ES2230727T3 - Procedimiento de administracion dermal de polipeptidos. - Google Patents

Procedimiento de administracion dermal de polipeptidos.

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ES2230727T3 ES98957511T ES98957511T ES2230727T3 ES 2230727 T3 ES2230727 T3 ES 2230727T3 ES 98957511 T ES98957511 T ES 98957511T ES 98957511 T ES98957511 T ES 98957511T ES 2230727 T3 ES2230727 T3 ES 2230727T3
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Abstract

Uso de un polipéptido y un compuesto de histidina en una cantidad suficiente para disminuir la tendencia de dicho polipéptido a autoasociarse en la fabricación de una composición para administrar dicho polipéptido a través de la piel por electrotransporte o administración transdérmica pasiva.

Description

Procedimiento de administración dermal de polipéptidos.
Campo técnico
La invención se refiere en general a la administración transdérmica de medicamento. Más en concreto, la invención se refiere a un método para disminuir la autoasociación de polipéptidos para contribuir a su administración transdérmica.
Antecedentes de la invención
La administración transdérmica (es decir, a través de la piel) de agentes terapéuticos proporciona una técnica cómoda, conveniente y no invasiva de administrar medicamentos. El método proporciona varias ventajas sobre los modos convencionales de administración de medicamento. Por ejemplo, se evitan las tasas variables de absorción y metabolismo (por ejemplo, hepático) propias del tratamiento oral, y se eliminan otros inconvenientes inherentes, por ejemplo, la irritación gastrointestinal y análogos. La administración transdérmica también permite un alto grado de control de las concentraciones en sangre de un medicamento particular y es una vía de administración especialmente atractiva para medicamentos con estrechos índices terapéuticos, duraciones medias cortas y potente actividad.
La administración transdérmica puede ser pasiva o activa. Muchos medicamentos no son adecuados para administración transdérmica pasiva de medicamento a causa de su tamaño, características de carga iónica e hidrofobicidad. Un método para superar esta limitación es el uso de niveles bajos de corriente eléctrica para transportar activamente medicamentos al cuerpo a través de la piel intacta. Esta técnica se denomina "electrotransporte" o administración "iontoforética" de medicamentos. La técnica proporciona un proceso más controlable que la administración transdérmica pasiva de medicamento puesto que la amplitud, el tiempo y la polaridad de la corriente eléctrica aplicada se regulan fácilmente usando componentes eléctricos estándar. A este respecto, el flujo de medicamento por electrotransporte puede ser de 50% a varios órdenes de magnitud mayor que el flujo transdérmico pasivo del mismo medicamento.
Los dispositivos de electrotransporte emplean en general al menos dos electrodos. Ambos electrodos se colocan en contacto eléctrico íntimo con alguna porción de la piel del cuerpo. Un electrodo, llamado el electrodo activo o donante, es el electrodo desde el que se administra agente terapéutico al cuerpo. El otro electrodo, llamado el contraelectrodo o electrodo de retorno, sirve para cerrar el circuito eléctrico a través del cuerpo. En unión con la piel del paciente, el circuito se termina por la conexión de los electrodos a una fuente de energía eléctrica, por ejemplo, una batería, y generalmente a circuitería capaz de controlar la corriente que pasa por el dispositivo.
Dependiendo de la carga eléctrica de la especie a administrar transdérmicamente, el ánodo o el cátodo pueden ser el electrodo activo o donante. Así, si la sustancia iónica a introducirse en el cuerpo tiene carga positiva, el electrodo positivo (el ánodo) será el electrodo activo y el electrodo negativo (el cátodo) servirá como el contraelectrodo, completando el circuito. Por otra parte, si la sustancia iónica a administrar está cargada negativamente, el electrodo catódico será el electrodo activo y el electrodo anódico será el contraelectrodo. Alternativamente, el ánodo y el cátodo se pueden usar para administrar al cuerpo medicamentos de carga apropiada. En este caso, se considera que ambos electrodos son electrodos activos o donantes. En otros términos, el electrodo anódico puede administrar al cuerpo agentes cargados positivamente mientras que el electrodo catódico puede administrar al cuerpo agentes con carga negativa.
Los dispositivos de electrotransporte existentes requieren además un depósito o fuente del agente terapéutico que se ha de administrar al cuerpo. Tales depósitos de medicamento están conectados al ánodo o el cátodo del dispositivo de electrotransporte para proporcionar una fuente fija o renovable de una o varias especies o agentes deseados. Los ejemplos de depósitos y fuentes incluyen una bolsa como se describe en la Patente de Estados Unidos número 4.250.878 de Jacobsen; un cuerpo de gel preformado como se describe en la Patente de Estados Unidos número 4.382.529 de Webster; y un recipiente de vidrio o plástico conteniendo una solución líquida del medicamento, como se describe en las figuras de la Patente de Estados Unidos número 4.722.726 de Sanderson y otros.
De interés particular aquí es la administración transdérmica de péptidos, polipéptidos, y proteínas a causa de los problemas hallados con las vías más comunes de administración de medicamentos, tal como la administración oral. Las moléculas de polipéptidos y proteínas son altamente susceptibles de degradación por enzimas proteolíticas en el tracto gastrointestinal y se someten a un amplio metabolismo hepático si se toman oralmente. Así, estas sustancias requieren generalmente la administración parenteral para lograr niveles terapéuticos en la sangre del paciente. Las técnicas más convencionales de administración parenteral son las inyecciones hipodérmicas y la administración intravenosa. Sin embargo, los polipéptidos y las proteínas son inherentemente de actuación corta en su actividad biológica, requiriendo inyecciones frecuentes, a menudo varias veces al día, para mantener los niveles terapéuticamente eficaces necesarios. Los pacientes consideran frecuentemente que este régimen de tratamiento es inconveniente y doloroso. Dicha terapia también incluye el riesgo de infección, por ejemplo.
Se han realizado muchos esfuerzos por hallar otras rutas (distintas de las inyecciones parenterales) para administración efectiva de polipéptidos y proteínas farmacéuticos. Las vías de administración con menos efectos colaterales así como mejor aceptación por parte del paciente han sido de interés particular. Tales vías alternativas han incluido generalmente administración oral "protegida" donde el polipéptido/proteína se libera desde una cápsula u otro recipiente después de pasar por el entorno de pH bajo del estómago, la administración a través de los tejidos mucosos, por ejemplo, los tejidos mucosos del pulmón con inhaladores, o los tejidos mucosos nasales con pulverizaciones nasales, y bombas implantables. Por desgracia, estas vías alternativas de administración de polipéptido/proteína solamente han tenido éxito limitado.
Varios investigadores han descrito la administración por electrotransporte de polipéptidos y proteínas. Un primer estudio de R. Burnette y otros, J. Pharm. Sci. (1986) 75:738, implicaba la permeación cutánea in vitro de hormona de liberación de tirotropina, una molécula tripeptídica pequeña. El flujo por electrotransporte se consideró más alto que el flujo de difusión pasiva. Chien y otros, J. Pharm. Sci. (1988) 78:376, en estudios tanto in vitro como in vivo, mostraron que era posible la administración transdérmica de vasopresina e insulina mediante electrotransporte. Véase también Maulding y otros, Registro Preceptivo de Invenciones de Estados Unidos número H1160, que describen la administración por electrotransporte de calcitonina en minicobayos.
Sin embargo, la administración transdérmica de polipéptidos y proteínas también ha encontrado dificultades técnicas. Por ejemplo, se puede producir irritación cutánea debido a hidrólisis de agua en la interface entre el electrodo y la solución medicamentosa o solución de sal de electrólito. Los productos de tal hidrólisis, iones hidronio en el ánodo y iones hidroxilo en el cátodo, compiten con iones de medicamento de carga análoga para administración a la piel, alterando el pH de la piel y produciendo irritación. La Patente de Estados Unidos número 5.533.971 de Phipps y otros describe este problema con más detalle y refiere el uso de soluciones tampón de aminoácidos, incluyendo disoluciones tampón de histidina, para reducir la irritación cutánea.
Además, algunos polipéptidos, particularmente los que son no nativos del animal tratado, pueden producir reacciones cutáneas, por ejemplo, sensibilización o irritación. Muchos polipéptidos también son inestables y se degradan rápidamente. A este respecto, WO97/39768 describe una formulación estabilizada contra la desaminación y la agregación incluyendo hormona del crecimiento, un aminoácido y un detergente iniónico. Igualmente, EP-A-0909564 describe una solución de eritropoyetina conteniendo un aminoácido y que tiene almacenamiento a largo plazo. En un método de almacenamiento alternativo, US 5.880.856 describe proteínas secas estabilizadas por un rango de estabilizadores. Además, la Publicación Internacional número WO 93/12812, publicada el 8 de julio de 1993, describe el uso de disoluciones tampón de histidina para estabilizar químicamente formulaciones de hormona del crecimiento. Además, algunos medicamentos polipeptídicos se agregan rápidamente en solución acuosa, lo que puede originar problemas de administración y solubilidad.
Por ejemplo, la insulina acuosa, a concentraciones relevantes para formulaciones farmacéuticas, tiende a formar dímeros, que a su vez se autoasocian a tetrámeros, hexámeros, hexámeros superpuestos y otras especies poliméricas, con una disminución concomitante de la solubilidad. Estos agregados pueden obstruir partes mecánicas de los dispositivos de administración continua, y son difíciles, si no imposibles, de administrar transdérmicamente. Esta tendencia se exacerba por la presencia de iones metal, tal como zinc, utilizados tradicionalmente en formulaciones de insulina para estabilizar y prolongar la actividad de la insulina.
Se han realizado intentos por disminuir la autoasociación de proteínas tal como insulina. Por ejemplo, US 4.371.523 describe un método de reducir la agregación de insulina en soluciones acuosas incluyendo un compuesto orgánico que tiene al menos dos radicales ácido carboxílico y al menos un radial amino, o amino derivado. Además, Ogiso y otros, Biol. Pharm. Bull. (1996) 19:1049-1054, refieren el uso de una solución tampón Gly-HCl para promover la disociación de oligómeros de insulina porcina antes de su absorción percutánea. Bringer y otros, Diabetes (1981) 30:83-85 refieren que los aminoácidos dicarboxílicos, Asp y Glu, a su pH isoeléctrico, reducen el agregado de insulina en solución. Los autores de los experimentos explican que el pH ácido (3,5) parece necesario para retardar la agregación usando dichos aminoácidos. Sin embargo, la insulina es químicamente inestable en ácido. La Patente de Estados Unidos número 4.940.456, de Sibalis y otros, describe composiciones de insulina para transporte transdérmico electrolítico que incluyen urea, propilurea, yoduro potásico, perclorato de sodio o hidrocloruro de guanidina como agentes disociantes.
También se han desarrollado análogos de insulina de los que se afirma que tienen menor tendencia a la autoasociación. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos número 5.164.366 de Balschmidt y otros describe análogos de insulina con supresiones de algunos aminoácidos, tal como Phe^{824} o Phe^{825}. La Publicación Internacional número WO 92/12999, publicada el 6 de agosto de 1992, describe análogos de insulina humana con residuos aminoácidos seleccionados sustituidos por residuos Asp y Glu. La Publicación de Patente EP número 214.826 B1, publicada el 18 de marzo de 1987, refiere análogos de insulina que tienen sustituciones aminoácidas, en particular en la región B9-B12 y las posiciones B26-B28, donde el aminoácido natural sustituido por el residuo es más hidrófilo. Las sustituciones de aminoácidos preferidas incluyen Asp, Glu, Ser, Thr, His e Ile. Sin embargo, muchos de estos análogos exhiben reducida actividad biológica.
Así, serían deseables métodos alternativos para disminuir la autoasociación de medicamentos de polipéptidos tal como insulina, en el contexto de la administración transdérmica.
Descripción de la invención
Por consiguiente, la presente invención se basa en un método para evitar la autoasociación de insulina y otros polipéptidos bioactivos contribuyendo al mismo tiempo a la solubilización de tales moléculas. El método usa compuestos de histidina y, en virtud de la disminución de la autoasociación, permite la administración transdérmica más eficiente de proteínas, tal como por electrotransporte, y la administración transdérmica pasiva, en cantidades terapéuticamente eficaces.
Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona el uso de un polipéptido y un compuesto de histidina en una cantidad suficiente para disminuir la tendencia de dicho polipéptido a autoasociarse en la fabricación de una composición para administrar dicho polipéptido a través de la piel por electrotransporte o administración transdérmica pasiva.
Preferiblemente, el compuesto de histidina es L-histidina o L-glicil-histidina y el polipéptido es un compuesto de insulina, con o sin zinc, tal como un compuesto de insulina humana sin zinc o un análogo de insulina humana Lys^{B28}Pro^{B29}.
En otra realización, la presente invención se dirige a un uso como el antes definido en el que se disminuye la formación de hexámeros y especies más grandes de un compuesto de insulina humana. Esto incluye combinar el compuesto de insulina con un compuesto de histidina a aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 8. La concentración de histidina es al menos aproximadamente 10 mmolar (mM).
En otra realización, la invención proporciona una composición adecuada para administración a través de una superficie corporal por electrotransporte o administración transdérmica pasiva, incluyendo un compuesto de insulina y un compuesto de histidina en una cantidad suficiente para disminuir la tendencia de dicho compuesto de insulina a autoasociarse.
En otra realización, la invención se refiere a un uso como el antes definido para administrar un compuesto de insulina humana a través de una superficie corporal por electrotransporte. Esto incluye:
(a) proporcionar una composición que incluye el compuesto de insulina y un compuesto de histidina a aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 8, donde la concentración del compuesto de histidina es aproximadamente 10 mmolar a aproximadamente 250 mmolar;
(b) administrar la composición a través de la superficie corporal por electrotransporte.
En otra realización, la invención se refiere a un uso como el antes definido para administrar un compuesto de insulina humana a través de una superficie corporal por administración transdérmica pasiva. Esto incluye:
(a) proporcionar una composición que incluye dicho compuesto de insulina y un compuesto de histidina, donde dicho compuesto de histidina está presente en dicha composición en una cantidad suficiente para disminuir la tendencia de dicha insulina a autoasociarse; y
(b) administrar dicha composición a través de la superficie corporal por administración transdérmica pasiva.
Los expertos en la materia pensarán fácilmente en estas y otras realizaciones de la presente invención a la luz de esta descripción.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el efecto de incrementar la concentración de histidina en la solubilidad de insulina humana de tipo natural con dos zinc unido por hexámero a pH 7,5.
La figura 2 es una vista esquemática de un dispositivo representativo de administración de medicamento por electrotransporte que se puede usar con la presente invención.
La figura 3 es una vista en sección transversal de un dispositivo representativo de administración transdérmica pasiva de medicamento que se puede usar con la presente invención.
La figura 4 es una vista en sección transversal de un dispositivo alternativo de administración transdérmica pasiva de medicamento que se puede usar con la presente invención.
La figura 5 es un gráfico que ilustra los pesos moleculares medios de insulina humana Lys^{B28}Pro^{B29} carente de zinc en función de la concentración de insulina para los datos de histidina 240 mM tomados de la Tabla III en los ejemplos.
La figura 6 es un gráfico que ilustra los pesos moleculares medios de insulina humana Lys^{B28}Pro^{B29} sin zinc en función de la concentración de insulina para los datos de histidina 0 mM tomados de la Tabla III en los ejemplos.
La figura 7 es un gráfico que ilustra los pesos moleculares medios de insulina humana de tipo natural sin zinc en función de la concentración de insulina para los datos de histidina 240 mM tomados de la Tabla IV en los ejemplos.
La figura 8 es un gráfico que ilustra los pesos moleculares medios de insulina humana de tipo natural sin zinc en función de la concentración de insulina para los datos de histidina 0 mM tomados de la Tabla IV en los ejemplos.
Descripción detallada de la invención
La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique lo contrario, métodos convencionales de química de las proteínas, electroquímica y bioquímica dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 1975); J. S. Newman, Electrochemical Systems (Prentice Hall, 1973); y A. J. Bard y L. R. Faulkner, Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications (John Wiley & Sons, 1980).
Se debe observar que, en el sentido en que se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "uno", "una" y "el/la" incluyen múltiples referentes a no ser que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una mezcla de dos o más polipéptidos, y análogos. En el texto se utilizan las siguientes abreviaturas de aminoácidos:
Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R)
Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D)
Cisteína: Cys (C) Glutamina: Gln (Q)
Ácido glutámico: Glu (E) Glicina: Gly (G)
Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I)
Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K)
Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F)
Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S)
Treonina: Thr (T) Triptafano: Trp (W)
Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V)
I. Definiciones
Al describir la presente invención, se emplearán los términos siguientes, y se pretende que se definan como se indica a continuación.
Los términos "polipéptido", "agente polipeptídico" y "medicamento polipeptídico" se usan de forma intercambiable en la presente memoria para designar cualquier polímero bioactivo de residuos de aminoácidos. Los términos abarcan péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y análogos. Tales polipéptidos se pueden derivar de fuentes naturales o se pueden sintetizar o producir de forma recombinante. Los términos también incluyen las modificaciones de postexpresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación, etc.
Un medicamento o agente polipeptídico definido en la presente memoria está formado en general por uno o varios de los 20 aminoácidos naturales, enumerados anteriormente, y también puede incluir cualquiera de los varios análogos de aminoácidos conocidos, tanto análogos existentes naturalmente como sintetizados, tal como, aunque sin limitación, homoisoleucina, 2-(metilenciclopropil)glicina, S-metilcisteína, S-(prop-l-enil)cisteína, homoserina, ornitina, norleucina, norvalina, homoarginina, 3-(3-carboxifenil)alanina, ciclohexilalanina, mimosina, ácido pipecólico, ácido 4-metilglutámico, canavanina, ácido 2,3-diaminopropiónico, y análogos. El polipéptido también puede existir en forma neutra o de sal, por ejemplo, sales de adición ácidas (formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos análogos) y que se forman con ácidos inorgánicos tal como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, succínico, maleico, tartárico, mandélico, y análogos. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tal como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, y análogos. A continuación se exponen ejemplos de agentes polipeptídicos que se utilizan en la presente invención.
El término "compuesto de insulina" en el sentido en que se usa aquí se refiere a un compuesto que tiene una estructura molecular similar o idéntica a la insulina nativa o proinsulina, incluyendo una molécula con conformación terciaria similar o idéntica a la insulina nativa o proinsulina, y que retiene la actividad de la insulina, es decir, la capacidad de regular los niveles de glucosa en sangre. Tales compuestos pueden incluir adiciones, sustituciones y supresiones de aminoácidos, con relación a la molécula nativa, a condición de que las modificaciones no destruyan la actividad de la insulina. Los ejemplos de compuestos de insulina con sustituciones de aminoácidos con relación a la insulina nativa incluyen insulina humana Lys^{B28}Pro^{B29} e insulina humana Asp^{B28}. Además, a efectos de la presente invención, un compuesto de insulina se puede derivar de cualquier fuente de mamíferos, tal como humanos, bovinos, caninos, equinos, ovinos, porcinos, cetáceos, etc. El compuesto de insulina se puede purificar directamente a partir del páncreas del organismo fuente, o se puede producir de forma recombinante o sintética. Véase, por ejemplo, Brange, J. Galenics of Insulin, The Physico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparations(Springer-Verlag) para varios métodos de obtener insulina.
Además, el término "compuesto de insulina" en el sentido en que se usa aquí denota un compuesto de insulina con o sin metales asociados. A este respecto, se ha hallado que los metales, tales como zinc y calcio, prolongan la actividad de la insulina y también aumentan la estabilidad física de la molécula. Así, un compuesto de insulina para uso en los métodos presentes incluye, sin limitación, insulina sin metal, así como insulina en asociación con un metal apropiado, incluyendo, aunque sin limitación, insulina que tiene desde aproximadamente 2 moléculas Zn^{2+}/hexámero a aproximadamente 4 moléculas Zn^{2+}/hexámero. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos número 4.476.118, para una descripción de tales compuestos, así como métodos de hacerlos. Otros ejemplos de compuestos de insulina para uso con la presente invención se describen con más detalle más adelante.
El término "compuesto de histidina" en el sentido en que se usa aquí se refiere al aminoácido L-His, así como análogos de aminoácidos de L-His que retienen la capacidad de disminuir la formación de oligómeros de un polipéptido dado, definido más adelante. Tales análogos incluyen, sin limitación, dipéptidos y tripéptidos que contienen His, tales como, aunque sin limitación, His-Gly, Gly-His, Ala-His, 3 metil-His, 1 metil-His, carnosina, His-Ser y His-Ala.
Un compuesto de histidina "disminuye la formación de oligómeros" de unpolipéptido dado cuando la autoasociación del polipéptido que da lugar a oligómeros, tal como tetrámeros, hexámeros, hexámeros superpuestos, y otros polímeros se retarda (por ejemplo, la formación de oligómeros se evita al menos parcialmente) o invierte (por ejemplo, se disocian polipéptidos ya agregados), por la presencia del compuesto de histidina. La capacidad de un compuesto de histidina de disminuir la formación de oligómeros se puede determinar evaluando la presencia de la especie oligomérica en presencia y ausencia del compuesto de histidina en cuestión. Tal formación se puede determinar usando ultracentrifugación analítica (véase, por ejemplo, Modem Analytical Ultracentrifugation, Schuster and Laue eds. 1994, Birkh@user; y Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science, Harding, Rowe and Horton eds., 1992, The Royal Society of Chemistry), tal como estudios de equilibrio de sedimentación como se describe en los ejemplos, determinaciones espectrofotométricas (véase, por ejemplo, Ogiso y otros Biol. Pharm. Bull. (1996) 19:1049-1054), osmometría, filtración en gel, y análogos. Para una descripción de tales métodos, véase, por ejemplo, Valdes y Ackers, Methods in Enzymology, Vol. 61 (Enzyme Structure, parte H, Hirs and Timasheff, eds) Academic Press, 1979, págs. 125-142.
El término "administración transdérmica pasiva" se refiere a la administración a través de una superficie corporal (por ejemplo, la piel) de uno o varios agentes polipeptídicos farmacéuticamente activos disponibles para administración mediante la circulación sistémica, sin la ayuda de una fuerza electromotriz aplicada. La administración transdérmica pasiva se puede realizar usando varios medios incluyendo, sin limitación, aplicación directa a la piel, parches transdérmicos, sistemas moderados por membrana para realizar administración controlada, sistemas controlados por difusión de adhesivo, sistemas del tipo de dispersión de matriz, y sistemas de microdepósito. Tales sistemas se conocen en la técnica y se explican con detalle en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19ª edición, 1995. Se puede usar mejoradores de penetración para facilitar la absorción a través de la piel. Tales mejoradores de penetración incluyen solventes tales como agua, alcoholes incluyendo metanol, etanol, 2-propanol y análogos, alquil metil sulfóxidos, pirrolidonas, laurocaprama, acetona, dimetilacetamida, dimetil formamida, tetrahidrofurfurilo; surfactantes; y sustancias químicas tal como urea, N,N-dietil-m-toluamida, y
análogos.
Los términos "electrotransporte", "iontoforesis", y "iontoforético" se usan aquí para referirse a la administración a través de una superficie corporal (por ejemplo, la piel) de uno o varios agentes polipeptídicos farmacéuticamente activos por medio de una fuerza electromotriz aplicada a un depósito conteniendo agente. El agente se puede administrar por electromigración, electroporación, electroósmosis o cualquier combinación de las mismas. La electroósmosis también se ha denominado electrohidroquinesis, electroconvección, y ósmosis inducida eléctricamente. En general, la electroósmosis de una especie a un tejido resulta de la migración de solvente en el que se contiene la especie, como resultado de la aplicación de fuerza electromotriz al depósito de la especie terapéutica, es decir, flujo de solvente inducido por electromigración de otras especies iónicas. Durante el proceso de electrotransporte, se pueden producir algunas modificaciones o alteraciones de la piel tal como la formación de poros de existencia transitoria en la piel, también denominada "electroporación". En el término "electrotransporte" en el sentido en que se usa aquí se incluye también cualquier transporte asistido eléctricamente de especies mejorado por modificaciones o alteraciones de la superficie corporal (por ejemplo, formación de poros en la piel). Así, en el sentido en que se usa aquí, los términos "electrotransporte", "iontoforesis" y "iontoforético" se refieren a (1) la administración de agentes cargados por electromigración, (2) la administración de agentes no cargados por el proceso de electroósmosis, (3) la administración de agentes cargados o no cargados por electroporación, (4) la administración de agentes cargados por los procesos combinados de electromigración y electroósmosis, y/o (5) la administración de una mezcla de agentes cargados y no cargados por los procesos combinados de electromigración y electroósmosis.
Un polipéptido exhibe "electrotransporte mejorado" cuando el flujo por electrotransporte del polipéptido a través de la superficie corporal (por ejemplo, la piel o mucosa) se incrementa en presencia de un compuesto de histidina, en comparación con el flujo en ausencia del compuesto de histidina, determinado usando métodos estándar de medición. Por ejemplo, el flujo transdérmico por electrotransporte puede ser evaluado usando varios métodos in vivo o in vitro, conocidos en la técnica. Los métodos in vitro incluyen fijar un fragmento de piel de un animal apropiado (por ejemplo, piel humana de un cadáver) entre los compartimentos donante y receptor de una pila de flujo por electrotransporte, mirando el lado del estrato córneo del fragmento de piel al compartimento donante. Una solución líquida o gel conteniendo el medicamento a administrar se pone en contacto con el estrato córneo, y se aplica corriente eléctrica a electrodos, un electrodo en cada compartimento. El flujo transdérmico se calcula muestreando la cantidad de medicamento en el compartimento receptor. Dos modelos exitosos usados para optimizar la administración transdérmica de medicamento por electrotransporte son el modelo de colgajo de piel aislada de cobayo de Riviere, Heit y otros, J. Pharm. Sci. (1993) 82:240-243, y el uso de piel sin pelo aislada de roedores sin pelo o cobayos. Véase, Hadzija y otros, J. Pharm. Pharmacol. (1992) 44:387-390. Véase también Ogiso y otros Biol. Pharm. Bull. (1996) 19:1049-1054, para una descripción de un método para evaluar la absorción percutánea de insulina.
II. Modos de llevar a la práctica la invención
La presente invención se refiere el uso de compuestos de histidina para disminuir la autoasociación de una molécula polipeptídica, mejorando por ello la administración transdérmica de la molécula polipeptídica en comparación con la administración del polipéptido no tratado. Por lo tanto, el método permite una mayor eficiencia de la administración transdérmica de gran número de sustancias, y permite la administración transdérmica de moléculas que de otro modo no se prestarían a dicha administración. Además, el método aumenta la solubilidad del agente polipeptídico así tratado y disminuye las posibles reacciones inmunológicas que se podrían producir contra agregados de sustancias por lo demás endógenas.
La presente invención encontrará uso con una amplia variedad de proteínas y agentes polipeptídicos que tienen tendencia a agregarse, tal como varios polipéptidos derivados de fuentes eucarióticas, procarióticas y virales, así como péptidos sintéticos. Tales polipéptidos incluyen, sin limitación, medicamentos peptídicos que son antibióticos y agentes antivirales, antineoplásicos, inmunomodulares, hormonas peptídicas tal como insulina, proinsulina, hormona del crecimiento, GHRH, LHRH, EGF, somatostatina, SNX-111, BNP, insulinotropina, ANP, y hormonas glicoproteínicas tales como FSH, LH, PSH y hCG.
La presente invención se ha ejemplificado usando insulina e análogos de insulina, pero no se limita a los compuestos de insulina. Se eligió insulina para ilustrar la invención en base a su tendencia a autoasociarse a estructuras hexaméricas y poliméricas denominadas "hexámeros superpuestos". Tal asociación inhibe la administración transdérmica del polipéptido y puede producir irritación en el lugar de administración.
Los ejemplos de compuestos de insulina para uso con los métodos presentes incluyen insulinas comercializadas, tales como, por ejemplo, insulina humana recombinante de Sigma, St. Louis, MO, formulada como soluciones neutras o suspensiones de insulina zinc. Tales preparados de insulina contienen un mínimo de dos iones zinc unidos por hexámero y tienen una concentración de insulina de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 3,0 mM (1 mg mL^{-1} a 18 mg mL^{-1}). Sin embargo, también se utilizarán aquí preparados de insulina incluyendo concentraciones más altas de insulina, de hasta aproximadamente 17 mM de insulina. También se puede utilizar insulina carente de metales, como zinc, con los métodos presentes, y la concentración puede oscilar entre aproximadamente 0,1 y 30 mM. Los análogos de insulina para usarlos aquí como el compuesto de insulina incluyen análogos de insulina humana comercializados tales como una insulina Lys^{B28} y Pro^{B29}, que se puede adquirir de Lilly (Indianapolis, IN) como inyección de insulina lispro Humalog®, mejor descrito en los ejemplos; compuestos de insulina conteniendo protamina, tal como NPH (Protamina Neutra Hagedorn) e insulina isofano (que se puede adquirir de varios fabricantes); e insulinas Lente y Bifásica (que se puede adquirir de varios fabricantes). Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19ª edición, 1995, para una descripción de estos y otros compuestos de insulina.
Otros análogos de insulina para uso aquí incluyen, aunque sin limitación, análogos tales como los descritos por Marki y otros, Z. Physiol. Chem. (1979) 360:1619-1632, sustituidos en las posiciones de aminoácido 2, 5, 6, 7, 8 y 11 de la cadena A y 5, 7, 13 y 16 de la cadena B; insulinas sulfatadas tales como las descritas por Albisser y otros en U. S. Pharmacopeial Convention, Rockville, MD. (Gueriguian y otros eds.) págs. 84-95; insulina Des-Phe (que tiene el aminoácido N-terminal de la cadena B borrado); análogos de insulina con supresiones adicionales de algunos aminoácidos, tal como la supresión de Phe^{B24} o Phe^{B25} (Patente de Estados Unidos número 5.164.366, de Balschmidt y otros); análogos de insulina que tienen sustituciones de aminoácidos, en particular en la región B9- B12 y las posiciones B26-B28, donde el aminoácido natural sustituido por residuo es más hidrófilo y es generalmente Asp, Glu, Ser, Thr, His e Ile (Publicación de Patente EP número 214.826 B1, publicada el 18 de marzo de 1987); análogos de insulina humana con residuos aminoácidos seleccionados sustituidos por residuos Asp y Glu (Publicación Internacional número WO 92/12999, publicada el 6 de agosto de 1992), y análogos.
Los compuestos de histidina para uso con la presente invención incluyen L-His, y sus análogos, tales como, aunque sin limitación, dipéptidos y tripéptidps que contienen His, tal como His-Gly, Gly-His, Ala-His, 3 metil-His, 1 metil-His, L-carnosina (también denominado (\beta-Ala-His), His-Ser y His-Ala. La elección de un compuesto de histidina apropiado está dentro de los conocimientos de la técnica y se determinará en base en gran parte al polipéptido particular en cuestión.
El compuesto de histidina estará presente en general en su punto isoeléctrico y en una concentración de desde aproximadamente 1 mM a 330 mM, más preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 250 mM, y muy preferiblemente de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 250 mM. La concentración óptima de histidina depende de varios factores incluyendo la concentración de insulina, la concentración de otras sales (por ejemplo, NaCl), la presencia o ausencia de zinc, la presencia o ausencia de conservantes, la tendencia del polipéptido a formar oligómeros, y análogos. En general, la concentración de histidina es al menos aproximadamente 10 mM. Los expertos en la materia de formulaciones de proteína pueden determinar fácilmente la concentración óptima de histidina para las variables particulares (por ejemplo, concentración de insulina, concentración de sales, presencia o ausencia de zinc, conservante o no conservante) utilizadas en una aplicación o formulación especial.
El polipéptido estará presente en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, una cantidad suficiente para lograr el resultado terapéutico deseado. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad, y estado general del sujeto, la gravedad de la patología tratada, y el medicamento polipeptídico particular de interés. Los expertos en la técnica determinan fácilmente las dosis terapéuticamente eficaces usando, por ejemplo, curvas de respuesta a dosis estándar y análogos. Por ejemplo, si el polipéptido es insulina, estará presente normalmente en una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 30 mM, más preferiblemente de 0,2 a aproximadamente 20 mM y muy preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 17 mM, dependiendo la concentración del compuesto particular de insulina usado y si la molécula incluye zinc unido.
Cuando se utiliza L-His junto con una insulina humana comercializada, que incluye en general insulina en forma de hexámeros y hexámeros superpuestos, la insulina estará presente en general en una concentración de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 17 mM (1 mg mL^{-1} a 100 mg mL^{-1}) y L-His presente en una concentración de aproximadamente 25-250 mM. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la cantidad apropiada de insulina y L-His para uso en el método de la invención.
Los medicamentos polipeptídicos para uso en la presente invención pueden tener carga negativa, carga positiva, o ser neutros, cuya elección dependerá, entre otros factores, del compuesto particular de histidina usado, así como el pH deseado. La determinación de estos parámetros cae dentro de los conocimientos en la técnica. Por ejemplo, cuando se usa L-His como el compuesto de histidina y el pH de la composición es 7-8, el compuesto de insulina tendrá carga negativa.
En general, el pH de la solución final será de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8,5, más preferiblemente de pH 7 a aproximadamente pH 8. Sin embargo, el pH de la solución puede variar dependiendo de nuevo del polipéptido particular y compuesto de histidina utilizado en el método.
Los compuestos de polipéptido y histidina están generalmente presentes en excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agua, salina, dextrosa acuosa, glucerol, etanol, y análogos, para formar por ello una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica a administrar también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes, agentes tamponantes de pH y análogos, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, trietanolamina acetato de sodio, oleato de trietanolamina, etc. La elección de un excipiente y aditivos apropiados se determina en gran parte por los compuestos de polipéptido y histidina que se usen. Para una explicación de formulaciones poilpeptídicas, véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19ª edición, 1995.
Para formulaciones de insulina, tales sustancias incluyen, sin limitación, conservantes tal como metilparaben y fenol (m-cresol); agentes isotónicos tal como glucerol o sales, incluyendo, aunque sin limitación, NaCl (en general a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mM NaCl); y otros aditivos y agentes tamponantes tal como acetato de sodio, NaPO_{4}, y análogos. Para una explicación de formulaciones de insulina, véase, por ejemplo, Brange, J., Stability of Insulin (Kluwer Academic Publishers); Brange, J. Galenics of Insulin, The Physico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparations (Springer-Verlag); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19ª edición, 1995.
Una vez que se prepara la formulación polipeptídica deseada con histidina, se puede administrar al sujeto usando alguno de varios sistemas de administración transdérmica de medicamentos, y la administración no se limita al uso de un sistema particular. Se describen ejemplos de sistemas de administración de medicamentos por electrotransporte, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos números 5.312.326 de Myers y otros 5.080.646 de Theeuwes y otros 5.387.189 de Gyory y otros y 5.169.383 de Gyory y otros, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia.
La figura 2 ilustra un dispositivo representativo de administración por electrotransporte que se puede usar en unión con el método presente. El dispositivo 10 incluye una carcasa superior 16, un conjunto de placa de circuitos 18, una carcasa inferior 20, electrodo de ánodo 22, electrodo de cátodo 24, depósito de ánodo 26, depósito de cátodo 28 y adhesivo compatible con la piel 30. La carcasa superior 16 tiene alas laterales 15 que contribuyen a fijar el dispositivo 10 en la piel del paciente. La carcasa superior 16 se compone preferiblemente de un elastómero moldeable por inyección (por ejemplo, etileno acetato de vinilo). El conjunto de placa de circuitos impresos 18 incluye un circuito integrado 19 acoplado a componentes discretos 40 y batería 32. El conjunto de placa de circuitos 18 está unido a la carcasa 16 por puntales (no representados en la figura 2) que pasan a través de agujeros 13a y 13b, calentándose/fundiéndose los extremos de los puntales para piquetear el conjunto de placa de circuitos 18 a la carcasa 16. La carcasa inferior 20 está unida a la carcasa superior 16 por medio de adhesivo 30, adhiriéndose la superficie superior 34 del adhesivo 30 a la carcasa inferior 20 e incluyendo la carcasa superior 16 las superficies inferiores de las alas 15.
En el lado inferior del conjunto de placa de circuitos 18 se muestra (parcialmente) una pila de botón 32. También se puede emplear otros tipos de baterías para alimentar el dispositivo 10.
El dispositivo 10 se compone en general de batería 32, circuitería electrónica 19. 40, electrodos 22, 24, y depósitos de medicamento/químico 26, 28, todos los cuales están integrados en una unidad autónoma. Las salidas (no representadas en la figura 2) del conjunto de placa de circuitos 18 hacen contacto eléctrico con los electrodos 24 y 22 a través de agujeros 23, 23' en las depresiones 25, 25' formadas en las carcasa inferior 20, por medio de tiras adhesivas conductoras eléctricas 42, 42'. A su vez, los electrodos 22 y 24 están en contacto mecánico y eléctrico directo con los lados superiores 44', 44 de los depósitos de medicamento 26 y 28. Los lados inferiores 46', 46 de los depósitos de medicamento 26, 28 contactan la piel del paciente a través de los agujeros 29', 29 en el adhesivo 30.
El dispositivo 10 tiene opcionalmente una característica que permite al paciente autoadministrarse una dosis de medicamento por electrotransporte. A la pulsación del interruptor de botón pulsador 12, la circuitería electrónica del conjunto de placa de circuitos 18 suministra una corriente CC predeterminada a los electrodos/depósitos 22, 26 y 24, 28 durante un intervalo de administración de longitud predeterminada. El interruptor de botón pulsador 12 está situado convenientemente en el lado superior del dispositivo 10 y se pulsa fácilmente a través de la ropa. Se usa preferiblemente una pulsación doble del interruptor de botón pulsador 12 dentro de un período de tiempo breve, por ejemplo, tres segundos, para activar el dispositivo para administración de medicamento, minimizando por ello la probabilidad de accionamiento inadvertido del dispositivo 10. Preferiblemente, el dispositivo transmite al usuario una confirmación visual y/o audible del inicio del intervalo de administración de medicamento por medio del LED 14 que se ilumina y/o una señal sonora audible, por ejemplo, de un "zumbador". Se administra medicamento a través de la piel del paciente por electrotransporte, por ejemplo, en el brazo, durante el intervalo de administración predeterminado.
El electrodo anódico 22 se compone preferiblemente de plata y el electrodo catódico 24 se compone preferiblemente de cloruro de plata. Ambos depósitos 26 y 28 se componen preferiblemente de materiales de polímero de hidrogel. Los electrodos 22, 24 y los depósitos 26, 28 se retienen dentro de las depresiones 25', 25 en la carcasa inferior 20.
El interruptor de botón pulsador 12, la circuitería electrónica en el conjunto de placa de circuitos 18 y la batería 32 se "sellan" con adhesivo entre la carcasa superior 16 y la carcasa inferior 20. La carcasa superior 16 se compone preferiblemente de caucho u otro material elastomérico. La carcasa inferior 20 se compone preferiblemente de una hoja de material plástico o elastomérico (por ejemplo, polietileno) que se puede moldear fácilmente para formar depresiones 25, 25' y cortar para formar agujeros 23, 23'. El dispositivo montado 10 es preferiblemente resistente al agua (es decir, a prueba de salpicaduras) y es muy preferiblemente impermeable. El sistema tiene un perfil bajo que se adapta fácilmente al cuerpo, permitiendo por ello libertad de movimiento en, y alrededor de, el lugar de uso. Los depósitos 26 y 28 están situados en el lado del dispositivo 10 en contacto con la piel y están suficientemente separados para evitar el cortocircuito eléctrico accidental durante la manipulación y el uso normales.
El dispositivo 10 se adhiere a la superficie del cuerpo del paciente (por ejemplo, la piel) por medio de un adhesivo periférico 30 que tiene un lado superior 34 y un lado de contacto con el cuerpo 36. El lado adhesivo 36 tiene propiedades adhesivas que garantizan que el dispositivo 10 permanezca en posición en el cuerpo durante la actividad normal del usuario, y permite, no obstante, la extracción razonable después del intervalo de uso predeterminado (por ejemplo, 24 horas). El lado adhesivo superior 34 se adhiere a la carcasa inferior 20 y retiene la carcasa inferior 20 unida a la carcasa superior 16.
Los depósitos 26 y 28 incluyen en general una matriz de gel, con la solución medicamentosa uniformemente dispersada en al menos uno de los depósitos 26 y 28. Se puede usar concentraciones de medicamento del orden de aproximadamente 1 x 10^{-4} M a 1,0 M o más, prefiriéndose concentraciones de medicamento en la porción inferior del rango. Los polímeros adecuados para la matriz de gel pueden incluir esencialmente cualesquiera materiales poliméricos iniónicos sintéticos y/o naturales. Se prefiere una naturaleza polar cuando el agente activo es polar y/o capaz de ionización, para mejorar la solubilidad del agente. Opcionalmente, la matriz de gel será hinchable al agua. Los ejemplos de polímeros sintéticos adecuados incluyen, aunque sin limitación, poli (acrilamida), poli(2-hidroxietil acrilato), poli(2-hidroxipropil acrilato), poli(N-vinil-2-pirrolidona), poli(N-metilol acrilamida), poli(diacetona acrilamida), poli(2-hidroxiletil metacrilato), poli(alcohol vinílico) y poli(alcohol alílico). Los polímeros de condensación hidroxilo funcionales (es decir, poliésteres, policarbonatos, poliuretanos) también son ejemplos de polímeros sintéticos polares adecuados. Los polímeros polares naturales (o sus derivados) adecuados para ser utilizados como la matriz de gel se ejemplifican por éteres de celulosa, éteres de metil celulosa, celulosa y celulosa hidroxilada, metil celulosa y metil celulosa hidroxilada, gomas tales como guar, algarrobilla, karaya, xantano, gelatina, y sus derivados. También se pueden utilizar polímeros iónicos para la matriz a condición de que los contraiones disponibles sean iones de medicamento u otro iones con carga opuesta con relación al agente activo.
Así, las formulaciones de polipéptido/histidina utilizadas en la presente invención se incorporarán al depósito de medicamento, por ejemplo, una matriz de gel como acaba de describirse, y administrarse a un paciente usando un sistema de administración de medicamento por electrotransporte, opcionalmente como se ilustra anteriormente. La incorporación de la solución medicamentosa se puede hacer de varias formas, es decir, embebiendo la solución en la matriz del depósito, mezclando la solución medicamentosa con el material de matriz antes de la formación de hidrogel, o análogos.
En otras realizaciones de la presente invención, se puede usar administración transdérmica pasiva para administrar las formulaciones de polipéptido/histidina. Quienes trabajan en este campo apreciarán que la presente invención se puede usar en unión con una amplia variedad de sistemas transdérmicos pasivos, puesto que la invención no se limita a este respecto. Como ejemplos de sistemas pasivos, se puede hacer referencia, aunque sin limitación, a las Patentes de Estados Unidos números 4.379.454 de Campbell y otros, 4.588.580 de Gale y otros, 4.832.953 de Campbell y otros, 4.698.062 de Gale y otros, 4.867.982 de Campbell y otros, y 5.268.209 de Hunt y otros, cuyos sistemas descritos se pueden usar con la presente invención. Dos ejemplos de dispositivos de administración transdérmica pasiva se ilustran en las figuras 3 y 4.
En la figura 3, el dispositivo de administración transdérmica pasiva 88 incluye un depósito 90 conteniendo la formulación a administrar transdérmicamente. El depósito 90 tiene preferiblemente forma de una matriz conteniendo la formulación dispersada. El depósito 90 está intercalado entre una capa de soporte 92, que es impermeable al agente, y una membrana opcional de control de velocidad 94. En la figura 3, el depósito 90 es de un material, tal como un polímero, que es suficientemente viscoso para mantener su forma. Si se utiliza un material de viscosidad más baja para el depósito 90, tal como un gel acuoso, la capa de soporte 92 y la membrana de control de velocidad 94 se sellarían conjuntamente alrededor de su periferia para evitar el escape. Debajo de la membrana 94 está situado un dispositivo perforador cutáneo 2 con un medio de conexión 65 en su superficie que mira a la piel que se extiende a través de los agujeros (no representados) en el dispositivo 2 para contactar la membrana 94. El dispositivo 88 se adhiere a una superficie corporal por medio de capa adhesiva de contacto 96 alrededor de la periferia del dispositivo 2 y, opcionalmente, por los elementos de fijación de cualquiera de las realizaciones descritas previamente. En la mayoría de los casos, el medio de conexión 65 contendrá inicialmente agente. Normalmente se dispone un recubrimiento de desprendimiento desprendible (no representado) a lo largo de la superficie expuesta de la capa adhesiva 96 y se quita antes de la aplicación del dispositivo 10 a la superficie corporal.
Alternativamente, como se representa en la figura 4 ampliada, el dispositivo terapéutico transdérmico 98 se puede unir a una superficie corporal por medio de un recubrimiento adhesivo flexible 100. El dispositivo 98 consta de un depósito conteniendo agente 90 que tiene preferiblemente forma de una matriz conteniendo el agente dispersado. El medio de conexión 65 se extiende a través de los agujeros 8 para contactar el depósito 90. Alternativamente, la matriz en el depósito 90 se puede extender a través de los agujeros 8 de manera que esté inicialmente en contacto con el medio de conexión 65 o el depósito y el medio de conexión pueden ser el mismo. Se dispone una capa de refuerzo impermeable 102 junto a una superficie del depósito 90. El recubrimiento adhesivo 100 mantiene el dispositivo en la superficie corporal. El recubrimiento adhesivo 100 se puede fabricar junto con, o disponer por separado de, los elementos restantes del dispositivo 98. Con algunas formulaciones, el recubrimiento adhesivo 100 puede ser preferible al adhesivo de contacto 96 representado en la figura 3. Esto es cierto, por ejemplo, donde el depósito de agente contiene un material (tal como, por ejemplo, un surfactante oleoso) que afecta adversamente a las propiedades adhesivas de la capa adhesiva de contacto 96. La capa de refuerzo impermeable 102 es preferiblemente ligeramente más grande que el depósito 90, y de esta manera evita que los agentes del depósito 90 cooperen adversamente con el adhesivo del recubrimiento 100. Opcionalmente, se puede disponer una membrana de control de velocidad (no representada en la figura 4) parecida a la membrana 94 de la figura 3 en el lado de superficie corporal del depósito 90. También se facilita normalmente un recubrimiento de desprendimiento desprendible (no representado) con el dispositivo 98 y se quita justo antes de la aplicación de dispositivo 98 a la superficie corporal.
La formulación del depósito 90 puede ser de base acuosa o no acuosa. La formulación está diseñada para administrar el agente a los flujos necesarios. Las formulaciones acuosas incluyen típicamente agua y de aproximadamente 1 a 60 por ciento en peso de un polímero hidrófilo como un agente gelificante, tal como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilmetacrilato y polímeros usados en lentes de contacto blandas. Las formulaciones no acuosas típicas se componen de fluido de silicona, cauchos de silicona, polímeros de hidrocarbono, poliisobutileno, cauchos, o aceite mineral. Los geles a base de aceite mineral también contienen típicamente de 1 a 2 por ciento en peso de un agente gelificante tal como dióxido de silicio coloidal.
La matriz del depósito que contiene agente deberá ser compatible con el agente administrado, el agente inhibidor de captación (si lo hay) y cualquier vehículo para él. Al utilizar un sistema de base acuosa, la matriz del depósito es preferiblemente un polímero hidrófilo (por ejemplo, un hidrogel). Al utilizar un sistema de base no acuosa, la matriz del depósito se compone preferiblemente de un polímero hidrófobo. Las matrices poliméricas adecuadas son conocidas en la técnica de la administración transdérmica de medicamento.
Cuando se desea una velocidad constante de administración de agente, el agente está presente en la matriz o vehículo a una concentración superior a la saturación, siendo la cantidad excedente una función de la longitud deseada del período de administración de agente del sistema. Sin embargo, el agente puede estar presente en un nivel inferior a la saturación a condición de que la formulación de polipéptido/histidina y el agente inhibidor de captación (si lo hay) se administren continuamente y de forma coextensiva al mismo lugar de la superficie corporal en una cantidad y durante un período de tiempo suficiente para reducir o eliminar la irritación cutánea producida por el agente.
Además del agente, el medio de conexión también puede contener colorantes, pigmentos, rellenos inertes, mejoradores de permeación, excipientes adherentes, polímeros neutros, surfactantes, reactivos, soluciones tampón, plastificantes, y otros componentes convencionales de productos farmacéuticos o dispositivos transdérmicos conocidos en la técnica.
La cantidad de agente presente en el depósito y el tamaño del depósito no está limitado en general y es una cantidad igual o superior a la cantidad de agente que en su forma liberada es eficaz para producir los efectos fisiológico y/o farmacológicos locales y/o sistémicos deseados.
La forma preferida en la que se administra un agente determina en general el tipo de sistema de administración a usar, y viceversa. Es decir, la selección de un sistema pasivo que administra el agente por difusión o un sistema activado eléctricamente que administra el agente por electrotransporte la determinará en su mayor parte la forma del agente. Por ejemplo, con sistemas de administración pasiva, se reconoce en general que el agente se administra preferiblemente en su forma de base o ácido libre, en vez de en forma de una sal soluble en agua cuando el agente se difunde a través del estrato córneo. Por otra parte, con dispositivos de administración por electrotransporte, se ha reconocido que los agentes deberán ser en general solubles en agua. Se considera en general que los recorridos para administración transdérmica pasiva o por electrotransporte de agente a través de la piel intacta son diferentes, produciéndose la administración pasiva a través de las regiones de lípidos (es decir, regiones hidrófobas) de la piel y teniendo lugar la administración por electrotransporte a través de recorridos hidrófilos o poros tal como los asociados con los folículos del cabello y las glándulas sudoríparas. Para el caso de piel perforada, cabe esperar flujo pasivo sustancial a través de los recorridos creados que son acuosos. El agente para administración pasiva en el caso de piel perforada es generalmente hidrófilo (por ejemplo, forma de sal soluble en agua) y la forma preferida de un agente para administración por electrotransporte también es hidrófila (por ejemplo, forma de sal soluble en agua). Para administración pasiva, se puede usar una combinación de agente ionizado (por ejemplo, soluble en agua) y agente no ionizado (por ejemplo, hidrófilo).
En una realización preferida para administración transdérmica pasiva de insulina, la formulación contendrá una solución tampón de histidina y un compuesto de insulina sin zinc y carente de conservantes tal como m-cresol o fenol, e insulina humana de tipo natural o un análogo de insulina con tendencia reducida a autoasociarse, tal como un análogo de insulina humana Lys^{B28}Pro^{B29}. Tal formulación maximiza la proporción de las moléculas de insulina presentes como la especie de peso molecular más bajo que más rápidamente se difunde.
Las formulaciones de polipéptido/histidina también se pueden administrar usando sistemas osmóticos o activados por presión que administran agentes por flujo conectivo transportado por un solvente. En tales sistemas, el agente tiene preferiblemente suficiente solubilidad en el vehículo solvente. Quienes trabajan en este campo apreciarán que la presente invención se puede usar en unión con una amplia variedad de sistemas osmóticos o activados por presión, puesto que la invención no se limita a un dispositivo concreto a este respecto. Como ejemplos de dispositivos osmóticos o activados por presión se puede consultar las Patentes de Estados Unidos números 4340.480 de Eckenhoff, 4.655.766 de Theeuwes y otros, 4.753.651 de Eckenhoff, 5.279.544 de Gross y otros, 4.655.766 de Theeuwes, 5.242.406 de Gross y otros, y 4.753.651 de Eckenhoff, cualquiera de los cuales se puede usar con la presente invención.
III. Experimentos Materiales
Se adquirió insulina humana (producida por expresión en E. Coli), \beta-lactoglobulina, L-histidina (base) y serinamida de Sigma (St. Louis, MO). El preparado de insulina de Sigma contenía aproximadamente 0,4% Zn que equivalía a aproximadamente 2 átomos de zinc por hexámero de insulina. Se adquirió Humalog® (un análogo de insulina humana Lys^{B28}Pro^{B29}) así como Humulin® (inyección de insulina humana), ambos de origen DNA recombinante y fabricados por Lilly (Indianapolis, IN) en farmacias comerciales. Se obtuvo L-histidina (base) de J. T. Baker (Phillipsburg, NJ), así como de Sigma (St. Louis, MO). Se obtuvo ácido acético glacial de J. T. Baker (Phillipsburg, NJ). Se adquirió ácido clorhídrico de Mallinckrodt (Paris, KY). Aldrich (St. Louis, MO) suministró cloruro de sodio (NaCl). Se obtuvo lisozima de Worthington Biochemical Corp. (Freehold NJ). Bachem Bioscience Inc. (King of Prussia, PA) sintetizó L-glicil-L-histidina.
Métodos Preparación de insulinas humanas sin zinc
Todas las insulinas humanas que se puede adquirir de fuentes comerciales contienen aproximadamente 2 moléculas de zinc unidas por hexámero de insulina. El zinc unido a la insulina humana de tipo natural (que se puede adquirir de Sigma o como Humulin® R) y el análogo Lys^{B28}Pro^{B29} (disponible como Humalog®) se pueden extraer por diálisis extensiva contra ácido acético 10 mM a 4ºC. En el caso de Humulin® R y Humalog®, el pH de la insulina inyectable se ajustó primero de pH neutro a pH 3,5 usando ácido acético glacial y 1N clorhídrico antes de la diálisis. La insulina se liofilizó posteriormente después de la diálisis. El análisis de zinc del material liofilizado indicó que el zinc residual era inferior a 0,03 zinc/hexámero.
Preparación de soluciones tampón de L-histidina y L-glicil-L-histidina
Se utilizó agua Milli-Q (Millipore, Medford, MA) para la preparación de todas las soluciones tampón. Las soluciones tampón se filtraron a través de membranas de 0,22 \mum acetato de celulosa antes del uso. El pH de una solución de L-histidina 252 mM era aproximadamente pH 7,62 \pm 0,1 a 22ºC y el pH de una solución tampón de 1 M L-glicil-L-histidina era aproximadamente pH 7,68 \pm 0,1 a 22ºC.
Preparación de solución tampón de serinamida
Se preparó solución tampón madre de serinamida 100 mM y se ajustó el pH a 7,5 \pm 0,1.
Preparación de insulina en soluciones tampón de L-histidina y L-glicil-L-histidina
Se preparó una solución madre de insulina por cada experimento realizado en la ultracentrífuga analítica. La concentración de la solución madre se determinó diluyendo una alícuota en 6 M guanidina hidrocloruro (Pierce,
Rockford, IL) y comprobando su absorbancia en un espectrofotómetro (Aviv, modelo 14DS, Lakewood, NJ). La absorbancia de la muestra se corrigió para dispersión de luz antes de determinar su concentración usando un coeficiente de extinción molar de 1,109 mL mg^{-1}cm^{-1} a 276 nm). Para preparados que contenían histidina, la solución madre de insulina se hizo en L-histidina 250 o 330 mM. Para L-glicil-L-histidina, la solución madre de insulina se preparó en solución tampón 260 mM y/o 1 M L-glicil-L-histidina. Típicamente, con insulina de tipo natural conteniendo aproximadamente 2 zinc/hexámero, se preparó una solución madre de hasta 10 mM (aproximadamente 60 mg mL^{-1}) en L-histidina o L-glicil-L-histidina. Para preparados sin histidina, una solución madre conteniendo 7,1 mg mL^{-1} de insulina de tipo natural 2 zinc/hexámero se preparó en NaCl 10 mM, ajustándose a pH 7,5 con NaOH. En el caso de insulina humana de tipo natural sin zinc y/o análogo Lys^{B28}Pro^{B29}, se puede preparar una solución madre de hasta 17 mM (aproximadamente 100 mg mL^{-1}) en NaCl 0,1 M, pH 7,5 y/o histidina 250 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,5. El pH de la solución madre de insulina era aproximadamente 7,68 \pm 0,1 en 1 M de solución tampón de glicil-histidina y pH
7,62 \pm 0,1 en histidina 250 mM a 22ºC.
Antes de la pasada en ultracentrífuga analítica, la solución madre de insulina se diluyó con solución tampón de histidina o glicil-histidina con o sin la cantidad apropiada de NaCl de tal manera que la concentración de insulina variase de sólo 2 mg mL^{-1} (0,35 mM) a 40 mg mL^{-1} (7 mM). La concentración final de la solución tampón de
L-histidina en la que se disolvió la insulina, varió de 10 mM a 252 mM. Para L-glicil-L-histidina, se examinaron en la ultracentrífuga preparados de insulina de tipo natural conteniendo 2 zinc/hexámero en solución tampón 250 y 750 mM. Además, se añadió cloruro de sodio, a una concentración final de 50 y 100 mM, a algunas de las muestras de insulina en las soluciones tampón de L-histidina o L-glicil-L-histidina.
Preparación de lisozima y \beta-lactoglobulina
Se prepararon soluciones de lisozima (15 mg mL^{-1}) en 0,15 M NaCl con L-histidina 0, 100, o 250 mM. El pH de las soluciones conteniendo histidina era 7,60 \pm 0,1 a 21ºC; el pH de la solución de lisozima sin L-histidina se ajustó con base diluida de modo que fuese el mismo. Igualmente el pH de \beta-lactoglobulina en 0,15 M NaCl se ajustó con base diluida de modo que fuese el mismo pH que en L-histidina 250 mM, pH 7,74 \pm 0,1.
Estudios de equilibrio de sedimentación en la ultracentrífuga analítica
Se realizaron experimentos de equilibrio de sedimentación con varias formulaciones de insulina a 32ºC usando una ultracentrífuga analítica (modelo XL-A o XL-I; Beckman, Palo Alto, CA).
Se obtuvieron datos en equilibrio de sedimentación para todas las muestras usando óptica de interferencia Rayleigh y/o óptica UV/visible de exploración a varias velocidades del rotor. Para esto último, las exploraciones de absorbancia para muestras de insulina se comprobaron a varias longitudes de onda, por ejemplo 248, 288, 291 y 295 nm. Los valores de coeficiente de extinción molar se estimaron a partir de exploraciones obtenidas al comienzo de la pasada con el monocromador puesto a las longitudes de onda anteriores. Estos valores se utilizaron para calcular las constantes de equilibrio de asociación molar de insulina en varias condiciones. Cada punto de datos en las exploraciones de absorbancia se registró como la media de diez exploraciones con un incremento de la distancia radial de 0,002 cm. Para el sistema óptico de interferencia, se utilizó luz a 675 nm para obtener datos de equilibrio de sedimentación para muestras de insulina así como lisozima. El desplazamiento de franja de una solución polipeptídica de 1 mg mL^{-1} en un recorrido de 1 cm se tomó como 2,77 franjas (McMeekin y otros Biochem. Biophys. Res. Comm. (1962) 7:151-156; Doty y Geiduschek, págs. 393-460, en The Proteins, 1A, editado por Neurath and Bailey, Academic Press, N. Y. (1943); Perlmann y Longsworth, J. Amer. Chem. Soc. (1948) 70: 2719-2724). Este valor se utilizó para calcular las constantes de asociación molar para muestras de insulina y lisozima. El peso molecular monomérico de insulina humana se tomó como 5796 g mol^{-1} con un volumen específico parcial de 0,727 mL g^{-1} calculado a partir de la composición de aminoácidos que usa valores Cohn y Edsall para el volumen específico parcial residual. En el caso de lisozima, el peso molecular del monómero se tomó como 14.315 g mol^{-1} y un valor de 0,703 mL g^{-1} para el volumen específico parcial (Sophianopoulos y otros J. Biol. Chem. (1962) 237:1107). Para \beta-lactoglobulina, se obtuvieron exploraciones de absorbancia UV a 280 nm y el peso molecular del monómero se tomó como 18.400 g mol^{-1}. El volumen parcial para éste último es 0,747 mL g^{-1} (Kelly y Reithel, Biochemistry (1971) 10:2639-2644) y el coeficiente de extinción usado para calcular constantes de asociación molar era 0,97 mL g^{-1} cm^{-1} (Wetlaufer y Lovrien, J. Biol. Chem. (1964) 243:596). El peso molecular flotante efectivo de todas las proteínas en presencia de L-histidina se calculó usando el modelo de volumen excluido (Jacobsen y otros, Biochemistry (1996) 35:13173-13179) en el que el valor B_{AM} se consideró simplemente el peso molecular monomérico multiplicado por el volumen específico parcial. El volumen específico parcial de L-histidina y L-glicil-histidina se tomó como 0,641 mL g^{-1} (págs. 370-381, Proteins, Amino Acids and Peptides, (1943) editado por Cohn y Edsall, Hafner Publishing, N. Y.).
Después de la centrifugación, los datos obtenidos de las exploraciones de interferencia y absorbancia se analizaron usando métodos conocidos que incluían un algoritmo en base a la ecuación 9 en Shire y otros, Biochemistry (1991) 30:7703-7711. El algoritmo usado incluía una modificación en la que el parámetro de ajuste era (BM_{1})^{1/2} en lugar de (B)^{1/2}. Este análisis da estimaciones para las constantes de asociación para el modelo especificado por el usuario. El modelo puede ser el de un monómero ideal (el modelo más simple) o un monómero existente en equilibrio químico con uno, dos, tres o más agregados de tamaños específicos. El modelo más probable es el que minimiza la suma de cuadrados de la diferencia entre la absorbancia experimental de la absorbancia teórica, es decir, el modelo que tiene el valor más bajo para los residuos cuadráticos medios.
Ejemplo 1 Efecto de L-histidina en el límite de solubilidad de la insulina
Para determinar el efecto de L-histidina en el límite de solubilidad de insulina humana de tipo natural 2 zinc/ hexámero, se combinaron concentraciones variables de insulina con L-histidina. Como se representa en la figura 1, el uso de L-histidina en la disolución tampón incrementó la concentración máxima de insulina de una solución tampón conteniendo insulina. Sin L-histidina, a pH 7,5, NaCl 10 mM y a temperatura ambiente, la concentración más alta de insulina alcanzada con 2 zinc/hexámero era 7,1 mg mL^{-1} o 1,2 mM. En presencia de histidina 250 mM a su pl, se obtuvieron soluciones de insulina con una concentración de hasta 16,5 mM, que representa un aumento de la concentración de quince veces.
Ejemplo 2 Efecto de L-histidina y L-glicil-histidina a pl en la autoasociación de la insulina en ausencia de NaCl
Para determinar el efecto de L-histidina y L-glicil-histidina a sus pls en la autoasociación en ausencia de NaCl, se realizaron estudios de equilibrio de sedimentación como se ha descrito anteriormente. Como se expone en la Tabla I, la mayor concentración de L-histidina dio lugar a una disminución de la constante de equilibrio de hexamerización. A pH 7,5, en ausencia de histidina, los datos de equilibrio de sedimentación (recogidos a 32ºC y una velocidad del rotor de 18k a 48k) se pudieron ajustar en un modelo de asociación de hexámero-dímero con un valor InK_{2-6} de 52,6. El coeficiente de no idealidad, B, tiene en cuenta el efecto de no idealidad que surge debido a la fuerza iónica muy baja de la solución tampón. Suponiendo que estaba presente una sola especie de peso molecular, el análisis de datos usando el modelo más simple dio un valor M_{avg}/M_{1} de 5,5, lo que sugiere que el tamaño medio de los agregados de insulina en ausencia de histidina era ligeramente menor que un hexámero. La observación de que 3 dímeros de insulina se unen para formar un hexámero en presencia de zinc a pH neutro es consistente con los datos publicados (Brange, Galenics of Insulin, (1987) Springer Verlag). Los datos de equilibrio de sedimentación recogidos en presencia de histidina 20 a 252 mM a pH 7,6 \pm 0,1 a múltiples velocidades del rotor se ajustaron en un modelo de asociación de hexámero-dímero. Se observó una disminución de la constante de equilibrio de hexamerización cuando la concentración de histidina se incrementó de 20 a 252 mM. El efecto de histidina se observó con insulina a concentraciones de insulina en la pila centrífuga que van desde solo 0,01 mM (0,1 mg mL^{-1}) hasta 13 mM (75 mg mL^{-1}). A pesar del hecho de que la histidina incrementó drásticamente la solubilidad de la insulina (el límite de solubilidad era 16,5 mM en his 250 mM, pH 7,5 \pm 0,1), no toda la insulina agregada bajo estas condiciones eran dímeros y hexámeros. También se hallaron agregados de múltiples hexámeros a la concentración de carga de insulina más alta (6 mM) examinada en la ultracentrífuga. Solamente 80% de la insulina inicialmente cargada en la pila permaneció en solución cuando la muestra alcanzó el equilibrio a una velocidad del rotor de 20k rpm. El 20% restante de la insulina formó pelets en el fondo de la pila como agregados insolubles grandes. Un cálculo aproximado sugirió que los agregados tenían un peso molecular medio superior a 100.000, equivalente a aproximadamente 3 hexámeros de
insulina.
La glicil-histidina era uno de los análogos de histidina cuyo efecto en la autoasociación de insulina se examinó. A 250 mM, la glicil-histidina también redujo la tendencia de la insulina a formar hexámeros, pero no tan efectivamente como la histidina. El análisis del equilibrio de sedimentación realizado usando óptica de interferencia a una velocidad del rotor de 50K usando el modelo de especie única indicó que el peso molecular medio de la insulina era el de un tetrámero en glicil-histidina (Tabla I). Como comparación, a histidina 252 mM (la concentración más alta examinada en la ultracentrífuga), el peso molecular medio de la insulina era el de un dímero. La sustitución de la histidina por otra solución tampón, la serinamida, también ajustada a pH 7,5 \pm 0,1, no redujo la capacidad de la insulina de tipo natural de autoasociarse a pH neutro.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA I
Efecto de varias soluciones tampón en la autoasociación de insulina humana de tipo natural (con 2 zinc unido por hexámero) en ausencia de cloruro de sodio a pH 7,5 \pm 0,1 y 32ºC analizado usando un modelo de asociación dímero-hexámero
1
I.S. es la fuerza iónica de la solución tampón en mM
B (g^{-2}L mol) es el coeficiente de no idealidad, calculado en base a un dímero de insulina
r.m.s. es el resto del valor cuadrático medio entre datos experimentales y teóricos
\begin{minipage}[t]{155mm} M_{avg}/M_{1} es el peso molecular medio de la especie de sedimentación dividido por el peso molecular del monómero de insulina para un modelo no ideal de especie única\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{155mm} InK_{2-6} es el logaritmo natural de la constante de asociación para la formación de un hexámero a partir de 3 dímeros\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{155mm} ^{1} \hskip0,2cm obtenido de exploraciones de absorbancia UV supervisadas a 291 nm de una muestra de insulina 0,34 mM {}\hskip0,4cm a velocidades del rotor de 18k, 24k, 28k, 34k y 48k\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{155mm} ^{2} \hskip0,2cm obtenido de exploraciones de absorbancia UV supervisadas a 291 nm de una muestra de insulina 0,69 mM {}\hskip0,4cm a velocidades del rotor de 15k, 20k, 25k y 30k\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{155mm} ^{3} \hskip0,2cm obtenido de exploraciones de absorbancia UV supervisadas a 291 nm de una muestra de insulina 0,35 mM {}\hskip0,4cm a velocidades del rotor de 24k, 28k, 34k y 48k\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{155mm} ^{4} \hskip0,2cm obtenido de óptica de interferencia de una muestra de insulina 6 mM a velocidad del rotor de 50k\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{155mm}^{5} \hskip0,2cm obtenido de óptica de interferencia de insulina muestra a 3 y 6 mM a velocidad del rotor de 50k.\end{minipage} 
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Ejemplo 3 Efecto de L-histidina y L-glicil-histidina a pl en la autoasociación de insulina humana de tipo natural con dos zinc unido por hexámero en presencia de NaCl
Para determinar el efecto de L-histidina y L-glicil-histidina a sus pls en la autoasociación de insulina en presencia de NaCl, se realizaron experimentos como se ha descrito anteriormente. Al aumentar la fuerza iónica de las muestras de pH 7,5 a aproximadamente 100 mM con cloruro de sodio, existía insulina humana de tipo natural en su mayor parte como hexámeros en ausencia de solución tampón de histidina. Como se representa en Tabla II, cuando la concentración de histidina en las muestras de insulina aumentó de 50 a 226 mM, había una disminución modesta de la constante de equilibrio de hexamerización. El efecto no era tan drástico como el observado en ausencia de sal (véase la Tabla I). A 226 mM, la mayor concentración de histidina examinada a una fuerza iónica de 100 mM, el valor M_{avg}/M_{1} calculado en base al supuesto de una sola especie de insulina era aproximadamente 6. En contraposición, en ausencia de NaCl, la insulina se halló principalmente como dímeros en histidina 252 mM, pH 7,6 \pm 0,1. Además, en presencia de histidina 226 mM y NaCl 100 mM, independientemente de la concentración de carga inicial de insulina, la concentración final de insulina que sedimentó con un tamaño medio igual o inferior al de un dodecámero era aproximadamente 2 mM. El resto de la muestra de insulina formó pelets en la parte inferior de la pila a una velocidad del rotor de 20k. Así, el porcentaje de insulina que formó agregados muy grandes era considerablemente más alto en solución tampón de histidina que contiene NaCl 100 mM que sin NaCl. En este último caso, el rango de concentración de insulina que dio lugar a peletización de grandes agregados era aproximadamente
4,8 mM.
Estos resultados muestran que el efecto de la histidina en la autoasociación de insulina depende del entorno iónico del medio. Datos preliminares sugieren que la energía libre de Gibbs de la formación de un dodecámero de insulina a partir de 2 hexámeros aumenta en función de la raíz cuadrada de la fuerza iónica de la solución tampón.
En el caso de L-glicil-L-histidina, la adición de NaCl 50 mM a la muestra de insulina humana de tipo natural (elevando la fuerza iónica total a 77,5 mM) dio una constante de equilibrio de hexamerización cerca de la observada para insulina en histidina 226 mM y NaCl 100 mM (Tabla II). La histidina es una zwitterión a su pl, y su efecto en la insulina parece ser específico. Por ejemplo, como se expone en la Tabla II, el uso de taurina, otro zwitterión a pH 7,5 \pm
0,1, a una fuerza iónica de aproximadamente 100 mM, no redujo la constante de equilibrio de hexamerización de insulina.
TABLA II
Efecto de L-histidina y L-glicil-L-histidina en la autoasociación de insulina humana de tipo natural 2 zinc/hexámero en presencia de cloruro de sodio 50 y 100 mM a pH 7,5 \pm 0,1 y 32ºC analizado usando un modelo de asociación dímero-hexámero
2
^{1a} \begin{minipage}[t]{149mm}obtenido de exploraciones de absorbancia supervisadas a 295 nm de muestras de insulina a 3 y 6 mM a velocidad del rotor de 20k y 30k\end{minipage}
^{1b} \begin{minipage}[t]{149mm} obtenido de exploraciones de absorbancia supervisadas a 295 nm de muestras de insulina a 3 y 6 mM a velocidad del rotor de 20k y 30k con modelo ideal dímero-hexámero-hexámetro usodésmido con una constante InK_{6isodesmic} de 4,24\end{minipage}
^{2} \begin{minipage}[t]{149mm} obtenido de óptica de interferencia de muestras de insulina a 3 y 6 mM a una velocidad del rotor de 50k\end{minipage}
^{3} \begin{minipage}[t]{149mm} obtenido de exploraciones de absorbancia UV supervisadas a 291 nm de una muestra de insulina a 0,35 mM a velocidades del rotor de 18k, 24k, 34k y 48k\end{minipage}
^{4} \begin{minipage}[t]{149mm} obtenido de exploraciones de absorbancia UV supervisadas a 288 nm de una muestra de insulina de 0,7 mM a velocidades del rotor de 15k, 20k, 25k, 30k y 40k\end{minipage}
^{5} \begin{minipage}[t]{149mm} obtenido de exploraciones de absorbancia UV a 288 (0,35 mM) y 248 nm (0,7 mM) de muestra de insulina a velocidades del rotor de 15k, 20k, 25k, 30k y 40k\end{minipage}
^{6} \begin{minipage}[t]{149mm} obtenido de exploraciones de absorbancia UV a 248 nm de una muestra de insulina de 0,35 mM a velocidades del rotor de 15k, 20k, 25k y 30k.\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{149mm}InK_{6iso} es el logaritmo natural de la constante de asociación para la formación de hexámeros isodésmicos.\end{minipage}
Ejemplo 4 Efecto de L-histidina a pl en la autoasociación de insulina de tipo natural sin zinc y un análogo de insulina LysPro sin Zn
Se realizaron estudios de equilibrio de sedimentación en una ultracentrífuga analítica XL-I a 32ºC con insulina humana nativa de tipo natural (sin Zn, de Sigma y Humulin® R) así como un análogo de insulina Lys^{B28}Pro^{B29} sin Zn (purificado de Humalog®, Lilly) en función de incrementar la concentración de histidina, pH 7,5, como se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron datos de interferencia a múltiples velocidades del rotor, agruparon y analizaron globalmente usando regresión no lineal ajustada a varios modelos. En presencia de NaCl 100 mM, pH 7,5, los datos de insulina humana de tipo natural y Lys^{B28}Pro^{B29}, ambos libres de zinc, se pueden ajustar a un modelo conteniendo monómero, dímero, hexámero y hexámeros isodésmicos.
Como se expone en la Tabla III, para el análogo LysPro sin Zn, el valor de InK_{12} no cambió considerablemente con la concentración de histidina, pero InK_{6iso} mostró una disminución considerable con el aumento de la concentración de histidina. Los resultados sugerían que la histidina tenía un efecto en las propiedades de autoasociación del análogo de insulina LysPro. Un método sucinto de expresar el grado de agregado de una proteína es calcular un peso molecular medio a partir de las constantes de equilibrio de asociación. Varias de tales medias se describen bien en la literatura (véase, por ejemplo, "Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science", Ed. S. E. Hardin, A. J. Rowe, y J. C. Horton, Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1992). Uno, Mn, o el número de peso molecular medio se define como c_{total}/\sum(c_{i}/Mi), donde c_{i} es la concentración en peso de la i-ésima especie con peso molecular M_{i}. Un segundo tipo de media, Mw, llamado el peso molecular medio, se define como \sumc_{i}Mi/c_{total}. Se pueden definir otras medias de peso molecular tal como M_{z}, donde M_{z}=\sumc_{i}M_{i}^{2}/\sumc_{i}M_{i}. La figura 5 muestra la dependencia de la concentración de estas tres medias para el análogo de insulina LysPro en presencia de histidina 240 mM (calculado a partir de los valores InK_{12}, InK_{26} e inK_{6iso} para histidina 240 mM en la Tabla III) mientras que la figura 6 muestra un gráfico similar para la situación en ausencia de histidina (calculado a partir de los valores InK para histidina 0 mM en la Tabla III). La figura 7 muestra el gráfico similar para insulina de tipo natural sin zinc en presencia de histidina 240 mM (calculado a partir de los valores InK_{12}, InK_{26} e inK_{6iso} para histidina 240 mM en la Tabla IV), mientras que la figura 8 muestra un gráfico comparable en ausencia de histidina (calculado a partir de valores InK para histidina 0 mM en la Tabla IV).
Es evidente por estos gráficos que la presencia de histidina reduce sustancialmente el peso molecular medio de la insulina, y que este efecto es más pronunciado para el análogo LysPro.
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4
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Ejemplo 5 Efecto de L-histidina a su pl en la autoasociación de otras proteínas
También se estudió el efecto de L-histidina en la autoasociación de lisozima y \beta-lactoglobulina utilizando los métodos antes descritos. La lisozima y \beta-lactoglobulina son proteínas bien estudiadas que existen predominantemente en un equilibrio monómero-dímero a pH alcalino (Kim y otros, Chemical Reviews (1977) 77:659-690). Los datos de equilibrio de sedimentación de lisozima a pH alcalino se modelan mejor por un sistema monómero-dímero-tetrámero que por un sistema monómero-dímero más simple (Holladay, Ph. D. Dissertation (1973) Emory University). El comportamiento de autoasociación de lisozima sin L-histidina a 4ºC se averiguó analizando globalmente los datos de franja de interferencia de 14k, 18k y 30k rpm. Los resultados se exponen en la Tabla V.
El ruido esperado en la medición de franja del sistema Beckman XL-I es aproximadamente 0,02 a 0,04 franjas. Los datos a 4ºC se describen mejor por un sistema ideal de monómero-dímero-tetrámero (1-2-4). Obsérvese que cualquier modelo que contenga agregados por encima del tamaño del dímero produce estimaciones esencialmente idénticas para In(K_{12}). Dado que estos resultados (presentados a continuación) sobre el efecto de L-histidina en la dimerización de lisozima no tienden a ser dependientes del modelo, el modelado se realizó con un sistema ideal 1-2-4. La inclusión de un segundo coeficiente virial no disminuyó considerablemente r.m.s residual. El tipo isodésmico I tiene todos los agregados presentes con idénticas constantes de asociación. El Tipo II tiene solamente agregados regulares presentes. El Tipo III tiene una constante de dimerización diferente de los pasos de asociación siguientes que se presume que son isodésmicos. El tipo IV tiene solamente agregados regulares que se presume que están presentes con una constante de dimerización diferente de los pasos de asociación siguientes que se presume que son isodésmicos. Las ecuaciones para los modelos isodésmicos se conocen en la técnica, y se han descrito (Tang y otros, Biophys. Chem. (1977) 7:121-139). Obsérvese que para el modelo isodésmico IV que In(K_{14}) es 17,9, cerca del estimado a partir del modelo 1-2-4. Las cantidades previstas de agregados más allá del tetrámero son bastante pequeñas para todos los modelos
isodésmicos.
El efecto de L-histidina en la dimerización de lisozima se expone en la Tabla VI. Los resultados de la Tabla VI se generaron usando un modelo ideal 1-2-4 (monómero-dímero-tetrámero) y el análisis global de dos velocidades del rotor que diferían en 4k rpm. El efecto de L-histidina en la dimerización de \beta-lactoglobulina a tres temperaturas se expone en la Tabla VII. Para ambas proteínas, parece haber modestas disminuciones de la constante de equilibrio de dimerización con el aumento de temperatura. Para este análisis, se asumió implícitamente que el peso molecular flotante efectivo de cualquier agregado en presencia de L-histidina es un múltiplo entero del peso molecular flotante efectivo del monómero. Esto implica que el término B_{AM} de cualquier agregado es un múltiplo entero del término B_{AM} para el monómero. Puesto que en realidad la forma general de un agregado es probable que sea algo diferente de la del monómero, es posible que las disminuciones modestas de las constantes de dimerización para lisozima y \beta-lactoglobulina puedan reflejar el fallo del supuesto de que el peso molecular flotante del agregado es un múltiplo entero del monómero. Sin embargo, se debe observar que el valor devuelto de In(K_{12}) no tiende a ser sensible a los cambios de un pequeño porcentaje en el peso molecular flotante del monómero.
TABLA V Efecto de la elección del modelo de autoasociación en In(K_{12}) de lisozima en NaCl 150 mM, pH 7,6, 4ºC a partir de un análisis global de datos de interferencia obtenidos a velocidades del rotor de 14k, 18k y 30k
6
1-2 denota un modelo en el que el monómero existe en equilibrio con el dímero
1-2-4 denota un modelo en el que el monómero existe en equilibrio con dímero y tetrámero
InK_{1-2} es la constante de equilibrio para la formación de un dímero a partir de 2 monómeros
InK_{1-4} es la constante de equilibrio para la formación de un tetrámero a partir de 4 monómeros
TABLA VI Efecto de L-histidina en la autoasociación de lisozima a pH 7,6, NaCl 150 mM a múltiples velocidades del rotor usando una pieza central de 3 mm
7
8
^{1} \begin{minipage}[t]{150mm} obtenido de ajustar datos de interferencia globalmente en un modelo conteniendo monómero-dímero-tetrámero existentes en equilibrio. InK_{1-2} e InK_{1-4} son las constantes de equilibrio para la formación de un dímero y tetrámero, respectivamente, a partir de un monómero.\end{minipage}
^{2} los valores entre paréntesis son el error estándar autogenerado de InK.
TABLA VII Efecto de L-histidina en la autoasociación de \beta-lactoglobulina a pH 7,6, NaCl 150 mM a múltiples velocidades de rotor usando una pieza central de 3 mm
9
^{1} \begin{minipage}[t]{150mm} obtenido de ajustar datos de absorbancia globalmente en un modelo ideal de monómero-dímero con desviación base flotante. Los errores estándar autogenerados de valores InK se dan en paréntesis. Las cifras entre corchetes denotan residuos cuadráticos medios.\end{minipage}
En base a los experimentos anteriores, es evidente que la histidina y los análogos de histidina son capaces de disminuir la autoasociación de insulina y análogos de insulina, con y sin zinc. En el caso de insulina de tipo natural, conteniendo 2 moléculas de zinc/hexámero, en el rango de concentración examinado, los datos de equilibrio de sedimentación a pH 7,5 se pueden ajustar en un modelo no ideal de dímero-hexámero en ausencia de NaCl o en un modelo ideal dímero-hexámero (cuando la concentración de carga de insulina es inferior a 1 mM) en presencia de NaCl 100 mM. Además, hay un efecto sorprendente de la concentración de histidina en el valor InK_{26} de insulina humana nativa 2 zinc/hexámero si NaCl está presente o no. En ausencia de zinc, el efecto de histidina en el análogo LysPro es más pronunciado que la insulina de tipo natural. La histidina también es capaz de disminuir la autoasociación de otras proteínas totalmente no relacionadas, tal como lisozima y \beta-lactoglobulina.
Así, se han descrito métodos para disminuir la autoasociación y aumentar la solubilidad de agentes polipeptídicos.

Claims (12)

1. Uso de un polipéptido y un compuesto de histidina en una cantidad suficiente para disminuir la tendencia de dicho polipéptido a autoasociarse en la fabricación de una composición para administrar dicho polipéptido a través de la piel por electrotransporte o administración transdérmica pasiva.
2. El uso de la reivindicación 1, donde el compuesto de histidina es L-histidina o L-glicil-histidina.
3. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el polipéptido es un compuesto de insulina.
4. El uso de la reivindicación 3, donde el compuesto de insulina es un compuesto de insulina humana.
5. El uso de la reivindicación 4, donde el compuesto de insulina es un compuesto de insulina humana sin zinc.
6. El uso de la reivindicación 4 o 5, donde el compuesto de insulina es un análogo de insulina humana Lys^{B28}Pro^{B29}.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, donde se disminuye la formación de hexámero de insulina.
8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la concentración del compuesto de histidina es al menos aproximadamente 10 mmolar.
9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el pH de la composición es pH 7 a pH 8.
10. Uso según se reivindica en la reivindicación 1 para administrar un compuesto de insulina a través de la piel por electrotransporte donde la relación molar del compuesto de insulina al compuesto de histidina es 1:10 a 1:1000.
11. Una composición adecuada para la administración a través de una superficie corporal por electrotransporte o administración transdérmica pasiva incluyendo un compuesto de insulina y un compuesto de histidina en una cantidad suficiente para disminuir la tendencia de dicho compuesto de insulina a autoasociarse.
12. Un dispositivo de administración por electrotransporte o dispositivo de administración transdérmica pasiva incluyendo una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
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