CN101674812B

CN101674812B - 干燥蛋白组合物的方法、干燥的蛋白组合物和包含干燥的蛋白的药物组合物

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Publication number: CN101674812B
Application number: CN2008800133307A
Authority: CN
Inventors: S·哈夫伦; S·B·詹森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2007-04-30
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2028-04-30
Also published as: WO2008132224A2; JP2010526039A; US20100179090A1; EP2502618A3; US9387176B2; CN101674812A; EP2152245A2; JP5496082B2; WO2008132224A3; ES2563038T3; EP2502618A2; EP2152245B1

Abstract

本发明涉及喷雾干燥蛋白溶液的方法和喷雾干燥的蛋白产品。本发明还涉及含有这种喷雾干燥蛋白的药物组合物，使用本发明的喷雾干燥蛋白治疗糖尿病和高血糖的方法，和这种喷雾干燥蛋白在治疗糖尿病和高血糖中的用途。

Description

干燥蛋白组合物的方法、干燥的蛋白组合物和包含干燥的蛋白的药物组合物

发明领域

本发明涉及蛋白溶液的干燥方法和干燥的蛋白产品。本发明还涉及含有这种干燥的蛋白的药物组合物，使用本发明的干燥的蛋白治疗糖尿病和高血糖的方法，和这种干燥的蛋白在治疗糖尿病和高血糖中的用途。

发明背景

干燥是通过从固体、半固体或液体蒸发除去水分的质量转移过程，最终形成固态。可能的干燥法是真空干燥，其中通过接触导热或辐射(或微波)来提供加热，同时通过真空系统除去所产生的蒸汽。另一个技术是转鼓式干燥，其中用加热的表面提供能量，抽气机将蒸汽抽出到外部。冷冻干燥或干冻是生物化学行业通常使用的干燥法。在干燥之前将溶剂冷冻，然后升华，即在溶剂熔点以下直接从固相到达气相。冷冻干燥常常在高真空下进行，以合理的速率进行干燥。蛋白和肽的变性可以在冷冻期间发生，导致质量差的冷冻干燥产品。在化学工业、食品工业和生物化学和药学工业内，喷雾干燥具有广泛应用。从1940年代早期以来，喷雾干燥已经用于药物加工业。由于它可提供获得预定特性的粉末的手段，例如粒度分布和成型，因此它是加工药物的使用方法。另外，许多制剂加工可以在喷雾干燥器中一步实现：这些包括包封，复合物形成，甚至聚合。喷雾干燥还是干燥热敏药物(例如蛋白药物)的便利方法，活性损失最小。

国际专利申请WO 00/00176公开了通过将基本上纯的治疗剂溶液(没有不合需要的高浓度盐的伴随产品或其它赋形剂)进行喷雾干燥得到的微粒制剂。据说盐是不合需要的，因为它没有稳定效果，实际上，降低盐的量可以使稳定性更高。胰岛素微粒可如下得到：在酸(HCl)中溶解Zn-胰岛素，加入碱(NaOH)，得到胰岛素溶液，例如使pH值高于7，将胰岛素溶液喷雾干燥。加入的盐酸和氢氧化钠使得喷雾干燥的微粒制剂带有盐分。进一步的，获得的制剂(若加入到水中)则具有与送进喷雾干燥器的蛋白溶液相同的pH值。

国际专利公开WO 95/24183涉及肺部递送胰岛素的方法和组合物。胰岛素粉末是如下制备的：在含有赋形剂(甘露糖醇和/或棉子糖)的枸橼酸钠缓冲液中，将团块结晶胰岛素混合，得到7.5mg/ml的最终固体浓度和6.7±0.3的pH值，而后将胰岛素溶液喷雾干燥。

国际专利公开WO 05/092301涉及喷雾干燥胰岛素的澄清溶液(pH值在胰岛素的等电点下，优选低于5.4)。人GLP-1是37个氨基酸残基肽，源于预高血糖素原，其是在回肠远端、胰腺和脑的L-细胞中合成的。GLP-1是重要的胃肠激素，在葡萄糖代谢和胃肠分泌与代谢中具有调节功能。GLP-1可以以葡糖依赖方式促进胰岛素分泌，促进胰岛素生物合成，促进β-细胞救援，降低胰高血糖素分泌、胃排空和食物摄入。人GLP-1可水解为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)-酰胺，这两个都是促胰岛素分泌肽。

治疗激素胰岛素是影响血糖水平的小蛋白。其每天用于数百万人的糖尿病药物治疗。糖尿病是由绝对或相对缺乏胰岛素和胰岛素抗性所引起的慢性病，其导致高血糖水平(高血糖症)，产生长期并发症。

目前，糖尿病(I型和II型糖尿病)的治疗依赖所谓的增强胰岛素疗法的增加程度。按照这种方案，每天用多次胰岛素注射来治疗患者，包括每天一或两次注射长效胰岛素，来保证基本的胰岛素需求，通过快速起作用的胰岛素的快速浓注进行补充，以保证与膳食相关的胰岛素要求。

胰岛素的分子由两个链A和B组成，分别具有21和30个残基。A链是由两个螺旋片段组成的，两个螺旋片段被与其中一个螺旋连接(通过内链二硫键)的短的延长部分分开。两个额外的二硫键将A链与较大的B链连接起来。在生物学活性形式中，胰岛素以单体形式存在，其中B链包括中心螺旋区域(与两个延长部分侧接)。在二价离子例如锌的存在下，单体组装成六聚体，其中两个中心锌离子的每一个与三个组氨酸残基配位。

胰岛素易产生原纤化作用，其是一种导致良序交叉-β组装的错折叠加工过程。防止β细胞中的原纤化作用是通过锌六聚体内的敏感单体的多价螯合来提供的。当在胰岛素的喷雾干燥期间发生原纤化作用时，喷嘴可能阻塞，导致干燥过程中断。

为了避免喷雾干燥喷嘴的阻塞，另一个重要因素是所干燥的蛋白应该恰当地溶于溶液中。分散在料液中的蛋白还可能导致设备的阻塞。

进一步的，干燥蛋白的pH值是非常重要的。通常合乎需要的是，获得具有特定pH值的干燥产品，例如，可与生理pH值相比较的pH值。

本发明概述

本发明涉及干燥蛋白溶液的方法，其中

a)如下获得蛋白溶液：将蛋白与水混合，任选包含赋形剂，用挥发碱、不挥发的碱和任选不挥发的酸调节蛋白溶液的pH值，使其成为碱性，和

b)将蛋白溶液干燥

另外，本发明涉及利用所提及方法得到的干燥蛋白，包含该干燥蛋白的药物组合物和治疗糖尿病的方法。

定义

本文提及的“蛋白溶液”是指不使用酸而溶解的、pH值高于蛋白的等电点的胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素衍生物、GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或胰高血糖素的溶液。

“挥发碱”是指一种碱，在某种程度上，在加热和/或减压条件下，其可蒸发，例如，在室温下蒸汽压力高于65Pa的碱，或包含在室温下蒸汽压力高于65Pa的碱的含水共沸混合物。

本文提及的“不挥发碱”是指一种碱，其不蒸发或在加热条件下仅仅部分蒸发，例如在室温下蒸汽压力低于65Pa的碱。

本文提及的“不挥发酸”是指一种酸，其不蒸发或在加热条件下仅仅部分蒸发，例如在室温下蒸汽压力低于65Pa的酸，例如磷酸。

本文提及的“强酸”是指pKa值低于-1的酸，例如盐酸和硫酸。

本文使用的“胰岛素”是指人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素，其在CysA7和CysB7之间和在CysA20和CysB19之间具有二硫键，在CysA6和CysA11之间具有内部二硫键，或胰岛素类似物或其衍生物。

本文使用的“GLP-1”是指胰高血糖素样肽-1。人GLP-1是37个氨基酸残基的肽。人GLP-1可水解为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)-酰胺，这两个都是促胰岛素分泌肽。

“蛋白溶液/胰岛素溶液/GLP-1溶液/胰高血糖素溶液的pH值”是指用挥发性和不挥发碱调节之后、在蛋白溶液的喷雾干燥之前的蛋白/胰岛素/GLP-1/胰高血糖素溶液的pH值。

“干燥蛋白/胰岛素/GLP-1/胰高血糖素的pH值”是指当至少20mg喷雾干燥/干燥蛋白与0.5ml软化水混合、得到每ml软化水至少40mg蛋白/胰岛素/GLP-1的浓度并且测定pH值时，干燥/喷雾干燥蛋白/胰岛素/GLP-1/胰高血糖素的pH值。干燥蛋白/胰岛素/GLP-1的pH值可以如下测定：将至多大约300mg喷雾干燥/干燥蛋白/胰岛素/GLP-1与0.5ml软化水混合，测定pH值。例如，如下测定pH值：将大约20至大约250mg喷雾干燥/干燥蛋白/胰岛素/GLP-1/胰高血糖素与0.5ml软化水混合，将大约20至大约200mg喷雾干燥/干燥蛋白/胰岛素/GLP-1/胰高血糖素与0.5ml软化水混合，将大约20至大约150mg喷雾干燥/干燥蛋白/胰岛素/GLP-1/胰高血糖素与0.5ml软化水混合，或将大约20至大约100mg喷雾干燥/干燥蛋白/胰岛素/GLP-1/胰高血糖素与0.5ml软化水混合，测定pH值。

“干燥蛋白的目标pH值”是指获得干燥蛋白所需要的干燥蛋白/胰岛素/GLP-1/胰高血糖素的pH值，例如在干燥蛋白的化学稳定性是最佳的情况下的pH值，或可与生理pH值相比较的干燥蛋白的pH值。

“蛋白溶液的目标pH值”是指当蛋白溶液/胰岛素溶液/GLP-1溶液/胰高血糖素溶液应当被干燥时的合乎需要的pH值，例如，由于溶解蛋白的高溶解度或低聚集趋势，pH值是溶解蛋白处于最佳时的pH值。

本文使用的“类似物”是指一种多肽，通过除掉和/或交换至少一个存在于天然存在蛋白中的氨基酸残基和/或加入至少一个氨基酸残基，其具有形式上可以源自于蛋白结构的分子结构。加入和/或交换的氨基酸残基可以是可编码的氨基酸残基或其它天然存在的残基或纯粹合成的氨基酸残基。胰岛素类似物可以是这样的类似物，其中B链的28位可以从天然Pro残基改变为Asp、Lys或Ile之一。在另一个方面，胰岛素的B29位的Lys改变为Pro或Glu。同样，A21位的Asn可以改变为Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，尤其是改变为Gly、Ala、Ser或Thr，优选Gly。此外，B3位的Asn可以改变为Lys、Thr、Ser、Gln、Glu或Asp。胰岛素类似物的进一步例子是des(B30)人胰岛素；des(B30)人胰岛素类似物；其中PheB1已被除掉的胰岛素类似物；其中A-链和/或B-链具有N端延伸的胰岛素类似物，和其中A-链和/或B-链具有C端延伸的胰岛素类似物。由此，一或两个Arg可以加到B1位上。

简单系统用于描述GLP-1肽的类似物。由此，例如，[Gly8]GLP-1(7-37)称为GLP-1(7-37)的类似物，形式上衍生自GLP-1(7-37)，通过在8位用Gly取代天然存在的氨基酸残基(Ala)。GLP-1类似物可以是这样的类似物，其中天然存在的GLP-1(7-37)的34位的Lys被Arg取代。将不说明旋光异构体的所有氨基酸被理解为L-异构体。

在本发明的某些方面，已经改变了最多17个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了最多15个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了最多10个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了最多8个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了最多7个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了最多6个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了最多5个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了最多4个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了最多3个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了最多2个氨基酸。在本发明的某些方面，已经改变了1个氨基酸。

“desB30胰岛素”、“desB30人胰岛素”是指缺乏B30氨基酸残基的胰岛素或其类似物。

“母体胰岛素”是指天然存在的胰岛素，例如人胰岛素或猪胰岛素。或者，母体胰岛素可以是胰岛素类似物。

本文使用的“衍生物”是指化学上已经改变的天然存在的蛋白或其类似物，例如在蛋白骨架的一个或多个位置引入取代基，或将蛋白中的氨基酸残基的基团氧化或还原，或将游离氨基或羟基酰化。

本发明的说明

用本发明的方法，可以获得干燥蛋白粉末，其pH值不同于所干燥的蛋白溶液的pH值。

本发明涉及干燥蛋白溶液的干燥方法，其中

b)将蛋白溶液干燥

在本发明的一方面，该方法包括：

a)选择干燥蛋白的目标pH值，

b)选择蛋白溶液的目标pH值，

c)提供水相，

d)加入蛋白，

e)任选加入赋形剂，

f)用不挥发的碱和任选不挥发的酸将pH值调节至干燥蛋白的目标pH值，

g)用挥发的碱将pH值调节至所干燥的蛋白溶液的目标pH值，和

h)将蛋白溶液喷雾干燥。

其中步骤d、e、f和g可以以任何顺序进行，同时连续搅拌。

在本发明的一方面，步骤d、e和f可以以任何顺序进行，同时连续搅拌。

在一方面，用挥发碱和不挥发碱调节蛋白溶液。

在该方法的一方面，蛋白溶液是在温度低于大约8℃、低于大约6℃、低于大约5℃、低于大约4℃、低于大约3℃、低于大约2℃或低于大约1℃下获得的。

在一方面，抑制水的冰点，并且在低于0℃的温度获得蛋白溶液。

在一方面蛋白溶液具有高于大约7.4、高于大约7.6、高于大约7.8、高于大约8.0、高于大约8.2、高于大约8.4或高于大约8.6的pH值或目标pH值。

当蛋白溶液在大约7.6和大约11.0之间、在大约7.6和大约10.5之间、在大约7.8和大约11.0之间、在大约7.8和大约10.5之间、在大约8.0和大约11.0之间、在大约8.0和大约10.5之间、在大约8.2和大约11.0之间、在大约8.4和大约11.0之间、在大约8.6和大约10.0之间、在大约8.8和大约10.0之间、在大约9.0和大约10.0之间或在大约9.2和大约10.0之间时，较少发布蛋白细纤维化的倾向。

在本发明的一方面，将蛋白加入到水溶液中。水溶液可以是纯水，或可以含有赋形剂或碱。

在本发明的一方面，用包含不挥发碱的碱性溶液调节蛋白溶液的pH值。不挥发碱可以选自碱金属盐、碱金属氢氧化物、碱土金属盐、碱土金属氢氧化物和氨基酸或其组合。例如，可以用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙或其任一组合来调节pH值。

在本发明的一方面，用包含挥发碱的碱性溶液调节蛋白溶液的pH值。挥发碱可以选自氢氧化铵，四烷基氢氧化铵，仲胺，叔胺，芳基胺，脂肪胺或碳酸氢铵或其组合。例如，挥发碱可以是碳酸氢盐，碳酸盐，氨，肼或有机碱，例如低级脂肪族胺，例如三甲胺，三乙胺，二乙醇胺，三乙醇胺和它们的盐。进一步的，挥发碱可以是氢氧化铵、乙基胺或甲胺或其组合。

一旦将氢氧化铵加入到含有胰岛素、蛋白的水溶液中，例如，胰岛素将会更快速地溶解。

在本发明的一方面，用包含挥发碱和不挥发碱的碱性溶液调节蛋白溶液的pH值。在一方面，用氢氧化钠将蛋白溶液的pH值调节到干燥蛋白的目标pH值，用氢氧化铵调节，获得蛋白溶液(用于喷雾干燥)的所选择的pH值。

在本发明的一方面，挥发碱用于调节蛋白溶液的pH值，调节至少大约0.5pH单位，至少大约0.7pH单位，或至少大约0.9pH单位，或至少大约1.1pH单位，或至少大约1.3pH单位，或至少大约1.5pH单位。

在溶液中，胰岛素的自我结合型式是蛋白浓度、金属离子、pH值、离子强度和溶剂成分的复合功能。对于一些目前使用的含有胰岛素、锌离子、盐和酚类化合物的溶液，认为必须具有下列平衡：

6 In &LeftRightArrow; 3 {In}_{2}

3 {In}_{2} + 2 {Zn}^{2 +} H &LeftRightArrow; {In}_{6} (T_{6})

T_{6} &LeftRightArrow; T_{3} R_{3} &LeftRightArrow; R_{6}

其中In是胰岛素，In₂是二聚胰岛素，In₆是六聚胰岛素，T₆是T₆构象形式的六聚胰岛素，T₃R₃是T₃R₃构象形式的六聚胰岛素，R₆是六聚R₆状态的六聚胰岛素。

胰岛素的已知降解型包括：a)细纤维形成；b)在A18、A21和B3的脱酰胺作用；c)通过酰胺基转移作用或Schiff碱形成的二聚作用；d)二硫化物交换反应。

按照Brange(Stability of Insulin，Kluwer Academic Press，1994)，这些降解反应的每一个在单体状态中比在六聚状态中进行的显著更快。因此，稳定胰岛素制品的最有效的方法是尽可能向右推动上述平衡。除了质量作用的这种综合影响之外，根据它们在T→R构型变化中的直接涉及程度，进一步改变所选择残基的反应性。由此，在R状态下(当残基存在于alfa-螺旋中时)，B3Asn的反应性比在T-状态下的反应性低得多。通过与T₃R₃和R₆形式结合的配体，调节两个锌胰岛素六聚体的T₆、T₃R₃和R₆构象之间的相互转化。阴离子例如氯化物对T₃R₃和R₆的金属离子中的第四个配位位置具有亲合性，而防腐剂例如酚与位于T₃R₃和R₆形式的表面附近的疏水性凹穴结合(Derewenda，Nature，和Brzovic，Biochemistry 33，130557，1994)。

因此，在溶液中，有利于胰岛素R6构象的条件在干燥过程期间(以免胰岛素的变性)和在搁置存储期间(以便极大化化学稳定性)都是优点。

在本发明的一方面，蛋白溶液包含酚。在一方面，每摩尔蛋白的蛋白溶液包含至少大约2摩尔酚，或每摩尔蛋白至少大约3摩尔酚，或每摩尔蛋白至少大约4摩尔酚。在一方面，蛋白溶液包含大约4摩尔酚(每摩尔胰岛素)。在一方面，蛋白溶液包含大约4摩尔酚(每摩尔胰岛素)，并且蛋白溶液包含锌。当蛋白溶液包含胰岛素时，酚可以使胰岛素六聚体稳定。

在本发明的一方面，蛋白选自胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物和GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合。

在本发明的一方面，蛋白溶液包含蛋白，该蛋白选自胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，并且溶液进一步包含锌。包含胰岛素的蛋白溶液的锌含量可以是每个胰岛素六聚体大约2到大约4个锌离子的范围之内，或锌含量可以是每个胰岛素六聚体大约2.1到大约3个锌离子的范围之内，或锌含量可以是每个胰岛素六聚体大约2.2到大约2.7个锌离子的范围之内。包含胰岛素的蛋白溶液的锌含量可以是每个胰岛素六聚体大约2.3个锌离子。

在本发明的一方面，蛋白溶液包含缓冲液，清净剂，稳定剂，蛋白酶抑制剂，调味剂，载体，吸收促进剂，填充剂或改善流动特性的试剂或渗透增强剂。

在本发明的一方面，蛋白溶液包含双甘氨肽。当双甘氨肽加入到蛋白溶液中时，蛋白溶解更迅速。在一方面，将双甘氨肽加入到包含胰岛素的水溶液中。在溶液中，双甘氨肽的浓度在大约4mM和大约200mM之间。

在本发明的一方面，本发明涉及干燥或喷雾干燥蛋白溶液的方法，并且测定干燥蛋白的目标pH值。要干燥的或喷雾干燥的蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的目标pH值。蛋白溶液的pH值可以至少高于干燥蛋白的pH值0.5个pH单位。蛋白溶液的pH值可以高于喷雾干燥蛋白的pH值至少大约0.7、至少大约0.9、至少大约1.1、至少大约1.3或至少大约1.5、或至少大约2.0、或至少大约2.5个pH单位。

在本发明的一方面，喷雾干燥蛋白的pH值或目标pH值在大约6.0和大约8.5之间，在大约6.2和大约8.4之间，在大约6.4和大约8.3之间，在大约6.6和大约8.2之间，在大约6.8和大约8.1之间，在大约7.0和大约8.0之间，在大约7.2和大约7.9之间，在大约7.4和大约7.8之间，或在大约7.6和大约7.7之间。

在本发明的一方面，将蛋白溶液干燥或喷雾干燥，获得低于大约10％的水含量。水含量可以低于大约6％、低于大约4％、低于大约2％或低于大约1％，按照实验部分中所陈述的方法、基于干燥失重试验(重力法)计算/测定。

在本发明的一方面，要干燥或喷雾干燥的蛋白选自AspB28人胰岛素；LysB28ProB29人胰岛素和LysB3GluB29人胰岛素。

在一方面，本发明涉及通过本发明方法获得的干燥蛋白。

在一方面，本发明涉及实施例中描述的干燥蛋白。

在一方面，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的按照本发明的干燥蛋白，例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合，该组合物可以在需要这种治疗的患者中治疗I型糖尿病、II型糖尿病及其它导致高血糖的状况。

在一方面，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的按照本发明的干燥蛋白以及可药用载体和/或可药用添加剂，干燥蛋白例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合，该组合物可以在需要这种治疗的患者中治疗I型糖尿病、II型糖尿病及其它导致高血糖的状况。

在本发明的一方面，提供了在需要治疗的患者中治疗I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖状况的方法，包括给予患者治疗有效量的药物组合物，药物组合物包含按照本发明的干燥蛋白，例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合。

在本发明的一方面，提供了在需要治疗的患者中治疗I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖状况的方法，包括给予患者治疗有效量的药物组合物，药物组合物包含按照本发明的干燥蛋白以及任选的可药用载体和/或药学可接受的添加剂，干燥蛋白例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合。

在本发明的一方面，提供了在需要治疗的患者中治疗I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖状况的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的按照本发明的干燥蛋白与一或两种按照本发明的喷雾干燥蛋白以及任选的可药用载体和/或添加剂的混合物，干燥蛋白例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素，喷雾干燥蛋白例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素。

在本发明的一方面，提供了在需要治疗的患者中治疗I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖状况的方法，包括给予患者治疗有效量的药物组合物，药物组合物包含按照本发明的干燥蛋白与一或两种按照本发明的干燥蛋白以及任选的可药用载体和/或药学可接受的添加剂的混合物，本发明的干燥蛋白例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素，一或两种按照本发明的干燥蛋白例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素。

本发明的一个方面涉及药物组合物，其包含治疗有效量的按照本发明的干燥蛋白以及任选的可药用载体和/或可药用添加剂，干燥蛋白例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合，该药物组合物可以在需要这种治疗的患者中为I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖的状况提供肺部治疗。

在一方面，本发明涉及药物组合物在需要治疗的患者中用于I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖状况的肺部治疗，药物组合物包含治疗有效量的按照本发明的干燥蛋白，干燥蛋白例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合，任选与具有速效作用的胰岛素或胰岛素类似物以及可药用载体和/或添加剂混合。

在本发明的一方面，提供了制备药物组合物的方法，该药物组合物用于治疗I型糖尿病、II型糖尿病及其它引起高血糖状况，该组合物是肺部使用的，并且包含治疗有效量的按照本发明的干燥蛋白，干燥蛋白例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合，任选与具有速效作用的胰岛素或胰岛素类似物以及可药用载体和/或药学可接受的添加剂混合。

胰岛素的制备

胰岛素或其前体物可以利用众所周知的肽合成或利用众所周知的重组体制备方法(在合适转化的微生物中)来制备。由此，胰岛素可以利用包括如下的方法制备：在合宜的营养剂介质中，在允许肽的表达的条件下，将含有编码多肽和能够表达多肽的DNA序列的宿主细胞进行培养，而后，从培养物中回收得到的肽。

当制备用于按照本发明的药学制剂中的胰岛素衍生物时，可以利用众所周知的肽合成方法或众所周知的重组体制备方法(在合适转化的微生物中)，制备用于代替的起始产品、母体胰岛素或胰岛素类似物或其前体物。由此，胰岛素起始产品可以利用包括如下的方法制备：在合宜的营养剂介质中，在允许肽的表达的条件下，将含有编码多肽和能够表达多肽的DNA序列的宿主细胞进行培养，而后，从培养物中回收得到的肽。参考国际专利申请WO 2005/012347。

药物组合物

本发明的干燥蛋白可以例如皮下、口服、鼻部或肺部施用。

对于皮下施用，用配制已知胰岛素的类似方法来配制干燥胰岛素。此外，对于皮下施用，利用类似于施用已知胰岛素的方法来施用本发明的干燥胰岛素，通常，医生熟悉这种方法。

本发明的干燥胰岛素可以以增加循环胰岛素水平和/或降低循环葡糖水平的剂量有效方式通过吸入剂施用。这种施用可以有效治疗例如糖尿病或高血糖病症。获得有效的胰岛素剂量需要施用本发明的干燥胰岛素的吸入剂量，剂量大于大约0.5μg/kg至大约50μg/kg。专业人员可以确定治疗有效量，其将考虑各种因素，包括患者的胰岛素水平、血糖水平、身体病症、患者的肺部状态，等等。

按照本发明，本发明的干燥胰岛素可以通过吸入递送，以将其快速吸收。吸入给药可以产生与皮下施用胰岛素相比拟的药物动力学。本发明的干燥胰岛素吸入可以导致循环胰岛素水平的快速升高，而后血液中葡糖水平迅速下降。当比较类似大小的颗粒和类似水平的肺沉积时，不同的吸入装置典型地提供类似的药物动力学。

按照本发明，本发明的干燥胰岛素可以通过本领域已知的、用于吸入给予治疗剂的任何种类的吸入装置来递送。这些装置包括计量吸入器、雾化器、干燥粉未发生器、喷雾器，等等。本发明的干燥胰岛素通过干粉吸入器或喷雾器递送。用于给予本发明干燥胰岛素的吸入装置具有一些所需要的特征。例如，通过吸入装置递送是有利可靠的、可再现的和精确的。吸入装置应该递送小颗粒，例如颗粒小于大约10μm，例如大约1-5μm，以便良好呼吸。适合于本发明实践的可商购的吸入装置的一些具体例子是Turbohaler^TM(Astra)，

(Glaxo)，

(Glaxo)，Spiros^TM吸入器(Dura)，Inhale Therapeutics销售的装置，AERx^TM(Aradigm)，

雾化器(Mallinckrodt)，Acorn

雾化器(Marquest Medical Products)，

定量吸入器(Glaxo)，

粉末吸入器(Fisons)，等等。

本领域技术人员能够了解，本发明的干燥蛋白制剂、递送制剂的数量和单一剂量的给予周期取决于所使用吸入装置的类型。对于一些气溶胶递送系统，例如雾化器，给予频率和系统启动的时间长短主要取决于气溶胶中的胰岛素共轭物的浓度。例如，较短的给药周期可以使用于高浓度的胰岛素共轭物(在雾化器溶液中)。装置例如定量吸入器可以产生更高气溶胶浓度，并且可以操作较短的递送目标数量的胰岛素共轭物的周期。装置例如粉末吸入器可以递送活性剂，直到给定的试剂荷载从装置中排出为止。在这类吸入器中，在所得到数量的粉末中的本发明干燥胰岛素的量决定了单次给药中所递送的剂量。

关于胰岛素进入到肺中和进入到下呼吸道或肺泡中的能力，在制剂中通过吸入装置递送的本发明的干燥胰岛素的粒径是关键性的。可以配制本发明的干燥胰岛素，以使至少大约10％的所递送的胰岛素共轭物沉积在肺中，例如大约10至大约20％，或更多。已知的是，对于张口呼吸的人，肺部沉积的最高效率是用大约2μm至大约3μm大小的颗粒得到的。当颗粒大小超过大约5μm时，肺部的沉积会大量地降低。低于大约1μm尺寸的颗粒会导致肺部沉积降低，并且变得难以递送足够质量的治疗有效的颗粒。由此，通过吸入递送的干燥蛋白的颗粒具有小于大约10μm的粒径，例如在大约1μm至大约5μm范围内。选择干燥蛋白的制剂，以便在所选择的吸入装置中得到目标粒径。

优选，对于干粉形式给药，以小于大约10μm粒径的颗粒形式制备本发明的干燥蛋白，例如大约1至大约5μm。该粒径可有效递送至患者的肺泡中。干粉基本上由制备的颗粒组成，大部分颗粒应该具有目标范围的尺寸。优选，至少大约50％的干粉由具有小于大约10μm直径的颗粒组成。

在容器中，颗粒通常与干粉制剂分离，而后通过载体空气流输送到患者的肺中。典型地，在现行的干粉吸入器中，破碎固体的力仅仅是通过患者的吸入所提供的。在另一个类型的吸入器中，通过患者吸入产生的气流启动叶轮马达，其可以使颗粒解聚。

对于用干粉吸入器施用的本发明的干燥蛋白的制剂，典型地包括含有干燥蛋白的细分散干粉，但粉末还可以包括填充剂、载体、赋形剂、另一种添加剂，等等。添加剂可以包括在胰岛素共轭物的干粉制剂中，例如，根据具体粉末吸入器的递送需要来稀释粉末，便于制剂的加工，以提供给制剂有利的粉末特性，便于从吸入装置中出来的粉末的分散，使制剂稳定(例如，抗氧化剂或缓冲液)，提供制剂味道，等等。优选，添加剂不会不利地影响患者的呼吸道。可以以分子水平将干燥蛋白与添加剂混合，或固体制剂可以包括蛋白共轭物的颗粒，其中蛋白共轭物与添加剂的颗粒混合，或涂渍在添加剂的颗粒上。典型的添加剂包括：单、二和多糖；糖醇及其它多元醇，例如，乳糖，葡糖，棉子糖，松三糖，乳糖醇，麦芽糖醇(maltitol)，海藻糖，蔗糖，甘露糖醇，淀粉，或其组合；表面活化剂，例如山梨糖醇，二磷脂酰胆碱，或卵磷脂；等等。典型地，添加剂，例如填充剂，以对上述目的有效的数量提供，常常是制剂重量的大约50％至大约99％。对于蛋白制剂，例如胰岛素类似物蛋白，本领域已知的其它试剂还可以包括在制剂中。

蛋白溶液可以任选与适合于呼吸和肺部给药的药学载体或赋形剂混合。当希望载体降低给予患者的粉末中的胰岛素浓度时，这种载体可以简单地以填充剂形式提供，但也可以用来增强胰岛素组合物的稳定性、提高粉末在粉末分散装置内的分散性，以便提供胰岛素的更有效和可再现的递送，改进胰岛素的处理特性，例如流动性和黏稠度，便于制备和装填粉末。

合适载体材料可以是非晶形粉末、晶体粉末或非晶形和晶体粉末的组合形式。合适物质包括碳水化合物，例如单糖，例如果糖，半乳糖，葡糖，D-甘露糖，山梨糖，等等；二糖，例如乳糖，海藻糖，纤维二糖，等等；环糊精，例如2-羟基丙基-环糊精；和多糖，例如棉子糖，麦芽糖糊精，葡聚糖，等等；(b)氨基酸，例如甘氨酸，精氨酸，门冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，等等；(c)用有机酸和碱制备的有机盐，例如枸橼酸钠，抗坏血酸钠，葡萄糖酸镁，葡糖酸钠，氨基丁三醇盐酸盐，等等；(d)肽和蛋白，例如阿斯巴甜，人血清白蛋白，凝胶，等等；(e)糖醇，例如甘露糖醇，木糖醇，等等。优选的一组载体包括乳糖，海藻糖，棉子糖，麦芽糖糊精，甘氨酸，枸橼酸钠，氨基丁三醇盐酸盐，人血清白蛋白和甘露糖醇。

这种载体物质可以在喷雾干燥之前与胰岛素混合，即，向准备喷雾干燥的蛋白溶液或水溶液中加入载体。用这种方法，能够与蛋白颗粒同时并且作为蛋白颗粒的一部分形成载体。

典型地，当载体通过与蛋白一起喷雾干燥形成时，蛋白存在于每个单个颗粒中，其重量百分数在5％至95％的范围，优选20％至80％。颗粒的剩余部分主要是载体物质(典型地是5％至95％重量，通常是20％至80％重量)，但也包括缓冲液，还可以包括如上所述的其它组分。

或者，可以独立地制备干粉形式的载体，并且通过共混而与干粉蛋白混合。独立制备的粉末载体通常是晶体(避免吸水)，但在某些情况下可以是非晶形的或晶体和非晶体的混合物。可以选择载体颗粒的尺寸，以提高胰岛素粉末的流动性，典型地在25m至100m的范围。在该尺寸范围的载体颗粒通常不渗入到肺的蜂窝状区域中，并且在吸入之前常常在递送装置中从胰岛素中分离出来。由此，渗入肺的蜂窝状区域的颗粒基本上由胰岛素和缓冲剂组成。优选的载体材料是具有上述范围尺寸的晶体甘露糖醇。

本发明的干燥胰岛素粉末还可以与其它活性组分混合。例如，合乎需要的是，在胰岛素粉末中混合少量的糊精或活性糊精类似物，以改善糖尿病的治疗。糊精是在正常(非糖尿病患者)个体中由胰腺0-细胞胰岛素分泌的激素。人们相信，糊精可调节胰岛素体内活性，并且认为与胰岛素一起给予糊精，可以改善血糖控制。在本发明的组合物中，干粉糊精与胰岛素混合可提供用于这种同时给药尤其方便的产品。糊精可以与胰岛素混合，重量从0.1％至10％(基于剂量中的胰岛素的总重量)，优选从0.5％重量至2.5％重量。糊精可得自于商品供应商，例如AmylinCorporation，San Diego，California，并且可以容易地配制在本发明的组合物中。例如，糊精可以与胰岛素以及任选的载体一起溶于水溶液或其它合适溶液，并且将溶液喷雾干燥，产生粉末产品。

包含本发明干燥蛋白的喷雾可以在压力下强迫蛋白共轭物的悬浮液或溶液通过喷嘴来产生。可以选择喷嘴尺寸和构造、外加压力和液体进料速度，以获得所需输出量和粒径。可以产生电喷雾，例如，通过电场与毛细管或喷嘴进料结合。优选，通过喷雾器递送的胰岛素共轭物的颗粒具有小于大约10μm的粒径，例如在大约1μm至大约5μm的范围内。

适合使用喷雾器的本发明的干燥蛋白的制剂，典型地包含在水溶液中的蛋白，其浓度为每ml溶液大约1mg至大约20mg蛋白共轭物。制剂可以包含试剂，例如赋形剂、缓冲剂、等渗试剂、防腐剂、表面活化剂，和例如锌。制剂还可以包含赋形剂或用以稳定晶体的试剂，例如缓冲剂、还原剂、原液(bulk)蛋白或碳水化合物。用于配制干燥蛋白共轭物的原液蛋白包括白蛋白、精蛋白等等。用于配制蛋白共轭物的典型碳水化合物包括蔗糖，甘露糖醇，乳糖，海藻糖，葡糖，等等。晶体制剂还可以包括表面活化剂，其可以降低或预防由气溶胶形式溶液的雾化所引起的表面诱导的胰岛素共轭物的聚集。可以使用各种常规表面活化剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。数量通常介于制剂的大约0.001和大约4％重量的范围之间。

含有按照本发明的干燥蛋白的药物组合物还可以鼻部施用。药物组合物可以以液体组合物、干燥组合物或凝胶形式给药。对于通过鼻子给药，晶体可以超过10μm，以便保证沉积在鼻腔中，并且避免颗粒被进一步携带到气管支气管和肺部区域。不太了解尺寸的上限，但可以这样限制粒径的上限：超过该粒径时，颗粒(因为许多原因)表明没有效果，并且甚至可能导致局部刺激性。

含有按照本发明的干燥蛋白的药物组合物还可以胃肠外给予需要这种治疗的患者。肠胃外给药可以借助于注射器通过皮下、肌注或静脉注射进行，任选笔类注射器。或者，肠胃外给药可以借助于输液泵进行。

本发明干燥蛋白的注射组合物可以使用制药工业的传统方法制备，该方法涉及将组分溶解和混合(视情况而定)，得到目标最终产物。由此，按照一个方法，将包含按照本发明胰岛素的晶体溶于适量的水中，水的体积稍微少于所制备组合物的最终体积。根据需要，加入等渗试剂、防腐剂和缓冲剂，如果需要的话，使用酸例如盐酸或碱例如氢氧化钠水溶液(按照需要)调节溶液的pH值。最后，用水调节溶液的体积，得到组分的目标浓度。

在本发明的进一步方面，缓冲剂选自乙酸钠，碳酸钠，柠檬酸盐，双甘氨肽，组氨酸，甘氨酸，赖氨酸，精氨酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钠，和三(羟甲基)-甲胺，N-二羟乙基甘氨酸，麦黄酮(tricine)，苹果酸，琥珀酸盐，马来酸，富马酸，酒石酸，门冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂的每个构成了本发明的替代性的方面。

在本发明的进一步方面，制剂进一步包含可药用防腐剂，防腐剂可以选自酚，邻甲酚，间甲酚，对甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，2-苯氧乙醇，对羟基苯甲酸丁酯，2-苯基乙醇，苯甲醇，氯丁醇，和硫柳汞(thiomerosal)，溴硝丙二醇，苯甲酸，咪唑啉基脲(imidurea)，双氯苯双胍己烷，脱氢醋酸钠，氯甲酚，对羟苯甲酸乙酯，苄索氯铵，氯酚醚(chlorphenesine)(3p-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本发明的进一步方面，防腐剂存在的浓度是0.1mg/ml至20mg/ml。在本发明的进一步方面，防腐剂存在的浓度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本发明的进一步方面，防腐剂存在的浓度是5mg/ml至10mg/ml。在本发明的进一步方面，防腐剂存在的浓度是10mg/ml至20mg/ml。这些具体防腐剂的每个构成了本发明的替代性的方面。防腐剂在药物组合物中的用途对于技术人员是众所周知的。为方便起见，参考Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，19^th edition，1995。

在本发明的进一步方面，制剂进一步包含等渗试剂，其可以选自盐(例如氯化钠)，糖或糖醇，氨基酸(例如甘氨酸，L-组氨酸，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，门冬氨酸，色氨酸，苏氨酸)，糖醇(alditol)(例如丙三醇(甘油)，1，2-丙二醇(丙二醇)，1，3-丙二醇，1，3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)，或其混合物。可以使用任何糖，例如单、二或多糖，或水溶性的葡聚糖，包括例如果糖，葡糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，葡聚糖，支链淀粉，糊精，环糊精，可溶性淀粉，羟乙基淀粉和羧甲纤维素钠。在一方面，糖添加剂是蔗糖。将糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，并且包括，例如，甘露糖醇，山梨糖醇，肌醇，半乳糖醇，卫矛醇，木糖醇和阿糖醇。在一方面，糖醇添加剂是甘露糖醇。上述的糖或糖醇可以单独或组合使用。对使用数量没有固定限制，只要糖或糖醇可溶于液体药剂并且不会不利地影响使用本发明方法所获得的稳定效果即可。在一方面，糖或糖醇浓度在大约1mg/ml和大约150mg/ml之间。在本发明的进一步方面，等渗试剂存在的浓度是1mg/ml至50mg/ml。在本发明的进一步方面，等渗试剂存在的浓度是1mg/ml至7mg/ml。在本发明的进一步方面，等渗试剂存在的浓度是8mg/ml至24mg/ml。在本发明的进一步方面，等渗试剂存在的浓度是25mg/ml至50mg/ml。这些具体等渗试剂的每个构成了本发明的替代性的方面。等渗试剂在药物组合物中的用途对于技术人员是众所周知的。为方便起见，参考Remington：The Science andPractice of Pharmacy，19^th edition，1995。

典型的等渗试剂是氯化钠，甘露糖醇，二甲砜和丙三醇，典型的防腐剂是酚，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯和苯甲醇。

合适缓冲剂的例子是乙酸钠，双甘氨肽，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)和磷酸钠。

含有本发明干燥蛋白(例如胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素)的组合物可以用于治疗对胰岛素敏感的状况。由此，它们可以用于治疗I型、II型糖尿病和高血糖症，例如在受到严重伤害的人和进行大手术的人中有时所看到的症状。对于任何患者，最佳剂量水平取决于各种因素，包括所使用的具体胰岛素的效果，患者的年龄、体重、实际活动和饮食，取决于与其它药物的合适组合，和取决于所治疗状况的严重程度。推荐的是，对于每个个体患者，由本领域技术人员按照与已知药物组合物类似的方法来确定本发明的干燥蛋白的日剂量。

在适宜的情况下，本发明的干燥蛋白可以与具有更速效作用的其它类型蛋白例如胰岛素类似物混合使用。这种胰岛素类似物的例子描述在例如下列中：欧洲专利申请(具有公开号EP 214826(Novo Nordisk A/S)，EP 375437(Novo Nordisk A/S)和EP 383472(Eli Lilly&Co.))。

将本文中引用的所有参考文献(包括出版物，专利申请和专利)以其整体引入本文作为参考，其程度如同每个参考文献是单独和具体地注明引入作为参考那样，并且本文以其整体列出(法律所允许的最大程度)。

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本发明包括本文所附加权利要求中所列举主题的适用的法律所允许的所有变体和等效内容。

下面的段落概括了本发明：

1.干燥蛋白溶液的方法，其中

b)将蛋白溶液干燥

2.按照段落1的方法，包括：

a)选择干燥蛋白的目标pH值，

b)选择蛋白溶液的目标pH值，

c)提供水相，

d)加入蛋白，

e)任选加入赋形剂，

g)用挥发的碱将pH值调节至所要干燥的蛋白溶液的目标pH值，和

h)将蛋白溶液喷雾干燥。

其中步骤d、e、f和g可以以任何顺序进行，同时连续搅拌。

3.按照段落2的方法，其中步骤d、e和f可以以任何顺序进行，同时连续搅拌。

4.按照段落1-3的方法，其中蛋白溶液是在低于8℃的温度下获得的。

5.按照段落1-4的方法，其中蛋白溶液是在低于6℃、低于5℃、低于4℃、低于3℃、低于2℃或低于1℃的温度下获得的。

6.按照段落1-5的方法，其中抑制水相的冰点，蛋白溶液是在低于0℃的温度下获得的。

7.按照段落1-6的方法，其中干燥法选自喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、流化床干燥、冷冻干燥和真空干燥。

8.按照段落1-7的方法，其中蛋白溶液具有高于7.4的pH值。

9.按照段落1-8的方法，其中蛋白溶液具有高于7.6、高于7.8、高于8.0、高于8.2、高于8.4或高于8.6的pH值。

10.按照段落1-8的方法，其中蛋白溶液具有在7.4和11.0之间的pH值。

11.按照段落1-8和10的方法，其中蛋白溶液具有在大约7.6和大约11.0之间、在大约7.6和大约10.5之间、在大约7.8和大约11.0之间、在大约7.8和大约10.5之间、在大约8.0和大约11.0之间、在大约8.0和大约10.5之间、在大约8.2和大约11.0之间、在大约8.4和大约11.0之间、在大约8.6和大约10.0之间、在大约8.8和大约10.0之间、在大约9.0和大约10.0之间或在大约9.2和大约10.0之间的pH值。

12.按照段落1-11的方法，其中不挥发碱选自碱金属盐、碱金属氢氧化物、碱土金属盐、碱土金属氢氧化物和氨基酸或其组合。

13.按照段落12的方法，其中不挥发碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙或其任一组合。

14.按照段落1-13的方法，其中挥发碱选自氢氧化铵，四烷基氢氧化铵，仲胺，叔胺，芳基胺，脂肪族胺或碳酸氢铵或其组合。

15.按照段落14的方法，其中挥发碱是氢氧化铵、乙基胺或甲胺或其组合。

16.按照段落1-15的方法，其中挥发碱调节蛋白溶液的pH值，调节至少0.5个pH单位。

17.按照段落1-16的方法，其中挥发碱调节蛋白溶液的pH值，调节至少0.7个pH单位，或至少0.9个pH单位或至少1.1个pH单位，或至少1.3个pH单位或至少1.5个pH单位。

18.按照段落1-17的方法，其中用包含氢氧化钠和氢氧化铵的溶液调节蛋白溶液的pH值。

19.按照段落1-18的方法，其中蛋白选自胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物和GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合。

20.按照段落1-19的方法，其中蛋白溶液包含选自下列的蛋白：胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，并且溶液进一步包含锌。

21.按照段落20的方法，其中蛋白溶液包含酚。

22.按照段落20-21的方法，其中在蛋白溶液中，每摩尔蛋白包含大约4摩尔酚。

23.按照段落1-22的方法，其中蛋白溶液包含缓冲剂，清洗剂，稳定剂，蛋白酶抑制剂，调味剂，载体，吸收促进剂(absorption protactingagent)，填充剂或改善流动特性的试剂或渗透增强剂或其组合。

24.按照段落23的方法，其中蛋白溶液包含双甘氨肽。

25.按照段落1-24的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值。

26.按照段落25的方法，其中蛋白溶液的pH值至少高于干燥蛋白的pH值0.5个pH单位。

27.按照段落1-26的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值，高出至少0.7、至少0.9、至少1.1、至少1.3或至少1.5个pH单位。

28.按照段落1-27的方法，其中干燥蛋白的pH值在大约6.0和大约8.5之间。

29.按照段落1-28的方法，其中干燥蛋白的pH值在大约6.2和大约8.4之间，在大约6.4和大约8.3之间，在大约6.6和大约8.2之间，在大约6.8和大约8.1之间，在大约7.0和大约8.0之间，在大约7.2和大约7.9之间，在大约7.4和大约7.8之间或在大约7.6和大约7.7之间。

30.按照段落1-29的方法，其中将蛋白溶液干燥，达到喷雾干燥蛋白的水含量低于大约10％、低于大约6％、低于大约4％、低于大约2％或低于大约1％。

31.按照段落1-30的方法，其中蛋白是胰岛素类似物，选自AspB28人胰岛素；LysB28ProB29人胰岛素和LysB3GluB29人胰岛素。

32.由段落1-31的方法得到的干燥蛋白。

33.药物组合物，其包含治疗有效量的按照段落32的喷雾干燥蛋白。

34.按照段落33的药物组合物，其中组合物用于糖尿病或高血糖症的肺部、肠胃外、鼻部或口服治疗。

35.药物组合物，其在需要治疗的患者中用于糖尿病或高血糖症的治疗，其包含治疗有效量的按照段落32的干燥蛋白，其中蛋白选自胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合。

36.在需要治疗的患者中治疗糖尿病的方法，包括给予患者治疗有效量的按照段落32的干燥蛋白或按照段落33-35的任一项的药物组合物。

37.按照段落36的方法，其中蛋白选自胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，胰高血糖素和/或其任一组合。

38.实施例中描述的干燥蛋白。

1a.干燥蛋白溶液的方法，其中

a)如下获得蛋白溶液：将蛋白与水混合，任选包含赋形剂，调节pH值，使其成为碱性，和

b)将蛋白溶液干燥

2a.用蛋白溶液制备干燥蛋白的方法，包括：

a)选择干燥蛋白的目标pH值，

b)选择蛋白溶液的目标pH值，

c)提供水相，

d)加入蛋白，

e)任选加入赋形剂，

f)用不挥发的碱将pH值调节至干燥蛋白的目标pH值，

h)将蛋白溶液喷雾干燥。

其中步骤d、e、f和g可以以任何顺序进行，同时连续搅拌。

3a.按照段落1a的方法，其中蛋白溶液是用挥发性碱和不挥发性碱调节的。

4a.按照段落1a-3a的方法，其中蛋白溶液是在低于8℃的温度下获得的。

5a.按照段落1a-4a的方法，其中蛋白溶液是在低于6℃、低于5℃、低于4℃、低于3℃、低于2℃或低于1℃的温度下获得的。

6a.按照段落1a-5a的方法，其中抑制水相的冰点，且蛋白溶液是在低于0℃的温度下获得的。

7a.按照段落1a-6a的方法，其中干燥法选自喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、流化床干燥、冷冻干燥和真空干燥。

8a.按照段落1a-7a的方法，其中蛋白溶液具有高于7.4的pH值。

9a.按照段落1a-8a的方法，其中蛋白溶液具有高于7.6、高于7.8、高于8.0、高于8.2、高于8.4或高于8.6的pH值。

10a.按照段落1a-8a的方法，其中蛋白溶液具有在7.4和11.0之间的pH值。

11a.按照段落1a-8a和10a的方法，其中蛋白溶液具有在大约7.6和大约11.0之间、在大约7.6和大约10.5之间、在大约7.8和大约11.0之间、在大约7.8和大约10.5之间、在大约8.0和大约11.0之间、在大约8.0和大约10.5之间、在大约8.2和大约11.0之间、在大约8.4和大约11.0之间、在大约8.6和大约10.0之间、在大约8.8和大约10.0之间、在大约9.0和大约10.0之间或在大约9.2和大约10.0之间的pH值。

12a.按照段落1a-11a的方法，其中不挥发性碱选自碱金属盐、碱金属氢氧化物、碱土金属盐、碱土金属氢氧化物和氨基酸或其组合。

13a.按照段落12a的方法，其中不挥发性碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙或其任一组合。

14a.按照段落1a-11a的方法，其中挥发性碱选自氢氧化铵，四烷基氢氧化铵，仲胺，叔胺，芳基胺，脂肪族胺或碳酸氢铵或其组合。

15a.按照段落14a的方法，其中挥发性碱是氢氧化铵、乙基胺或甲胺或其组合。

16a.按照段落1a-15a的方法，其中挥发性碱调节蛋白溶液的pH值，调节至少0.5个pH单位。

17a.按照段落1a-16a的方法，其中挥发性碱调节蛋白溶液的pH值，调节至少0.7个pH单位，或至少0.9个pH单位或至少1.1个pH单位，或至少1.3个pH单位或至少1.5个pH单位。

18a.按照段落1a-17a的方法，其中用包含氢氧化钠和氢氧化铵的溶液调节蛋白溶液的pH值。

19a.按照段落1a-18a的方法，其中蛋白溶液包含酚。

20a.按照段落1a-19a的方法，其中蛋白选自胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，exendin，exendin类似物和衍生物和/或其任一组合。

21a.按照段落1a-20a的方法，其中蛋白选自糊精，糊精类似物，糊精衍生物，α-MSH，α-MSH类似物，α-MSH衍生物和/或其任一组合。

22a.按照段落1a-20a的方法，其中蛋白溶液包含选自下列的蛋白：胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，并且溶液进一步包含锌。

23a.按照段落1a-22a的方法，其中蛋白溶液包含缓冲剂，清洗剂，稳定剂，蛋白酶抑制剂，调味剂，载体，吸收促进剂，填充剂或改善流动特性的试剂或渗透增强剂或其组合。

24a.按照段落23a的方法，其中蛋白溶液包含双甘氨肽。

25a.按照段落1a-24a的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值。

26a.按照段落25a的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值至少0.5个pH单位。

27a.按照段落1a-26a的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值，高出至少0.7、至少0.9、至少1.1、至少1.3或至少1.5个pH单位。

28a.按照段落1a-27a的方法，其中干燥蛋白的pH值在大约6.0和大约8.5之间。

29a.按照段落1a-28a的方法，其中干燥蛋白的pH值在大约6.2和大约8.4之间，在大约6.4和大约8.3之间，在大约6.6和大约8.2之间，在大约6.8和大约8.1之间，在大约7.0和大约8.0之间，在大约7.2和大约7.9之间，在大约7.4和大约7.8之间或在大约7.6和大约7.7之间。

30a.按照段落1a-29a的方法，其中将蛋白溶液干燥，达到喷雾干燥蛋白的水含量低于大约10％、低于大约6％、低于大约4％、低于大约2％或低于大约1％。

31a.按照段落1a-30a的方法，其中蛋白是胰岛素类似物，选自AspB28人胰岛素；LysB28ProB29人胰岛素和LysB3GluB29人胰岛素。

32a.由段落1a-31a的方法得到的干燥蛋白。

33a.药物组合物，其包含治疗有效量的按照段落32a的喷雾干燥的蛋白。

34a.按照段落33a的药物组合物，其中组合物用于糖尿病或高血糖症的肺部、肠胃外、鼻部或口服治疗。

35a.药物组合物，其用于需要治疗的患者中的糖尿病或高血糖症的治疗，其包含治疗有效量的按照段落32a的干燥蛋白，其中蛋白选自胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，exendin，exendin类似物和衍生物和/或其任一组合。

36a.在需要治疗的患者中治疗糖尿病的方法，包括给予患者治疗有效量的按照段落32a的干燥蛋白或按照段落33a-35a的任一项的药物组合物。

37a.按照段落36a的方法，其中蛋白选自胰岛素，胰岛素类似物，胰岛素衍生物，GLP-1，GLP-1类似物，GLP-1衍生物，exendin，exendin类似物和衍生物和/或其任一组合。

38a.实施例中描述的干燥蛋白。

分析方法

基于Ph.Eur方法，利用等度筛析色谱法测定HMWP含量。使用Waters Insulin HMWP 7,8×300mm柱，流动相由65％1.0mg/ml L-精氨酸溶液、20％乙腈和15％冰醋酸组成，流速0.5ml/min。注射体积是100μl。柱温是环境温度。检测是利用紫外线吸收(在276nm)进行的。对色谱峰面积以总峰面积为基础进行分析。

纯度是用反相层析方法测定的，使用Waters Sunfire C18，3.5μm，150×4.6mm i.d.柱。柱温是35℃，流速是1ml/min。使用梯度系统，流动相A含有1.4％(w/w)硫酸钠、0.2％(w/w)o-磷酸、7.7％(w/w)乙腈，pH值3.6，流动相B含有42.8％(w/w)乙腈/水。梯度系统开始以大约42％流动相B等度洗脱30分钟。然后用3分钟从42％至80％线性增加流动相B，而后保持等度洗脱2分钟。然后初始条件返回到42％流动相B，用1分钟，保持20分钟。用紫外线吸收(在214nm处)进行检测。注射体积是10μl。对色谱峰面积以总峰面积为基础进行分析。该方法检测了胰岛素相关的杂质，包括胰岛素的脱酰氨形式，并且以胰岛素相关杂质的形式进行报道。

使用激光衍射装置，以湿模式操作Mastersizer(Malvern Instruments，United Kingdom)，测定喷雾干燥粉末的体积粒径分布。该装置安装有湿式分散系统(Malvern QS Small Volume Sample Dispersion Unit)，其中微粒悬浮在含有大约0.05％Tween 80的异丙醇中。然后测定样品，并且基于分散数据，使用Malvern软件计算粒径分布。体积中间粒径D[v，0.5]是在分布状态为50％超过和50％低于该值的情况下的直径。

使用model 3321 Aerodynamic Particle

(APS)光谱仪(结合TSI)(其是基于粒子筛选仪器的激光，基于颗粒在流速加速型喷管下游的即时速率来测定单个颗粒的空气动力学直径)，测定喷雾干粉的空气动力学粒径分布。用小型粉末分散器model 3433(结合TSI)将粉末雾化。由这些测定，以接近实时的方式测定粒径分布。质量中位数气动粒径(MMAD)是在分布状态为50％超过和50％低于此值的情况下的空气动力学直径。

使用PerkinElmer Pyris TGA1热重分析仪，通过在110℃干燥(最少3小时)后的失重，测定喷雾干粉的残留含水量。记录由水分损失所引起的重量改变，用重量百分数表示。

实施例

实施例1

溶解人胰岛素(在pH 9.5条件下)

将10.0g人胰岛素分散在387.3g冰冷水中。将分散体放置在冰浴上，测定的pH值是pH 5.03。然后逐步加入冰冷的0.2N氢氧化钠，直到pH 8.99为止。45分钟之后，pH值降低至8.77，在接下来4小时中，加入0.2N氢氧化钠，直到pH 8.75为止。溶液还不清澈，将其放置在冰箱中过夜。

第二天，测定pH值是8.75，溶液还不清澈。用冰冷的0.2N氢氧化钠将pH值调节至9.48，然后将不清澈的溶液放入冰箱中5天。

5天之后，溶液变清澈，用0.2N氯化氢将pH值从9.37调节到7.59。

实施例2

A)喷雾干燥含有挥发性碱的蛋白溶液，和

B)测定喷雾干燥蛋白的pH值

将9.5g人胰岛素分散在200g冰冷水中。将悬浮液放置在冰浴上，测定的初始pH值是pH 5.12。用5.8g冰冷的0.2N氢氧化钠将pH值调节至7.04。将溶液保持在冰浴上另外2小时，而后加入软化水，至240g的总重量。

将50g pH 7.04的溶液进一步处理。用冰冷1N NH₄OH将pH值从7.04调节至7.50，然后放入冰箱中过夜。第二天，测定pH值是7.32，并用冰冷的1N NH₄OH将pH值调节至pH 8.06。然后加入水，至多60.0g。人胰岛素的最后浓度是大约30mg/ml。

在配备0.7mm并流两流体喷嘴的Büchi B-290小型喷雾干燥器(Büchi，Labortechnik AG Flawil，Switzerland)上制备干燥固体微粒。将人胰岛素溶液喷雾到在干燥室中的热空气流中，液体进料速度2ml/min，雾化气流600-800升/小时。

干燥空气具有150℃的入口温度，和35m³/小时的干燥空气流速。出口温度大约70℃。

用连接干燥室的旋流分离器收集固体微粒，而后集聚，并在干燥条件下保存。

将喷雾干燥的人胰岛素(在喷雾干燥之前，蛋白溶液pH值是8.06)重新溶于软化水中，浓度为40mg/mL、80mg/mL和160mg/mL，研究是否不同的浓度对测定的pH值有影响：

25.3mg加入633μL水：测定的pH值是6.95

43.5mg加入545μL水：测定的pH值是6.95

81.7mg加入510μL水：测定的pH值是7.01

实施例3

喷雾干燥用各种比例的挥发性和非挥发性碱溶解的胰岛素阿速帕(aspart)(B28^Asp人胰岛素)。

在喷雾干燥之前，在有和没有稳定赋形剂的条件下，制备各种胰岛素阿速帕(aspart)溶液：

制备A

溶液A1：在冰浴上，将16g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在150ml水中。然后，逐步加入2.6ml冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.53并且得到澄清溶液为止。最后，加入水，至200ml的总体积。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是80mg/ml。

溶液A2：将65ml溶液A1进一步稀释至130ml。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是40mg/ml。

制备B

溶液B1：在冰浴上，将16g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在150ml水中。开始，逐步加入2.2ml冰冷的1N NaOH，而后加入750μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.52并且得到澄清溶液为止。最后，加入水，至200ml的总体积。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是80mg/ml。

溶液B2：将65ml溶液B1进一步稀释至130ml。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是40mg/ml。

制备C

溶液C1：在冰浴上，将16g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在150ml水中。开始，加入4.4ml冰冷的1N NaOH，而后逐步加入750μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.48并且得到澄清溶液为止。最后，加入水，至200ml的总体积。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是80mg/ml。

溶液C2：将65ml溶液C1进一步稀释至130ml。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是40mg/ml。

制备D

溶液D1：在冰浴上，将16g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在150ml水中。开始，加入6.6ml冰冷的1N NaOH，而后逐步加入370μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.47并且得到澄清溶液为止。最后，加入水，至200ml的总体积。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是80mg/ml。

溶液D2：将65ml溶液D1进一步稀释至130ml。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是40mg/ml。

制备E

溶液E1：在冰浴上，将16g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在150ml水中。开始，加入6.6ml冰冷的1N NaOH，而后逐步加入370μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.47并且得到澄清溶液为止。最后，加入水，至200ml的总体积。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是80mg/ml。

溶液E2：将65ml溶液E1进一步稀释至130ml。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是40mg/ml。

制备F

在冰浴上，将1.8g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在40ml水中。开始，逐步加入175μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.83为止。

将1.1ml 0.1M ZnCl₂溶液和3.6ml 0.32M酚溶液进一步加入到溶液中。

最后，用85μl稀氨水(8％w/w)将pH值调节至7.99，加入水，至60ml的总体积。溶液是清澈的，胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是30mg/ml。

制备G

在冰浴上，将1.8g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在40ml水中。开始，加入288μl冰冷的1N NaOH，而后逐步加入120μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.86为止。

最后，用80μl稀氨水(8％w/w)将pH值调节至8.03，加入水，至60ml的总体积。溶液是清澈的，胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是30mg/ml。

制备H

在冰浴上，将1.8g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在40ml水中。开始，加入864μl冰冷的1N NaOH，而后逐步加入50μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.85为止。

最后，用60μl稀氨水(8％w/w)将pH值调节至7.98，加入水，至60ml的总体积。溶液是清澈的，胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是30mg/ml。

制备I

在冰浴上，将1.8g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在40ml水中。开始，逐步加入150μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.99为止。

将4.6ml 0.25M双甘氨肽溶液、1.1ml 0.1M ZnCl₂溶液和3.6ml0.32M酚溶液进一步加入到溶液中。

最后，用245μl稀氨水(8％w/w)将pH值调节至7.98，加入水，至60ml的总体积。溶液是清澈的，胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是30mg/ml。

制备J

在冰浴上，将1.8g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在40ml水中。开始，加入288μl冰冷的1N NaOH，而后逐步加入125μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是8.18为止。

将4.6ml 0.25M双甘氨肽溶液、11ml 0.1M ZnCl₂溶液和3.6ml0.32M酚溶液进一步加入到溶液中。

最后，用125μl稀氨水(8％w/w)将pH值调节至7.98，加入水，至60ml的总体积。溶液是清澈的，胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是30mg/ml。

制备K

在冰浴上，将1.8g胰岛素阿速帕(aspart)悬浮在40ml水中。开始，加入288μl冰冷的1N NaOH，而后逐步加入125μl冰冷的浓氨水(25％w/w)，直到pH值是7.93为止。

将1.1ml 0.1M ZnCl₂溶液和1.9ml 0.32M酚溶液进一步加入到溶液中。

最后，用40μl稀氨水(8％w/w)将pH值调节至7.98，加入水，至60ml的总体积。溶液是清澈的，胰岛素阿速帕(aspart)的浓度是30mg/ml。

在配备0.7mm并流两流体喷嘴的Büchi B-290小型喷雾干燥器(Büchi，Labortechnik AG Flawil，Switzerland)上制备干燥固体微粒。将液体原料(制备A1，A2，B1，B2，C1，C2，D1，D2，E1，E2，F，G，H，I，J和K)喷雾到在干燥室中的热空气流中，液体进料速度2ml/min，雾化气流600-800升/小时。

干燥空气具有150℃的入口温度，和35m³/小时的干燥空气流速。出口温度在41和61℃之间变化。

按照Hvass，2003，(A.Hvass，M.Hach，和M.U.Jars.Complementaryanalytical HPLC methods for insulin-related degradation products.American Biotechnology Laboratory 21(2)：8-12，2003)中描述的方法，在40℃储存1个月之后，用HPLC分析来研究胰岛素化学不稳定性。利用排阻(SE)色谱分析共价结合的二聚物和高分子聚合物(HMWP)。使用反相(RP)色谱(pH3.6)(梯度洗脱)分离降解产物(胰岛素的脱酰氨形式及其它胰岛素相关杂质)。

使用PerkinElmer Pyris TGA1热重分析仪，通过在110℃干燥(最少3小时)后的失重，测定干燥微粒的水分含量。记录由水分损失所引起的重量改变，用重量百分数表示。

Aerodynamic Particle

光谱仪(APS)用于测定粒径分布(质量中位数气动粒径)。

如下测定喷雾干燥胰岛素的pH值：将喷雾干粉溶解在软化水中，浓度大约为40mg/ml，用电位计(Radiometer，Denmark)测定pH值。

由喷雾干燥制品A-K的特征产生的结果列于表1中。

表1.喷雾干燥的胰岛素阿速帕(aspart)粉末

制备水分溶液pH 喷雾干燥 MMAD^A) 胰岛素阿速帕HMWP^C)(％)

ID (％) 胰岛素的 (μm) (aspart)

pH值相关杂质^B)

(％)

A1 5.6 7.5 5.35 2.7 1.1 0.43

A2 6.6 7.5 6.03 3.3 1.4 0.45

B1 6.3 7.5 6.04 3.0 1.1 2.17

B2 7.0 7.5 6.17 4.8 1.3 0.75

C1 6.7 7.5 6.27 3.3 0.8 0.63

C2 7.1 7.5 6.44 4.0 1.4 0.67

D1 5.9 7.5 6.66 3.3 0.3 0.26

D2 5.8 7.5 6.89 3.9 1.0 2.87

E1 6.6 7.5 7.43 3.2 0.4 0.22

E2 5.2 7.5 7.43 3.9 0.7 0.31

F 6.9 8.0 4.91 2.6 2.0 0.35

G 9.3 8.0 5.16 2.6 1.9 0.51

H 9.6 8.0 6.33 2.8 1.4 0.35

I 7.2 8.0 5.04 2.7 2.3 0.30

J 8.2 8.0 5.79 2.8 1.9 0.24

K 8.9 8.0 5.37 2.7 1.8 0.47

A)MMAD是用APS测定的质量中位数气动粒径

B)在40℃储存1个月之后形成的胰岛素阿速帕(aspart)相关杂质，用RP-HPLC测定(包括胰岛素阿速帕(aspart)的脱酰氨及其它降解形式)

C)在40℃储存1个月之后形成的高分子聚合物，用SE-HPLC测定

实施例4

胰岛素阿速帕(aspart)的喷雾干燥

将361.8g胰岛素阿速帕(aspart)分散在4.5升冰冷的软化水中。用冰冷的0.2 NaOH将pH值调节至7.68。然后加入水，至多达9升。胰岛素阿速帕(aspart)的最后浓度是37g/l。通过无菌滤过器(0.2μm)过滤溶液，而后喷雾干燥。

在试验规模喷雾干燥器(model Mobile Minor，Niro，Denmark)(带有1.0 mm孔径的两流体喷嘴)上进行胰岛素阿速帕(aspart)溶液的喷雾干燥。使用氮气作为干燥气体和作为雾化气体。

入口和出口温度分别是110和62℃。原料流速大约是1kg/h，气体/原料比大约是11。

喷雾干燥器安装有旋流分离器和袋式过滤器。在喷雾干燥期间，同时从旋流分离器和袋式过滤器收集粉末。

用激光衍射(Mastersizer，Malvern)和气动粒子筛选光谱(APS)分析粒径分布。在40℃储存1个月之后，用实施例2中描述的SE或RP-HPLC研究喷雾干燥的胰岛素阿速帕(aspart)的化学完整性。

A)D50是用激光衍射测定的体积中间粒径

B)MMAD是用APS测定的质量中位数气动粒径

实施例5

具有各种pH值的冷冻干燥胰岛素阿速帕(aspart)干粉的储存稳定性

将0.806g胰岛素阿速帕(aspart)分散在10ml冰冷的水中。将悬浮液放置在冰浴上，测定的初始pH值是pH 4.58。用冰冷的0.2N氢氧化钠将pH值调节至7.39，因此将胰岛素阿速帕(aspart)溶解。加入软化水，至20.4g的总重量。

将溶解的胰岛素阿速帕(aspart)分成6个2.5ml等分样品，将它们分别调节至pH 7.0、7.7、8.0、8.5、9.0和9.5。加入软化水，至3.06g的总重量。

用0.9ml的等分样品(在小玻璃管中)，使用标准冷冻干燥程序，将胰岛素阿速帕(aspart)溶液在Christ Alpha 2-4LSC(Christ Alpha，Germany)装置中冷冻干燥。

如下测定冷冻干燥胰岛素阿速帕(aspart)粉末的pH值：将0.5ml软化水加入到大约33mg胰岛素阿速帕(aspart)粉末中，而后(15分钟之后)用配备pH电极的电位计测定pH值。

在40℃干燥(在硅胶上)储存2周之后(相对于在-18℃的对照物)，用实施例2中描述的SE-HPLC研究喷雾干燥胰岛素阿速帕(aspart)的化学完整性。

表3.冷冻干燥的胰岛素阿速帕(aspart)粉末

溶液pH值冷冻干燥胰岛素的pH值 HMWP^A)(％)

7.0 6.69 0.20

7.7 7.58 0.17

8.0 7.83 0.11

8.5 8.42 0.07

9.0 8.81 0.10

9.5 9.27 0.10

A)在40℃储存2周之后形成的高分子量二聚物和聚合物，用SE-HPLC测定

实施例6

具有各种pH值的喷雾干燥胰岛素阿速帕(aspart)干粉的储存稳定性

将20.6g胰岛素阿速帕(aspart)分散在300ml冰冷的水中。将悬浮液放置在冰浴上，测定的初始pH值是pH 4.63。用100ml冰冷的0.1N氢氧化钠将pH值调节至7.50，因此将胰岛素阿速帕(aspart)溶解。

将溶解的胰岛素阿速帕(aspart)分成6个65g等分样品，将它们用冰冷的0.1N NaOH分别调节至pH 7.0、7.7、8.0、8.5、9.0和9.5。将软化水加入到每个等分样品中，至80.0g的总重量。胰岛素阿速帕(aspart)的浓度大约是38mg/ml。

在配备0.7mm并流两流体喷嘴的Büchi B-290小型喷雾干燥器(Büchi，Labortechnik AG Flawil，Switzerland)上制备干燥固体微粒。将液体原料(80ml)喷雾到在干燥室中的热空气流中，液体原料速率是2ml/min，雾化气流是600-800升/小时。

干燥空气具有150℃的入口温度，干燥空气流速是35m³/小时。出口温度在49和61℃之间变化。用连接干燥室的旋流分离器收集固体微粒，而后集聚并保存在干燥条件下。

如下测定喷雾干燥胰岛素阿速帕(aspart)的pH值：将喷雾干粉溶解在软化水中，至70-80mg/ml的浓度，用电位计(Radiometer，Denmark)测定pH值。

在40℃干燥(在硅胶上)储存4周之后，用实施例2中描述的SE-HPLC和RP-HPLC研究喷雾干燥胰岛素阿速帕(aspart)的化学完整性(相对于在-18℃的对照物)。

表3.喷雾干燥的胰岛素阿速帕(aspart)粉末的稳定性

溶液pH值喷雾干燥的胰岛素阿速 HMWP^A)(％) 纯度^B)(％)

帕(aspart)的pH值

7.5 7.28 0.28 98.2

7.7 7.54 0.26 98.3

8.0 7.82 0.22 98.3

8.5 8.26 0.19 98.4

9.0 8.58 0.23 98.2

9.5 9.00 1.34 95.0

A)在40℃储存4周之后形成的高分子量二聚物和聚合物，用SE-HPLC测定

B)在40℃储存4周之后喷雾干燥胰岛素阿速帕(aspart)的纯度，用RP-HPLC测定

实施例7

将20000nmol赖氨酸-酰化的GLP1类似物N-epsilon 26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4羧基4-(17羧基十七酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰氨基]-乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)溶于水中，达到4000nmol/mL(分子量4113g/mol)。用氢氧化钠将2mL溶液调节至pH 7.6，并进一步分成2部分，其中一部分中加入氨(25％，在水中)，至pH 9.6。类似地，用氢氧化钠将2mL溶液调节至pH 8.7，分成2部分，其中一部分中加入氨(25％，在水中)，至pH 10.3。最后，向1mL GLP1类似物溶液中加入氢氧化钠，至pH 10.3。将5个样品全部冷冻干燥，并再溶解至40mg/mL。测定样品的pH值分别是7.5、7.5、8.6、8.6和9.7。

实施例8

含有挥发碱的GLP-1类似物的喷雾干燥

将180mg(43800nmol)赖氨酸-酰化的GLP1类似物N-epsilon26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基4-(17-羧基十七酰氨基)丁酰基氨基]乙氧基}-乙氧基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)溶于7ml软化水中，用0.2N盐酸将pH值从7.53调节至7.03。然后用0.25％w/w氨水将溶液调节至pH 9.96，加入软化水，得到20mg/ml的GLP-1类似物的最后浓度。

将溶液喷雾到在配备0.7mm并流两流体喷嘴的Büchi B-290小型喷雾干燥器(Büchi，Labortechnik AG Flawil，Switzerland)的干燥室中的热空气流中，液体进料速度2ml/min，雾化空气流是600-800升/小时。干燥空气具有150℃的入口温度，干燥空气流速是35m³/小时。出口温度是大约63℃。用连接干燥室的旋流分离器收集固体微粒。

将粉末再溶解在软化水中，至120mg/ml，测定的pH值是pH 6.9。

实施例9

在强碱性pH值下的胰岛素阿速帕(aspart)的化学不稳定性

将720mg胰岛素阿速帕(aspart)溶解在9ml软化水中。用2N氢氧化铵溶液将2.25ml溶液的pH值从7.6调节至10.0。用2N氢氧化铵溶液将另一个2.25ml溶液的pH值调节至11.0。用2N氢氧化铵溶液和1N氢氧化钠溶液将又一个2.25ml溶液调节至pH 12.0。用2N氢氧化铵溶液和1N氢氧化钠溶液将最后2.25ml溶液调节至pH 12.6。

将四个调整过pH值的溶液在3-8℃的冰箱中保持24小时，而后用1N盐酸将四个溶液调节至中性pH值，以便猝灭化学降解。

利用实施例2中描述的排阻和反相HPLC分析来研究在被中和的溶液中的胰岛素化学不稳定性。

表4.在各种pH值下的胰岛素阿速帕(aspart)溶液的化学稳定性

溶液pH值 HMWP^A)(％) 纯度^B)(％)

7.6 0.0 97.2

10.0 0.5 97.8

11.0 1.8 92.2

12.0 49.8 7.8

12.6 39.5 2.3

A)在3-8℃储存24小时之后形成的高分子量二聚物和聚合物，用SE-HPLC测定

B)在3-8℃储存24小时之后胰岛素阿速帕(aspart)的纯度，用RP-HPLC测定

Claims

1.干燥蛋白溶液的方法，包括：

a)选择干燥蛋白的目标pH值，

b)选择蛋白溶液的目标pH值，所述目标pH值在7.4和11.0之间，

c)提供水相，

d)加入蛋白，

e)任选加入赋形剂，

h)将蛋白溶液喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、流化床干燥、真空干燥或冷冻干燥，

其中步骤a)-g)之后的所述蛋白溶液的pH值是碱性的，步骤d、e、f和g可以以任何顺序进行，同时连续搅拌，所述挥发的碱将蛋白溶液的pH值调节至少0.5个pH单位，并且其中蛋白选自：胰岛素；GLP-1；胰高血糖素；或胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物是B链的28位从天然Pro残基改变为Asp、Lys或Ile之一的胰岛素，和/或胰岛素的B29位的Lys改变为Pro或Glu；胰岛素类似物，其中所述胰岛素的A21位从天然Asn改变为Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val；胰岛素类似物，其中所述胰岛素的A21位从天然Asn改变为Gly，和B3位从Asn改变为Lys、Thr、Ser、Gln、Glu或Asp；胰岛素类似物，其中所述胰岛素的B3位从Asn改变为Lys、Thr、Ser、Gln、Glu或Asp；GLP-1片段，选自GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)-酰胺；和/或其任意组合。

2.按照权利要求1的干燥蛋白溶液的方法，其中在所述步骤a)中所述选择的干燥蛋白的目标pH值在6.0和8.5之间。

3.按照权利要求1的方法，其中蛋白溶液是在低于8℃的温度下获得的。

4.按照权利要求1-2的任一项的方法，其中蛋白溶液包含缓冲剂，清洗剂，稳定剂，蛋白酶抑制剂，调味剂，载体，填充剂或改善流动特性的试剂或渗透增强剂或其组合。

5.按照权利要求1-2的任一项的方法，其中蛋白溶液包含双甘氨肽和/或酚。

6.按照权利要求1-2的任一项的方法，其中蛋白溶液包含每摩尔蛋白4摩尔的酚。

7.按照权利要求1-2的任一项的方法，其中蛋白溶液的pH值高于干燥蛋白的pH值。