JPH04502465A

JPH04502465A - ヒトインシュリン類似物質

Info

Publication number: JPH04502465A
Application number: JP2501698A
Authority: JP
Inventors: バルシュミット，ペル; ブランエ，イェンス　イェルゲン　ファイルガールド
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1992-05-07
Also published as: ATE178908T1; DE68928917T2; NO912438L; CA2006578A1; ATE175974T1; EP0861851A1; EP0375437A3; FI913037A0; US5164366A; CN1043719A; EP0375437B1; NZ231936A; EP0837072A2; EP0837072A3; ES2134669T3; DE68928971T2; EP0375437A2; ATE170875T1; NO301483B1; AU641631B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトインシュリン類似物質技術分野本発明は溶液において低い会合能力を示す新規ヒトインシュリン類似物質、このようなインシュリン類似物質の調製方法、本発明のヒトインシュリン類似物質を含むインシュリン製剤およびこれらのヒトインシュリン［１物質を使用する糖尿病の処置方法に関する。

背景技術１９２２年のインシュリン発見以来ずっと、多くの異なったタイプのインシュリン製剤が糖尿病の治療に使用されてきている。当初はインシュリン活性を迅速に開始しそして比較的迅速に終わらせるインシュリン溶液のみを使用していたが、後にはたとえば亜鉛塩および／またはプロタミンのような添加剤を用いてインシュリンの溶解性を低めることにより得られたより広い活性プロフィールを示すインシュリン製剤が作られるようになった。入手性の理由からこれに使用されるインシュリンは家畜たとえば最も頻繁にはウシ、ブタおよびヒツジからの膵臓から取り出されていたが、しかしながら最近ではバイオチクノロシイによるヒトインシュリンを含む製剤もまた市場に現われてきている。

ヒトインシュリンの構造は以下の式で示される：Ｂ−鎖（続き）ある種の家畜からのインシュリンはヒトインシュリンと構造的に非常に似ている。すなわちイヌおよびブタインシュリンはＢ鎖の３０位にＡｌａを含むことだけがヒトインシュリンと異なり、ウサギインシュリンは同じ位置にＳｅｔを含むことだけが異なる。これらのインシュリンは、モリハラら（Ｍｏｒｔｈａｒａｅｔ、ａｌ）、　Ｎａｔｕｒｅ　２８０　（１９７９）、　４１２　４１３およびマルクッセンＭａｒｃｕｓｓｅｎ　（米国特許第４．３４３，８９８号）により記載された半合成法によりＢ５０−アミノ酸残基をＴｈｒで置換することによりヒトインシュリンへ転化されうる。

このようなインシュリンが生理学的ｐＨ値で溶解する場合、濃度依存性会合平衡は単量体、二量体、四量体、六量体の間および重合体インシュリンの間でも確立される。平衡は、たとえば超遠心分離、浸透圧法またはゲル濾過法により測定され、これはたとえばアール、ヴアルデスジュニア（Ｒ，ＶａｌｄｅｓＪｒ、）およびシイ、ニー、アッカーズＧ、Ａ、＾ｃｋｅｒｓＳ”メリーズインエンザイモロジ４　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙ＊ｏｌｏｇｙ）’、Ｖｏｌ、６１（エンザイムストラクチュアＥｎｚｙ＋ｗｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、バートＨ０著：ヒルスアンドティマシェフ旧ｒｓ　＆　Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ）　、アカデミツクブレス１９７９．　ｐ１２５−１４２を参照せよ。インシュリン製剤の一般的配合においてこの平衡は非常に高程度のインシュリンが六量体形であるようにシフトされる。

インシュリン分子における置換基は、糖尿病の治療においてインシュリンの活性プロフィールを向上する目的で導入されうる。すなわち、公開国際出願筒Ｎｏ　８６１０５４９７号には、インシュリン分子における中性アミノ酸残基によるＧｌｕの１個以上の置換が、注射後のゆっくりした放出が得られるようにインシュリンの沈澱ゾーンのシフトを起こすことが記載されている。

さらに、公開ヨーロッパ出願第Ｆ！Ｐ　２１４１１１２６号には注射後に特に迅速に吸収されるインシュリン類似物質が記載されている。この効果は、インシュリン分子にて８９−８１２の領域およびＢ２６−８２８位における特にある種の置換基によりインシュリンの会合傾向が抑制されやすく、このためほとんど単量体または二量体として存在することの結果である。しかしながらこれらインシュリン類似物質の多くは低い生物活性を示す。

長年の間、活性における構造の影響を明らかにする目的で、非常に多数の人工的に作られたヒトインシュリン類似物質が記載されており、これらはたとえばメルケら（Ｍｉｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋、　３６０　（１９７９）、１６１９−１６３２を参照せよ、レセプター結合におけるインシュリンの（Ｂ２２−８２６）−配列での置換基の影響の研究は、前記配列がインシュリンレセプターに対する結合の実質的部位であると考えられそして天然産生突然変異体が前記部位において置換基を備えていることが見出されたので、特に興味深いものである。

たとえばニス、シェールソンら（Ｓ、５ｈｏｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、ＰＮＡＳ８０　（１９８３）、　７３９０−７３９４およびエム、コバヤシら（Ｍ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔ　ａｌ、）　：　Ｂｉｏｍｅｄ、Ｒｅｓ、５　（３）（１９８４）、　２６７−２７２を参照せよ。

非常に低い生物学的活性がＰｈｅ　（Ｂ２４）またはＰｈｅ　（８２５）が置換された類似物質について見出され、したがってこれら２つのアミノ酸の存在がレセプター結合に対しきわめて重要であることが結論された。

本発明は、アミノ酸残基（ｐ　ｈｅ　ｌ　ｌ　ａ　）または〔Ｐｈｅ′〕の１つが存在しないある種のヒトインシュリン類似物質が溶液において低い会合傾向を示し、同時にヒトインシュリンよりもインビトロでの生物学的活性が変わらないかまたはそれ以上であるという驚くべき認識に基づ＜、（Ｐｈｅ”’　）または（Ｐｈｅ”’　）のいずれかの欠失は（Ｌｙ　ｓ　＊　”　ｑ　）が（Ｌｙｓｌ！Ｉ　）へ移動するという効果を有する。ヒトインシュリン分子におけるこの部位での陽電荷の位置は本発明の重要な見地であると考えられる。

発明の要約最も広い見地において、本発明は８２８位すなわち（に１ｙｌｆｆｉｏ）から計算してＢ鎖における８番目の位置において陽性に帯電されたアミノ酸残基、すなわちＬｙｓまたはＡｒｇが存在するヒトインシュリン類似物質に関連する。

本発明インシュリン類似物質は驚くべきことに低い会合傾向を有し、同時に低会合傾向を有する他のインシュリン類似物質と比べて向上した物理的安定性を示す、８２８位における陽電荷の導入は２つの方法で行なわれる。ヒトインシュリン分子におけるＢ２４　、　Ｂ２５　、　Ｂ２６　、　Ｂ２７または８２８位のアミノ酸残基の１つを欠失して８２８位にＬｙｓを有するヒトインシュリン類似物質とするかまたはヒトインシュリン分子における〔Ｐｒｏｌｔｌ′〕をＬｙｓまたはＡｒｇで置換するかのいずれかである。Ａｒｇが８２８位で好ましい場合、Ｂ２４　、　Ｂ２５　、　Ｂ２６　、　Ｂ２７または８２８におけるアミノ酸残基の１つの欠失をもとからの〔ＬｙｓＩ１ｇ′〕のＡｒｇ残基との置換と組合わせる。

本発明ヒトインシュリン類似物質はさらにヒトインシュリンと比べてＢ鎖のＣ末端に１つ以上の変性を含む。すなわち、Ｂ２５から８２７位のアミノ酸残基および（Ｌｙｓ””　）または（Ａ、ｇｌ！ｌ　）に続くアミノ酸残基を天然産生アミノ酸残基の間から任意に選択するかまたはＢ２９もしくはＢ３０またはその両方ともを欠失させてもよい。

本発明の一つの見地において、（Ｔｙｒ”’　）は、側鎖における二番目の炭素原子（Ｃｒ）がｓｐ冨−ハイブリッド化された（結合は平面構造を有する）別の非帯電アミノ酸残基により置換されてもよい。

化学的分解に対し分子を安定化する目的で、Ａ２１位および／または８３位におけるＡｓｎをさらに別のアミノ酸残基で置き換えてもよい。

本発明インシュリン類似物質は、次式Ｉ：Ｂ−鎖（続き）Ｘｒ−Ｘｚ−Ｘｓ−Ｘａ−Ｘｓ−Ｘｈ（式中、Ｘｌ、Ｘｚ、Ｘｘ、Ｘｓ、Ｙ＋およびＹｔはいずれかの天然産生アミノ酸残基であり、Ｘ４はＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘ。

はＣ末端ヒドロキシ基を有する天然産生アミノ酸残基または−ＯＨであり、またはＸｓおよびＸｈは一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成する）で表わされることが特徴的である。

天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される。

上記式においてＹｌおよび／またはＹ２は一実施態様において＾ｓｎを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される。

上記式ＩにおいてＸｌは特にＰｈｅ、　Ａｌａ、　Ｈｔｓ＋　Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ。

ＡｓｎまたはＴｙｒであり、Ｘ２は特にＴｙｒ、　Ｔｈｒ、　Ｇｌｕ、＾Ｓｐ＋＾ｌａ、旧ｓ、　ＳｅｒまたはＰｈｅであり、Ｘ、は特にＰｒｏ、　Ｇ１ｕ＋＾ｓｐ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒまたは旧Ｓであり、Ｘ、は特にＬｙｓ、　Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ、＾ｌａ、　ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ６は特にＴｈｒ−ＯＲ、５ｅｒ−ＯＲ、＾１ａ−ＯＨ、Ａｓｐ−ＯＲ。

Ｇｌｕ−ＯＨまたは一〇Ｈであり、Ｙｌ　はＡｓｎ、　Ｇｌｕ、　ＡＳＩ）、　ＨＩＳＩ　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｖａｌ＋　Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ。

＾１ａ、　Ｍｅｔ、　Ｔｒｐ、　Ｔｙｒ、　ＧｉｎまたはＧｔｙ、特に好ましくはＧｕｙ。

Ａｓｐ、　ＧｌｕまたはＡｌａであり、Ｙｔは＾ｓｎ＋　Ｇｌｕ、　Ａｓｐ、　Ｒｉｓ、　Ｓｅｒ＋　Ｔｈｒ、　Ｖａｌ＋　Ｌｅｕ、　ｌｉｅ。

Ａｌａ、　Ｍｅｔ＋　Ｔｒｐ＋　Ｔｙｒ＋　ＧｌｎまたはＧｕｙ　、特に好ましくはＧｌｕまたはＡｓｐである。

本発明ヒトインシュリン類似物質の一群は、Ｂ２４または８２５位におけるアミノ酸残基の１つが欠失し、８２６位におけるアミノ酸残基が場合によりγ位の炭素原子が−ｓ　ｐ　１−混成である別の非帯電アミノ酸残基により置換され、場合によりＡ２１　、　Ｂ　３および８３０位のアミノ酸残基の１つ以上がヒトインシュリンにおける相当する位置でのアミノ酸残基と異なり、そして場合により８３０位にアミノ酸残基が存在しないようなものが特徴的である。

より簡単な定義によれば、このような類似物質は［７ｙｒ１ｍ＆］が存在せず、（ｐ　ｈｅ　ｌ　ｔ　Ｓ　）が１位の炭素原子がｓ　ｐ　２−混成である別の非帯電アミノ酸残基により場合により置換され、Ａ２１　、　Ｂ　３および８３０位のアミノ酸残基の１つ以上が場合によりヒトインシュリンにおけるアミノ酸残基と異なり、そして場合により８３０位におけるアミノ酸残基が存在しないヒトインシュリン類似物質である。

Ｃ１がｓ　ｐ　Ｒ−混成である非帯電アミノ酸残基の例はＴｙｒ。

Ｐｈｅ、　Ｈｉｓ、　Ｔｒｐおよび＾ｓｎである。

特性がほとんど変わらない場合、上述のヒトインシュリン類似物質において別の置換または誘導化を導入することもできる。このような別の誘導化はカルボキシル基のエステル化もしくはアミド化、アミノ−もしくはヒドロキシル基のアシル化もしくはアルキル化であるか、またはカルボキサミド基の脱アミド化である。

別の置換は旧Ｓによる（　Ｔｈｒ”）の交換またはＡｓｐによる（　Ｈ４５１１１１３の交換である。さらに、好ましくはＢ鎖のＣ末端および／またはＮ末端でのアミノ酸残基の１個または多数個を添加または欠失することもできる。

本発明によるヒトインシュリン類似物質の一群は、以下の式■で示される構造を有するもので、該式中ＸはＴｙｒ、　Ｈｉｓ＋Ｐｈｅまたは＾ｓｎを意味し、ＹはＴｈｒ＋　Ｓｅｒ＋　Ａ１ａ＋　ＡｓｐもしくはＧｌｕまたは欠失を意味しそして場合により下線を引いたＡｓｎの１つまたは両方ともが置換または脱アミド化によりＡｓｐへ変えられるかまたはＡ鎖における下線を引いたＡｓｎがｃｔｙであるものである。

Ｈ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ＩＢ−鎖（続き）Ｘ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｙ−ＯＨ本発明による好ましいヒトインシュリン類似物質は次のものである：デス（ｐ　ｈｅ　Ｉ　ｔ　％　）−ヒトインシュリンデス（７ｙ、１ｔ＆　）− ヒトインシュリンデス〔ＴｈｒＩ！７〕−ヒトインシュリンデス（Ｐｒｏ″！ＩＩ　）−ヒトインシュリンデス（ｐｈｅｌ、ｓ　）−ブタインシュリンデス（ｐｒｏ■１７　）−ブタインシュリンデス（ｐｒｏＩ！Ｉ　）−ウサギインシュリンデス（Ｐｈｅ”’　）　、デス〔Ｔｈｒ１３ｏ〕−ヒトインシュリンデス（１ｙｒ１ｔ＆　）、デス（ｒｈｒｌ！１１　）−ヒトインシュリン（Ｓｅ、Ａｌｌ　）−デス（ｐ　、ｏ　ｌ　＊　Ｉ　）−ヒトインシュリン（Ｇｌｙ”’　）− デス（Ｐｒｏ”″”〕−ヒトインシュリン（Ｇ　１　ｙ　Ａ　！　＋　）−デス（ｐ　ｈ　ｅ　ｌ　ｔ　Ｓ　）−ヒトインシュリン（Ａｓ、Ａｌｌ　）−デス（ｐ　ｈ　ｅ　ｍ　Ｚ　Ｓ　）−ヒトインシュリン〔旧ｓ１５〕−デス（Ｔｙｒ” ”　）　、デス（７ｈｒ１３６　）−ヒトインシュリン〔＾ｓｎｌ１ｇｓ〕−デス（７ｙｒＩ！６　）、デス（７ｈｒｌ！１１　）−ヒトインシュリン（Ａｓ、Ａｌｌ　）−デス（Ｐｈｅ”’　）　、デス（７１，ｒ１３６　）−ヒトインシュリン（ＡｓｐＩｔ＠　）−デス〔Ｐｈｅｌ１２５〕−ヒトインシュリン（Ａｓｐ”） −デス（ｐ　ｈｅ　１１　Ｓ　）−ヒトインシュリン（ＬｙｓＩ□ｚ８〕−ヒトインシュリン（ｌｙ’ｓｌ！ＩＩ、　７ｈｒｌ！！　）−ヒトインシュリン（Ａｒｇ″ｔｓ　）−デス〔Ｌｙｓｌｔ９〕−ヒトインシュリン本発明によるヒトインシュリン類似物質は、会合能力の低下により通常使用される皮下注射の後ばかりでなく非−腸管外投与の後もまた本来のインシュリンに比べて血流により迅速に吸収されるので、糖尿病の治療に有利に使用される。たとえば、公開国際出願第−ｏ　８７１０６１３７号参照。またこれらの向上した物理的安定性により、これらが糖尿病治療においてさらに有利になる。

本発明によるインシュリン類似物質は、所望のアミノ酸残基置換基をコードするコドンにより天然ヒトプロインシュリン遺伝子における適当な部位のコドンを置換するか、および／または所望の欠失に相当するコドンを欠失させることによりプロインシュリン遺伝子を変化させることで調製される。

これとは別に、所望のインシュリン類似物質をコードする全ＤＮＡ配列を合成することもできる０次いで所望のインシュリン類似物質をコードする遺伝子を適当な発現ベクターへ挿入し、これは適当な宿主微生物たとえば大腸菌、バチルス菌または酵母へ移されると所望の産生物を生ずる０発現産生物は、これが細胞から分泌されるか否かに応じて細胞からまたは培養ブロスから単離される。

新規インシュリン類似物質はまたメルキら（Ｍｉｒｋｉ　ｅｔ　ａｌ、）により記載された方法（ホッペーセイラーズＨｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓＺ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｓ＋、、　３６０（１９７９）、　１６１９−１６３２）による化学的合成によっても調製される。これらはまた適当なアミノ酸残基置換基および欠失を含む別々にインビトロで調製されたＡ鎖およびＢ鎖から形成され、その後修飾されたＡ鎖およびＢｌ［を公知方法によるジスルフィド橋を確立することにより一緒に結合する（たとえば、チャンスらＣｈａｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ、、リックディエッチＲｉｃｋ　Ｄｌ、グロスイーＧｒｏｓｓ　Ｅ（著）ペプチド：合成−構造−機能。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｖｅｎｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｖｐｏｓｉｕｍ、イリノイ州、ｐｐ７２１−７２８）。

インシュリン類似物質はさらにヨーロッパ特許出願第０１６３５２９Ａ号と記載された方法と同じ方法で調製され、この記載はここに参考として編入される。このような方法により、８２Ｂおよび８２９位の塩基性アミノ酸（もし最終生成物がこの位置に塩基性アミノ酸を有すべき場合）がペプチド結合または可変長のペプチド鎖のいずれかによりに１．ＡＩと結合しているヒトインシュリン類似物質のインシュリン前駆体が正しい位置にジスルフィド橋を有して酵母により発現され分泌され、そして次いでモリハラ法（モリハラ、同上）またはいわゆるペプチド転移反応（米国特許第４３４３８９８号参照）により所望のヒトインシュリン類似物質へ転化される。

したがって本発明インシュリン類（以物質は、当該インシュリン類似物質の前駆体をエンコードするＤＮＡ配列を、これが酵母へ移された時に適当な普通培地中で形質転換された酵母菌株を培養するとペプチド結合まば次式■−Ｒ，，−Ｒ’ 　−（ＩＩＩ）（式中、Ｒはｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、ｎはＯ〜３３の整数であり、Ｒ１はＬｙｓまたはＡｒｇである）で表わされるペプチド鎖により［１ｙｓｌ！ＩＩ　３　、（４ｒｇＩ！ａ　）。

（Ｌｙｓｌ！？　）または（Ａｒｇ”９］がに１ｙＡｌ！ｌ　と接続するインシュリン１！伯物質の前駆体を発現および分泌しうる適当な酵母発現ビヒクルへ挿入することにより調製されるものである。

次いで前駆体を培養ブロスから回収し、米国特許明細書箱４．３４３．８９８号（その記載は参考としてここに編入される）に記載のように、次式■ Ｑ−ＯＲ”　（ＩＶ）（式中、Ｑは１個のアミノ酸残基好ましくはＴｈｒまたはジペプチドであり、Ｒｒｒはカルボキシ保護基（たとえばメチルまたはｔｅｒ　ｔ−ブチル基）である）で表わされるアミノ化合物と水および有機溶媒の混液中触媒としてトリプシンまたはトリプシン様酵母を用いて反応させ、それからカルボキシ保護基を除き、インシュリン類似物質を反応混合物から単離する。

インシュリン類似物質がＢ鎖においてＣ末端残基としてＬｙｓまたはＡｒｇと異なるアミノ酸残基を含む場合、これらはまた公開ヨーロッパ出願第ＥＰ　１９５６９１号に記載された方法と同じ方法により調製され、その記載は参考としてここに編入される。この方法により塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）の１対からなるＡ鎖およびＢ鎖間の橋を有するタイプのインシュリン類似物質前駆体が酵母中で作られ次いで酵素転化によりインシュリン類似物質へ転化される。

ＢＩ［におけるＣ末端アミノ酸残基がＬｙｓまたはＡｒｇである場合、インシュリン類似物質はトリプシンを用いた酵素開裂により前記生合成前駆体から構成される装置換基がＢ鎖のＣ末端に最も近い最後のアミノ酸残基内にのみ存在する本発明のヒトインシュリン類似物質はさらにそれ自体公知の方法でたとえばケイ、イノウニら（Ｋ、ｒｎｏｙｅ　ｅｔａｌ、）　：　ＪＡＣＳ　１０１　（３）、（１９７９）、　７５１−７５２に記載のようにブタインシュリンからさらに調製され、これによればブタインシュリンを最初にトリプシンで分裂させてデス− （Ｂ　２３−３０）−ヒトインシュリンとしその後で後者を所望のアミノ酸配列を有する合成ペプチドと酵素的に結合させる。

本発明インシュリン類似物質は、当該技術でこれまで知られているインシュリン製剤中にヒトまたはブタインシュリンと置き換えられるべきインシュリン活性を有する新規インシュリン製剤の調製に使用される。このような新規インシュリン製剤は本発明によるインシュリン類似物質またはその薬剤上許容されうる塩を、好ましくは中性ｐＨにて水溶液または懸濁液中に含有する。水性媒体はたとえば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはグリセロールで等張化される。さらに、水性媒体は亜鉛イオン、緩衝剤たとえば酢酸塩およびクエン酸塩および保存剤たとえばｍ−クレゾール、メチルパラベンまたはフェノールを含む。調製剤のｐＨ値は所望の値に調整されそしてインシュリン製剤は滅菌濾過により滅菌される。

本発明インシュリン類似物質はまた遅延性インシュリン活性を有する別のインシュリン類似物質と混合して迅速作用および遅延インシュリンの混合物からなるインシュリン製剤を調製する。

本発明のインシュリン製剤は公知インシュリン製剤の使用と同様に使用されうる。

学術用語アミノ酸について使用される記号はＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４３（１９８６）、　３５５Ｂに記載されたものである。アミノ酸はＬ型装置である。特記しない限り、ここに記載したインシュリンの種類はヒトである。

図面の簡単な説明本発明は添付の図面を参考にしてさらに説明される。

第１図は発現プラスミドｐＹＧＡＢＡ　１４２７６を表わし、第２図は酵母ベクターｐＡＢ２４を表わし、第３図はプラスミドｐＫＦＮ　−８６４からの０．４ｋｂ　ＥｃｏＲｒ−ＸｂａｌフラグメントのＤＮＡ配列を表わし、第４図は発現プラスミドｐＫＦＮ−８６６の調製を表わす。

詳細な説明修飾されたインシュリン前駆体をエンコードするＤＮＡ配列を、発現カセット中で塩基とともに構築する。前記カセットは第１図に示すように発現プラスミドｐＹＧＡＢＡからのＢａｍＨＩ制限フラグメントに含まれ、１１０３塩基対の長さを有しそして実質的に次のものを含む（５′末端から出発して連続的に挙げるン：　ＧＡＰｒ）Ｈプロモーター（トラビスらＴｒａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ＋、、　２６０　（１９８５）、　４３８４−４３８９）とこれに続（次のものからなるコード領域：クルジャンおよびヘルスコウィッッ（Ｋｕｒｊａｎ　＆　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）により記載されたように野生型酵母ＤＮＡ−配列によりエンコードされたＭＦＩｙｌ−リーダー配列の８３Ｎ末端アミノ酸とこれに続＜　ＬｙｓおよびＡｒｇをエンコードする２つのコドンＡＡＡおよびＡＧＡおよび再びインシュリン前駆体一本鎖デス（７ｈｒｌｆｆｌ＋　３ −ヒトインシュリン（ＳＣＩ）に対するコード領域であって、これは好ましい酵母コドンを用いて合成的に構築された遺伝子である。２つのストップコドンの後に、５ａｉｌ制限部位が位置し、そして配列の停止はターミネーター領域を含むＭＰ、１配列を構成する。配列は全く一般的な技術を用いて構築される。

使用した方法は“オリゴヌクレオチド特定部位の突然変異誘発”であり、これはシラーとスミス（Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｓｍ１ｔｈ）、ＤＡＮ、　Ｖｏ１３．　Ｎａ６（１９８４）、４７９−４８８により記載されている。

方法を以下に簡単に記載し、例１において十分に記載する。

インシ工リン前駆体配列を発現プラスミドから単離しそして一重鎖ゲツム、環状Ｍ１３バクテリオファージベクターへ挿入する。化学的に合成された相補的ＤＮＡストランドをアニールして一重鎖ゲツムとする。ＤＮＡストランドは環状ＤＮＡにおいてインシュリン配列と完全に均質な配列により囲まれた所望の配列を含む。次いでプライマーをタレノウポリメラーゼを用いて生化学的に環状ゲノムの全長までインビトロで延長する。このストランドは一重鎖ファージのもとであり、これを大腸菌中で増殖すると所望の配列を有する二重鎖ＤＮＡを単離することができる。この二重鎖ＤＮＡから制限フラグメントを単離しそして発現ベクターへ再度挿入する。

発明の実施態様本発明をさらに次の例により説明する。

実施例１デス（Ｐｈｅ”ゝ）−５ＣＩを発現するために使用される発現プラスミドの構築Ｂａｇ旧制比制限フラグメント上現プラスミドｐＹＧＡＢＡ　（第１図に示す）に含まれる発現カセットを単離した二発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＢａｍ１ｌｌ　とともにインキュベートした。条件は次のようであったニブラスミド２０可、Ｂａ＊ＨＩ３０単位、１００５Ｍ　Ｍａｃｅ　、　５０ｍｍＭ　トリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ？、５．１０ｗＭＭｇＣＩ！□およびｂ＋＋Ｍ口ＴＴ、　１００Ｉ！！容量中。温度３７°Ｃおよび反応時間２時間であった。２つのＤＮＡ−フラグメントは１％アガロースゲル上で分離そして所望のフラグメントを単離した。

Ｍ１３ベクターＭ１３鋼ｐｌＢへの連結単離した制限フラグメントを、以下の反応混合物中にて制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切断されたバタテリオファージベクターＭ１３ｍｐ１８へ連結した二フラグメント０．２Ｎ、ベクター０．０２ｇ　、　５０１１１Ｍ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，４，１（１ｗＭ　ＭｇＣｊ！ｚ＋　１０ｇＭＤＴＴおよび１ｍＭ　ＡＴＰ、　２０１１１容量中、この混合物５Ｉを大腸菌株ＪＭ　１０１へ形質転換した。ベクターにおけるフラグメントの存在およびフラグメントの配向は、形質転換体から単離される二重１１Ｍ１３−ＤＮＡにおける制限酵素マツピングにより測定された。

一重鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（鋳型）の単離上記の形質転換体から、ｓｓ　−ＤＮＡをメッシングＭｅｓｓｉｎｇ＋Ｇｅｎｅ、　１９　（１９８２）、　２６９−２７６に記載された方法にしたがって単離した。

突然変異体プライマーの５′ホスホリル化配列５　’　−ＴＴＧＧＡＧＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴ−３’を有する突然変異体プライマーを、７０ｍＭ　）リス−〇Ｃｆ、ｐＨ７，０、１０＋＋＋Ｍ　ＭｇＣｌ　ｔ。

５ｍＭ口ＴＴ、　１ｍＭ　ＡＴＰ、　１００１００ｐオリゴヌクレオチドおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３．６単位を含む反応混合物３０ｍ中５′−末端でホスホリル化した。反応を３７°Ｃで３０分間行なった０次いで６５℃で１０分間反応混合物をインキュベートすることにより酵素を不活化した。

鋳型およびホスホリル化突然変異体プライマーのアニーリング鋳型およびプライマーのアニーリングを、鋳型０．５ピコモル、プライマー５ピコモル、２０ＩＩＭトリスー１１ｃｆ、　ｐＨ７，５，１０５Ｍ　ＭｇＣｊ！　ｚ、５０ｍＭ　Ｍａｃｅおよび１ｍＭ　ＤＴＴを含む１０ｐ！容量中１０分間６５℃にて加熱し、その後Ｏ″Ｃまで冷却することにより実施した。

延長／連結反応：上記反応混合物へ、以下の混合物１０ｉｌｌを加えた：　０．３ｍＭｄＡ丁Ｐ、０．３讃Ｍ　ｄＣＴＰ、０．３ｍＭ　ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ　ＴＴＰ、１ｓ＋Ｍ　ＡＴＰ、２０＋ｓＭトリスーＨＣ１，ｐＨ１，５，１０ｗＭ　ＨｇＣ１ｔ、　１０５Ｍ　ＤＴＴ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ３単位およびタレノウポリメラーゼ２．５単位０次いで反応を１６時間１６°Ｃで行なった。

ＪＭ　１０１の形質転換上記反応混合物を標準的技術を用いてＣａＣｊ！ｚ処理大腸菌ＪＭ　１０１細胞へ異なった稀釈度で形質転換し、２ＸＹＴ寒天プレート上の２ｘＹＴ）ツブ寒天にプレートした。（２ＸＹＴ＝）リブトン１６ｇ＃！酵母抽出物１０ｇ／／！、ＮａＣｆ　５ｇ／１．２ＸＹＴ）ツブ寒天＝０．４％アガロースを添加しそしてオートクレーブした２ＸＹＴ。

２ＸＹＴ寒天プレ一ト＝２％寒天を添加しそしてオートクレーブした２ＸＹＴ、）プレートを３７°Ｃで一晩インキユベートした。

陽性クローンの同定化使用された方法はプラーク−リフトハイブリッド法であり、これは次のように記載されている：ニトロセルロースーフィルターを適当なプラーク密度を有するプレート上に置き、これによりフィルターを湿らせた。次いでフィルターを以下の溶液中に浸した：　１．５Ｍ　ＮａＣｊ！、　０．５Ｍ　Ｎａ０ｆｌ　３０秒間、１．５ＭＮａＣ１，０，５Ｍ）リス−ＨＩＪ、　ｐｉ（８，０、１分間、２ｘｓｓｃ（０，３Ｍ　’ＮａＣｊ！　、　０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）後で使用するまで。フィルターを３ＭＭ濾紙上で乾燥しそして真空炉中８０℃で２時間焼付けた。

配列５　’　ＴＴＧＧＡＧＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴ−３’を有する突然変異プライマーを、７０１℃ＭトリスーＨＣｊ！、　ｐＨ７，５，ＩＯ＋ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、　５ｓＰＩＤＴＴ、　１０ピコモルオリゴヌクレオチド、２０ピコモルｒｓａｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３６５単位を含む３０ｄ容量中にて５′末端に放射活性を標識化した。混合物を３０分間３７°Ｃでインキュベートし次いで１００℃で５分間インキュベートした。

乾燥したフィルターを、５　Ｘ５ＳＣ，０，２％ウシ−血清アルブミン、０６２％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ナトリウム−ドデシル −スルフェート（ＳＯ５）および５０ｎ／ｄサーモン精子ＤＮＡ中で６５°Ｃにて２時間プレハイブリッド化した。次いで、標識化されたプローブを含む反応混合物を新しいハイブリッド化した混合物１５ｄへ加え、フィルターをおだやかに振とうしなから２８°Ｃで一晩これへ浸した。ハイブリッド化後、フィルターをそれぞれ１５分間２　Ｘ５ＳＣ４０，１％ＳＤＳ中で３回洗浄し、オートラジオグラフィを行なった。

同じ溶液でしかしながら今回は５２°Ｃで洗浄し別のオートラジオグラフィを行なった後、突然変異体プライマーに対し相補的なりＮＡ配列を含むプラークを同定した。

陽性クローンの再スクリーニング：同定されたクローンがへテロ二重鎖の結果のため、プラークを再びプレートした。ハイブリッド法および同定を繰り返した。

二重鎖Ｍ１３−ファージＤＮＡの精製再スクリーンしたクローンを大腸菌株ＪＭ　１０１の感染に使用した。はぼ１０ ”個のファージとＪＭ　１０１のコロニー５個を含む培養物を２ＸＹＴ培地５ｄ中３７℃にて５時間増殖した０次いで二重鎖の環状ＤＮＡを、ビルンボイムとドリー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　＆Ｄｏｌｙ）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、２　（１９７９）、　１５１３により記載された方法にしたがってペレットから精製した。

修飾インシュリン前駆体を含む制限フラグメントの単離上述で単離されたＤＮＡ調製物（約５１！ｇ）を、１００＊Ｍ　ＮａＣｌ　。

５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　、　ｐＨ７，５、１０ｗＭ　ＭｇＣｊ！　ｔおよび１ｍＭ口ＴＴの６０ｄ中２時間３７°Ｃにて制限エンドヌクレアーゼＢａ５ＨＩ　１０単位で消化した。ＤＮＡ生成物をアガロース−ゲル上で分離し、フラグメントをゲルから精製した。

酵母ベクターｐＡＢ２４　（第２図）への連結：単離した制限フラグメントを、以下の反応混合物中にて制限エンドヌクレアーゼＢａｇ旧で消化された酵母ベクターｐＡＢ２４と連結した：フラグメント０．２　ｎ、ベクター０．０２ｑ　、　５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ７，４、１０ｗＭ　ＭｇＣｊ！　、、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　１ｍＭ　ＡＴＰ、総量２０１．この反応混合物５Ｉを大腸菌株ＭＣ１０６１の形質転換に使用し、ここで修飾された発現プラスミドを同定し増殖させた。プラスミドは欠失したコドンを除いてｐＹＧＡＢＡと同じであった。

酵母の形質転換酵母菌株サッカロミセスセレヴイシアエＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＪＣ４８２ΔｐｅｐΔＬｅｕ　２ｃｉｒ’　（ａ　＋　ｈｉｓ４＋　ｐｅｐｔｕｒａ３＋　１ｅｕ２＋　ｃｉｒ”　）への発現プラスミドの形質転換は、イトウら（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｊ、Ｂａｃｔ、、　Ｖｏｌ、１５３．　Ｎｏ、１．（１９８３）、　１６３−１６８に記載のように実施された。形質転換された細胞を、ブラスミ含有細胞を選択するために、ＳＣ−ｕｒａ培地（０，７％酵母窒素塩基、２．０％グルコース、０．５％カサミノ酸、２．０％寒天）上にプレートした。

例■ デス（Ｔｙｒ”’　）−５ＣＩの調製に使用されうる発現プラスミドの構築使用される方法は実質的に例■に記載されたものと同じであるが、ただし突然変異誘発プライマーが配列５　’　−ＡＣＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＣＴ−３’を有し、ハイブリッド化温度は３６°Ｃであり、ハイブリッド化後の洗浄温度は６０°Ｃであった。修飾されたプラスミドは欠失されたコドンを除いてｐＹＧＡＢＡと同一の配列を有する。

例■ 〔旧５ｗｆｆ１ｓ　）、デス（Ｔｙｒ”’　）−５ＣＩの調製に使用されうる発現プラスミドの構築使用した方法は例Ｉに記載されたものとほぼ同じであるが、しかし突然変異誘発プライマーは配列５　’　−ＡＡＴＡＣＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧ＾＾＾ＣＣＴＣＴＴＴＣＡＣＣ−３’であり、ハイブリッド化温度は４３°Ｃであり、ハイブリッド化後の洗浄温度は６６°Ｃであった。

修飾されたプラスミドは、修飾されたおよび欠失したコドンを除いてｐＹＧＡＢＡと同じ配列である。

例■ （Ａｓｎ″ｉｓ　）、デス［Ｔｙｒ”６）−５ＣＩの調製に使用されうる発現プラスミドの構築使用した方法は例Ｉに記載されたものとほぼ同じであるが、しかし突然変異誘発プライマーは配列５′−＾ＡＴＡＣＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＣＡＣＣ−３’であり、ハイブリッド化温度は４２°Ｃであり、ハイブリッド化後の洗浄温度は６５°Ｃであった。

例■ 前駆体の発現および培養基からの単離例■〜■に記載のように形質転換された酵母をウラシル不含有最少培地を含むペトリ皿上で３０°Ｃにて４８時間増殖した。

ウラシル不含有最少培地＋５ｇ／２カサミノ酸＋１０ｇ／ｌコハク酸＋３０　ｇ　／　ｆｆｉグルコース、ｐＨ５，０を含む１００ｄ振とうビンに、ペトリ皿からの１つのコロニーを接種した。次いでインキュベーター中３０°Ｃにて７２時間ビンを振とうした。

遠心分離後プールした上澄Ｉｆを濾過により滅菌し、５ＭＨＣｆと水の添加によりＰＨ４−４，５および伝導率＜　１０ｍ５に調整した。予め５０５Ｍ酢酸、５０％（容量）エタノールＮａ０）１でｐＨ４，０まで調節したもので平衡化したＳ／セファロースＯＦＦの１．６Ｘ６ＣＩカラムへ流速１２０ｄ／ｈにて上澄を施こした。カラムを緩衝液６０ｍで洗浄し、次いで前駆体を、緩衝液３６０ｄ中にＮａＣｆ！　Ｏ〜０．３５Ｍの直線状勾配液を用い流速１０ｄ／ｈにて溶出した。溶出液を４ｄのフラクションに分け、ＵＶ吸収率を検出した。前駆体含有フラクションをＲＰ　−ＨＰＬＣ分析により同定しプールした。１Ｍ酢酢酸上セファデックス０Ｇ２５カラムで脱塩後、前駆体を凍結乾燥により単離した。

例■ デス（ｐｈｅＩｔＢ　）、デス（ＴｈｒＩ＋３”　）−ヒトインシュリンの調製例■およびＶに記載された方法により調製されたデス（Ｐｈｅ”’　）　−５Ｃｉ　４００■を４０１ｄの５０ｍＭ　）リス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２０％（容量）エタノールＨＣ１でｐＨ９まで調節したものに溶かし、同じ緩衝液中に固定化したトリプシン３２ｆｆｉｇを含むセファロース＠４０ｉｄ　（沈でん容量）を加えた。懸濁液を緩やかに撹拌しなから８−１０°Ｃにて２４時間懸濁液を放置し、次いで濾過した。ゲルを緩衝剤４０ｄで洗浄し、プールした溶液を、予め５０ＩＩＭトリスー（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５０％（容量）エタノール、８１でｐＨ８，０まで調節したもので平衡化したＱ−セファロースＯＦＦの２．６×７．５ｃ■カラムへ施こした。次いで、流速２２５ｄ／ｈで６時間にわたって、同じ緩衝液中のＮａＣｌ　Ｏ＝０．１５Ｍ直線状勾配液でカラムを溶出した。溶出液をＵＶ吸収について検知し、主要タンパク質ピークを含むフラクションをプールした。減圧下にエタノールを除去後、タンパク質をｐＨ５，４で沈でんさせた。

デス（Ｐｈｅ”’　）　％デス（７ｈ、１１１１１　）−ヒトインシュリン２５０１ｇを凍結乾燥により単離した。

生成物の同定を、アミノ酸分析、プラズマディソープション質量分析および別々にビニルピリジル化したＡｌｌおよびＢ鎖の逐次エドマン分解により確認した。

例■ 、”ス（Ｐｈｅ”’　）−ヒトインシュリンの調製例■で記載した方法により調製されたデス（ｐ　ｈｅ　１　ｔ　％　）、デス（７１，ｒＩｌｌ（１）−ヒトインシュリン２００■を、トレオニンメチルエステル４００■、エタノール２．０　ｄおよび水０．８　ｄを含む混合物中に溶解した。ｐＨ値を酢酸で６．３に調整し、固定化トリプシン３．２■を含むセファロース＠４ｄで（沈でん容量）を加えた。緩やかに撹拌しながら２０°Ｃで２時間放置後、ゲルを濾去し、２− プロパツールＩＯ容量を添加することによりタンパク質を沈でんさせた。風乾した沈でん物を２０曽ｉトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／ｌｌｃ／！、６０％（容りエタノール、ｐＨ８，２５に再溶解し、そして予め前記緩衝液で平衡化した２、　６　ＸｇＯｃｍ　Ｑ−セファロースのＦＦカラムへ施こし、同じ緩衝液中Ｏ〜０．１　Ｍへ増加する直線状ＮａＣｌ−勾配液を用いて１５時間かけ流速１２５ｄ／ｈで溶出した。デス［Ｐｈｅ”’）−ヒトインシュリン−（Ｂ２Ｏ−メチルエステル）ヲ含む７’　−ルされたフラクションから減圧下にエタノールを除き、ｐＨ６、１でタンパク質を沈でんした。懸濁液を遠心分離し、沈でん物を凍結乾燥した。次いで冷０．　］、　Ｍ　ＮａＯＨ中タンパク質濃度１０■／ｄにて１０分間メチルエステルを加水分解した。ＰＦＩ値を８．５に調節することにより反応を停止し、２０ｍＭ　）リス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン／ＨＣｌ　、　ｐＨ８，５の２容量を加えた。次いで溶液を２．６　Ｘ２０ｃｍ　Ｑ−セファロース＠ＦＦカラムへ施こし、上述のように溶出した。エタノールを減圧下に除去後ｐＨ５，５にてタンパク質が沈でんした。

凍結乾燥後にデス（ｐｈ８１２％　）−ヒトインシュリン８０■が得られた。

生成物の同定は、アミノ酸分析、プラズマディソープション質量分析および別々にビニルピリジル化したＡ鎖およびＢ鎖の逐次エドマン分解により確認された。

例■ デス（７ｙｒｌ！＆　）、デス（Ｔｈｒ１３（１）−ヒトインシュリンの調製例■およびＶに記載した方法により調製されたデス（Ｔｙｒ”’　）　−５ＣＩ　２５０＋１ｇを、５０１１Ｍトリス　（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２０％（容Ｉ）エタノール、ＨＣｆでｐＨ９まで調節したちの２５ｙｄに溶かし、同じ緩衝液中固定化トリプシン２０■を含むセファロース＠２５ＩＩＲ（沈でん容量）を加えた。

緩やかに撹拌しながら懸濁液を２４時間８−１０°Ｃにて放置し次いで濾過した。ゲルを緩衝液２５ｄで洗浄し、予め５０ｍＭＦリスー（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５０％（容量）エタノール、ＨＣｆでＰＨ８，０まで調整したもので平衡化したＱ−セファロースΦＦＦの２．６　Ｘ　７．５　ｃｍカラムヘブールした濾液を施こした。次いで同じ緩衝液中のＮａＣｊ！　０〜０．１５Ｍの直線状勾配液を用いて６時間にわたり流速２２５ｄ／ｈでカラムを溶出した。溶出液をＵＶ−吸収について検知し、主なタンパク質ピークを含むフラクションをプールした。エタノールを減圧下に除去後たんばく質はｐＨ５，４で沈でんした。

凍結乾燥によりデス〔Ｔｙｒ１１１６〕、デス（７ｈｒ　＠　３０　）−ヒトインシュリン１３０■が単離した。

生成物の同定はアミノ酸分析および別々にビニルピリジル化されたＡ鎖およびＢ鎖の逐次エドマン分解により確認された。

例■ 〔旧５Ｉｌｌｓ　）、デス（Ｔｙｒ”６）　、デス（７ｈ、！１３０　）−ヒトインシュリンの調製例■および■に記載した方法により調製した（　Ｈｌｓｍｉｓ　）、デス（Ｔｙｒｌ！”　）　−５Ｃ１４５０１ｇを、４５ｄの５０ｍＭ　トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２０％（容量）エタノールｐＨ９までＨＣｆで調節したものに溶かし、同じ緩衝液中に固定化トリプシン３６■を含むセファロース＠４５ｄ　（沈でん容量）を加えた。緩やかに撹拌しながら２４時間８−１０°Ｃにて懸濁液を放置し、次いで濾過した。緩衝液４０ｄでゲルを洗浄し、予め５０ｍＭ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５０％（容量）エタノール、［１でｐｎｇ、ｏまで調整したもので平衡化したＱ〜セファロース＠ＦＰ　２．６Ｘ　７．５　ｃｍカラムへ施こした。次いで同じ緩衝液中のＮａＣｆ！　Ｏ〜０．１５Ｍの直線状勾配液で６時間にわたって流速２２５ａｄ！／ｈで溶出した。溶出液をＵＶ吸収について検知し、主なタンパク質ピークを含むフラクションをプールした。エタノールを減圧除去後タンパク質がｐＨ５，４で沈でんした。

（Ｈ４５Ｉｔｓ　）、デス〔Ｔｙｒ！Ｉｔ６〕、デス（７ｈｒ１３１１　）−ヒトインシュリン２００■を凍結乾燥により単離した。

生成物の同定はアミノ酸分析および別々にビニルピリジル化したＡ鎖およびＢ鎖の逐次エドマン分解により確認された。

例Ｘ（Ａｓｎ１！５　］、デス（７ｙｒＩ！＆　）、デス（Ｔｈｒ″３１１　）−ヒトインシュリンの調製例■およびＶに記載された方法により調製された（Ａｓｎ１！５）、デス（Ｔｙｒ”’　）　−５ＣＩ　１５０１１ｇを、１５〆の５０＋＋＋Ｍ　）リス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２０％（容量）エタノールＨＣ２でｐＨ９まで調節したものに溶かし、同じ緩衝液中固定化トリプシン１２■を含むセフ１０− ス＠１５ｄ　（沈でん容量）を加えた。懸濁液を緩やかに撹拌しなから８−１θ ℃にて２４時間放置し、次いで濾過した。ゲルを緩衝液４０ｄで洗浄し、予め５０ｗＭ　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５０％（容量）エタノール、Ｈ（ＪでｐＨ８，０まで調整したもので平衡化されたＱ−セファロースＯＦＦの１．６　Ｘ　１０ｃｍカラムへ施こした。次いで同じ緩衝液中のＮａＣｌの０ −０．１５の直線状勾配液で６時間かけて流速９０ｄ／ｈにてカラムを溶出した。溶出液をＵＶ吸収について検出しそして主なタンパク質ピークを含むフラクションをプールした。Ｍ圧下にエタノール除去後ｐＨ５，４にてタンパク質が沈でんした。

凍結乾燥により〔＾５ｎＩｔｓ　）、デス（Ｔｙｒ”’　）　、デス（Ｔ　ｈｒ　１１＠　）−ヒトインシュリン８０■が単離した。

生成物の同定はアミノ酸分析および別々にビニルピリジル化されたＡＭおよびＢ鎖の逐次エドマン分解により確認された。

例ＸＩ〔ＡｓｐＡｆｆｉＩ〕、デス（ｐｈｅ０５　）、デス（ｔ　ｈ　ｒ　１３６　） −ヒトインシュリンの調製例■に記載された方法により調製されたデス（Ｐｈｅ”’　）、デス（７ｈｒ　１３１’　）−ヒトインシュリン５０■を、ＩＭＩ（（／！でｐＨ値を２に調節することにより水１０ｄに溶かした０次いで溶液を３０°Ｃで１６時間放置した。冷却（２０″Ｃまで）後、尿素７．５ｇを加え、Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨでｐＨ値８．１まで調節した。次いで、４°Ｃにて予め２０＋＋＋Ｍ　）リス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン／Ｈ（／！、７Ｍ尿素、ｐＨ８，１で平衡化した１、　６　Ｘ２０ＣＩ　Ｑ−セファロースＯＦＦカラムへ溶液を施こし、同じ緩衝液中０〜０．０５Ｍの直線状ＮａＣｆ勾配液で２４時間かけて流速４０ｉｄ／　ｈにて溶出した。最後の溶出ピークからタンパク質を含有するプールしたフラクションを、ＩＭ酢酢酸上セファデックス０６２５カラムて脱塩化しそして凍結乾燥した。

（ＡｓｐＩｌ＋　３、デス（Ｐｈｅ”’　）　、デス（Ｔ　ｈｒ　１３０　）− ヒトインシュリン３０■が得られた。

生成物の同定はアミノ酸分析、５段階エドマン分解およびカルボキシペプチダーゼＡを用いたＣ末端分析により確認された。

例Ｘ■ （Ｓｅｔ”’　）　、デス（Ｐｒｏｏ”）−ヒトインシュリンの調製に使用されうる発現プラスミドの構築および（５ｅｔＡ！Ｉ　）、デス［ｐｒ０１２８　］ −ヒトインシュリンの調製この類似物質をエンコードするｐｏｃ−１９由来プラスミド、ｐＫＦＮ　−８６４は、２つの突然変異プライマーＮ０Ｒ−６４８ＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＧＴＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴＡＧおよびＮｏｒ　−７４５＾ＴＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＣＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＣＡＣＣを用いてプラスミドｐＫＦＮ　 −７３４のギャップした二重突然変異誘発（ワイ。

モリナガら、Ｙ、Ｍｏｒｉｎａｇａ　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｚ　（１９８４Ｌ６３６−６３９）により構築された。プラスミドｐＫＦＮ　−７３４は、プラスミドｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３からの合成インシュリン前駆体遺伝子Ｂ（１−２９）　−Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ−Ａ（１−２１）に骨格融合した合成酵母のシグナル−リーダーをエンコードする０、４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントをｐＵｃ−１９からの２．７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ− Ｘｂｌフラグメントに連結することにより構築された（ヤニッシューベロンらＹａｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　３３（１９８５）＋　１０３−１１９ＬプラスミドｐＬａｃ２１２ｓｐｘ３は例３に記載されており、国際特許出願公開第一０８９１０２４６３号の第６図および第１３図に記載されている。

シグナルリーダーインシュリンＢ（１−２９、デス２Ｂ　Ｐｒｏ）　−Ａｌａ＾ｌａ　Ｌｙｓ　−Ａ（１−２１、２１５ｅｔ）をエンコードするｐＫＦＮ　−８６４からの０．４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＸｂａｌフラグメントのＤＮＡ配列を第３図に示す。

ｐＫＦＮ　−８６４をＥｃｏＲＩとＸｂａ　Ｉで切断し、０．５ｋｂフラグメントをｐＭＴ　６３６からの９．５ｋｂ　Ｎｃｏｌ−ＸｂａｌフラグメントとｐＭＴ　６３６からの１．４ｋｂ　Ｎｃｏｌ　−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結するとプラスミドｐＫＦＮ　−８６６が得られ、第４図を参照せよ。プラスミドｐＭ７６３６は、ＬＥＤ−２遺伝子欠失後の９Ｍ７６０８と９Ｍ７４７９から構築され、第４図を参照せよ。９Ｍ７６０８はヨーロッパ特許第１９５６９１号に記載されている。ｐＭＴ　４７９はヨーロッパ特許第１６３５２９号に記載されている。９Ｍ７４７９はシゾサツカロミセスボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ＋ｌ１ｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ）　、サッカロミセスセレヴイシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　）リオースホスフヱートイソメラーゼプロモーターおよびターミネータ−１ＴＰＩ、およびＴＰｂを含む（アルバー、ティ、　Ａｌｂｅｒ、Ｔ、およびカワサキ、シイ、Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｇ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、上（１９Ｂ２）　。

４１９−４３４）。プラスミドｐＫＰＮ　−８６６は次の配列を含む：ＴＰＩＦ −シグナルーリーダーインシュリンＢ（１−２９、デス２８Ｐｒｏ）−＾１ａ＾Ｉａ　Ｌｙｓ−Ａ（１−２１、２１５ｅｒ）　・ＴＰＩｔサッカロミセスセレヴイシアエ菌株ＭＴ　６６３　（Ｅ２−７ＢＸＥ１１−３６ａ／ａ、Δｔｐｉ　Δ ｔｐｉ、　ｐｅｐ　４　３　／ｐｅｐ４−３）は、ＹＰＧａＬ（１％バクト酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、１％ラクテート）中で６００Ｍｍでの０．Ｄ、が０゜６まで増殖した。

得られた培養物１００ｄを遠心分離により採取し、水１（ｌｄで洗浄し、再度遠心分離にかけ、１．２Ｍソルビトール、２５＋＋＋ＭＮａ、ＥＤＴ＾ｐＨ−８，０および６．７ｅｒｇ／ｄジチオトレイトールを含む溶液１０ａｅ中に再度懸濁させた。懸濁液を１５分間３０°Ｃでインキュベートし、遠心分離しそして細胞を１．２　Ｍソルビトール、１０ｍＭ　ＮａＪＤＴＡ、０．１　Ｍクエン酸ナトリウム、Ｐｔ１＝５．８、および２■ノボザイム■２３４を含む溶液１０ｍに再度懸濁した。懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートし、細胞を遠心分離により集め、１．２Ｍソルビトール１０　ａｌｌとＣＡＳ（１，２Ｍソルビトール、１０５Ｍ　ＣａＣ１，ｚ、１０５Ｍ　）リス１（Ｃｆ（）リス−トリス　（ヒドロキシメチル）アミノメタン）　ｐＨ＝７．５）１０ａｄ！中で洗浄し、ＣＡＳ　２ｄ中に再度懸濁した。形質転換のためにＣＡＳ−再懸濁化細胞０．１　ｄをプラスミドｐＫＦＮ　−８６６はぼ１ｎとともに混合し、室温で１５分間放置した。　（２０％ポリエチレングリコール４０００゜１０ｍＭ　ＣａＣｌ　ｚ、１０ｍＭ　トリスＨＣＩ　、　ｐＨ＝７．５）　１　ｄを加え、混合物を室温でさらに３０分間放置した。混合物を遠心分離しそしてベレットを５Ｏ５（１，２Ｍソルビトール、３３％ｖ／ｖＹＰ口、　６．７ｍＭＣａＣ１！＋　１４ｇ／ｄロイシン）０．１ｄに再懸濁させて、３０゛Ｃで２時間インキュベートした。次いで懸濁液を遠心分離し、ペレットを１．２Ｍソルビトール０．５　ｄ中に再懸濁した。次いでトップ寒天（シェアマンら５ｈｅｒ＋＋ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、のＳＣ培地（メリーズインイーストジェネティックスＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、コールドスプリングハーバーラボラトリイＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８１）１．２Ｍソルビトール＋２．５％寒天を含む）６ｄを５２°Ｃで添加し、懸濁液を同じ寒天固化ソルビトール含有培地を含むプレートの表面へ注入した。形質転換体コロニーを３０°Ｃで３日後採取し、再度単離し液体培養を開始するために使用した。このような形質転換体にＦＮ−８８３の１つが別の特性決定のために選択された。

酵母菌株ＫＦＮ　−８８３をＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン（ディフコラボラトリイーズから）および２％グルコース）上で増殖した。菌株の培養物１０ｄを、６００ｎ−〇〇、Ｄ。

が２０になるまで３０℃で振とうした。遠心分離後、上澄を記載（エル、スネルらり、５ｎｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｈｒｏｗａｔｏｇｒａｐｈｉａ　２４（１９８７）＋３２９−３３２）のようにＨＰＬＣにより分析した。収率はインシュリンＢ（１−２９、デス２Ｂ　Ｐｒｏ）−八！ａ＾ｌａ　Ｌｙｓ　−Ａ（１２１，２１Ｓｅｔ）約０．１４■／／！であった。

一本鎖インシュリン前駆体は、低ｐＨでイオン交換カラムへ吸着させ、高ｐＨで脱着させ、プールしたものを亜鉛イオンにより沈でんさせることにより発酵上澄液から単離した。前駆体の（Ｓｅｒ”’　）　、デス〔Ｐｒｏ１１′〕、（Ｔｈｒ”’　−ＯＭｅ　）−ヒトインシュリンへのペプチド転移反応は次のようであった：トレオニンメチルエステル１０ミリモル（２，３５ｇ　）および氷酢酸をＤＭＦ中に溶かして５１Ｉ１１．とし、７６．５％ｖ／ｖＤＭＦ水溶液２．５　ｄを加えそして前駆体０．５ｇを混合物中に溶かし、これを１２°Ｃに保持した；次いで０．０５Ｍ酢酸カルシウム１．２５．ｄ中のトリプシン５０ＩＩｇを加え、１２°Ｃで２４時間後に反応混合物をペプチド沈でんのためにアセトン１００ｄへ添加し、これを回転させ減圧下に乾燥させた。

単離したインシュリン類似物質エステルを、酸性ｐＨにてシリカ−Ｃ１Ｂマトリツクスを用いて調製用ＨＰＬＣカラム中で精製した。次いで精製したエステルをｐＨ１０で２５℃にて２４時間水性媒体中で加水分解した。形成された［　Ｓｅｒ”’　）　、デス（ｐｒｏｌ！１１　）−ヒトインシュリンを、中性ｐＨにて亜鉛イオンを用いて沈でんさせた。陰イオン交換クロマトグラフィを行ない次いでゲル濾過により脱塩することにより沈でん物を精製した。凍結乾燥した〔５ｅｒＡ！１〕、デス（ｐｒ０１！ｌ　）−ヒトインシュリンの収量は１０２ｇであった。

例Ｘ■ デス（７ｈ、ｌ！？　）−ヒトインシュリンの調製亜鉛不含有ブタインシュリンＩｇをｐＨ値９に調節した水４０ｄに溶かし、そしてアンモニア溶液でｐＨ９に調節した０、２５Ｍ炭酸水素アンモニウム１０ｄ中にブタトリプシン５０■が溶解した液を加えた０次いで溶液を４℃で放置し、４８時間後にＨＰＬＣ分析により収率６５％が見出された。次いで、４°Ｃにて０．０５Ｍ炭酸水素アンモニウムにおけるセファデックス＠Ｇ５０スーパーファイン５Ｘ９０Ｃ１１カラム中で流速９０ｄ／ｈにて反応混合物をゲル濾過した。主なタンパク質ピークを含むフラクションをプールし凍結乾燥した。収量はデス（Ｂ２３−Ｂ３０）−ヒトインシュリン５２０■であった。

配列Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｔｙｒ　−Ｐｒｏ　−Ｌｙｓ−Ｔｈｒを有するペプチドを、ＰＡＭ樹脂中にて保護された対称性アミノ酸無水物を用いアプライドバイオシステム社製のペプチド合成装置を用いて合成した。最後に、０°Ｃにて無水フッ化水素によリペプチドを樹脂から分割し、その際残存する保護基も同時に除かれた。

デス（Ｂ２３−Ｂ３０）−ヒトインシュリン２００■およびペプチド４００■を、ジメチルホルムアミド２．４０ｊｌｆと水１．２０ｍの混液に溶かし、そして混液のｐＨをトリエチルアミンで６．５に調節した。水０．２０ｊｄ中のブタトリプシンｌＯ■を加え、反応混合物を２０℃で４時間放置した。次いで２−プロパツール２５ｍを添加することにより反応を停止し、遠心分離により沈でんしたタンパク質を単離した。排水した沈でん物を１Ｍ酢酸１０ｄに再度溶解し、予め３０％（容量）エタノール中の０．５ｍＭ塩酸、０．１Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したりクロプレツブ＠　ＲＰ−１８（２５−４０，ａ）の２．６Ｘ２０Ｑｌカラムへ施こした。次いで２０℃で流速２０ｄ／ｈにて同じ緩衝液であるがただし２４時間にわたってエタノール含有量を５０％まで直線状に増加するもので溶出した。溶出液をＵＶ吸収についてモニターし、主なタンパク質ピークを含むフラクションを集めた。同量の水で希釈しそして水酸化ナトリウム溶液でｐＨ値５．５に調節することによりタンパク質を沈でんさせ、４℃で１時間放置後、遠心分離および凍結乾燥により単離した。

収量はデス（Ｔｈｒ　Ｂ２７）−ヒトインシュリン８０■であり、これは別々にビニル−ピリジル化されたＡ鎖およびＢ鎖の逐次エドマン分解により同定された。

例■ 注射溶液の配合本発明によるヒトインシュリン類似物質６０マイクロモルを０．１？Ｉ　ＨＣｆｆｉ　４１ｄに溶かし、１．５％請−クレゾール２０Ｍ１を加えた。ここで溶液を４％グリセロール４０ｍと６５ａｅＭリン酸水素二ナトリウム２０ｍとともに混合し、ｐＨ値を７．３まで調節した。

最後に溶液を水で１００ｄまで調節し、滅菌濾過を行なった。

例Ｖ会合度の評価セファデックス＠Ｇ−７５の２．６　Ｃ１ｌ　Ｘ　８８Ｃ１１カラムを、１３ｓ＋Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ＰＩＴ７．３で流速２２ｄ／ｈにて平衡化した。

デス−（オクタペプチド−１３１２−３０）−ヒトインシュリン、チトクロームＣ、リボヌクレアーゼおよび分子量マーカーとして単量体と二量体ミオグロビンを施こすことにより、溶出量の関数としての分子量を表わす曲線が描かれた。

０．６ｍＭ　Ｚｎ不含有ヒトインシュリンまたは０．６＋ｓＭインシュリン類値物質を含みそして例Ｘ■に記載のように調製された溶液１Ｍｌを施こすことにより、Ｚｎ不含有ヒトインシュリンが例■〜Ｘに記載されたように調製された！１（Ｉｉ動物質見掛の分子量Ｚ　５　ｋＤを有する対称的ピークとして溶出した。

これらの結果として本発明によるヒトインシュリン類似物質がｐＨ７，３で溶液中で実質的に単量体であり、一方同じ条件下で高い程度までの普通のヒトインシュリンが二量体またはそれ以上のオリゴマーの混合物として現われることが示される。

例ＸＶＩ生物学的活性の評価インビトロでの生物学的活性は、実質的にジエイ、グリーマンＪ、Ｇ目ｅｌｌａｆｌＬ　ニス、ガーメルトフトＳ、Ｇａ＋ｗ＋＋＋ｅｌ　ｔｏｆ　ｔ　：　Ｄｉａ−ｂｅｔｏ１ｏｇｉａ旦（１９７４）、　１０５−１１３に記載されたように、単離したラットのアジボサイトおよびヘパトサイトへのインシュリンレセプターとの結合親和性を測定することにより決定された。

インシュリンＩｆ（Ｅ物質を半合成ヒトインシュリンと比較し、その力を１００％とし、結果を以下の表に示すニアシボサイト　へパトサイトデス（ｐ　ｈｅ　１　Ｒ％　）、デス（７ｈｒ１３０　）−ヒトインシュリン　２２３％　２０１％デス（ｐ　ｈ　ｅ　１２　Ｓ　）−ヒトインシュリン　２２５％　２４９％ＦＩＧ、　１ＦＩＧ、　２ル江ＬｙｓＡ　１　ａＶａ　Ｉ　ＰｈｅＬｅ　ｕＶａ　ｌ　Ｌｅｕｓ＠　ｒＬａｕ　Ｉ　１　ｅＧ　１ｙＰｈｅＣｙｓＴｒｐＡ　１　ａＧｌ　ｎＰｒｏＶａ　１ＴｈｒＧ　１　ｙＡｇｐＧｌ　ｕｓｅｒｓｅｒＶａ　Ｉ　Ｇｌｕ　Ｉ　１　ｅＰｒｏＧｌ　ｕＧｌ　ｕｓ■窒kａｕｌ　１　＠Ｘ　１　ｅ＾１ａＧ１ｕＡｓｎＴｈｒＴｈｒＬｅｕＡｌａ＾ＩＢｙ＋Ｖａｌ入１ａＵ工Ａ１ａＬｙｓ＾ｒｇＰｈｅＶａｌ＾５ｎＧ１ｎ）ｔｆｓＬａｕＣｙｓＧｌｙｓｅｒＨｉｓｌ、ａｕＶａＩＧｌｕＡ１ａＬａｕＴｙｒＬｅｕｖａｌｃｙｓＧｌｙＧ１ｕＡｒｇＧ１ｙＰｈａＰｈａＴｙｒＴｈｒＬｙｓＡ１ａ＾１　ａＬｙｓＧ　１　ｙ　Ｉ　ｌ　ｅｒａ　ＩＧＩ　ｕＧｌ　ｎＣｙ　５ＣｙｓＴｈ　ｒｓｅｒｌ　１　ｅｃｙｓｓｅ@ｒＬｅｕＴｙｒＧｌ　ｎＦＩＧ、　３ＦＩＧ、　’１ＦＩＧ、　ｑ（つづ合）国際調査報告一一一一一一一　ＰＣＴｌｏＫ　１１９７００２％国際調査報告Ｔｈ＆＋ｗ−ｈａ−−−ｎｋｋａｏｓｌｌｗｍａｍｍａ−一−ｂ　ｈｅ−一一− ｗｙｄｈ−

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｂ２８位、すなわち〔ＧｌｙＢ２０〕から計算してＢ鎖における８位において陽性に帯電したアミノ酸残基すなわちＬｙｓまたはＡｒｇを有し、場合によりさらに〔ＰｈｅＢ２４〕からＣ末端アミノ酸残基にかけてのＢ鎖のＣ末端において修飾され、ただしＢ２９位にはＰｒｏはなくそして場合によりＡ２１および／またはＢ３はＡｓｎとは異なることからなるヒトインシュリン類似物質。
２．これらが次式：Ａ−鎖【配列があります】Ｂ−鎖【配列があります】Ａ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】（式中、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ５，Ｙ１およびＹ２はいずれかの天然産生アミノ酸残基であり；Ｘ４はＬｙｓまたはＡｒｇであり；Ｘ６はＣ末端ヒドロキシ基を有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−ＯＨであり、またはＸ５およびＸ６は一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成する）を有するヒトインシュリン類似物質。
３．Ｘ５がＰｒｏを除いたいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される請求項２に記載のヒトインシュリン類似物質。
４．Ｙ１および／またはＹ２がＡｓｎを除いたいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される請求項２または３に記載のヒトインシュリン類似物質。
５．Ｘ１がＰｈｅ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，ＡｓｎまたはＴｙｒからなる群から選択され；Ｘ２がＴｙｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，ＳｅｒまたはＰｈｅからなる群から選択され；Ｘ３がＰｒｏ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＨｉｓからなる群から選択され；Ｘ５がＬｙｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択され；Ｘ６がＴｈｒ−ＯＨ，Ｓｅｒ−ＯＨ，Ａｌａ−ＯＨ，Ａｓｐ−ＯＨ，Ｇｌｕ−ＯＨまたは−ＯＨからなる群から選択され、またはＸ５およびＸ６は一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成し；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，ＧｌｕまたはＡｌａからなる群から選択され；Ｙ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＧｌｕまたはＡｓｐからなる群から選択される請求項２に記載のヒトインシュリン類似物質。
６．Ｘ１がＰｈｅ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，ＡｓｎまたはＴｙｒからなる群から選択され；Ｘ２がＴｙｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，ＳｅｒまたはＰｈｅからなる群から選択され；Ｘ３がＰｒｏ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＨｉｓからなる群から選択され；Ｘ５がＬｙｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択され；Ｘ６が−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，ＧｌｕまたはＡｌａからなる群から選択され；Ｙ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＧｌｕまたはＡｓｐからなる群から選択される、請求項２に記載のヒトインシュリン類似物質。
７．Ｘ１がＰｈｅ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，ＡｓｎまたはＴｙｒからなる群から選択され；Ｘ２がＴｙｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，ＳｅｒまたはＰｈｅからなる群から選択され；Ｘ３がＰｒｏ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＨｉｓからなる群から選択され；Ｘ５およびＸ６が一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成し；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｙ，Ｇｌｕ，ＳｅｒまたはＡｌａからなる群から選択され；Ｙ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＧｌｕまたはＡｓｐからなる群から選択される請求項２に記載のヒトインシュリン類似物質。
８．Ｘ１がＰｈｅであり；Ｘ２がＴｙｒであり；Ｘ３がＴｈｒであり；Ｘ５がＬｙｓであり；Ｘ６がＴｈｒ−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙからなる群から選択されそしてＹ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択される請求項２に記載のヒトインシュリン類似物質。
９．Ｘ１がＴｙｒであり；Ｘ２がＴｈｒであり；Ｘ３がＰｒｏであり；Ｘ５がＴｈｒであり；Ｘ６が−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙからなる群から選択され；そしてＹ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択される請求項２に記載のヒトインシュリン類似物質。
１０．Ｘ１がＰｈｅであり；Ｘ２がＴｈｒであり；Ｘ３がＰｒｏであり；Ｘ５がＴｈｒであり；Ｘ６が−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙからなる群から選択され；そしてＹ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択される請求項２に記載のヒトインシュリン類似物質。
１１．Ｘ１がＰｈｅであり；Ｘ２がＴｙｒであり；Ｘ３がＰｒｏであり；Ｘ５がＴｈｒであり；Ｘ６が−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙからなる群から選択され；そしてＹ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択される請求項２に記載のヒトインシュリン類似物質。
１２．前記Ｘ１アミノ酸が非帯電であり、ｓｐ２混成である炭素原子をγ位に有し、Ｘ６が−ＯＨである請求項２に記載のヒトインシュリン類似物質。
１３．Ｙ１およびＹ２がＡｓｎを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択され、Ｘ５がＴｈｒを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される請求項１２に記載のヒトインシュリン類似物質。
１４．Ｘ５およびＸ６が一緒になって−ＯＨを形成する請求項１２に記載のヒトインシュリン類似物質。
１５．次式：Ａ−鎖【配列があります】Ｂ−鎖【配列があります】Ａ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】（式中、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ５，Ｙ１およびＹ２はいずれかの天然産生アミノ酸残基であり；Ｘ４はＬｙｓまたはＡｒｇであり；そしてＸ６はＣ末端ヒドロキシ基を有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−ＯＨでありまたはＸ５およびＸ６は一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成する）を有するヒトインシュリン類似物質またはその薬剤上許容されうる塩と薬剤上許容されうる担体とからなる薬剤組成物。
１６．前記インシュリン類似物質がｐＨ７．３で低溶解度を示す請求項１５に記載の薬剤組成物。
１７．前記インシュリン類似物質が実質的に単量体である請求項１６に記載の薬剤組成物。
１８．前記薬剤組成物が水溶液として配合される請求項１５に記載の薬剤組成物。
１９．前記薬剤組成物が水性懸濁液として配合される請求項１５に記載の薬剤組成物。
２０．前記薬剤上許容されうる担体が水性の等張溶液である請求項１５に記載の薬剤組成物。
２１．前記水溶液、水性懸濁液または水性等張溶液がさらに亜鉛イオンおよび／または緩衝剤たとえば酢酸塩もしくはクエン酸塩および／または保存剤たとえばｍ−クレゾール、メチルパラベンもしくはフェノールを含む請求項１８，１９または２０に記載の薬剤組成物。
２２．前記薬剤組成物がインシュリン類似物質１つ以上を含む請求項１５に記載の薬剤組成物。
２３．前記薬剤組成物が粘膜または経皮投与用に配合される請求項１５に記載の薬剤組成物。
２４．前記薬剤組成物が腸管外投与用に配合される請求項１５に記載の薬剤組成物。
２５．Ｘ５がＰｒｏを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される請求項１５に記載の薬剤組成物。
２６．Ｙ１および／またはＹ２がＡｓｎを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される請求項１５または２５に記載の薬剤組成物。
２７．Ｘ１がＰｈｅ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，ＡｓｎまたはＴｙｒからなる群から選択され；Ｘ２がＴｙｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，ＳｅｒまたはＰｈｅからなる群から選択され；Ｘ３がＰｒｏ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＨｉｓからなる群から選択され；Ｘ５がＬｙｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，ＡｓｐまたはＧ１ｕからなる群から選択され；Ｘ６がＴｈｒ−ＯＨ，Ｓｅｒ−ＯＨ，Ａｌａ−ＯＨ，Ａｓｐ−ＯＨ，Ｇｌｕ−ＯＨまたは−ＯＨからなる群から選択され；またはＸ５およびＸ６は一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成し；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，ＧｌｕまたはＡｌａからなる群から選択され；Ｙ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＧｌｕまたはＡｓｐからなる群から選択される請求項１５に記載の薬剤組成物。
２８．Ｘ１がＰｈｅ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，ＡｓｎまたはＴｙｒからなる群から選択され；Ｘ２がＴｙｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，ＳｅｒまたはＰｈｅからなる群から選択され；Ｘ３がＰｒｏ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＨｉｓからなる群から選択され；Ｘ５がＬｙｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択され；Ｘ６が−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，ＡｓＰ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，ＧｌｕまたはＡｌａからなる群から選択され；Ｙ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＧｌｕまたはＡｓｐからなる群から選択される、請求項１５に記載の薬剤組成物。
２９．Ｘ１がＰｈｅ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，ＡｓｎまたはＴｙｒからなる群から選択され；Ｘ２がＴｙｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，ＳｅｒまたはＰｈｅからなる群から選択され；Ｘ３がＰｒｏ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＨｉｓからなる群から選択され；Ｘ５およびＸ６が一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成し；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｙ，Ｇｌｕ，ＳｅｒまたはＡｌａからなる群から選択され；Ｙ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＧｌｕまたはＡｓｐからなる群から選択される請求項１５に記載の薬剤組成物。
３０．Ｘ１がＰｈｅであり；Ｘ２がＴｙｒであり；Ｘ３がＴｈｒであり；Ｘ５がＬｙｓであり；Ｘ６がＴｈｒ−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙからなる群から選択されそしてＹ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択される請求項１５に記載の薬剤組成物。
３１．Ｘ１がＴｙｒであり；Ｘ２がＴｈｒであり；Ｘ３がＰｒｏであり；Ｘ５がＴｈｒであり；Ｘ６が−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙからなる群から選択され；そしてＹ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択される請求項１５に記載の薬剤組成物。
３２．Ｘ１がＰｈｅであり；Ｘ２がＴｈｒであり；Ｘ３がＰｒｏであり；Ｘ５がＴｈｒであり；Ｘ６が−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙからなる群から選択され；そしてＹ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択される請求項１５に記載の薬剤組成物。
３３．Ｘ１がＰｈｅであり；Ｘ２がＴｙｒであり；Ｘ３がＰｒｏであり；Ｘ５がＴｈｒであり；Ｘ６が−ＯＨであり；Ｙ１がＡｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙからなる群から選択され；そしてＹ２がＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択される請求項１５に記載の薬剤組成物。
３４．前記Ｘ１アミノ酸が非帯電であり、ｓｐ２混成である炭素原子をγ位に有し、Ｘ６が−ＯＨである請求項１５に記載の薬剤組成物。
３５．Ｙ１およびＹ２がＡｓｎを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択され、Ｘ５がＴｈｒを除くいずれかの天然産生アミノ酸残基からなる群から選択される請求項３４に記載の薬剤組成物。
３６．Ｘ５およびＸ６が一緒になって−ＯＨを形成する請求項３４に記載の薬剤組成物。
３７．次式：Ａ−鎖【配列があります】Ｂ−鎖【配列があります】Ａ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】（式中、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ５，Ｙ１およびＹ２はいずれかの天然産生アミノ酸残基であり；Ｘ４はＬｙｓまたはＡｒｇであり；そしてＸ６はＣ末端ヒドロキシ基を有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−ＯＨでありまたはＸ５およびＸ６は一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成する）を有するヒトインシュリン類似物質またはその薬剤上許容されうる塩と薬剤上許容されうる担体とを含む薬剤組成物を実施される個人に対し提供することからなる糖尿病の治療方法。
３８．前記インシュリン類似物質がｐＨ７．３で低溶解度を示す請求項３７に記載の方法。
３９．前記インシュリン類似物質が実質的に単量体である請求項３８に記載の方法。
４０．前記薬剤組成物が水溶液として配合される請求項３７に記載の方法。
４１．前記薬剤組成物が水性懸濁液として配合される請求項３７に記載の方法。
４２．前記薬剤上許容されうる担体が水性の等張溶液である請求項３７に記載の方法。
４３．前記水溶液、水性懸濁液または水性等張溶液がさらに亜鉛イオンおよび／または緩衝液たとえば酢酸塩またはクエン酸塩；および／または保存剤たとえばｍ−クレゾール、メチルパラベンまたはフェノールを含む請求項４０，４１または４２に記載の方法。
４４．前記薬剤組成物が１つ以上のインシュリン類似物質を有する請求項３７に記載の薬剤組成物。
４５．前記薬剤組成物が粘膜または経皮投与用に配合される請求項３７に記載の薬剤組成物。
４６．前記薬剤組成物が腸管外投与用に配合される請求項３７に記載の方法。
４７．次式：Ａ−鎖【配列があります】Ｂ−鎖【配列があります】Ａ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】（式中、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ５，Ｙ１およびＹ２はいずれかの天然産生アミノ酸残基であり；Ｘ４はＬｙｓまたはＡｒｇであり；そしてＸ６はＣ末端ヒドロキシ基を有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−ＯＨでありまたはＸ５およびＸ６は一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成する）で表わされるヒトインシュリン類似物質の調製方法であって、当該インシュリン類似物質の前駆体をエンコードするＤＮＡ配列を、酵母へ移した場合ペプチド結合または次式ＩＩＩ− Ｒ（ｎ）−Ｒ（１）− （式中、Ｒはｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、ｎは０〜３３の整数であり、Ｒ（１）はＬｙｓまたはＡｒｇである）で表わされるペプチドにより〔ＬｙｓＢ２８〕，〔ＡｒｇＢ２８〕，〔ＬｙｓＢ２９〕または〔ＡｒｇＢ２９〕がＧｌｙＡ１に結合しているインシュリン類似物質の前駆体を発現および分泌しうる適当な酵母発現ビヒクルへ移し、形質転換された酵母菌株を適当な普通培地中で培養し、前駆体を培養ブロスから回収し、そして次式ＩＶＱ−ＱＲ′′ （式中、Ｑは１個のアミノ酸残基であり、Ｒ′′はカルボキシ保護基たとえばメチルまたはｔｅｒｔ−ブチル基である）で表わされるアミノ化合物と、触媒としてトリプシンまたはトリプシン様酵素を用い、水と有機溶媒の混液中にて反応させ、その後カルボキシ保護基を除き、インシュリン類似物質を反応混合物から単離するか、またはＣ末端アミノ酸がＬｙｓまたはＡｒｇと異なるインシュリン類似物質前駆体であって該前駆体がＣ末端とＧｌｙＡ１との間にＬｙｓおよびＡｒｇからなる群から選択される一対の塩基性アミノ酸の橋を有するものを単離し、次いでトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いて酵素処理することによりインシュリン類似物質へ転化することからなる前記ヒトインシュリン類似物質の調製方法。
４８．次式：Ａ−鎖【配列があります】Ｂ−鎖【配列があります】Ａ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】Ｂ−鎖（続き）【配列があります】（式中、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ５，Ｙ１およびＹ２はいずれかの天然産生アミノ酸残基であり；Ｘ４はＬｙｓまたはＡｒｇであり；そしてＸ６はＣ末端ヒドロキシ基を有するいずれかの天然産生アミノ酸残基または−ＯＨでありまたはＸ５およびＸ６は一緒になってＣ末端ヒドロキシ基を形成する）で表わされるヒトインシュリン類似物質の調製方法であって、デス（Ｂ２３−Ｂ３０）−ヒトインシュリンをトリプシンでインシュリンを処理して（Ｂ２３−Ｂ３０）−アミノ酸を開裂除去することにより調製し、５〜７個のアミノ酸の所望のペプチドを合成し、得られたペプチドをデス（Ｂ２３−Ｂ３０）−ヒトインシュリンと結合し、そして得られたインシュリン類似物質を反応混合物から単離することからなる前記ヒトインシュリン類似物質の調製方法。