盐析上清、盐析沉淀，使用非还原SDS-PAGE分析，结果如图3所示。
在周质蛋白提取完毕后，大肠杆菌菌体仍然保持了比较好的状态，并未出现大范围 裂解，胞内蛋白和胞内核酸并未明显释放，提取液粘度保持了较低水平。因此表明本发明提供的蛋白提取方法可以有效地获得目的蛋白，很少将胞内蛋白提取出来，具有一定 的选择性。另外发明人还尝试更换其他方法处理提取后的菌体，没有发现继续有rhGH 的释放，证明本发明的方法一次抽提即可彻底提取目的蛋白。
制备例1中列出的具体条件仅用作说明而非限制本发明。
制备例1中的补料-分批发酵培养基及发酵过程参数控制是发酵培养的关键，同时诱导表达的时机选择也会影响最终rhGH的产量和整个发酵周期的长度。因此发明人对 于制备例1中的发酵培养基参数和其他工艺参数进行了优化(未列参数与制备例1相同， 下同)进行发酵条件考查(制备例2和制备例3)，结果所获得发酵产量基本与制备例1 相同，结果如表1所示。同时，发明人对诱导表达时机进行调整研究(制备例4和制备 例5)，结果如表2所示。
表1
参数 制备例1 制备例2 制备例3
分批发酵培养基中的甘油(g/L) 20 30 40
接种量(％) 2.5 5 10
pH 6.8 7.0 7.2
DO(％) 40 30 45
L(+)阿拉伯糖(mM) 0.5 1.0 0.2
发酵产量 250mg/L 260mg/L 270mg/L
表2
参数 制备例1 制备例4 制备例5
诱导时OD600 20 35 50
发酵结束时OD600 55 65 80
发酵周期(h) 11.5 13 16.5
发酵产量 250mg/L 300mg/L 350mg/L
实施例3 rhGH中试放大发酵(150L)
本实施例阐述了rhGH的发酵工艺放大，在小试发酵工艺(实施例2)基础上实施 中试放大发酵工艺研究和验证。具体如下：
1、种子活化同实施例2中的制备例1，获得二级种子液。
2、按照实施例2中的制备例1中的方法和培养基成分制备15L基础培养基于50L 的种子罐中原位灭菌，然后将步骤1中的二级种子液接种到种子罐中进行培养，培养条 件为：罐压＝0.3MPa T＝37℃D0＝40％pH＝7.0，使用氨水控制pH不低于7.0，培养过程 中不加入抗生素。培养至OD＝15-30之间均可移种。
3、按照实施例2中的制备例1中的方法和培养基成分制备150L基础培养基于500L的种子罐中原位灭菌，然后将步骤2中的三级种子液移种到工作罐中进行培养，培养条 件为：罐压＝0.3MPa T＝37℃D0＝40％pH＝7.0，使用氨水控制pH不低于7.0，培养过程 中不加入抗生素。当出现补料信号的时候开始补料(补料培养基同实施例2制备例1)， 补料速度为1L/h至发酵结束。培养至OD600＝50的时候向发酵罐中打入终浓度为0.5mM L(+)阿拉伯糖诱导表达，诱导表达4h结束培养，收集发酵菌体。发酵过程菌体生长 曲线如图4所示。
4、将步骤3中放大发酵获得的菌体使用实施例2中的方法进行表达鉴定，鉴定结果如图5所示。
从上述结果中可以看出工作罐中菌体生长快速，在14h内OD600即可达到90以上，达到了高密度发酵水平，对发酵菌体提取周质蛋白，然后核算表达量，中试发酵批次目 标蛋白产量可达到365mg/L，因此具备良好的放大效果。
实施例4rhGH周质蛋白提取和层析纯化
1、取实施例3中于-20℃冰箱冷冻24h以上的中试放大发酵菌体1kg，将冷冻的菌体于2-8℃低温条件下解冻12h以上。
2、将步骤1中解冻后菌体使用高渗缓冲液(20mM Tris HCl pH 8.0+20％蔗糖+1mMEDTA)重悬至100g/L，2-8℃静置30min-1h，离心收集上清1和菌体沉淀1。
3、将菌体沉淀1再次使用低渗缓冲液(20mM Tris HCl+5mM硫酸镁+1mM EDTA) 重悬至100g/L，2-8℃静置30min-1h，离心收集上清2。
4、将步骤2和3中的上清1和上清2合并，过滤去除不溶性杂质即获得周质蛋白 提取液。将周质蛋白提取液使用切向流超滤系统浓缩至原体积的1/2，然后在搅拌混匀 条件下向其中缓慢加入250g/L(质量/初始体积)的硫酸铵颗粒进行盐析，2-8℃静置1h 然后离心收集沉淀，沉淀即为粗纯的rhGH。
5、使用复溶缓冲液(20mM Tris+0.8M硫酸铵+1mM EDTA，pH7.5)按2L/kg(缓 冲液/起始发酵菌体湿重)将rhGH盐析沉淀复溶，2-8℃复溶30min以上，过滤后获得 清液，清液即为rhGH粗纯液。
6、将步骤5中的粗纯液使用Phenyl sepharose FF纯化，使用20mM Tris pH7.5缓冲 液进行线性洗脱，梯度为10CVs经过柱床的硫酸铵浓度达到0，收集洗脱样品。
7、将步骤6中的洗脱样品处理使得电导率不高于2mS/cm，过滤样品后使用QSepharose high performance纯化。使用20mM Tris 1M氯化钠pH7.5缓冲液进行线性洗脱，梯度为10CVs内经过柱床的氯化钠浓度达到0.3M，收集洗脱样品。
8、将步骤7中的纯化样品超滤法换液为10mM PB pH7.5，最终样品电导率不高于2mS/cm，过滤样品使用Q20纯化(TSK gel SuperQ-5PW(20))。使用10Mm PB 1M氯 化钠pH7.5缓冲液进行线性洗脱，梯度为10CVs内经过柱床的氯化钠浓度达到0.2M， 收集洗脱样品。
将步骤2-5、6-8样品使用非还原电泳分析，结果分别如图5、6所示。
取纯化后样品转膜，然后N端5个氨基酸测序分析，结果如图7所示。图7中N 端氨基酸测序结果显示本发明产生的重组人生长激素N端5个氨基酸与天然人生长激素 N端5个氨基酸序列完全一致，表明信号肽序列被切除干净，无残留。
不同批次发酵样品使用上述方法纯化，所得样品使用SEC-HPLC分析纯度，分析方法参考2015《中国药典》执行，结果如图8所示。
不同批次发酵样品使用上述方法纯化，所得样品进行使用鲎试剂进行内毒素残留分 析，分析显示各批次相比较对照品均为阴性。
不同批次发酵样品使用上述方法纯化，所得样品进行HCP残留分析，结果如图9 所示。
不同批次发酵样品使用上述方法纯化，所得样品进行DNA残留分析，宿主DNA 残留均显著低于2015版《中国药典》规定的上限标准。经过三步层析纯化，最终获得 纯度达到95％标准的纯品约为90mg/L(纯品蛋白质量/发酵液体积)，总收率约为24.6％。
实施例5 rhGH体内药效评价
rhGH的体内药效活性测定参考2005版《中国药典》中关于重组人生长激素活性测定的方法进行评价。
选择60-80g SD大鼠，以10％水合氯醛按照3.5ml/kg的剂量麻醉动物；
待动物翻正反射消失后，保定动物，颈部备皮，皮肤消毒；
沿颈中部近下颚处作一2cm纵向切口，分开颌下腺，暴露胸甲状肌，在此肌肉右侧近咽部钝性分离血管神经，直至骨板；
擦去骨板上的肌肉，找到枕骨脊，沿枕骨脊继续向头部剥离两侧肌肉组织，直至可见“T"型凸起及蝶枕骨联合；
在蝶枕骨联合上方2mm处，即垂体窝附近，用2mm钻头钻通骨板；
通过钻孔吸取垂体，检查垂体是否为三叶。逐层缝合肌肉皮肤，术后肌注氨苄西林钠抗感染；
取去垂体手术后2-3周，体重变化小于手术前±10％的大鼠，按照体重随机分成4组， 每组6只动物，每只编号并记录体重；
分别自颈部皮下注射一种浓度为33.33μg/ml的标准品或供试品溶液0.5ml，每日一 次，连续6天；
于最后1次给药后24h，处死大鼠，称体重，尸检，观察蝶鞍区是否有垂体残留，剔除有垂体残留的大鼠。
以每只动物给药后体重增加的克数作为反应值，结果如图10所示。结果显示本发明 的供试品相比对照品有更高的效价。
序列表
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120> 一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用
<130> 一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 576
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ttcccgacca tcccgctgag ccgtctgttt gacaacgcga tgctgcgtgc gcaccgtctg 60
caccagctgg cgttcgatac ctaccaagag tttgaggaag cgtatatccc gaaggaacag 120
aaatacagct tcctgcagaa cccgcaaacc agcctgtgct ttagcgagag cattccgacc 180
ccgagcaacc gtgaggaaac ccagcaaaag agcaacctgg agctgctgcg tatcagcctg 240
ctgctgattc agagctggct ggaaccggtg caattcctgc gtagcgtttt tgcgaacagc 300
ctggtgtatg gcgcgagcga cagcaacgtt tacgacctgc tgaaggatct ggaggaaggt 360
atccagaccc tgatgggtcg tctggaagac ggcagcccgc gtaccggtca gatcttcaag 420
caaacctaca gcaagttcga taccaacagc cacaacgacg atgcgctgct gaaaaactac 480
ggcctgctgt attgcttccg taaggacatg gataaagtgg agacctttct gcgtattgtg 540
caatgccgta gcgttgaagg tagctgcggc ttctga 576
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> bacterial
<400> 2
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60
gcc 63
<210> 3
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> bacterial
<400> 4
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala
20
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agacatatga aaaagacagc 60
tatc 64
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctcgagttat cagaagccg 49

Claims (8)

1.重组人生长激素，其特征在于，其由如SEQ ID NO：1所示的基因序列在大肠杆菌表达系统中分泌表达得到，且所述基因序列前还有如SEQ ID NO：2所示的OmpA3信号肽基因序列。
2.用于携带和表达权利要求1所述重组人生长激素编码基因的表达质粒。
3.根据权利要求2所述的表达质粒，其特征在于，所述质粒为pDEST14。
4.含有权利要求3所述表达质粒的大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21 AI。
6.权利要求1所述重组人生长激素的大肠杆菌发酵表达方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求5所述大肠杆菌发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵，所述的发酵包括如下步骤：
将种子液按照1-10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；
设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；
发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待OD600达到20左右时，开始进行补料培养；
待菌体生长至0D600≈20-50之间向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM的L(+)-阿拉伯糖进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。
7.权利要求1所述重组人生长激素的蛋白提取和粗纯方法，其特征在于，包括：将权利要求6所述诱导表达结束的发酵菌体-20℃冷冻24h以上；冷冻的菌体2-8℃低温解冻8h以上；解冻后菌体使用高渗缓冲液重悬至100-150g/L，2-8℃静置30min-1h，离心收集上清1和菌体沉淀1；将菌体沉淀1再次使用低渗缓冲液重悬至100g/L，2-8℃静置30min-1h，离心收集上清2；上清1和上清2合并，过滤去除不溶性杂质即获得周质蛋白提取液；将周质蛋白提取液使用切向流超滤系统浓缩至原体积的1/2至1/4，然后在搅拌混匀条件下向其中按250-280g/L缓慢加入硫酸铵颗粒进行盐析，2-8℃静置1h，然后离心收集沉淀，沉淀即为粗纯的重组人生长激素；使用复溶缓冲液按2L/kg将重组人生长激素盐析沉淀复溶，2-8℃复溶30min以上，最终过滤获得清液即为重组人生长激素粗纯液；
所述高渗缓冲液为20mM Tris HCl pH 8.0+20％蔗糖+1mM EDTA；
所述低渗缓冲液为20mM Tris HCl+5mM硫酸镁+1mM EDTA；
所述复溶缓冲液为20mM Tris+0.8M硫酸铵+1mM EDTA，pH7.5。
8.权利要求1所述重组人生长激素的粗纯液的层析纯化方法，其特征在于，具体包括：将权利要求7所述的重组人生长激素粗纯液使用Phenyl Fast Flow纯化，收集；将上步洗脱收集的样品超滤换液使用Q sepharose high performance纯化，洗脱收集样品；将上步收集样品超滤换液，使用TSKgel SuperQ-5PW(20)层析纯化，收集纯品。
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