JP2001522815A

JP2001522815A - ポリペプチド類の自己会合を減少させる方法

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Publication number: JP2001522815A
Application number: JP2000520157A
Authority: JP
Inventors: レウング、イリス、カ、マン
Original assignee: Alza Corp
Current assignee: Alza Corp
Priority date: 1997-11-12
Filing date: 1998-11-03
Publication date: 2001-11-20
Also published as: EP1030688B1; DE69816325T2; WO1999024015A1; AU1302499A; EP1028706A1; CA2309818A1; JP2001522793A; EP1030688A1; ES2202910T3; EP1028706B1; CA2309818C; CA2309955A1; DE69826705D1; AU1375199A; US20020058608A1; WO1999024071A1; US20070078096A1; DE69816325D1; DE69826705T2; ES2230727T3

Abstract

(57)【要約】自己会合するポリペプチド医薬の傾向を減少させるための方法が開示される。その方法はヒスチジン化合物を使用しそして経皮送り込み技術を用いてのポリペプチド剤の一層有効な送り込みを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般に経皮医薬送り込み（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｄｒｕｇｄ
ｅｌｉｖｅｒｙ）に関する。さらに特定的には、本発明は、ポリペプチドの経皮
送り込みを助けるために、そのポリペプチド類の自己会合（ｓｅｌｆａｓｓｏ
ｃｉａｔｉｏｎ）を減少させる方法に関する。

【０００２】（背景技術）治療薬の経皮（即ち、皮膚を通過させての）送り込みは、医薬を投与するため
に楽な便利のよいそして非侵襲的な技術を提供する。その方法は医薬送り込みの
慣用の様式よりも優っている幾つかの利点を提供する。例えば経口治療における
吸収および（例えば肝臓の）代謝の速度の変化が避けられそして他の固有の不都
合さ（例えば胃腸刺激、等）が排除される。経皮送り込みはまた、特定の医薬の
血液濃度についての高い程度のコントロールを可能にしそして狭い治療指数、短
い半減期そして有効な活性を有する医薬のための魅力的な投与経路である。

【０００３】経皮送り込みは受動的であるかまたは能動的であるかのいずれかであることが
出来る。多くの医薬はそれらの大きさ、イオン電荷特性および疎水性の故に、受
動的経皮医薬送り込みに適していない。この制約を克服する１つの方法は、無傷
の皮膚を通過させて身体中に医薬を能動的に移送するための低水準の電流の使用
である。この技術は、“電気輸送（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｒｔ）”また
は“イオン電気導入（法）（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）”の医薬送り込みと
して知られている。この技術は適用する電流の振幅、時間調節および極性を標準
の電気部品を用いて容易に調節することができるので、受動的経皮医薬送り込み
よりも一層コントロール可能な方法を提供する。これに関して、電気輸送医薬フ
ラックスは、同じ医薬の受動的経皮フラックスよりも５０％から数オーダーの大
きさで大きい可能性がある。

【０００４】電気輸送装置は一般に少なくとも２つの電極を使用する。これらの電極の両方
は、身体の皮膚の或る部分と緊密に電気的接触して配置される。作用電極、また
はドナー電極と呼ばれる、１つの電極は、それから治療薬が身体中に送り込まれ
る電極である。対向電極、または戻り電極と呼ばれる、他の電極は身体中を通過
する電気回路を閉じるのに役に立つ。患者の皮膚と一緒になって、電気エネルギ
ーの源、例えばバッテリーにそして通常は装置を通過する電流を制御することが
出来る回路に、電極を接続することにより、回路が完成される。

【０００５】経皮的に送り込まれる種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の電荷に依存して、アノードまた
はカソードのいずれかが作用電極、即ちドナー電極であることが出来る。したが
って、もし身体中に送り込まれるべきイオン物質が正に荷電されているならば、
正電極（アノード）が作用電極でありそして負電極（カソード）が、回路を完成
する対向電極として役に立つだろう。他方、もし送り込まれるべきイオン物質が
負に荷電されているならば、カソード電極が作用電極でありそしてアノード電極
が対向電極であろう。別法として、アノードとカソードとの両方が身体中に適当
な荷電の医薬を送り込むために用いられることが出来る。この場合において、両
方の電極が作用電極、即ちドナー電極であると考えられる。言い換えれば、アノ
ード電極が正に荷電された薬剤を送り込むことが出来、その一方で、カソード電
極が負に荷電された薬剤を身体中に送り込むことが出来る。

【０００６】現存する電気輸送装置は、身体中に送り込まれるべきである治療薬の液貯め（
ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）または源（ｓｏｕｒｃｅ）をさらに必要とする。そのよう
な医薬液貯めは１種またはそれ以上の所望の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）または薬剤の
固定したまたは更新可能な源を提供するために電気輸送装置のアノードまたはカ
ソードに接続される。液貯めおよび源の例は、Ｊａｃｏｂｓｅｎの米国特許第４
，２５０，８７８号に記載されているようなパウチ；Ｗｅｂｓｔｅｒの米国特許
第４，３８２，５２９号に開示されているような予め形成されたゲル体；およびＳａｎｄｅｒｓｏｎ等の米国特許第４，７２２，７２６号の図面に開示されて
いるような医薬の液体溶液を保持するガラスまたはプラスチックの容器を包含す
る。

【０００７】本明細書において特に興味のあるものの中に、経口送り込みのような極めて通
常の医薬投与経路を用いると問題があるので、ペプチド類、ポリペプチド類およ
びたんぱく質類の経皮送り込みがある。ポリペプチドおよびたんぱく質の分子は
胃腸管中のたんぱく質分解酵素により非常に分解を受けやすくそして経口的に摂
取された場合に広範な肝臓の代謝に付される。したがって、これらの物質は患者
の血液において治療水準を達成させるために通常非経口投与を必要とする。最も
慣用的な非経口投与技術は、皮下注射および静脈内投与である。しかしながら、
ポリペプチド類およびたんぱく質類は、それらの生物学的活性において、本来的
に短い作用であり、必要とされる治療的に有効な水準を維持するために、頻繁な
注射、多くの場合１日に数回の注射を必要とする。患者はしばしば、この治療を
面倒で且つ苦痛であるとしている。そのような治療はまた、例えば感染の危険性
を包含する。

【０００８】医薬ポリペプチドおよびたんぱく質類の有効な投与のために（非経口注射以外
の）他の経路を見い出すために多くの努力が費やされてきた。一層少ない副作用
ならびに良好な患者順応性を有する投与経路が特に興味ある経路であった。その
ような別の経路は、ポリペプチド／たんぱく質が、胃の低いｐＨ環境を通過した
後にカプセルまたは他の容器から放出される“遮蔽された（ｓｈｉｅｌｄｅｄ）
”経口投与、粘膜組織を通過させての、例えば吸入器を用いて肺の粘膜組織を通
過させてのまたは鼻内噴霧を用いての鼻腔粘膜を通過させての送り込みまたは植
え込み可能なポンプを一般に包含した。残念なことには、ポリペプチド／たんぱ
く質送り込みのこれらの別の経路によっては、ほんの限られた成功にしか得られ
なかった。

【０００９】多くの調査研究者は、ポリペプチド類およびたんぱく質類の電気輸送送り込み
を開示した。Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９８６）７５：第７３８頁における
Ｒ．Ｂｕｒｎｅｔｔｅ等による初期の研究は、甲状腺刺激ホルモン放出性ホルモ
ン、小さなトリペプチド分子のインビトロ皮膚浸透を包含した。電気輸送フラッ
クスは受動的拡散性フラックスよりも高いことが分かった。インビトロおよびイ
ンビボの両方の研究において、Ｃｈｉｅｎ等によるＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（
１９８８）：第３７６頁は、電気輸送を介してバソプレシンおよびインシュリン
の経皮送り込みが可能であったことを示した。また、ミニ小豚におけるカルシト
ニンの電気輸送送り込みを開示する米国法定発明登録（Ｕ．Ｓ．Ｓｔａｔｕｔｏ
ｒｙＩｎｖｅｎｔｉｏｎＲｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）第Ｈ１１６０号を参
照。

【００１０】しかしながら、ポリペプチド類およびたんぱく質類の経皮送り込みにはまた、
技術的困難性がある。例えば、電極と医薬溶液または電解質塩溶液との間の界面
での水の加水分解に起因して皮膚刺激が起こる可能性がある。そのような加水分
解の生成物、アノードでのヒドロニウムイオンおよびカソードでのヒドロキシル
イオンは、皮膚中に送り込むための同様な電荷の医薬イオンと競合し、皮膚のｐ
Ｈを変化させ刺激を起こす。Ｐｈｉｐｐｓ等の米国特許第５，５３３，９７１号
は、一層詳細にこの問題を記載し皮膚刺激を減少させるために、ヒスチジン緩衝
剤を包含する、アミノ酸緩衝剤の使用を報告している。

【００１１】さらに、ある種のポリペプチド類、特に治療される動物にとって本来的でない
ポリペプチド類は、皮膚反応、例えば感作、または刺激を起こす可能性がある。
多くのポリペプチド類はまた、不安定でありそして迅速に劣化する。これに関し
て、１９９３年７月８日に公開されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／１２８１２号
は成長ホルモン配合物を化学的に安定化するためにヒスチジン緩衝剤の使用を記
載している。さらに、或る種のポリペプチド医薬は、水溶液中で迅速に凝集し、
これは送り込みおよび溶解性の両方において問題を起こす可能性がある。

【００１２】例えば、医薬配合物のための関連する濃度で、水性インシュリンは二量体を形
成する傾向を有し、これは次に、自己会合して四量体、六量体、積層六量体（ｓ
ｔａｃｋｅｄｈｅｘａｍｅｒｓ）および他の重合体種を形成し、同時に溶解度
を減少させる。これらの凝集物は、連続送り込み装置の機械部品を閉塞しそして
、たとえ不可能でないにしても、経皮的に送り込むことが困難である。この傾向
はインシュリンの活性を安定化しそして延長化するためにインシュリン配合物に
おいて伝統的に用いられる、亜鉛のような金属の存在により悪化増大される。

【００１３】インシュリンのようなたんぱく質の自己会合を減少させるための試みがなされ
て来た。例えば、Ｏｇｉｓｏ等によるＢｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，（１９
９６）１９：第１０４９頁〜第１０５４頁は、経皮吸収のまえにブタのインシュ
リンオリゴマーの解離を促進するためにＧｌｙ−ＨＣｌ緩衝液の使用を報告して
いる。Ｂｒｉｎｇｅｒ等によるＤｉａｂｅｔｅｓ（１９８１）３０：第８３頁〜
第８５頁はジカルボキシルアミノ酸、ＡｓｐおよびＧｌｕが、それらの等電ｐＨ
で溶液中のインシュリンの凝集を減少させることを報告している。それらの実験
は、これらのアミノ酸を用いて凝集を遅延化させるために酸性のｐＨ（３．５）
が必要であると思われることを説明している。しかしながら、インシュリンは酸
中で化学的に不安定である。Ｓｉｂａｌｉｓ等の米国特許第４，９４０，４５６
号は、尿素、プロピル尿素、沃化カリウム、過塩素酸ナトリウムまたはグァニジ
ン塩酸塩を、解離剤として含む、電解的経皮輸送のためのインシュリン組成物を
記載している。

【００１４】自己会合に対する傾向を減少させた、インシュリン類似体の開発も報告されて
いる。例えば、Ｂａｌｓｃｈｍｉｄｔ等の米国特許第５，１６４，３６６号には
、Ｐｈｅ^B24またはＰｈｅ^B25のような或る種のアミノ酸を欠失しているインシュ
リン類似体が記載されている。１９９２年８月６日に公開されたＰＣＴ国際公開
第ＷＯ９２／１２９９９号は、選択されたアミノ酸残基を、ＡｓｐおよびＧｌｕ
残基と置換させたヒトインシュリン類似体を記載している。１９８７年３月１８
日に公告されたＥＰ特許公告第２１４，８２６Ｂ１号は本来のアミノ酸を置換さ
せた残基が一層親水性である、特にＢ９−Ｂ１２領域およびＢ２６−Ｂ２８位置
においてアミノ酸置換を有するインシュリン類似体を報告している。好ましいア
ミノ酸置換基はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅを包含する
。しかしながら、これらの類似体の多くは減少した生物学的活性を示す。

【００１５】したがって、経皮送り込みに関して、インシュリンのようなポリペプチド医薬
の自己会合を減少させる別の方法が望ましいであろう。

【００１６】（発明の開示）したがって、本発明はインシュリンおよび他の生物学的に活性なポリペプチド
類の自己会合を防止する一方で、同時にそのような分子の溶解化を助けるための
方法を提供する。本方法はヒスチジン化合物を使用し自己会合を減少させること
によって電気輸送および受動的経皮送り込みのような送り込みによって、治療的
に有効な量で経皮的にたんぱく質類の一層有効な送り込みを可能にする。

【００１７】したがって、１つの態様において、本発明はポリペプチド類のオリゴマー形成
を減少させる方法に関する。本方法はポリペプチドを、このポリペプチドの自己
会合する傾向を減少させるのに十分な量のヒスチジン化合物と一緒にすることか
らなる。特に好ましい方法において、ヒスチジン化合物はＬ−ヒスチジンまたは
Ｌ−グリシル−ヒスチジンでありそしてポリペプチドは、亜鉛を含有するかまた
は亜鉛を含有しないインシュリン化合物、例えば亜鉛を含有しないヒトインシュ
リン化合物またはヒトＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29インシュリン類似体である。

【００１８】他の態様において、本発明はヒトインシュリン化合物の六量体およびそれより
大きな種の形成を減少させる方法に向けられている。本方法は約ｐＨ７〜約ｐＨ
８でインシュリン化合物をヒスチジン化合物と一緒にすることからならなる。ヒ
スチジンの濃度は少なくとも約１０ミリモル（１０ｍＭ）である。

【００１９】なお他の態様において、本発明は電気輸送により身体表面を通過させてポリペ
プチド剤を送り込む方法に向けられている。その方法は：（ａ）該ポリペプチドとヒスチジン化合物とを含む組成物を用意し、しかも
該ヒスチジン化合物は該ポリペプチドの自己会合する傾向を減少させるのに十分
な量で該組成物中に存在し；そして（ｂ）電気輸送により身体表面を通過させて該組成物を送り込む；ことからなる。

【００２０】他の態様において、本発明は電気輸送により身体表面を通過させてヒトインシ
ュリン化合物を送り込む方法に向けられている。その方法は：（ａ）約ｐＨ７〜約ｐＨ８で、該インシュリン化合物とヒスチジン化合物と
を含む組成物を用意し、しかも該ヒスチジン化合物の濃度は約１０ミリモル〜約
２５０ミリモルであり；（ｂ）電気輸送により身体表面を通過させて該組成物を送り込む；ことからなる。

【００２１】なお他の態様において、本発明は受動的経皮送り込みにより身体表面を通過さ
せてヒトインシュリン化合物を投与する方法に向けられている。その方法は：（ａ）前記インシュリン化合物およびヒスチジン化合物を含む組成物を用意
し、しかも前記ヒスチジン化合物は前記インシュリンの自己会合する傾向を減少
させるのに十分な量で前記組成物中に存在し；そして（ｂ）受動的経皮送り込みにより、身体表面を通過させて該組成物を投与す
る；ことからなる。

【００２２】本発明のこれらのおよび他の態様は、本明細書においての開示からみて、当業
者にとって容易に想起されるだろう。

【００２３】図面の簡単な記載：図１は、ｐＨ７．５で六量体当たり２つの亜鉛結合を有する本来型ヒトインシ
ュリンの溶解度がヒスチジン濃度の増加により影響をうけることを示す。図２は、本発明とともに使用されることが出来る代表的な電気輸送医薬送り込
み装置の図解的図である。図３は、本発明とともに使用されることが出来る代表的な受動的経皮医薬送り
込み装置の横断面図である。図４は、本発明とともに使用されることが出来る別の受動的経皮医薬送り込み
装置の横断面図である。図５は、実施例において第III表から得られた２４０ｍＭのヒスチジンデータについてのインシュリン濃度の関数として亜鉛を含有しないＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29 ヒトインシュリンの平均分子量を描くグラフである。図６は、実施例において第III表から得られた０ｍＭのヒスチジンデータについてのインシュリン濃度の関数として亜鉛を含有しないＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29ヒト
インシュリンの平均分子量を描くグラフである。図７は、実施例において第IV表から得られた２４０ｍＭのヒスチジンデータに
ついてのインシュリン濃度の関数として亜鉛を含有しない本来型ヒトインシュリ
ンの平均分子量を描くグラフである。図８は、実施例において第IV表から得られた０ｍＭのヒスチジンデータについ
てのインシュリン濃度の関数として亜鉛を含有しない本来型ヒトインシュリンの
平均分子量を描くグラフである。

【００２４】発明の詳細な記載：他のように示されない限り、本発明の実施において、当業界内のたんぱく質化
学、電気化学および生化学の分野において慣用の方法を使用する。そのような技
術は文献において十分に説明されている。例えばＴ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎに
よる、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（１９９３年Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍ
ｐａｎｙ発行）；Ａ．Ｌ．ＬｅｈｎｉｎｇｅｒによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（１９７５年ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＩｎｃ．発行）；Ｊ．Ｓ．Ｎ
ｅｗｍａｎによるＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ（１９７３
年、ＰｒｅｎｔｉｃｅＨａｌｌ発行）；およびＡ．Ｊ．ＢａｒｄおよびＬ．Ｒ
．ＦａｕｌｋｎｅｒによるＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，
ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８０年
ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ発行）を参照。

【００２５】この明細書においてそして特許請求の範囲において使用された単数形（ａ，ａ
ｎ，ｔｈｅ）は、内容から明かに異なる場合を除いて、複数形をも含むものであ
る。したがって、例えば“ポリペペチド”といった場合、２種またはそれ以上の
ポリペプチドの混合物等を包含する。

【００２６】以下のアミノ酸略語が本明細書を通して用いられる。

【表１】

【００２７】Ｉ．定義：本発明を記載するにあたって、以下の用語が使用され、そして以下に示される
とおりに定義されることが意図される。

【００２８】用語“ポリペプチド”、“ポリペプチド剤”および“ポリペプチド医薬”はア
ミノ酸残基の任意の生物学的活性重合体を示すために本明細書において互換的に
使用される。これらの用語は、ペプチド類、オリゴペプチド類、二量体類、多量
体類、等を包含する。このようなポリペプチド類は、天然源から由来することが
出来るか、あるいは合成されることが出来るかまたは組み換え的に生成されるこ
とが出来る。これらの用語はまた、該ポリペプチドの発現後変性（ｐｏｓｔｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、例えばグリコシル化、アセチ
ル化、りん酸化、等を包含する。

【００２９】本明細書において定義されるものとして、ポリペプチド医薬またはポリペプチ
ド剤は、上に挙げられた２０種の天然アミノ酸の１種またはそれ以上から一般に
形成されそしてまた、天然に存在する類似体および合成された類似体の、任意の
幾種かの既知のアミノ酸類似体、例えばホモイソロイシン、２−（メチレンシク
ロプロピル）グリシン、Ｓ−メチルシスティン、Ｓ−（プロペ−１−エニル）シ
スティン、ホモセリン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ホモアルギニ
ン、３−（３−カルボキシフェニル）アラニン、シクロヘキシルアラニン、ミモ
シン（ｍｉｍｏｓｉｎｅ）、ピペコリン酸、４−メチルグルタミン酸、カナバニ
ン、２，３−ジアミノプロピオン酸、等を包含していてもよいが、しかしそれら
に限定されない。該ポリペプチドはまた、中性形または塩形、例えば（類似体ポ
リペプチド類の遊離のアミノ基とともに形成されそして）塩酸または燐酸のよう
な無機酸、または酢酸、こはく酸、マレイン酸、酒石酸、マンデル酸、等のよう
な有機酸を用いて形成される酸付加塩の形で存在することが出来る。遊離カルボ
キシル基から形成された塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基およびイソプロピルアミン
、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、等のような有
機塩基から誘導されることが出来る。本発明において使用を見い出すであろうポ
リペプチド剤の例は下に記載される。

【００３０】本明細書において使用されるものとして用語“インシュリン化合物”は天然（
本来の）インシュリンまたはプロインシュリンに対して類似のまたは同一の分子
構造を有する化合物を言い、それらは本来型インシュリンまたはプロインシュリ
ンに対して類似または同一の第３次立体配座を有し、そしてインシュリン活性、
即ち血液グルコース水準を調節する能力を維持する分子を包含する。そのような
化合物は、変性がインシュリン活性を損傷しない限り、本来（生来）の分子に関
連して、アミノ酸付加、置換および欠失を包含することが出来る。本来型インシ
ュリンに関連してアミノ酸置換を有するインシュリン化合物の例は、Ｌｙｓ^B28 Ｐｒｏ^B29ヒトインシュリンおよびＡｓｐ^B28ヒトインシュリンを包含する。さら
に、本発明の目的のために、インシュリン化合物は、ヒト、ウシ、イヌ、ウマ、
ヒツジ、ブタ、クジラ、等のような任意の哺乳動物源から由来してよい。インシ
ュリン化合物は、源の生体の膵臓から直接に精製されることが出来るかあるいは
組み換え的にまたは合成的に生成されることが出来る。インシュリンを得る種々
の方法について、例えば、Ｂｒａｎｇｅ，ＪによるＧａｌｅｎｉｃｓｏｆＩ
ｎｓｕｌｉｎ，ＴｈｅＰｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＰｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓｏｆＩｎｓｕｌｉｎａｎｄＩ
ｎｓｕｌｉｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ発
行）を参照。

【００３１】さらに、本明細書において用いられるものとして用語“インシュリン化合物”
は、随伴金属を有するかまたは随伴金属を有しないインシュリン化合物を示す。
これに関して、亜鉛およびカルシウムのような金属は、インシュリンの活性を延
長させるだけでなく、さらにその分子の物理的安定性を増大させることが分かっ
た。したがって、本方法において使用されるためのインシュリン化合物は、限定
されることなく、金属を有しないインシュリンのみでなく、約２Ｚｎ²⁺分子／六
量体〜約４Ｚｎ²⁺分子／六量体を有するインシュリンを包含する（しかしそれら
に限定されない）、適当な金属を伴っているインシュリンを包含する。そのよう
な化合物そしてまたその製造方法の記載について、例えば米国特許第４，４７６
，１１８号参照。本発明とともに使用するためのインシュリン化合物の追加の例
は下に十分に記載される。

【００３２】本明細書において使用されるものとして用語“ヒスチジン化合物”は下に定義
される通りの一定のポリペプチド類のオリゴマー形成を減少させる能力を維持し
ているアミノ酸Ｌ−ＨｉｓならびにＬ−Ｈｉｓのアミノ酸類似体を言う。そのよ
うな類似体は、限定されることなしにＨｉｓを含有するジペプチド類およびトリ
ペプチド類を包含し、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ａｌａ−Ｈｉｓ、３メ
チル−Ｈｉｓ、１メチル−Ｈｉｓ、カルノシン、Ｈｉｓ−ＳｅｒおよびＨｉｓ−
Ａｌａのようなものである（しかしそれらに限定されない）。

【００３３】ポリペプチドが自己会合して、四量体、六量体、積層六量体および他の重合体
のようなオリゴマーを生ずる場合においてヒスチジン化合物が一定のポリペプチ
ドの“オリゴマー形成を減少させる”とは、そのヒスチジン化合物の存在により
、遅延化される（例えば、オリゴマー形成が少なくとも部分的に防止される）か
あるいは逆転される（例えば、既に凝集されたポリペプチドが解離される）かの
いずれかである。オリゴマー形成を減少させるヒスチジン化合物の能力は、当該
ヒスチジン化合物の存在下または不存在下に、オリゴマー種の存在を評価するこ
とにより決定することが出来る。そのような形成は、実施例に記載されているよ
うな沈降平衡研究のような、分析超遠心分離（例えば、１９９４年Ｂｉｒｋｈ＠
ｕｓｅｒ発行ＳｃｈｕｓｔｅｒおよびＬａｕｅ編集ＭｏｄｅｒｎＡｎａｌｙｔ
ｉｃａｌＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ；および１９９２年Ｔｈｅ
ＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ発行Ｈａｒｄｉｎｇ
、ＲｏｗｅおよびＨｏｒｔｏｎ編集ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＵｌｔｒａｃｅｎｔ
ｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｏｌｙｍ
ｅｒＳｃｉｅｎｃｅ参照）；分光測光測定法（例えば、Ｏｇｉｓｏ等による、
Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９９６）１９：第１０４９頁〜第１０５
４頁参照）；浸透圧測定法、ゲル濾過、等を用いて調べることが出来る。そのよ
うな方法の記載について、例えば１９７９年ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ発行
ＶａｌｄｅｓおよびＡｃｋｅｒｓによるＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１（ＨｉｒｓおよびＴｉｍａｓｈｅｆｆ編集Ｅｎｚｙｍｅ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＰａｒｔＨ）第１２５頁〜第１４２頁参照。

【００３４】用語“受動的経皮送り込み”は、適用される起電力の助けによることなしに、
全身の循環を介しての分布に利用出来る１種またはそれ以上の医薬的に活性なポ
リペプチド剤の身体表面（例えば皮膚）を通過させての送り込みを言う。受動的
経皮送り込みは、皮膚への直接適用、経皮パッチ類（ｐａｔｃｈｅｓ）、制御さ
れた送り込みを提供するための膜調整されたシステム（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｍｏ
ｄｅｒａｔｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）、接着剤拡散−制御システム（ａｄｈｅｓｉ
ｖｅｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）、マトリ
ックス分散タイプシステムおよび微小液貯めシステム（ｍｉｃｒｏｒｅｓｅｒｖ
ｏｉｒｓｙｓｔｅｍｓ）を、制限されることなしに、包含する多くの手段を用
いて達成されることが出来る。そのようなシステムは当業界に知られておりそし
て１９９５年ペンシルベニア州イーストンのＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙ発行のＲｅｍｉｎｇｔｏｎによるＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎ
ｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ第１９版において詳細に論じら
れている。浸透増進剤が皮膚を通過させての吸収を容易にするために用いられる
ことが出来る。そのような浸透増進剤は、水、メタノール、エタノール、２−プ
ロパノール、等を包含するアルコール類、アルキルメチルスルホキシド類、ピロ
リドン、ラウロカプラム（ｌａｕｒｏｃａｐｒａｍ）、アセトン、ジメチルアセ
トアミド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフルフリルアルコールのような
溶媒；界面活性剤；および尿素、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、等のよう
な化学剤を包含する。

【００３５】用語“電気輸送（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｒｔ）”、“イオン電気導入
（法）（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）”および“イオン電気導入（法）的（ｉ
ｏｎｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）”は、薬剤含有液貯めへの適用された起電力により
１種またはそれ以上の医薬的に活性なポリペプチド剤の身体表面（例えば皮膚）
を通過させての送り込みを言うために本明細書において使用される。その薬剤は
電気泳動（エレクトロミグレーション：ｅｌｅｃｔｒｏｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、
電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、電気浸透またはそれらの任意の組み
合わせにより送り込まれてもよい。電気浸透はまた、電気液体運動（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｈｙｄｒｏｋｉｎｅｓｉｓ）、電気還流（エレクトロコンベクション：ｅｌ
ｅｃｔｒｏｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ）、および電気的に誘導された浸透とも呼ばれ
ている。一般に、組織中への種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の電気浸透は、治療用種液貯
めへの起電力の適用の結果として、種を含有している溶媒の移動、即ち他のイオ
ン種の電気泳動（エレクトロミグレーション：ｅｌｅｃｔｒｏｍｉｇｒａｔｉｏ
ｎ）により誘発された溶媒の流れから生ずる。電気輸送の処置中、皮膚中に一時
的に存在する孔の形成のような皮膚の或る種の変更または変化を起こさせてもよ
く、これは“電気穿孔”と称される。身体表面への変更または変化（例えば、皮
膚中の孔の形成）により増進される種の任意に電気的に助けられる輸送はまた、
本明細書において用いられるものとしての用語“電気輸送”に包含される。した
がって、本明細書において用いられるものとして、用語“電気輸送”、“イオン
電気導入（法）”、“イオン電気導入（法）的”は、（１）電気泳動（エレクト
ロミグレーション）により荷電された薬剤の送り込み、（２）電気浸透の方法に
よる、荷電されていない薬剤の送り込み、（３）電気穿孔法による、荷電された
または荷電されていない薬剤の送り込み、（４）電気泳動および電気浸透の組み
合わされた方法による、荷電された薬剤の送り込み、そして（または）（５）電
気泳動および電気浸透の組み合わされた方法による、荷電された薬剤と荷電され
ていない薬剤との混合物の送り込みを言う。

【００３６】標準の測定方法を用いて測定されたとき、ヒスチジン化合物の不存在下のフラ
ックスに比較して、ヒスチジン化合物の存在下に身体表面（例えば皮膚または粘
膜）を通過するポリペプチドの電気輸送フラックスが増大される場合に、ポリペ
プチドは“高められた電気輸送”を示す。例えば、経皮電気輸送フラックスは当
業界において周知の多くのインビボまたはインビトロ方法を用いて評価されるこ
とが出来る。インビトロ方法は、皮膚細片の角質層側をドナー区画に面するよう
にして、適当な動物の皮膚（例えばヒトの死体の皮膚）の細片を電気輸送フラッ
クスセルのドナー区画とリセプター区画との間に固定することを包含する。送り
込まれるべき医薬を含有する液体溶液またはゲルを該角質層と接触して配置しそ
して各々の区画に１つの電極がある、それらの電極に電流を適用する。経皮フラ
ックスはリセプター区画における医薬の量をサンプル採取することにより計算さ
れる。経皮電気輸送医薬送り込みを最適化するために用いられる２つの成功した
方法は、Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｈｅｉｔ等によるＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９９
３）８２：第２４０頁〜第２４３頁の単離されたブタ皮膚フラップモデル及び毛
のない齧歯類動物又はギニァピッグからの単離された毛のない皮膚の使用である
。Ｈａｄｚｉｊａ等によるＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９２）
４４：第３８７頁〜第３９０頁参照。また、インシュリンの経皮吸収を評価する
方法の記載について、Ｏｇｉｓｏ等によるＢｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（
１９９６）１９：第１０４９頁〜第１０５４頁参照。

【００３７】II．本発明を実施する態様：本発明は、ポリペプチド分子の自己会合を減少させ、それにより非処理ポリペ
プチドの送り込みに比較して、ポリペプチド分子の経皮送り込みを高めるために
ヒスチジン化合物の使用に関する。それ故に、本方法は多数の物質の経皮送り込
みの高められた効率を可能にしそして他の方法ではそのような送り込みに順応出
来ない分子の経皮送り込みを可能にする。さらに、本方法はそのように処理され
たポリペプチド剤の溶解度を増大させそして別の内因性物質の凝集に対して起こ
る可能性がある免疫反応の潜在的可能性を減少させることができる。

【００３８】本発明は、真核生物源、原核生物源およびウィルス源ならびに合成ペプチド類
から由来する多種のポリペプチドのような凝集する傾向を有する広い種々のたん
ぱく質およびポリペプチド剤を用いる場合に使用できる。そのようなポリペプチ
ド類は、抗生物質、抗ウィルス薬、抗新生物（腫瘍）薬、免疫調節薬であるペプ
チド医薬、インシュリン、プロインシュリン、成長ホルモン、ＧＨＲＨ、ＬＨＲ
Ｈ、ＥＧＦ、ソマトスタチン、ＳＮＨ−１１１、ＢＮＰ、インスリノトロピン（
ｉｎｓｕｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）およびＡＮＰのようなペプチドホルモン、そして
ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＳＨおよびｈＣＧのような糖たんぱく質ホルモンを、限定され
ることなしに、包含する。

【００３９】本発明を、インシュリンおよびインシュリン類似体を用いて例示したが、しか
しインシュリン化合物に限定されない。六量体構造および“積層六量体（ｓｔａ
ｃｋｅｄｈｅｘａｍｅｒｓ）”と呼ばれる重合体構造に自己会合するインシュ
リンの傾向に基づいて、本発明を例示するためにインシュリンを選んだ。そのよ
うな会合はポリペプチドの経皮送り込みを阻止しそして送り込みの部位において
刺激を起こす可能性がある。

【００４０】本方法とともに使用するためのインシュリン化合物の例は、例えば、亜鉛イン
シュリンの中性溶液または懸濁液として配合された、ミズリー州セントルイスの
Ｓｉｇｍａ社から市販の組み換え型ヒトインシュリンのような、任意の市販のイ
ンシュリンを包含する。そのようなインシュリンの製剤は、六量体当たり、結合
された最少量の２つの亜鉛イオンを含有しそして約０．２ｍＭ〜約３．０ｍＭ（
１ｍｇ／ｍｌ〜１８ｍｇ／ｍｌ）のインシュリン濃度を有する。しかしながら、
約１７ｍＭのインシュリンまでの高濃度のインシュリンを含むインシュリン製剤
がまた、本方法において使用できる。亜鉛のような金属が存在しないインシュリ
ンがまた、本方法とともに使用されることが出来そしてその濃度は約０．１ｍＭ
〜３０ｍＭの範囲であることが出来る。本方法においてインシュリン化合物とし
て使用するためのインシュリン類似体は、本実施例においてさらに記載されてい
る、Ｈｕｍａｌｏｇ^R インシュリンリスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）注射液として（イ
ンディァナ州インディァナポリスの）Ｌｉｌｌｙ社から市販の、Ｌｙｓ^B28およびＰｒｏ^B29インシュリン；（種々の製造会社から市販されている）ＮＰＨ（ＮｅｕｔｒａｌＰｒｏｔａｍｉｎｅＨａｇｅｄｏｒｎ）およびイソフェンイン
シュリンのようなプロタミンを含有するインシュリン化合物；および（種々の製
造会社から市販されている）ＬｅｎｔｅおよびＢｉｐｈａｓｉｃインシュリンの
ような市販のヒトインシュリン類似体を包含する。例えば、これらのおよび他の
インシュリン化合物の記載について、１９９５年ペンシルベニア州イーストンの
ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ発行のＲｅｍｉｎｇｔｏｎに
よるＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃ
ｙ第１９版参照。

【００４１】本方法において使用するための他のインシュリン類似体は、Ａ−鎖のアミノ酸
位置２、５、６、７、８および１１そしてＢ−鎖のアミノ酸位置５、７、１３お
よび１６で置換された、Ｍａｒｋｉ等によるＺ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（
１９７９）３６０：第１６１９頁〜第１６３２頁に記載されているようなインシ
ュリン類似体；メリーランド州ロックビルでの米国薬局方大会録（Ｇｕｅｒｉｇ
ｕｉａｎ等編集）第８４頁〜第９５頁においてＡｌｂｉｓｓｅｒ等により記載さ
れたような硫酸化インシュリン；（Ｂ−鎖のＮ−末端アミノ酸が欠失した）Ｄｅ
ｓ−Ｐｈｅインシュリン；Ｐｈｅ^B24またはＰｈｅ^B25の欠失のような、或る種の
アミノ酸の追加の欠失を有するインシュリン類似体（Ｂａｌｓｃｈｍｉｄｔの米
国特許第５，１６４，３６６号）；天然アミノ酸を置換した残基が一層親水性で
ありそして一般にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＨｉｓおよびＩｌｅである
、特にＢ９−Ｂ１２領域およびＢ２６−Ｂ２８位置においてアミノ酸置換を有す
るインシュリン類似体（１９８７年３月１８に公告されたＥＰ特許公告第２１４
，８２６Ｂ１号）；選ばれたアミノ酸残基がＡｓｐおよびＧｌｕ残基で置換され
たヒトインシュリン類似体（１９９２年８月６日に公開されたＰＣＴ国際公開第
ＷＯ９２／１２９９９号）等を包含するが、しかしそれらに限定されない。

【００４２】本発明とともに使用するためのヒスチジン化合物はＨｉｓ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−
Ｈｉｓ、Ａｌａ−Ｈｉｓ、３メチル−Ｈｉｓ、１メチル−Ｈｉｓ、（β−Ａｌａ
−Ｈｉｓとしてまた知られている）Ｌ−カルノシン、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ、および、
Ｈｉｓ−Ａｌａのような、Ｈｉｓを含有するジペプチド類およびトリペプチド類
のような、しかしそれらに限定されない、Ｌ−Ｈｉｓおよびその類似体を包含す
る。適当なヒスチジン化合物の選択は当業者の技術内でありそして当該の特定の
ポリペプチドに大部分基づいて決定されるだろう。

【００４３】ヒスチジン化合物は、一般にその等電点で、そして約１ｍＭ〜３３０ｍＭ、さ
らに好ましくは約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭそして最も好ましくは約２５ｍＭ〜約
２５０ｍＭの濃度で存在する。最適のヒスチジン濃度は、インシュリン濃度、他
の塩（例えばＮａＣｌ）の濃度、亜鉛の存在または不存在、保存料（防腐剤）の
存在または不存在、オリゴマーを形成するポリペプチドの傾向、等を包含する多
くの要因により左右される。一般に、ヒスチジンの濃度は少なくとも約１０ｍＭ
である。たんぱく質配合の当業者は、特定の適用または配合において使用される
特定の可変因子（例えばインシュリン濃度、塩濃度、亜鉛の存在または不存在、
保存料ありまたは保存料なし）についての最適のヒスチジンの濃度を容易に決定
することが出来る。

【００４４】ポリペプチドは治療的に有効な量、即ち所望の治療結果を達成させるのに十分
な量で存在する。必要な正確な量は、種（ｓｐｅｃｉｅｓ）、患者の年齢および
一般的な症状、治療される症状の重症度および当該の特定のポリペプチドに依存
して、患者毎に変化する。治療的に有効な投与量は、例えば標準の用量・反応曲
線、等を用いて当業者により容易に決定される。例えば、ポリペプチドがインシ
ュリンであるならば、それは使用される特定のインシュリン化合物に依存してそ
してその分子が結合亜鉛を含んでいるかどうかに依存して、インシュリンは通常
約０．１〜約３０ｍＭ、さらに好ましくは０．２〜約２０ｍＭそして最も好まし
くは約０．３〜約１７ｍＭの濃度で存在する。

【００４５】一般に六量体および積層六量体の形でのインシュリンを含む、市販のヒトイン
シュリンと一緒にＬ−Ｈｉｓが使用される場合、インシュリンは通常約０．２ｍ
Ｍ〜約１７ｍＭ（１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ）の濃度で存在しそしてＬ−
Ｈｉｓは約２５〜２５０ｍＭの濃度で存在する。当業者は本発明の方法において
使用するためにインシュリンおよびＬ−Ｈｉｓの適当な量を容易に決定すること
が出来る。

【００４６】本発明において使用するためのポリペプチド医薬は、負に荷電されているか、
正に荷電されているかまたは中性であることが出来、その選択は、他の要因の中
で、使用される特定のヒスチジン化合物ならびにその所望のｐＨによって左右さ
れる。これらのパラメータの決定は、十分に当業者の技術内にある。例えば、Ｌ
−Ｈｉｓがヒスチジン化合物として用いられそして組成物のｐＨが７〜８である
場合にインシュリン化合物は負に荷電している。

【００４７】一般に最終溶液のｐＨは約ｐＨ６〜約ｐＨ８．５、さらに好ましくはｐＨ７〜
約ｐＨ８である。しかしながら溶液のｐＨはまた、本方法において用いられる特
定のポリペプチド及びヒスチジン化合物に依存して変化させることが出来る。

【００４８】ポリペプチドおよびヒスチジン化合物は、一般に水、食塩水、水性デキストロ
ース、グリセロール、エタノール、等のような医薬的に許容出来る賦形剤中に存
在して、それにより溶液または懸濁液を形成する。所望に応じて、投与されるべ
き医薬組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、保存料、ｐＨ緩衝剤、等のような少量の
非毒性の補助物質、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエ
タノールアミンナトリウムアセテート、オレイン酸トリエタノールアミン、等を
含有することが出来る。適当な賦形剤および添加剤の選択は、大部分、使用され
るポリペプチドおよびヒスチジン化合物により決定される。ポリペプチド配合物
の記載について、例えば１９９５年ペンシルベニア州イーストンのＭａｃｋＰ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ発行のＲｅｍｉｎｇｔｏｎによるＴｈｅ
ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ第１９版
を参照。

【００４９】インシュリン配合物について、そのような物質は、制限されることなしに、メ
チルパラベンおよびフェノール（ｍ−クレゾール）のような保存料；グリセロー
ル、あるいは（一般に約１〜約１００ｍＭのＮａＣｌの濃度で）ＮａＣｌ（しか
しそれに限定されない）を包含する塩のような等張化剤；そして他の添加剤およ
び酢酸ナトリウム、ＮａＰＯ₄、等のような緩衝剤を包含する。インシュリン配合物の記載について、例えば、Ｂｒａｎｇｅ，Ｊ．によるＳｔａｂｉｌｉｔｙ
ｏｆＩｎｓｕｌｉｎ（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓ発行）；Ｂｒａｎｇｅ，Ｊ．によるＧａｌｅｎｉｃｓｏｆＩｎｓｕｌｉｎ
，ＴｈｅＰｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕ
ｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓｏｆＩｎｓｕｌｉｎａｎｄＩｎｓｕｌｉｎ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ発行）；およびペ
ンシルベニア州イーストンのＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ
の１９９５年発行ＲｅｍｉｎｇｔｏｎによるＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ
ＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ第１９版を参照。

【００５０】いったんヒスチジンを有する所望のポリペプチド配合物が造られたならば、そ
れは任意の幾つかの経皮医薬送り込みシステムを用いて患者に送り込まれること
が出来そして送り込みは１つの特定のシステムの使用に限定されない。電気輸送
医薬送り込みシステムの例は、例えば、Ｍｙｅｒｓ等の米国特許第５，３１２，
３２６号、Ｔｈｅｅｕｗｅｓ等の同第５，０８０，６４６号、Ｇｙｏｒｙ等の第
５，３８７，１８９号およびＧｙｏｒｙ等の第５，１６９，３８３号（これらの
特許の開示を参照することにより本明細書に組み入れる）において記載されてい
る。

【００５１】図２は、本方法と一緒に用いられることが出来る代表的な電気輸送送り込み装
置を例示する。装置１０は上部ハウジング１６、回路板アセンブリ１８、下部ハ
ウジング２０、アノード電極２２、カソード電極２４、アノード液貯め２６、カ
ソード液貯め２８および皮膚順応適合性接着剤３０を含む。上部ハウジング１６
は患者の皮膚上に装置１０を保持するのを助ける横方向の翼１５を有する。上部
ハウジング１６は射出成形可能なエラストマー（例えばエチレンビニルアセテー
ト）から形成されるのが好ましい。印刷回路板アセンブリ１８は、個別部品４０
に結合された集積回路１９およびバッテリー３２を含む。回路板アセンブリ１８
は開口１３ａおよび１３ｂ中を通過している支柱（図２において図示されていな
い）によりハウジング１６に取り付けられ、支柱の末端は回路板アセンブリ１８
をハウジング１６に加熱固定するために加熱／溶融される。下部ハウジング２０
は接着剤３０により上部ハウジング１６に取り付けられ、接着剤３０の上部表面
３４は、下部ハウジング２０そして翼１５の底部表面を包含する上部ハウジング
１６の両方に接着される。

【００５２】回路板アセンブリ１８の下面にボタンセルバッテリー３２が（部分的に）示さ
れる。他のタイプのバッテリーがまた、パワー装置１０に使用されることが出来
る。

【００５３】この装置１０は、一般に、バッテリー３２、電子回路１９、４０、電極２２、
２４および医薬／化学剤液貯め２６、２８から構成され、それらのすべては自己
完備（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）ユニット中に一体化される。回路板アセ
ンブリ１８の出力口（ｏｕｔｐｕｔｓ）（図２において図示せず）は、電気的に
伝導性の接着剤ストリップ４２、４２’により、下部ハウジング２０に形成され
たくぼみ２５、２５’中に形成された開口２３、２３’を通過して電極２４およ
び２２と電気的接触する。次に、電極２２および２４は、医薬液貯め２６および
２８の上面４４’、４４と直接に機械的および電気的接触している。医薬液貯め
２６および２８の底面４６’、４６は、接着剤３０における開口２９’、２９を
介して患者の皮膚と接触している。

【００５４】装置１０は、場合により、患者が電気輸送により或る投与量の医薬を自己投与
することを可能にする特徴を有する。押しボタンスィッチ１２を押した際に、所
定の長さの送り込み間隔で、回路板アセンブリ１８上の電子回路が電極／液貯め
２２、２６および２４、２８に所定のＤＣ電流を送り出す。押しボタンスィッチ
１２は、装置１０の上面上に使いやすく配置されておりそして衣服を通して容易
に始動される。短い時間期間、例えば３秒内に、押しボタンスィッチ１２の２回
押しは、好ましくは医薬送り込みのために装置を始動させて、それにより、装置
１０の不注意な作動化の恐れを最少にするために使用される。好ましくは装置は
、例えば、“ビーパー（ｂｅｅｐｅｒ）”からの、明るく輝くシグナルそして（
または）可聴音シグナルとなるＬＥＤ１４により、医薬送り込み間隔の開始の可
視的および（または）可聴性の確認を使用者に伝える。医薬は所定の送り込み間
隔にわたって、例えば腕上で、電気輸送により患者の皮膚を通過して送り込まれ
る。

【００５５】アノード電極２２は好ましくは銀から形成されそしてカソード電極２４は好ま
しくは塩化銀から形成される。液貯め２６および２８の両方は好ましくは重合体
ヒドロゲル材料から形成される。電極２２、２４および液貯め２６、２８は、下
部ハウジング２０内のくぼみ２５’、２５内に維持される。

【００５６】押しボタンスィッチ１２、回路板アセンブリ１８上の電子回路およびバッテリ
３２は、上部ハウジング１６と下部ハウジング２０との間に接着的に“シールさ
れて”いる。上部ハウジング１６は好ましくはゴムまたは他のエラストマー材料
から形成される。下部ハウジング２０は好ましくは、くぼみ２５、２５’を形成
するように容易に成形されることが出来そして開口２３、２３’を形成するよう
に容易にカットされることが出来るプラスチックまたはエラストマーシート材料
（例えばポリエチレン）から形成されている。組み立てられた装置１０は好まし
くは耐水性（即ちはね防止性）でありそして最も好ましくは防水性である。その
システムは、身体に容易に順応して、それにより装着部位でそしてその周りで自
由な運動を可能にする薄い形を有する。液貯め２６および２８は装置１０の皮膚
接触面上に配置されておりそして通常の取り扱いおよび使用中の思いがけない電
気ショートを防止するために十分に分離されている。

【００５７】装置１０は、上面３４および身体接触面３６を有する周囲接着剤３０により患
者の身体表面（例えば皮膚）に接着する。接着面３６は、通常の使用者の活動中
に装置１０を身体上の適所に維持しそしてなお、所定の装着期間（例えば２４時
間）後に適当に取り外しを可能にするのを確実にする接着性を有している。上部
接着面３４は下部ハウジング２０に接着しそして上部ハウジング１６に取り付け
られた下部ハウジング２０を維持する。

【００５８】液貯め２６および２８は、一般にゲルマトリックスを含み、医薬溶液が液貯め
２６及び２８の少なくとも１つに均一に分散している。約１ｘ１０^-4Ｍ〜１．０
Ｍまたはそれ以上の範囲の医薬濃度が使用されることが出来、その範囲の低い方
の医薬濃度が好ましい。ゲルマトリックスのための適当な重合体は、任意の非イ
オン性合成および（または）天然に存在する重合体材料から本質的になっていて
よい。活性剤が極性および（または）イオン化出来る場合は、その活性剤の溶解
性を高めるために、極性の種類が好ましい。場合によりゲルマトリックスは水膨
潤性である。適当な合成重合体の例は、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（２−ヒ
ドロキシエチルアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシプロピルアクリレート）
、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（ｎ−メチロールアクリルアミド
）、ポリ（ジアセトンアクリルアミド）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリ
レート）、ポリ（ビニルアルコール）およびポリ（アリルアルコール）を包含す
るが、しかしそれらに限定されない。ヒドロキシ官能性縮合重合体（即ち、ポリ
エステル類、ポリカーボネート類、ポリウレタン類）はまた、適当な極性合成重
合体の例である。ゲルマトリックスとして使用するために適当である極性の天然
に存在する重合体（またはその誘導体）は、セルロースエーテル類、メチルセル
ロースエーテル類、セルロースおよびヒドロキシル化セルロース、メチルセルロ
ースおよびヒドロキシル化メチルセルロース、グァガム、ローカストガム、カラ
ヤガム、キサンタンガムのようなガム類、ゼラチンおよびそれらの誘導体が例示
される。イオン性重合体はまた、有効な対イオンが医薬イオンであるかあるいは
活性剤に関して反対に荷電されている他のイオンであることを条件として、マト
リックスのために用いられることが出来る。

【００５９】したがって、本発明のポリペプチド／ヒスチジン配合物は、医薬液貯め、例え
ば直前に記載されたようなゲルマトリックス中に導入されそして場合により上に
例示されたとおりの電気輸送医薬送り込みシステムを用いて患者に投与される。
医薬溶液の導入は、任意の多くの方法、即ち液貯めマトリックス中に溶液を吸収
させる（ｉｍｂｉｂｉｎｇ）ことにより、ヒドロゲル形成の前に医薬溶液をマト
リックス材料と混合することにより、等により行われることが出来る。

【００６０】本発明の他の態様において、受動的経皮送り込みを、本発明のポリペプチド／
ヒスチジン配合物を投与するために用いることが出来る。本発明は特に限定され
ないで広い種々の受動的経皮システムと一緒に用いられることが出来ることは当
業者により認識されよう。受動システムの例について、Ｃａｍｐｂｅｌｌ等の米
国特許第４，３７９，４５４号、Ｇａｌｅ等の同第４，５８８，５８０号、Ｃａ
ｍｐｂｅｌｌ等の同第４，８３２，９５３号、Ｇａｌｅ等の同第４，６９８，０
６２号、Ｃａｍｐｂｅｌｌ等の同第４，８６７，９８２号およびＨｕｎｔ等の同
第５，２６８，２０９号を参照することが出来るが、しかしそれらに限定されず
、開示されたシステムは任意に本発明とともに用いられることが出来る。受動的
経皮送り込み装置の２つの例が図３および図４において例示される。

【００６１】図３において、受動的経皮送り込み装置８８は経皮的に送り込まれるべき配合
物を含有する液貯め９０を含む。液貯め９０は好ましくは中に分散されて配合物
を含有するマトリックスの形にある。液貯め９０は、薬剤に不浸透性である裏当
て（ｂａｃｋｉｎｇ）層９２と任意速度制御膜９４との間にサンドイッチされて
いる。図３において、液貯め９０は、その形状を維持するのに十分に粘性である
、重合体のような材料から形成される。もし水性ゲルのような低い粘度の材料が
液貯め９０のために用いられるならば、漏れを防止するために裏当て層９２と速
度制御膜９４とは一緒になってそれらの周囲のあたりでシールされる。その皮膚
に面する表面上に、接続用媒体６５を有する皮膚突き刺しデバイス２が膜９４の
下に配置されており、該接続用媒体６５は該デバイス２中の開口（図示せず）を
通過して延びて膜９４に接触している。装置８８は該デバイス２の周囲で接触接
着剤層９６によりそして場合により、まえに記載された態様のいずれかの固定要
素により身体表面に接着する。ほとんどの場合において接続用媒体６５は始めに
薬剤を含有する。引き剥がすことが出来る剥離ライナー（図示せず）は通常接着
剤層９６の露出表面に沿って設けられておりそして装置１０を身体表面に適用す
る前に取り除かれる。

【００６２】別法として、拡大された図４において示されるように、経皮治療装置９８は柔
軟な接着剤オーバーレイ１００により身体表面に取り付けられることが出来る。
装置９８は中に分散させて薬剤を含有するマトリックスの形にあるのが好ましい
薬剤含有液貯め９０から形成される。接続用媒体６５は、開口８を通過して延び
て液貯め９０に接触している。別法として液貯め９０におけるマトリックスは、
はじめに開口８を通過して延びて接続用媒体６５と接触していることが出来、あ
るいは液貯めと接続用媒体とは同じであることが出来る。不透過性裏当て層１０
２が液貯め９０の一つの表面に隣接して設けられる。接着剤オーバーレイ１００
は身体表面上に装置を維持する。接着剤オーバーレイ１００は装置９８の残りの
要素と一緒に造られるかまたは残りの要素とは別に設けられることが出来る。或
る種の配合物を用いて、接着剤オーバーレイ１００は図３において示される接触
接着剤９６より好ましいだろう。このことは、例えば接触接着剤層９６の接着剤
の性質に有害に作用する（例えば油性界面活性剤のような）材料を薬剤液貯めが
含有する場合に、事実である。不透過性裏当て層１０２は液貯め９０より僅かに
大きいのが好ましくそしてこの様式で、液貯め９０中の薬剤がオーバーレイ１０
０中の接着剤と有害に相互作用するのを防止する。場合により、図３における膜
９４と類似している速度制御膜（図４において図示せず）は液貯め９０の身体表
面上に設けられることが出来る。引き剥がすことが出来る剥離ライナー（図示せ
ず）はまた、通常、装置９８に関して設けられそして身体表面に装置９８の適用
の直前に取り除かれる。

【００６３】液貯め９０の配合物は、水性であってもよくまたは非水性をベースとしてもよ
い。その配合物は必要なフラックスで薬剤を送り込むようにデザインされる。典
型的には水性配合物は水そして、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルセルロース、ヒドロキシエチルメタクリレートおよびソフトコンタクトレン
ズにおいて使用される重合体のような、ゲル化剤として、親水性重合体の約１〜
６０重量％を含む。典型的な非水性配合物は、シリコーン液体、シリコーンゴム
、炭化水素重合体、ポリイソブチレン、ゴムまたはミネラルオイルから形成され
る。ミネラルオイルをベースとするゲルはまた、典型的には、コロイド状二酸化
珪素のようなゲル化剤の１〜２重量パーセントを含有する。

【００６４】中に薬剤を有する液貯めのマトリックスは、送り込まれる薬剤、（存在する場
合の）吸収防止剤そしてそのための任意の担体と適合性であるべきである。水性
をベースとするシステムを用いる場合、液貯めマトリックスは親水性重合体（例
えばヒドロゲル）が好ましい。非水性をベースとするシステムを用いる場合、液
貯めマトリックスは、疎水性重合体から形成されるのが好ましい。適当な重合体
マトリックスは経皮医薬送り込み業界において周知である。

【００６５】一定の薬剤送り込み速度が所望である場合、その薬剤は飽和より過剰の濃度で
マトリックスまたは担体中に存在し、過剰の量はシステムの薬剤送り込み期間の
所望の長さの関数である。しかしながら、ポリペプチド／ヒスチジン配合物およ
び（存在する場合の）吸収防止剤が、薬剤による皮膚刺激を減少させるかまたは
排除するのに十分な量で且つ十分な期間にわたって同じ身体表面部位に連続的に
且つ同じ範囲わたって投与される限り、薬剤は飽和以下の水準で存在することが
出来る。

【００６６】薬剤に加えて接続用媒体はまた、染料、顔料、不活性充填剤、浸透増進剤、賦
形剤、粘着剤、中性重合体、界面活性剤、試薬類、緩衝剤、可塑剤そして当業界
に知られている医薬品又は経皮装置の他の慣用成分を含有することが出来る。

【００６７】液貯め中に存在する薬剤の量および液貯めの寸法は一般に限定されないそして
その放出された形において、所望の局所および（または）全身の生理学的および
（または）薬理学的効果をもたらすのに有効な量に等しいかまたはそれより大き
い量である。

【００６８】薬剤が送り込まれる好ましい形は、一般に使用されるべき送り込みシステムの
タイプを決定しそしてその逆の場合も同じである。即ち、拡散により薬剤を送り
込む受動的システムを選択または電気輸送により薬剤を送り込む電気的に動かさ
れるシステムを選択するかは、薬剤の形により殆ど決定される。例えば、受動的
送り込みシステムに関して、薬剤が角質層を通過して拡散する場合、薬剤は、水
溶性塩の形でよりもむしろ、その遊離塩基または酸の形のいずれかで送り込まれ
るのが好ましいことが一般に認識されている。他方、電気輸送送り込み装置に関
して、薬剤は一般に水中で可溶性であるべきことが認識されている。無傷の皮膚
を通過させての受動的経皮薬剤送り込みのための通路と、電気輸送経皮薬剤送り
込みのための通路とは異なり、受動的送り込みは皮膚の脂質領域（即ち疎水性領
域）を通過して起こりそして電気輸送送り込みは毛嚢および汗腺に伴う孔のよう
な、親水性通路、即ち孔を通過して起こると一般的に認識されている。突き刺さ
れた皮膚の場合について、水性である造られた通路を通過する実質的な受動的フ
ラックスが予期されることが出来る。突き刺された皮膚の場合における受動的送
り込みのための薬剤は一般に親水性（例えば水溶性塩形）でありそして電気輸送
送り込みのための薬剤の好ましい形はまた、親水性（例えば水溶性塩形）である
。受動的送り込みのために、イオン化された薬剤（例えば水溶性）とイオン化さ
れていない薬剤（例えば親水性）との組み合わせが使用されることが出来る。

【００６９】インシュリンの受動的経皮送り込みのための１つの好ましい態様において、配
合物は（イ）ヒスチジン緩衝剤、および（ロ）亜鉛を含有しないそしてｍ−クレ
ゾールまたはフェノールのような保存料を含有しないそして本来型のヒトインシ
ュリンあるいはヒトＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29インシュリン類似体のような自己会合に
対して減少した傾向を有するインシュリン類似体であるインシュリン化合物を含
有するであろう。そのような配合物は一層迅速に拡散する低分子量種（ｓｐｅｃ
ｉｅｓ）として存在するインシュリン分子の割合を最大にする。

【００７０】ポリペプチド／ヒスチジン配合物はまた、溶媒によって担持される連結（ｃｏ
ｎｎｅｃｔｉｖｅ）流により薬剤を送り込む浸透および圧力駆動システムを用い
て送り込むことが出来る。そのようなシステムにおいて、薬剤は担体溶媒中への
十分な溶解度を有することが好ましい。本発明は浸透および圧力駆動に関して特
定の装置に限定されないので、本発明は広い種々の浸透および圧力駆動システム
と組み合わせて使用することが出来ることが当業者に認識されよう。浸透および
圧力駆動装置の例について、Ｅｃｋｅｎｈｏｆｆの米国特許第４，３４０，４８
０号、Ｔｈｅｅｕｗｅｓ等の米国特許第４，６６５，７６６号、Ｅｃｋｅｎｈｏ
ｆｆの同第４，７５３，６５１号、Ｇｒｏｓｓ等の同第５，２７９，５４４号、
Ｔｈｅｅｕｗｅｓの同第４，６５５，７６６号、Ｇｒｏｓｓ等の同第５，２４２
，４０６号、およびＥｃｋｅｎｈｏｆｆの同第４，７５３，６５１号を参照する
ことが出来、これらのうちのいずれも本発明とともに用いることが出来る。

【００７１】本発明をその好ましい特定の態様に関して記載したが、上記記載ならびに以下
の実施例は本発明を例示することを意図しており、本発明の範囲の限定を意図し
ていないことが理解されるべきである。本発明の範囲にある他の態様、利点およ
び変更は本発明が関係する当業者に明らかであろう。

【００７２】（発明を実施するための最良の形態）III．実験：材料：（Ｅ．ｃｏｌｉにおいての発現により生成された）ヒトインシュリン、β−ラ
クトグロブリン、Ｌ−ヒスチジン（塩基）およびセリンアミド（ｓｅｒｉｎａｍ
ｉｄｅ）は、Ｓｉｇｍａ社（ミズリー州セントルイス）から購入された。Ｓｉｇ
ｍａ社のインシュリン製剤はインシュリン六量体当たり約２個の亜鉛原子に当量
であった約０．４％のＺｎを含有した。両方とも組み換え型ＤＮＡ源でありそし
てＬｉｌｌｙ社（インディァナ州インディアナポリス）により製造された、Ｈｕ
ｍａｌｏｇ^R（Ｌｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29ヒトインシュリン類似体）ならびにＨｕｍ
ｕｌｉｎ^R（ヒトインシュリン注射）は、市場の薬局から購入された。Ｌ−ヒス
チジン（塩基）はＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社（ニュージャージー州フィリップスバー
グ）からおよびＳｉｇｍａ社（ミズリー州セントルイス）から得られた。氷酢酸
はＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社（ニュージャージー州フィリップスバーグ）から得られ
た。塩酸はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ社（ケンタッキー州パリス）から購入され
た。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）はＡｌｄｒｉｃｈ社（ミズリー州セントルイス
）により供給された。リゾチームはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌＣｏｒｐ．（ニュージャージー州フリーホールド）から得られた。Ｌ−
グリシル−Ｌ−ヒスチジンジペプチドはＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＩ
ｎｃ．（ペンシルベニア州キングオブプロシャ）により合成された。

【００７３】方法：亜鉛を含有しないヒトインシュリンの製造：市販源から手に入れることが出来るすべてのヒトインシュリン類は、インシュ
リン六量体当たり約２つの結合された亜鉛分子を含有する。本来型のヒトインシ
ュリンへの亜鉛結合（Ｓｉｇｍａ社からまたはＨｕｍｕｌｉｎ^Rとして市販）お
よびＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29類似体への亜鉛結合（Ｈｕｍａｌｏｇ^Rとして市販）は
４℃で１０ｍＭ酢酸に対して広範な透析により除去されることが出来る。Ｈｕｍ
ｕｌｉｎ^R ＲおよびＨｕｍａｌｏｇ^Rの場合において、注射可能なインシュリン
のｐＨは、最初に、透析の前に、氷酢酸および１Ｎの塩酸を用いて中性のｐＨか
らｐＨ３．５に調節された。次に、そのインシュリンは透析後に凍結乾燥された
。凍結乾燥された材料の亜鉛分析は０．０３亜鉛／六量体より以下であったこと
を示した。

【００７４】Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グリシル−Ｌ−ヒスチジン緩衝液の製造：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（マサチューセッツ州メドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社
製）がすべての緩衝液の製造のために使用された。緩衝液は使用まえに０．２２
μｍの酢酸セルロース膜を通過させて濾過された。２５２ｍＭのＬ−ヒスチジン
溶液のｐＨは２２℃で約ｐＨ７，６２±０．１でありそして１ＭのＬ−グリシル
−Ｌ−ヒスチジン緩衝液のｐＨは２２℃で約ｐＨ７．６８±０．１であった。

【００７５】セリンアミド緩衝液の製造：１００ｍＭのセリンアミド（ｓｅｒｉｎａｍｉｄｅ）緩衝液原料液が造られそ
してｐＨが７．５±０．１に調節された。

【００７６】Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グリシル−Ｌ−ヒスチジン緩衝液中のインシュリンの製造：分析超遠心分離機中で行われる各々の実験のためにインシュリン原料溶液を調
整した。原料溶液の濃度は、６Ｍのグァニジン塩酸塩（イリノイ州ロックフォー
ドのＰｉｅｒｃｅ社製）中に分別量を希釈しそして分光光度計（ニュージャージ
ー州レークウッドのＡｖｉｖ社モデル１４ＤＳ）においてその吸光度を監視する
ことにより測定された。サンプルの吸光度は、２７６ｎｍでの、１．１０９ｍｌ
／ｍｇ・ｃｍのモル吸光係数を用いて、その濃度を測定するまえに、光散乱につ
いて補正された。ヒスチジンを含有する製剤のために、インシュリン原料溶液は
２５０ｍＭまたは３３０ｍＭのどちらかでのヒスチジン中に造られた。Ｌ−グリ
シル−Ｌ−ヒスチジンについて、インシュリン原料溶液は、２６０ｍＭおよび（
または）１ＭのＬ−グリシル−Ｌ−ヒスチジン緩衝液中に造られた。典型的には
、約２つの亜鉛／六量体を含有する本来型インシュリンを用いて、１０ｍＭ（約
６０ｍｇ／ｍｌ）までの原料溶液はＬ−ヒスチジンまたはＬ−グリシル−Ｌ−ヒ
スチジンのいずれかにおいて造られた。ヒスチジンを含有しない製剤のために、
２亜鉛／六量体本来型インシュリンの７．１ｍｇ／ｍｌを含有する原料溶液は、
ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調節された１０ｍＭのＮａＣｌ中に造られた。亜
鉛を含有しない本来型及び（又は）Ｌｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29ヒトインシュリン類似体
の場合において、１７ｍＭ（約１００ｍｇ／ｍｌ）までの原料溶液は０．１Ｍの
ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）および（または）２５０ｍＭヒスチジン，０．１ＭのＮ
ａＣｌ（ｐＨ７．５）のいずれか中に造られることが出来る。インシュリン原料
溶液のｐＨは２２℃で１Ｍのグリシル−ヒスチジン緩衝液において約７．６８±
０．１でありそして２２℃で２５０ｍＭのヒスチジンにおいてｐＨ７．６２±０
．１であった。

【００７７】分析超遠心分離機操作のまえにインシュリンの濃度が２ｍｇ／ｍｌ（０．３５
ｍＭ）の低さから４０ｍｇ／ｍｌ（７ｍＭ）の高さまで変化するように、インシ
ュリン原料溶液は、適当な量のＮａＣｌを有するかまたはそれを有しない、ヒス
チジン緩衝液またはグリシル−ヒスチジン緩衝液のいずれかで希釈された。イン
シュリンが溶解されたＬ−ヒスチジン緩衝剤の最終濃度は１０ｍＭ〜２５２ｍＭ
で変化した。Ｌ−グリシル−Ｌ−ヒスチジンについて、２５０および７５０ｍＭ
の緩衝液においての２亜鉛／六量体を含有する本来型インシュリン製剤が超遠心
分離機において調べられた。また、５０および１００ｍＭの最終濃度での塩化ナ
トリウムが、Ｌ−ヒスチジン緩衝液またはＬ−グリシル−Ｌ−ヒスチジン緩衝液
中のインシュリンサンプルの幾つかに加えられた。

【００７８】リゾチーム＆β−ラクトグロブリンの製造：０ｍＭ、１００ｍＭまたは２５０ｍＭのＬ−ヒスチジンを有する０．１５Ｍの
ＮａＣｌ中でリゾチーム溶液（１５ｍｇ／ｍｌ）が造られた。そのヒスチジン含
有溶液のｐＨは２１℃で７．６０±０．１であり；Ｌ−ヒスチジンを有しない、
リゾチーム溶液のｐＨは同じであるように希釈塩基を用いて調節された。同様に
０．１５ＭのＮａＣｌ中のβ−ラクトグロブリンのｐＨは、２５０ｍＭのＬ−ヒ
スチジンにおけるｐＨと同じであるｐＨ、ｐＨ７．７４±０．１であるように、
希釈塩基で調節された。

【００７９】分析超遠心分離機における沈降平衡研究：種々のインシュリン配合物を用いての沈降平衡実験が、分析超遠心分離機（カ
リフォルニア州パロアルトのＢｅｃｋｍａｎ社製モデルＸＬ−ＡまたはＸＬ−１
）を用いて３２℃で行われた。

【００８０】種々の回転機速度でレイリー干渉光・光学および（または）走査ＵＶ光／可視
光・光学を用いてすべてのサンプルについて、沈降平衡でのデータが得られた。
後者について、インシュリンサンプルについての吸光度走査が幾つかの波長、例
えば、２４８、２８８、２９１および２９５ｎｍで監視された。モル吸光係数値
は上記波長で設定されたモノクロメータを用いて実験の開始時に得られた走査か
ら概算された。これらの値は、種々の条件下のインシュリンのモル会合平衡定数
をコンピュター計算するために用いられた。吸光度走査における各データ点は、
０．００２ｃｍの半径方向距離増分（ｒａｄｉａｌｄｉｓｔａｎｃｅｉｎｃ
ｒｅｍｅｎｔ）を用いて走査の平均として記録された。干渉光・光学システムに
ついて、６７５ｎｍでの光がインシュリンサンプルならびにリゾチームサンプル
についての沈降平衡データを得るために使用された。１ｃｍ通路における１ｍｇ
／ｍｌポリペプチド溶液のフリンジ変位は、２．７７フリンジとしてみなされた
（ＭｃＭｅｅｋｉｎ等のＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
（１９６２）７：第１５１頁〜第１５６ページ；１９４３年ニューヨークＡｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ発行ＮｅｕｒａｔｈおよびＢａｉｌｅｙ編集のＴｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１Ａ第３９３頁〜第４６０頁のＤｏｔｙおよびＧｅｉｄｕｓ
ｃｈｅｋにより；ＰｅｒｌｍａｎｎおよびＬｏｎｇｓｗｏｒｔｈによるＪ．Ａｍ
ｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９４８）７０：第２７１９頁〜第２７２４頁）。
この値はインシュリンサンプルおよびリゾチームサンプルについてのモル会合定
数をコンピューター計算するために用いられた。ヒトインシュリンの単量体分子
量は残基部分比容積についてＣｏｈｎ及びＥｄｓａｌｌの値を用いてのアミノ酸
組成から計算された０．７２７ｍｌ／ｇの部分比容積を有する５７９６ｇ／モル
であるとみなされた。リゾチームの場合において単量体の分子量は１４．３１５
ｇ／モルおよび部分比容積について０．７０３ｍｌ／ｇの値であるとみなされた
（Ｓｏｐｈｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ等によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９６２
）２３７：第１１０７頁）。β−ラクトグロブリンについて、ＵＶ光吸光度走査
が２８０ｎｍで得られそして単量体分子量は１８，４００ｇ／モルであるとみな
された。後者についての部分容積は０．７４７ｍｌ／ｇである（Ｋｅｌｌｙおよ
びＲｅｉｔｈｅｌによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７１）１０：第２６３
９頁〜第２６４４頁）そしてモル会合定数をコンピューター計算するために用い
られた吸光係数は０．９７ｍｌ／ｇ・ｃｍであった（Ｗｅｔｌａｕｆｅｒおよび
ＬｏｖｒｉｅｎによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９６４）２４３：第５９６
頁）。Ｌ−ヒスチジンの存在下のすべてのたんぱく質の有効な浮遊（ｂｕｏｙａ
ｎｔ）分子量は、Ｂ_AM値が単に単量体分子量に部分比容量をかけ算することであ
るとみなされた、排除体積モデル（Ｊａｃｏｂｓｅｎ等によるＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ（１９９６）３５：第１３１７３頁〜第１３７３９頁）を用いてコンピ
ューター計算された。Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グリシル−ヒスチジンの部分比
容量は０．６４１ｍｌ／ｇであるとみなされた（ニューヨークのＨａｆｎｅｒ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ発行ＣｏｈｎおよびＥｄｓａｌｌ編集のＰｒｏｔｅｉｎｓ
，ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓ（１９４３）第３７０頁
〜第３８１頁）。

【００８１】遠心分離後、干渉光および吸光度走査から得られたデータはＳｈｉｒｅ等によ
るＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）３０：第７７０３頁〜第７７１１頁に
おける方程式９に基づく算法を包含する既知の方法を用いて分析された。使用さ
れた算法は適合パラメータが（Ｂ）^1/2の代わりに（ＢＭ₁）^1/2であった変更を包含した。この分析は、使用者特定化モデルについての会合定数についての概算
を生ずる。そのモデルは理想単量体（最も単純なモデル）あるいは特定の寸法の
１つ、２つ、３つまたはそれ以上の凝集物を用いての化学平衡において存在する
単量体のモデルであることが出来る。最もありそうなモデルは、実験吸光度と理
論吸光度との差の平方の合計を最少にするモデル、即ち、二乗平均平方根残差（
ｒｏｏｔｍｅａｎｓｑｕａｒｅｄｒｅｓｕｄｕｅｓ）についての最も低い
値を有するモデルである。

【００８２】例１：インシュリンの溶解度限界へのＬ−ヒスチジンの影響：２亜鉛／六量体の本来型のヒトインシュリンの溶解度限界へのＬ−ヒスチジン
の影響を調べるために、種々の濃度のインシュリンをＬ−ヒスチジンと一緒にし
た。図１において示されるように、緩衝溶液中のＬ−ヒスチジンの使用は、イン
シュリン含有緩衝溶液の最大インシュリン濃度を増大させた。Ｌ−ヒスチジンの
存在なし、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＮａＣｌおよび室温で、２亜鉛／六量体を有
するインシュリンの最も高い濃度は、７．１ｍｇ／ｍｌ、即ち１．２ｍＭであっ
た。そのｐＩ（等電点のｐＨ値）での２５０ｍＭヒスチジンの存在において、濃
度で１５倍増加を表す、１６．５ｍＭほどの高さの濃度を有するインシュリン溶
液が得られた。

【００８３】例２：ＮａＣｌの不存在下のインシュリンの自己会合への、ｐＩでのＬ−ヒスチジンおよびＬ−グリシル−ヒスチジンの影響：ＮａＣｌの不存在下での自己会合への、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−グリシル−
ヒスチジンの、それらのｐＩでの影響を調べるために、沈降平衡研究を上記のと
おりにして行った。第Ｉ表に示されるように、Ｌ−ヒスチジン濃度を増加させて
いくと、六量体化平衡定数の減少を生じた。いずれのヒスチジンも存在せずに、
ｐＨ７．５で、（３２℃および１８ｋ〜４８ｋの回転機速度で集められた）沈降
平衡データは、５２．６のＩｎＫ_2-6値を有する二量体六量体会合モデルに適合させることが出来た。非理想係数、Ｂは緩衝液の非常に低いイオン強度に起因し
て生ずる非理想影響を考慮に入れる。単一の分子量種（ｓｐｅｃｉｅｓ）が存在
したと仮定して、最も簡単なモデルを用いるデータ分析は、いずれのヒスチジン
も存在なしでのインシュリン凝集物の平均寸法が六量体よりわずかに小さかった
ことを示唆する５．５のＭ_avg／Ｍ₁を与えた。中性ｐＨで亜鉛の存在下に３つの
インシュリン二量体が集合して六量体を形成する観察は公開されたデータと一致
している（ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ発行ＢｒａｎｇｅによるＧａｌｅｎ
ｉｃｓｏｆＩｎｓｕｌｉｎ（１９８７））。複合回転機速度でｐＨ７．６±
０．１で２０〜２５２ｍＭのヒスチジンの存在下に集められた沈降平衡データは
、二量体六量体会合モデルに適合された。ヒスチジンの濃度が２０ｍＭから２５
２ｍＭに増大するにつれて、六量体化平衡定数における減少が観察された。遠心
分離機セル内で、０．０１ｍＭ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の低さから１３ｍＭ（７５
ｍｇ／ｍｌ）の高さまでの範囲のインシュリン濃度でのインシュリンを用いて、
ヒスチジンの影響が観察された。ヒスチジンがインシュリンの溶解度を劇的に増
加させた（溶解度限界は２５０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ７．５±０．１中に１６
．５ｍＭであった）にもかかわらず、これらの条件下で凝集したインシュリンは
すべてが必ずしも二量体および六量体であったとは限らなかった。多数の六量体
の凝集物がまた、超遠心分離機中で調べられた最も高いインシュリン装入濃度（
６ｍＭ）で見い出された。サンプルが２０ｋｒｐｍの回転機速度で平衡に達した
ときに、セルに初期に装入されたインシュリンのほんの８０％だけが溶液中に残
った。残りの２０％のインシュリンが大きな不溶性凝集物としてセルの底にペレ
ット化した。おおざっぱの計算は、それらの凝集物が約３インシュリン六量体に
当量である、１００，０００を超える平均分子量を有した。

【００８４】グリシル−ヒスチジンは、インシュリン自己会合へのその影響について調べら
れたヒスチジン類似体の１種であった。２５０ｍＭで、グリシル−ヒスチジンは
また、六量体を形成するインシュリンの傾向を減少させたが、しかしヒスチジン
ほどには効果的ではなかった。単一種（ｓｐｅｃｉｅｓ）モデルを用いて５０ｋ
の回転機速度で、干渉光・光学を用いて得られた沈降平衡の分析は、グリコシル
−ヒスチジン中でインシュリンの平均分子量が四量体の分子量であったことを示
した（第１表）。比較として、２５０ｍＭ（超遠心分離機中において調べられた
最も高い濃度）のヒスチジンで、インシュリンの平均分子量は二量体の分子量で
あった。ヒスチジンに代えて、またｐＨ７．５±０．１に調節された他の緩衝剤
であるセリンアミド（ｓｅｒｉｎａｍｉｄｅ）の使用は中性ｐＨで自己会合する
本来型インシュリンの能力を減少させなかった。

【表２】

【００８５】Ｉ．Ｓ．は、ｍＭにおける緩衝剤のイオン強度である；Ｂ（ｇ^-2Ｌモル）は、インシュリン二量体に基づいて計算された非理想係数であ
る；ｒ．ｍ．ｓ．は実験データと理論データとの間の二乗平均平方根残差である；Ｍ_avg／Ｍ₁は、単一種非理想モデルについて、インシュリン単量体の分子量によ
り割算された沈降する種の平均分子量である；ＩｎＫ_2-6は、３つの二量体からの六量体の形成についての会合定数の自然対数である；１：１８ｋ、２４ｋ、２８ｋ、３４ｋおよび４８ｋの回転機速度で０．３４ｍＭのインシュリンサンプルの、２９１ｎｍで監視されたＵＶ光吸光度走査から得られた。２：１５ｋ、２０ｋ、２５ｋ及び３０ｋの回転機速度で０．６９ｍＭのインシュリンサンプルの、２９１ｎｍで監視されたＵＶ光吸光度走査から得られた。３：２４ｋ、２８ｋ、３４ｋ及び４８ｋの回転機速度で０．３５ｍＭのインシュリンサンプルの、２９１ｎｍで監視されたＵＶ光吸光度走査から得られた。４：５０ｋの回転機速度で６ｍＭのインシュリンサンプルの干渉光・光学から得られた。５：５０ｋの回転機速度で３ｍＭおよび６ｍＭのインシュリンサンプルの干渉光・光学から得られた。

【００８６】例３：ＮａＣｌの存在下に六量体当たり２つの亜鉛結合を有する本来型のヒトインシュリンの自己会合への、ｐＩでのＬ−ヒスチジンおよびＬ−グリシル−ヒスチジンの影響：ＮａＣｌの存在下に、インシュリン自己会合への、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−
グリシル−ヒスチジンのｐＩ（それらの等電点のｐＨ値）でのＬ−ヒスチジンお
よびＬ−グリシル−ヒスチジンの影響を調べるために、上に記載されたとおりに
して実験を行った。塩化ナトリウムを用いて約１００ｍＭに、ｐＨ７．５のサン
プルのイオン強度を増大させた際に、本来型ヒトインシュリンは、ヒスチジン緩
衝剤の不存在下に、ほとんど六量体として存在した。第II表において示されるよ
うに、インシュリンサンプル中のヒスチジンの濃度が５０ｍＭから２２６ｍＭに
増大するにつれて、六量体化平衡定数においておだやかな減少があった。その効
果は、塩の不存在下に見られた効果ほどは劇的ではなかった（第１表参照）。１００ｍＭのイオン強度で調べられた最も高いヒスチジン濃度である２２６ｍＭ
で、単一のインシュリン種の想定に基づいて計算されたＭ_avg／Ｍ₁値は約６であ
った。対照的に、ＮａＣｌの不存在下に２５２ｍＭのヒスチジン、ｐＨ７．６±
０．１中でインシュリンは主として二量体として見い出された。また、インシュ
リンの初期装入濃度とは無関係に、２２６ｍＭのヒスチジンおよび１００ｍＭの
ＮａＣｌの存在下に、十二量体の大きさに等しいかまたはそれより小さな平均寸
法を有する沈降したインシュリンの最終濃度は、約２ｍＭであった。インシュリ
ンサンプルの残りは２０ｋの回転機速度でセルの底にペレット化した。したがっ
て、非常に大きな凝集物を形成したインシュリンのパーセントは、ＮａＣｌなし
よりも、１００ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液中でかなり高かった
。前者の場合において、大きな凝集物のペレット化を生じたインシュリン濃度範
囲は約４．８ｍＭであった。

【００８７】これらの結果は、インシュリンの自己会合へのヒスチジンの影響が、媒体のイ
オン環境により左右されることを示している。予備データは、２つの六量体から
インシュリン十二量体の形成のギブスの自由エネルギーが緩衝液のイオン強度の
平方根の関数として増大することを示唆した。

【００８８】Ｌ−グリシル−Ｌ−ヒスチジンの場合において、（７７．５ｍＭに合計イオン
強度を上昇させる）本来型ヒトインシュリンサンプルへの５０ｍＭのＮａＣｌの
添加は、２２６ｍＭのヒスチジンおよび１００ｍＭのＮａＣｌにおいてインシュ
リンについて観察された六量体化平衡定数に近い六量体化平衡定数を与えた（第
II表）。ヒスチジンは、そのｐＩで双性イオンでありそしてインシュリンへのそ
の作用は特異的であると思われる。例えば、第II表において示されるように、約
１００ｍＭのイオン強度でｐＨ７．５±０．１での他の双性イオンであるタウリ
ンの使用はインシュリンの六量体化平衡定数を減少させなかった。

【表３】

【００８９】１ａ：２０ｋおよび３０ｋの回転機速度で３ｍＭおよび６ｍＭのインシュリンサンプルの、２９５ｎｍで監視された吸光度走査から得られた。１ｂ：４．２４のＫ_6isodesmic定数を有する二量体−六量体−ｉｓｏｄｅｓｍｉ
ｃ六量体理想モデルを用いて２０ｋおよび３０ｋの回転機速度で３ｍＭお
よび６ｍＭのインシュリンサンプルの、２９５ｎｍで監視された吸光度走
査から得られた。２：５０ｋの回転機速度で３ｍＭおよび６ｍＭのインシュリンサンプルの干渉光・光学から得られた。３：１８ｋ、２４ｋ、３４ｋおよび４８ｋの回転機速度で０．３５ｍＭでインシュリンサンプルの、２９１ｎｍで監視されたＵＶ光吸光度走査から得られた。４：１５ｋ、２０ｋ、２５ｋ、３０ｋおよび４０ｋの回転機速度で０．７ｍＭのインシュリンサンプルの、２８８ｎｍで監視されたＵＶ光吸光度走査から得られた。５：１５ｋ、２０ｋ、２５ｋ、３０ｋおよび４０ｋの回転機速度で２８８ｎｍ（０．３５ｍＭ）および２４８ｎｍ（０．７ｍＭ）インシュリンサンプルでＵＶ光吸光度走査から得られた。６：１５ｋ、２０ｋ、２５ｋおよび３０ｋの回転機速度で０．３５ｍＭインシュリンサンプルの、２４８ｎｍでＵＶ光吸光度走査から得られた。ＩｎＫ_6isoは、ｉｓｏｄｅｓｍｉｃ六量体の形成について会合定数の自然対数である。

【００９０】例４：Ｚｎを有しない本来型インシュリンおよびＺｎを有しないＬｙｓＰｒｏインシュリン類似体の自己会合への、ｐＩでのＬ−ヒスチジンの影響：上に記載されたとおりにして、ｐＨ７．５、ヒスチジンの増加させていく濃度
の関数として、生来の本来型ヒトインシュリン（Ｚｎ含有せず：Ｓｉｇｍａ社か
らおよびＨｕｍｕｌｉｎ^R Ｒ）ならびに（Ｌｉｌｌｙ社のＨｕｍａｌｏｇ^Rから
精製された）Ｚｎを含有しないＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29インシュリンを用いて３２℃
でＸＬ−１分析超遠心分離機中で沈降平衡研究が行われた。干渉光データが複数
の回転機速度にわたって得られ、集められそして幾つかのモデルに適合させた非
線形回帰を用いて包括的に分析された。１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５の存
在下に、本来型およびＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29のヒトインシュリン（両方とも亜鉛が
存在しない）からのデータを、単量体、二量体、六量体およびｉｓｏｄｅｓｍｉ
ｃ六量体を含有するモデルに適合化させることが出来る。

【００９１】第III表において示されるように、Ｚｎを有しないＬｙｓＰｒｏ類似体についてＩｎＫ₁₂の値はヒスチジンの濃度とともに有意義な変化をしなかったが、しか
しＩｎＫ_6isoはヒスチジンの濃度を増大させるとともに有意義な減少を示した。
それらの結果は、ヒスチジンがＬｙｓＰｒｏインシュリン類似体の自己会合の性
質への影響を有したことを示唆した。たんぱく質の凝集の程度を表す簡明な方法
は会合平衡定数から平均分子量をコンピュター計算することである。幾つかのそ
のような平均は文献に十分に記載されている（例えば、１９９２年ケンブリッジ
のＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ発行のＳ．Ｅ．Ｈａ
ｒｄｉｎ、Ａ．Ｊ．ＲｏｗｅおよびＪ．Ｃ．Ｈｏｒｔｏｎ編集の“Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙａｎｄＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅ”参照）。１つのＭｎ、即
ち数平均分子量は、ｃ_total／Σ（ｃ_i／Ｍ_i）（但し、ｃ_iは分子量Ｍ_iを有するｉ番目（ｉ^th）種の重量濃度である）として定義される。重量平均分子量と称さ
れる第２のタイプの平均、Ｍｗは、Σｃ_iＭ_i／ｃ_totalとして定義される。

【数１】であるＭ_zのような、なお一層高度の分子量平均が定義されることが出来る。図５は（第III表における２４０ｍＭのヒスチジンについてのＩｎＫ₁₂、ＩｎＫ₂₆ およびＩｎＫ_6iso値から計算された）２４０ｍＭのヒスチジンの存在下のＬｙｓ
Ｐｒｏインシュリン類似体についてのこれらの３種の平均の濃度依存性を示す一
方で、図６は（第III表における０ｍＭのヒスチジンについてのＩｎＫ値から計算された）ヒスチジンの不存在下の情況についての同様なプロットを示す。図７
は（第IV表において２４０ｍＭのヒスチジンについてＩｎＫ₁₂、ＩｎＫ₂₆および
ＩｎＫ_6iso値から計算された）２４０ｍＭのヒスチジンの存在下の亜鉛を含有し
ない本来型インシュリンについての同様なプロットを示す一方で、図８は（第IV
表における０ｍＭのヒスチジンについてのＩｎＫ値から計算された）ヒスチジン
の不存在下における比較出来るプロットを示す。

【００９２】ヒスチジンを存在させると、インシュリンの平均分子量を実質的に減少させる
ことそしてこの効果はＬｙｓＰｒｏ類似体に対して一層顕著であることが、これ
らのプロットから明らかである。

【表４】

【００９３】Ｉｎ（Ｋ_6iso）＝６．０１−０．００３７〔ヒスチジン〕，ｐ＝０．００４；Ｉｎ（Ｋ₁₂）は、２つのインシュリン単量体から二量体の形成についての会合定
数の自然対数である；Ｉｎ（Ｋ₂₆）は、３つの二量体からのインシュリン六量体の形成についての会合
定数の自然対数である；Ｉｎ（Ｋ_6iso）は、積層された六量体の形成についての会合定数の自然対数であ
る；インシュリンの装入濃度は各々の条件について４ｍＭであった。遠心分離中に、
インシュリンは遠心分離機セル中に再分布する。表において報告された〔インシュリン〕範囲は、各々の条件について種々の回転
機速度下に観察された〔インシュリン〕の範囲を反映する。

【表５】

【００９４】Ｉｎ（Ｋ₁₂）＝９．０６（平均）（ｓ．ｅ．ｍ．＝０．２７３）（〔ヒスチジン〕への有意義な依存性なし）；Ｉｎ（Ｋ_6iso）＝７．１１６−０．００２〔ヒスチジン〕，ｐ＝０．０２；インシュリンの装入濃度は、２２４ｍＭのヒスチジン以外は各々の条件について
２ｍＭであった。後者の場合において、報告されたデータは、１ｍＭ、３ｍＭお
よび６ｍＭの３つのインシュリン装入濃度からのデータを組み合わせることによ
り得られた。

【００９５】例５：他のたんぱく質類の自己会合へのＬ−ヒスチジンのそのｐＩでの影響：リゾチームおよびβ−ラクトグロブリンの自己会合へのＬ−ヒスチジンの影響
が、上に記載された方法を用いてまた研究された。リゾチームおよびβ−ラクト
グロブリンは、アルカリ性ｐＨで単量体−二量体平衡で主として存在する十分に
研究されたたんぱく質である（Ｋｉｍ等によるＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗ
ｓ（１９７７）７７：第６５９頁〜第６９０頁）。アルカリ性ｐＨでのリゾチー
ム沈降平衡データは、一層単純な単量体−二量体システムによるよりも、単量体
−二量体−四量体システムにより一層良好にモデル化されている（Ｅｍｏｒｙ
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおけるＨｏｌｌａｄａｙによるＰｈ．Ｄ論文（１９７３
））。４℃でＬ−ヒスチジンの存在なしでリゾチームの自己会合挙動が１４ｋ、
１８ｋおよび３０ｋのｒｐｍからの干渉光フリンジデータを包括分析することに
より評価された。結果を第V表に示す。

【００９６】ＢｅｃｋｍａｎＸＬ−１システムからのフリンジ測定における予期されたノ
イズは約０．０２〜０．０４フリンジである。その４℃データは、理想単量体−
二量体−四量体（１−２−４）システムにより最良に記載される。二量体の寸法
以上の凝集物を含有するすべてのモデルが、Ｉｎ（Ｋ₁₂）について本質的に同一
の概算値を生ずることに留意。リゾチーム二量体化へのＬ−ヒスチジンの影響に
ついての（下に示される）これらの結果がモデル依存性である傾向がないので、
モデル化は理想の１−２−４システムを用いて行われた。第２ビリアル係数の包
含はｒ．ｍ．ｓ．残差を有意義に低下させなかった。ｉｓｏｄｅｓｍｉｃタイプ
Ｉは、同一の会合定数を有する存在するすべての凝集物を有する。タイプIIは存
在する均一な凝集物だけを有する。タイプIIIはｉｓｏｄｅｓｍｉｃであると予想される次の会合工程とは異なる二量体化定数を有する。タイプIVはｉｓｏｄｅ
ｓｍｉｃであると予想される次の会合工程とは異なる二量体化定数を有する存在
すると予想される均一な凝集物だけを有する。ｉｓｏｄｅｓｍｉｃモデルについ
ての方程式は当業界において既知でありそして記載されて来た（Ｔａｎｇ等によ
るＢｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）７：第１２１頁〜第１３９頁）。ｉ
ｓｏｄｅｓｍｉｃモデルIVについて、Ｉｎ（Ｋ₁₄）が１−２−４−モデルから予
期されるＩｎ（Ｋ₁₄）に近い１７．９であることに留意。四量体を超える凝集物
の予想される量は、すべてのｉｓｏｄｅｓｍｉｃモデルについて全く小さい。

【００９７】リゾチーム二量体化へのＬ−ヒスチジンの影響は第VI表に示される。第VI表に
おける結果は、理想１−２−４モデル（単量体−二量体−四量体）および４ｋの
ｒｐｍだけ異なる２つの回転機速度の包括的分析を用いて得られた。３つの温度
でのβ−ラクトグロブリン二量体化へのＬ−ヒスチジンの影響は第VII表に示される。両方のたんぱく質について、温度を上昇させるとともに二量体化平衡定数
におけるおだやかな減少があるように思われる。この分析について、Ｌ−ヒスチ
ジンの存在下のすべての凝集物の有効な浮遊（ｂｕｏｙａｎｔ）分子量は単量体
の有効な浮遊分子量の整数倍数であると無条件に想定された。このことは、すべ
ての凝集物のＢ_AM項が、単量体についてのＢ_AM項の整数倍であることを意味する
。実際において、凝集物の全体的形状は単量体の形状とは幾分異なるので、リゾ
チームおよびβ−ラクトグロブリンの二量体化定数におけるおだやかな減少は、
凝集物の浮遊分子量が単量体の浮遊分子量の整数倍数であると言う想定の欠陥を
反映することが可能である。しかしながらＩｎ（Ｋ₁₂）の戻り値（ｒｅｔｕｒｎ
ｖａｌｕｅ）が単量体浮遊分子量における数パーセントの変化に敏感である傾
向でないことに留意すべきである。

【表６】

【００９８】１−２は、単量体が二量体と平衡で存在するモデルを示す；１−２−４は、単量体が二量体および四量体と平衡で存在するモデルを示す；ＩｎＫ_1-2は、２つの単量体からの二量体形成についての平衡定数である；ＩｎＫ_1-4は、４つの単量体からの四量体の形成についての平衡定数である。

【表７】

【００９９】１：平衡に存在する単量体−二量体−四量体を含有するモデルに干渉光データを
包括的に適合させることから得られた。ＩｎＫ_1-2は単量体からの二量体の形成についての平衡定数でありそしてＩｎＫ_1-4は単量体からの四量体の形成についての平衡定数である。２：かっこ内の値はＩｎＫのブートストラップ標準誤差である。

【表８】

【０１００】１：浮遊する基線オフセットを有する理想単量体−二量体モデルに、吸光度データを包括的に適合されることにより得られた。ＩｎＫ値のブートストラップ標準誤差は括弧内に示される。角カッコ内の数値は二乗平均平方根残差を示す。

【０１０１】上記実験に基づいて、ヒスチジンおよびヒスチジン類似体は、亜鉛を有するか
または亜鉛を有しない、インシュリンおよびインシュリン類似体の自己会合を減
少させることが出来ることが明らかである。２つの亜鉛／六量体を含有する本来
型のインシュリンの場合において、調べられた濃度範囲にわたって、ｐＨ７．５
での沈降平衡データは、ＮａＣｌの不存在下の非理想二量体−六量体モデルに適
合させることが出来るかあるいは１００ｍＭのＮａＣｌの存在下の（装入インシ
ュリン濃度が１ｍＭ以下である場合の）理想二量体−六量体モデル）に適合させ
ることが出来る。さらに、ＮａＣｌが存在してもまたは存在しなくても、本来型
ヒト２亜鉛／六量体インシュリンのＩｎＫ₂₆値へのヒスチジン濃度の顕著な影響
がある。亜鉛の不存在において、ＬｙｓＰｒｏ類似体へのヒスチジンの影響は、
本来型インシュリンよりも一層顕著である。ヒスチジンはまた、リゾチームおよ
びβ−ラクトグロブリンのような他の全体的に非関連たんぱく質の自己会合を減
少させることが出来る。

【０１０２】かくして、ポリペプチド剤の自己会合を減少させそして溶解度を増加させる方
法が開示される。本発明の好ましい態様が幾分詳細に記載されたけれども、特許
請求の範囲により規定されたとおりの本発明の精神および範囲から離れることな
しに、自明な変更が行われることが出来ることが理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリペプチドのオリゴマー形成を減少させる方法であって、
ポリペプチドと、ポリペプチドの自己会合する傾向を減少させるのに十分な量の
ヒスチジン化合物とを組み合わせることを含む前記方法。
【請求項２】ヒスチジン化合物が、Ｌ−ヒスチジンである、請求項１の方
法。
【請求項３】ヒスチジン化合物がＬ−グリシル−ヒスチジンである、請求
項１の方法。
【請求項４】ポリペプチド化合物がインシュリン化合物である、請求項１
〜３のいずれか１項の方法。
【請求項５】インシュリン化合物がヒトインシュリン化合物である、請求
項４の方法。
【請求項６】インシュリン化合物が亜鉛を含有しないヒトインシュリン化
合物である、請求項５の方法。
【請求項７】インシュリン化合物がヒトＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29インシュリン
類似体である、請求項６の方法。
【請求項８】インシュリン六量体形成が減少される、請求項４の方法。
【請求項９】ヒスチジン化合物の濃度が少なくとも約１０ミリモルである
、請求項４の方法。
【請求項１０】組成物のｐＨが約ｐＨ７〜約ｐＨ８である、請求項４の方
法。
【請求項１１】電気輸送により身体表面を通過させてポリペプチド剤を送
り込むために有用な組成物の製造においてのポリペプチド類およびヒスチジン化
合物の使用であって、しかも前記ヒスチジン化合物は、前記ポリペプチドの自己
会合する傾向を減少させるのに十分な量で前記組成物に存在する、前記ポリペプ
チド類およびヒスチジン化合物の使用。
【請求項１２】ヒスチジン化合物がＬ−ヒスチジンである、請求項１１の
使用。
【請求項１３】ヒスチジン化合物がＬ−グリシル−ヒスチジンである、請
求項１１の使用。
【請求項１４】ポリペプチドがインシュリン化合物である、請求項１１〜
１３のいずれか１項の使用。
【請求項１５】インシュリン化合物がヒトインシュリン化合物である、請
求項１４の使用。
【請求項１６】インシュリン化合物が亜鉛を含有しないヒトインシュリン
化合物である、請求項１５の使用。
【請求項１７】インシュリン化合物がヒトＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29インシュリ
ン類似体である、請求項１５の使用。
【請求項１８】インシュリン六量体の形成が減少される、請求項１４の使
用。
【請求項１９】ヒスチジン化合物の濃度が約１０ミリモル〜約２５０ミリ
モルである、請求項１４の使用。
【請求項２０】組成物のｐＨが約ｐＨ７〜約ｐＨ８である、請求項１４の
使用。
【請求項２１】インシュリン化合物対ヒスチジン化合物のモル比が約１：
１０〜約１：１０００である、請求項２０の使用。
【請求項２２】受動的経皮送り込みにより身体表面を通過させてポリペプ
チド剤を送り込むために有用な組成物の製造においてのヒトインシュリン化合物
およびヒスチジン化合物の使用であって、しかも前記ヒスチジン化合物は前記ポ
リペプチドの自己会合する傾向を減少させるのに十分な量で前記組成物中に存在
する、前記ヒトインシュリン化合物およびヒスチジン化合物の使用。
【請求項２３】ヒスチジン化合物がＬ−ヒスチジンである、請求項２２の
使用。
【請求項２４】ヒスチジン化合物がＬ−グリシル−ヒスチジンである、請
求項２２の使用。
【請求項２５】インシュリン化合物が亜鉛を含有しないヒトインシュリン
化合物である、請求項２２の使用。
【請求項２６】インシュリン化合物がヒトＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29インシュリ
ン類似体である、請求項２２の使用。
【請求項２７】ヒスチジン化合物の濃度が約１０ミリモル〜約２５０ミリ
モルである、請求項２２の使用。
【請求項２８】組成物のｐＨが約ｐＨ７〜約ｐＨ８である、請求項２２の
使用。