JP4931282B2 - 生理活性ペプチド含有粉末 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性ペプチド含有粉末特に、吸入により投与するのに適した生理活性ペプチド含有粉末に関する。本発明は更に、生理活性ペプチド含有の水性液体を乾燥させて粉末化する工程において生理活性ペプチドの変性を防止して安定化するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、成長ホルモン、インスリン等の生理活性ペプチド含有の医薬品は、注射により投与されてきた。その関係上、それらの製剤の製造には凍結乾燥が専ら用いられてきた。このため、それらの製剤において、主薬である生理活性ペプチドの安定化についての研究は、完成品である製剤の乾燥状態での生理活性ペプチドの長期保存安定性、及び乾燥したペプチド含有組成物を溶解した後の液体中での生理活性ペプチドの保存安定性に、これまで集中してきた。例えば、カルシトニン溶液の安定化については、特開平7-179364号公報、特開平7-188060号公報、特表平7-188061号公報等に、また、成長ホルモン凍結乾燥品の安定化については、特表平10-504531号公報、特表平10-511965号公報、特表平10-507183号公報等に開示されている。
【０００３】
生理活性ペプチドの投与方法が注射に限られてきたのは、経口投与では消化管内で消化されてしまうためであり、実用可能な新たな投与経路が開発できれば、患者にとって非常に有益である。取り分け、成長ホルモンやインスリン等のように、ほぼ生涯にわたって投与を続ける必要のある活性ペプチドの場合、従来の注射による投与は患者に不便と苦痛を強いている。従って、これらの生理活性ペプチドに関して、注射以外の投与経路の開発は患者に切望されている。
【０００４】
吸入用の製剤は、体内に直接注入するためのものでなく、外気に常に接している気道内に吸入される関係上、注射剤に比して微生物学的品質基準は緩やかである。このため、その製造には、凍結乾燥装置を用い得ることは勿論、それ以外に流動層造粒装置、噴霧乾燥装置、噴霧凍結乾燥装置等の製造装置も用い得る。これら流動層造粒装置、噴霧乾燥装置、噴霧凍結乾燥装置を用いた製剤の製造段階における生理活性ペプチドの安定化に関しては、メイラード反応に対する阻害剤を添加することで安定性を確保することが報告されている（特表平10-505591号公報）。しかし、製造段階における生理活性ペプチドの安定化は、もし可能であるなら、医薬品添加物として現在許可されており、安全性が高く、長年の使用実績のある添加物を用いて行う方が、得られる医薬品につき高い安全性が期待できるという点で、好ましい。また、生理活性ペプチド含有吸入用製剤に配合される主薬以外の成分は、刺激性のないことが必要であると共に、吸入による投与（以下、「経肺投与」という。）によって、生理活性ペプチドの吸収（以下、「経肺吸収」という。）が十分な効率で達成できるものでなければならない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記背景の下で、本発明は、吸入により投与するのに特に適した生理活性ペプチド含有粉末を提供することを目的とする。
また本発明は、製造工程における生理活性ペプチドの安定性を改善した、生理活性ペプチド含有粉末の製造方法を提供することも目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、生理活性ペプチド含有粉末を得るに当たって、生理活性ペプチド水溶液からこれを乾燥させて粉末する際における生理活性ペプチドの安定化を達成すると同時に、粉末粒子から生理活性ペプチドを高い効率で経肺吸収させる物質を求めて検討した。その結果、本発明者等は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン含有の粉末を製造するに当たり生理活性ペプチド水溶液に乳糖を配合することにより、乾燥させ粉末化する工程において生理活性ペプチドの安定性が著しく高められることを見出した。また、乳糖を配合したヒト成長ホルモン含有の粉末を動物に経肺投与したとき、ヒト成長ホルモンの血中移行性が、同じ製剤を皮下注射したときよりも顕著に優れていることを見出した。本発明は、これらの発見に基づいてなされたものである。
【０００７】
すなわち本発明は、重量比１：１〜１：５０で生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子よりなることを特徴とする、生理活性ペプチド含有粉末を提供する。該生理活性ペプチド含有組成物の製法は限定されない。該組成物中において、該生理活性ペプチドに対し上記に規定された範囲で含有される乳糖は、該生理活性ペプチドの安定性を高める働きをする。また、生理活性ペプチドと乳糖との重量比は、投与時の粉末の取扱いに不便でない限り両者合わせての投与重量を少なくする方が良いという観点から、より好ましくは１：１〜１：４０、更に好ましくは１：１〜３０、特に好ましくは１：１〜２０である。
【０００８】
更に、該粒子の平均粒子経が１〜10μｍ、更に好ましくは２〜５μｍであるとき、吸入された粒子は気流に乗って呼吸器の深部まで到達しやすい。そのような粒子経としたとき、上記生理活性ペプチド含有粉末は、これを経肺投与することにより粒子が肺内に到達しやすく、その結果該生理活性ペプチドを優れた効率でかつ比較的持続的に持続的に循環血中へ移行させることができる。すなわち本発明は更に、重量比１：１〜１：５０で生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子よりなり且つ該粒子の平均粒子経が１〜10μｍ、更に好ましくは２〜５μｍであることを特徴とする生理活性ペプチド含有粉末をも提供する。
【０００９】
上記生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子よりなる活性ペプチド含有粉末は、種々の方法で製造したものであってよいが、例えば、生理活性ペプチドと乳糖とを相互の重量比１：１〜１：５０で水に溶解させ、得られた該生理活性ペプチドと乳糖とを含有する水溶液を乾燥させることにより得られる粒子よりなるものであってよい。製造に際して、更に好ましくは、平均粒子経が１〜10μｍ更に好ましくは２〜５μｍとなるように、乾燥条件が調節される。
【００１０】
上記粉末の製造において、生理活性ペプチド及び乳糖と含有する水溶液の乾燥方法は適宜選択してよく、例えば、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥又は凍結乾燥により行うことができる。噴霧乾燥には、流動層コーティングや流動層造粒において行われる噴霧による乾燥もこれに包含される。
【００１１】
上記粉末中の該生理活性ペプチドとしては、成長ホルモン類、インスリン類、カルシトニン類、エリスロポエチン、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、インターフェロン、インターロイキン、スーパオキシドジスムターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー形成刺激因子、カリクレイン、リゾチーム、フィブロネクチン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管新生因子及び血管新生阻害因子よりなる群より選ぶことができる。このうち例えば、ヒト成長ホルモン及びインスリンは、これまでは、患者が長期間、皮下注射により自家投与を続けるほかなかった関係上、本願において特に好ましい生理活性ペプチドである。
【００１２】
本発明は更に、上記生理活性ペプチド含有の粒子を含んでなることを特徴とする、生理活性ペプチド含有吸入用製剤をも提供する。該吸入用製剤は、上記生理活性ペプチド含有の粒子そのままであってもよいが、該粒子が相互に緩く凝集したもの又は該粒子を、より粗大な不活性の担体粒子（例えば乳糖）表面に緩く付着させたものであってもよい。それらの緩い凝集体粒子又は緩い複合粗大粒子は、製剤の吸引時に吸入装置から放出されるに際して空気流により崩壊して生理活性ペプチド含有の各粒子が凝集体又は担体から遊離し単独粒子となるような緩さのものであればよい。そのような緩い凝集体粒子又は緩い複合粗大粒子の製造は、粉末を構成する１〜数μｍオーダーの粒子を緩く凝集させ又はより粗大な不活性の担体粒子表面に緩く付着させる当業者に周知の種々の技術を適宜用いて行うことができる。それらの緩い凝集体粒子又は緩い複合粗大粒子は、吸入装置で用いる所定のカプセル等に吸入用製剤を一回投与量毎に充填する際に、製剤の流動性を高めて、充填を容易にし充填量の正確さを高めることを目的とするものである。従って、カプセル等に充填後は、外部からの衝撃等によりカプセル等の中で一部又は全部の粒子が遊離して単独粒子となって粉末を形成していてもよい。
【００１３】
本発明は更に、生理活性ペプチドをその水溶液から乾燥させて該生理活性ペプチドを含んでなる粒子よりなる粉末を製造する方法であって、該生理活性ペプチド及び乳糖を水に溶解させることによって該生理活性ペプチド及び乳糖を含有した該水溶液を調製し、該水溶液を乾燥させて粉末とすることを特徴とする方法をも提供する。乳糖を水溶液中で生理活性ペプチドと共存させることにより、生理活性ペプチドの粉末化に際し安定化を顕著に改善することができる。
【００１４】
ここにおいて、該生理活性ペプチドと乳糖とは、広い範囲の重量比で用いて高い安定化を達成できるが、製造工程における取扱い易さ、製造コスト、及び得られる粉末粒径を考慮すると、該水溶液中における該生理活性ペプチドと乳糖の重量比が１：１〜１：５０であることが好ましく、１：１〜１：４０であることがより好ましく、１：１〜３０であることが更に好ましく、１：１〜２０であることが特に好ましい。製造に際して、更に好ましくは、平均粒子経が１〜10μｍ、より好ましくは２〜５μｍとなるように、乾燥条件が調節される。
【００１５】
上記方法において、生理活性ペプチド及び乳糖を含有する水溶液の乾燥方法は適宜選択してよく、例えば、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥又は凍結乾燥により行ってよい。噴霧乾燥には、流動層コーティングや流動層造粒において行われる噴霧による乾燥もこれに包含される。
【００１６】
上記方法において、該生理活性ペプチドとしては、成長ホルモン類、インスリン類、カルシトニン類、エリスロポエチン、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、インターフェロン、インターロイキン、スーパオキシドジスムターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー形成刺激因子、カリクレイン、リゾチーム、フィブロネクチン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管新生因子及び血管新生阻害因子よりなる群より選ぶことができる。このうち例えば、ヒト成長ホルモン及びヒトインスリンは、特に好ましい例である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子が高い経肺吸収をもたらすという発見に基づいており、従って、生理活性ペプチド含有粉末を製造するに当たり、適宜の製法を選択してよい。本発明はまた、活性ペプチド含有水溶液から活性ペプチドを粉末化する際において、活性ペプチドを顕著に安定化する作用を乳糖が有するという発見に基づいており、従って、生理活性物質及び乳糖を含有する水溶液の乾燥は、通常用いられる適宜の方法を採用して行ってよい。
【００１８】
本発明において、安定化の対象となる生理活性ペプチドの例としては、成長ホルモン類、インスリン類、カルシトニン類、エリスロポエチン、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、インターフェロン（α型、β型、又はγ型）、インターロイキン（Ｉ、II、III、IV、Ｖ、VI、又はVII）スーパオキシドジスムターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー形成刺激因子、カリクレイン、リゾチーム及びフィブロネクチン、並びに、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管新生因子及び血管新生阻害因子等、各種の細胞増殖・分化を調節する因子等が挙げられる。生理活性ペプチドは、化学的には複数のアミノ酸がペプチド結合によって連結したという共通の構造を有しており、従って、本発明は、上記以外にも広範な種々の生理活性ペプチドに適用可能である。また、それらのペプチドが天然物から抽出されたものか遺伝子組換えにより製造されたものかは、ペプチドの基本的物性に影響を及ぼさないから、何れの方法により得られたものかは問わない。
【００１９】
また、本発明において特に好ましく用いられる生理活性ペプチドの一例として、ヒト成長ホルモンがある。本発明において、「ヒト成長ホルモン」の語は、ヒト下垂体より抽出できる191個のアミノ酸からなる分子量22,125の22Ｋ ｈＧＨののみならず、23〜46番目の15アミノ酸の欠失した20Ｋ ｈＧＨをも包含する。20Ｋ ｈＧＨは22Ｋ ｈＧＨと同等の成長促進作用を示す。また、本発明において、「ヒト成長ホルモン」の語は、これら天然型ヒト成長ホルモンのみならず、天然ヒト成長ホルモンと実質的に同等の作用を有する遺伝子組換えにより得られたタンパク質をも含む。遺伝子組換えによるヒト成長ホルモンとしては、192個のアミノ酸よりなるＮ末端メチオニン型のものが例示されるほか、一部のアミノ酸が欠失、置換、負荷又は挿入されているが天然型のヒト成長ホルモンと実質的に同等の活性を有する変異体もこれに包含される。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されることは意図しない。特に、下記実施例では、ヒト成長ホルモンとして組換えヒト成長ホルモンを使用しているが、物性において組換えヒト成長ホルモンと天然のヒト成長ホルモンとの間に差はないから、実施例において得られた結果は、天然、組換えを問わず、あらゆるタイプのヒト成長ホルモンに適合する。
【００２１】
＜ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−１＞
成長ホルモン（ＧＨ）分子は、水溶液中での激しい撹拌時に気液界面に接触して立体構造変化を起こし、単量体の減少及び２量体、多量体又は不溶性凝集体の形成を起こす性質が強い。ＧＨの粉末化の工程において、噴霧乾燥などの乾燥段階では気液界面の増大によるＧＨの変性をできるだけ抑制する必要がある。この目的で、ｒ−ｈＧＨ溶液に添加しておくことで粉末化に際してＧＨを安定化する化合物を求めて種々検討した結果、並びに経肺投与における安全性についての考察及び可能な限り成分数の少ない処方とすることが望ましいとの視点に基づいて、下記の添加剤を最終的に候補として選択した。ＧＨの噴霧乾燥におけるそれらの安定化効果についての試験及び結果を記す。
【００２２】
（材料）
ＧＨとしては、組換えヒト成長ホルモン（ｒ−ｈＧＨ）原体（BTG社製：末端Ｎメチオニンを選択的に酵素切断除去してなり、アミノ酸191個の天然ヒト成長ホルモンと同一アミノ酸配列を有する。）を、安定化のための添加剤としては、乳糖（１水和物）及びマンニトールを用いた。
【００２３】
（ｒ−ｈＧＨ溶液調製）
下記の各処方に従い、ｒ−ｈＧＨ及び添加剤（対照では含まず）を秤取し、15.0ｍｌの精製水に溶解させて噴霧溶液とした。
【００２４】
処方Ｎｏ．２３６：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・・29.25ｍｇ （6.5重量％）
Ｄ−マンニトール・・・・・ 420.75 ｍｇ （ 93.5 重量％）
計 450.00ｍｇ
【００２５】
処方Ｎｏ．２３７：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・・29.25ｍｇ （6.5重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 420.75 ｍｇ （ 93.5 重量％）
計 450.00ｍｇ
【００２６】
対照処方：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・・ 29.25 ｍｇ
計 29.25ｍｇ
【００２７】
（噴霧乾燥）
噴霧乾燥装置としてEYELA SD-1000 Spray Dryerを用い、上記の各ｒ−ｈＧＨ溶液を噴霧乾燥して、乾燥粉末を得た。噴霧乾燥条件は次の通りとした。
入口温度： 90℃
乾燥空気量： 0.2ｍ3／分
噴霧圧： 100ｋＰａ
送液ポンプ流量： 2.6ｍｌ／分
【００２８】
（ＨＰＬＣ／単量体含量測定）
ｒ−ｈＧＨ単量体の測定のためのＨＰＬＣ条件は次の通りとした。
ＨＰＬＣ装置： LC10A（島津製作所）
サンプル量： 約0.02ｇ／精製水0.5ｍｌ
検出器： ＵＶ（280ｎｍ）
分析カラム： TSK G3000SWXL （TOSOH）
カラム温度： 室温
移動相： 0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.1Ｍリン酸水素ナトリウム、0.2Ｍ塩化ナトリウム
流速： 0.6ｍｌ／分
注入量： 50μｌ
【００２９】
（ＨＰＬＣ／脱アミド体含量測定）
ｒ−ｈＧＨの脱アミド体の測定のためのＨＰＬＣ条件は次の通りとした。
ＨＰＬＣ装置： LC10A（島津製作所）
サンプル量： 約0.02ｇ／精製水0.5ｍｌ
検出器： ＵＶ（280ｎｍ）
分析カラム： Protein C4カラム（VYDAC, Cat.No. 214ATP54）
カラム温度： 45℃
移動相： 50ｍＭトリス塩酸（ｐＨ7.5）／ｎ−プロパノール（71:29）緩衝液
流速： 0.5ｍｌ／分
注入量： 50μｌ
【００３０】
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
１） サンプルの調製：
サンプルとして約0.04ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、その10μｌに水10μｌ及びサンプル緩衝液20μｌを加えた。標準サンプルとしては、ｒ−ｈＧＨ原体約1.6ｍｇ／ｍｌを調製し、その10μｌに水10μｌ及びサンプル緩衝液20μｌを加えた。
２） 泳動緩衝液の調製：
（Ａ） 10×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動緩衝液は、トリス30.3ｇ、グリシン144ｇ、ＳＤＳ10ｇに水を加えて1000ｍｌとすることにより調製した（保存用）
（Ｂ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動緩衝液は、10×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動緩衝液100ｍｌに水900ｍｌを加えることにより調製した。
（Ｃ） 0.25Ｍトリス塩酸（ｐＨ6.8）緩衝液は、トリス30.25ｇに水を加えて800ｍｌとし室温にて６Ｎ塩酸でｐＨ6.8に合わせた後、水で1000ｍｌにメスアップすることにより調製した（冷凍保存）。
（Ｄ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液は、0.25Ｍトリス塩酸（ｐＨ6.8）緩衝液25ｍｌ、ＳＤＳ２ｇ、ショ糖５ｇ、ブロムチモールブルー（ＢＰＢ）２ｍｇに水を加えて50ｍｌとすることにより調製した。
３） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記サンプル及び緩衝液を用いて、20ｍＡ／ゲルで常法により電気泳動を行った。
【００３１】
（結果）
噴霧乾燥により得られたｒ−ｈＧＨ粉末中のｒ−ｈＧＨ単体含量及び脱アミド体含量の測定結果を次の表に示す。
【表１】
【００３２】
表１より明らかな通り、処方Ｎｏ．２３６及び２３７共に、対照処方に対して遙かに高いｒ−ｈＧＨ単量体残存率を示した。また、サンプル調製に用いたｒ−ｈＧＨ原体自体３．１％の脱アミド体を含有しており、処方Ｎｏ．２３６及び２３７における脱アミノ体の増加は、ごく僅かであった。また処方Ｎｏ．２３６及び２３７とを比較すると、処方Ｎｏ．２３７（すなわち、乳糖配合）の方がより優れた安定性を有していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検討でも、処方Ｎｏ．２３７（乳糖配合）の方が処方Ｎｏ．２３６よりも純度の高いことを示す泳動像を示した。
【００３３】
＜ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−２＞
上記試験結果より、乳糖がｒ−ｈＧＨ粉末化のための安定化剤として特に好ましいことが判明したことから、乳糖を用いたｒ−ｈＧＨ粉末の製造のための諸状件につき検討した。
【００３４】
（ｒ−ｈＧＨ溶液調製）
下記の各処方に従い、ｒ−ｈＧＨ及び乳糖を秤取し、10ｍｌ、20ｍｌ又は30ｍｌの精製水に溶解させて３通りの濃度の噴霧溶液を調製した。これらの溶液中のｒ−ｈＧＨ濃度及び乳糖濃度は、それぞれ、ｒ−ｈＧＨは、0.4、0.2及び0.13ｗ／ｗ％、乳糖は4.6、2.3及び1.5ｗ／ｗ％である。
（処方）
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・ 40ｍｇ（ 8重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 460 ｍｇ（ 92 重量％）
計 500ｍｇ
【００３５】
（噴霧乾燥及び分析）
これら各濃度の溶液につき、噴霧乾燥装置（EYELA SD-1000 Spray Dryer）を用い、入口温度を80℃、100℃、120℃又は140℃とした以外は前記「ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−１」の部に記載したのと同一の条件で噴霧乾燥した。得られた各粉末につき、前記と同一の方法で分析した。結果を次に示す。
表において：
・単量体残存率（％）＝（噴霧乾燥品ｒ−ｈＧＨの単量体ピーク面積／ｒ−ｈＧＨ原体の単量体ピーク面積）×100
・脱アミド体ピーク面積率（％）＝〔脱アミド体ピーク面積／（脱アミド体ピーク面積＋未変化ｒ−ｈＧＨピーク面積）〕×100。
・原体＝ｒ−ｈＧＨ原体（噴霧乾燥せず）
【００３６】
（結果）
【表２】
【００３７】
表２に見られるように、試験した水量及び入口温度で、単量体残存率及び脱アミド体ピーク面積率に大きな変化は認められなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいても、何れのサンプルも、同等の泳動像を示した。表２において、サンプルＮｏ．２４７で、単量体残存率がやや低いが、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動像が何れのサンプルも同等であったこと、他のサンプルで温度依存性が見られないこと等から総合的に判断すると、微量の吸湿性の乾燥粉末を取り扱う場合に起こりやすい測定誤差による異常値と思われる。上記結果から、少なくとも、試験した入口温度80〜140℃及びｒ−ｈＧＨ濃度0.40〜0.13ｗ／ｖ％の範囲では、許容し得る安定性をもってｒ−ｈＧＨの粉末化を行うことができることが分かる。また、このように、乳糖を添加剤として用いて粉末化するに際して明らかな温度依存性もｒ−ｈＧＨの濃度依存性も見られないことから、入口温度及び濃度は、試験した範囲外からも選択可能である。
【００３８】
＜ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−３＞
ＧＨ含有水溶液の粉末化に際してＧＨと乳糖との相互比率の変更がＧＨの安定性に及ぼす影響につき、次いで検討した。
【００３９】
（ｒ−ｈＧＨ溶液調製）
下記の各処方に従い、ｒ−ｈＧＨ及び乳糖を秤取し、15ｍｌの精製水に溶解させて噴霧溶液を調製した。
処方Ｎｏ．２７４：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・250ｍｇ（50重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 250 ｍｇ（ 50 重量％）
計 500ｍｇ
処方Ｎｏ．２７５：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・200ｍｇ（40重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 300 ｍｇ（ 60 重量％）
計 500ｍｇ
処方Ｎｏ．２７６：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・100ｍｇ（20重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 400 ｍｇ（ 80 重量％）
計 500ｍｇ
処方Ｎｏ．２７７：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・ 50ｍｇ（10重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 450 ｍｇ（ 90 重量％）
計 500ｍｇ
【００４０】
（噴霧乾燥及び分析）
これら各濃度の溶液につき、噴霧乾燥装置（EYELA SD-1000 Spray Dryer）を用い、次の条件で噴霧乾燥し、得られた粉末につき、「ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−１」の部に記載したのと同一の方法で分析した。。
入口温度： 120℃
乾燥空気量： 0.2ｍ3／分
噴霧圧： 100ｋＰａ
送液ポンプ流量： 2.6ｍｌ／分
【００４１】
（結果）
次の表に結果を示す。
【表３】
【００４２】
表３は、試験した範囲内で、ｒ−ｈＧＨと乳糖の重量比率の変更によっては、噴霧乾燥を経た後の脱アミド体のピーク面積（％）は、実質的に影響を受けないことを示している。噴霧乾燥後の単量体残存率が100％を超えているものがあるが、微量の吸湿性の乾燥粉末の取扱いに際して生じがちな測定操作上の誤差によるものと考えられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、何れの処方も、同等の、純度の高ことを示す泳動像を示した。
【００４３】
＜in vivo試験用の乳糖配合ｒ−ｈＧＨ経肺投与粉末の製造＞
下記の処方に従い、ｒ−ｈＧＨ及び乳糖を秤取し、120ｍｌの精製水に溶解させて噴霧溶液とした。噴霧溶液中のｒ−ｈＧＨ濃度及び乳糖濃度は、それぞれ、0.20ｗ／ｗ％及び2.30ｗ／ｗ％である。
（処方）
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・0.240ｇ（ 8.0重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 2.760 ｇ（ 92.0 重量％）
計 3.000ｇ
【００４４】
上記の噴霧溶液をそれぞれ次の条件で噴霧乾燥した。
入口温度： 120℃
乾燥空気量： 0.2ｍ3／分
噴霧圧： 100ｋＰａ
送液ポンプ流量： 2.6ｍｌ／分
【００４５】
上記噴霧乾燥して得られたｒ−ｈＧＨ粉末につき、ＨＰＬＣによる単量体及び脱アミド体の測定並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥを、既に記載したのと同一の方法で確認した。結果は、次の表４に示す通り、上記「ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−２」と同様であり、噴霧乾燥品で脱アミド体の比率が標準品（噴霧乾燥せず）より高いものの、その差は僅かである。またＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、純度の高いことを示す泳動像が得られた。
【００４６】
【表４】
【００４７】
上記噴霧乾燥して得られたｒ−ｈＧＨ乾燥粉末を光学顕微鏡観察し、300個の粒子をランダムに選び粒子経を測定した。その結果、粒子経は2.7±0.7μｍであった。
【００４８】
＜ＧＨ粉末のラット経肺投与による血液動態の検討＞
ＧＨの粉末をラットに経肺投与し、その後の血中ＧＨ動態を調べた。また、経肺投与したのと同量のＧＨ粉末を水溶液にしてラットに皮下注射し、その後の血中ＧＨ動態を、経肺投与で得られた結果と比較した。
【００４９】
（使用動物）
経肺投与及び経皮投与のそれぞれにつき、９週齢の雄性Wistarラット６匹を使用した。
【００５０】
（被検ＧＨ粉末）
上記「in vivo試験用の乳糖配合ｒ−ｈＧＨ経肺投与粉末の製造」の部で得られたｒ−ｈＧＨ粉末を使用した。
【００５１】
（ｒ−ｈＧＨの投与）
経肺投与群のラットを１昼夜絶食させた後、ウレタン麻酔し、ラット体重当たり２ｍｇ／ｋｇのｒ−ｈＧＨ粉末をラット用の経肺投与器具（PennCentury）に入れ、装置のデリバリーチューブを気管内に挿入し、装置に連結したシリンジより３ｍｌの空気を素早く押し出すことによりｒ−ｈＧＨ粉末を肺内に放出した。経皮投与群のラットも同様に１昼夜絶食させた後、ｒ−ｈＧＨ粉末を精製水に懸濁させ、ラット体重当たりｒ−ｈＧＨ２ｍｇ／ｋｇ相当量を皮下注射した。
【００５２】
（血中サンプルの採取及び処理）
採血は、ｒ−ｈＧＨ投与直前及び投与後0、15、30、60、120、240、480、1440分の時点に行った。採血は、ラットを固定して頸静脈より行い、各回の採血量は300μｌとした。各回の採血後、同量（300μｌ）の生理食塩水を頸静脈内投与した。採取した血液は、室温にて１時間及び４℃にて一晩放置した後遠心分離（15000ｒｐｍ、10分間、４℃）し、血清を分取した。
【００５３】
（ＧＨ−ＥＬＩＳＡによる血中ｒ−ｈＧＨ濃度の測定）
常法により作製した抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体を、0.05Ｍトリス緩衝液で希釈して、吸光度ＯＤ280＝0.02となるように調整した。これを96穴プレートに100μｌずつ注入し、37℃にて２時間インキュベートした。0.01Ｍリン酸緩衝液（洗浄緩衝液）でプレートを５回洗浄した。ブロック液（ブロックエース：大日本製薬）をプレートに満たし、４℃にて一晩放置した。上記の血清及び標準曲線用ｒ−ｈＧＨを10倍ブロックエース水溶液で適当に希釈し、洗浄したプレートに100μｌずつ注入し、37℃にて２時間プレインキュベートした。
【００５４】
抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体を用いて常法により西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体を作製し、これを10倍ブロックエース水溶液で50000倍に希釈し、洗浄したプレートに100μｌずつ注入し、37℃にて２時間プレインキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ試薬（BIORAD）のを100μｌずつプレートに注入し、室温にて10分間反応させた後、１Ｎ硫酸により反応を停止させた。450ｎｍにおける吸光度を測定した。標準溶液の吸光度より検量線を作成し、これを用いて各サンプルの吸光度から、それぞれのサンプル中のｒ−ｈＧＨ濃度を求めた。
【００５５】
（結果）
ｒ−ｈＧＨ粉末の経肺投与又はｒ−ｈＧＨ懸濁液の皮下注射後のｒ−ｈＧＨの血中濃度測定結果を次の表５及び図１に示す。
【表５】
【００５６】
上記の表４及び図１より、ｒ−ｈＧＨ血中濃度は、皮下注射に比して経肺投与において顕著に高かったことが分かる。また、ｒ−ｈＧＨの投与開始（０分）から投与1440分後までのＡＵＣ（血液動態曲線下の面積）は、経肺投与で81829ｎｇ／ｍｌ・分、皮下注射では31502ｎｇ／ｍｌ・分であった。すなわち、経肺投与でのＡＵＣは皮下投与のそれの2.6倍であった。このことは、上記粉末の経肺投与によるｒ−ｈＧＨのバイオアベイラビリティーは、等しい量のｒ−ｈＧＨの皮下投与に較べて格段に優れていることを示している。
【００５７】
天然のヒト成長ホルモンは、191個のアミノ酸よりなり、分子内に２個のＳ−Ｓ結合を有する。これに対して、ヒトインスリンは51個のアミノ酸よりなり、やはり分子内に２個のＳ−Ｓ結合を有する。ヒトインスリンが、ヒト成長ホルモンより遙かに小型の分子である点で粘膜からの吸収に有利であること、及び２個のＳ−Ｓ結合を分子内に有するという構造的類似性をヒト成長ホルモンと共有することから、ヒト成長ホルモン含有の乳糖配合粉末を用いて上記の通り実証された経肺吸収は、ヒトインスリンを用いても起こることが十分に予測できる。また同様に、更にヒトインスリンのほぼ半分のサイズであるカルシトニン（32アミノ酸）、ソマトスタチン（28アミノ酸）についても、本発明の粉末とすることにより、経肺吸収させることのできる蓋然性が高い。
【００５８】
【発明の効果】
本発明は、これまで皮下投与が行われてきた生理活性ペプチド、特にヒト成長ホルモン及びヒトインスリンを、吸入用製剤の形で提供することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト成長ホルモン粉末の経肺投与及び同量の皮下投与後のラット血中の成長ホルモン濃度の推移を示すグラフ。
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性ペプチド含有粉末特に、吸入により投与するのに適した生理活性ペプチド含有粉末に関する。本発明は更に、生理活性ペプチド含有の水性液体を乾燥させて粉末化する工程において生理活性ペプチドの変性を防止して安定化するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、成長ホルモン、インスリン等の生理活性ペプチド含有の医薬品は、注射により投与されてきた。その関係上、それらの製剤の製造には凍結乾燥が専ら用いられてきた。このため、それらの製剤において、主薬である生理活性ペプチドの安定化についての研究は、完成品である製剤の乾燥状態での生理活性ペプチドの長期保存安定性、及び乾燥したペプチド含有組成物を溶解した後の液体中での生理活性ペプチドの保存安定性に、これまで集中してきた。例えば、カルシトニン溶液の安定化については、特開平7-179364号公報、特開平7-188060号公報、特表平7-188061号公報等に、また、成長ホルモン凍結乾燥品の安定化については、特表平10-504531号公報、特表平10-511965号公報、特表平10-507183号公報等に開示されている。
【０００３】
生理活性ペプチドの投与方法が注射に限られてきたのは、経口投与では消化管内で消化されてしまうためであり、実用可能な新たな投与経路が開発できれば、患者にとって非常に有益である。取り分け、成長ホルモンやインスリン等のように、ほぼ生涯にわたって投与を続ける必要のある活性ペプチドの場合、従来の注射による投与は患者に不便と苦痛を強いている。従って、これらの生理活性ペプチドに関して、注射以外の投与経路の開発は患者に切望されている。
【０００４】
吸入用の製剤は、体内に直接注入するためのものでなく、外気に常に接している気道内に吸入される関係上、注射剤に比して微生物学的品質基準は緩やかである。このため、その製造には、凍結乾燥装置を用い得ることは勿論、それ以外に流動層造粒装置、噴霧乾燥装置、噴霧凍結乾燥装置等の製造装置も用い得る。これら流動層造粒装置、噴霧乾燥装置、噴霧凍結乾燥装置を用いた製剤の製造段階における生理活性ペプチドの安定化に関しては、メイラード反応に対する阻害剤を添加することで安定性を確保することが報告されている（特表平10-505591号公報）。しかし、製造段階における生理活性ペプチドの安定化は、もし可能であるなら、医薬品添加物として現在許可されており、安全性が高く、長年の使用実績のある添加物を用いて行う方が、得られる医薬品につき高い安全性が期待できるという点で、好ましい。また、生理活性ペプチド含有吸入用製剤に配合される主薬以外の成分は、刺激性のないことが必要であると共に、吸入による投与（以下、「経肺投与」という。）によって、生理活性ペプチドの吸収（以下、「経肺吸収」という。）が十分な効率で達成できるものでなければならない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記背景の下で、本発明は、吸入により投与するのに特に適した生理活性ペプチド含有粉末を提供することを目的とする。
また本発明は、製造工程における生理活性ペプチドの安定性を改善した、生理活性ペプチド含有粉末の製造方法を提供することも目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、生理活性ペプチド含有粉末を得るに当たって、生理活性ペプチド水溶液からこれを乾燥させて粉末する際における生理活性ペプチドの安定化を達成すると同時に、粉末粒子から生理活性ペプチドを高い効率で経肺吸収させる物質を求めて検討した。その結果、本発明者等は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン含有の粉末を製造するに当たり生理活性ペプチド水溶液に乳糖を配合することにより、乾燥させ粉末化する工程において生理活性ペプチドの安定性が著しく高められることを見出した。また、乳糖を配合したヒト成長ホルモン含有の粉末を動物に経肺投与したとき、ヒト成長ホルモンの血中移行性が、同じ製剤を皮下注射したときよりも顕著に優れていることを見出した。本発明は、これらの発見に基づいてなされたものである。
【０００７】
すなわち本発明は、重量比１：１〜１：５０で生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子よりなることを特徴とする、生理活性ペプチド含有粉末を提供する。該生理活性ペプチド含有組成物の製法は限定されない。該組成物中において、該生理活性ペプチドに対し上記に規定された範囲で含有される乳糖は、該生理活性ペプチドの安定性を高める働きをする。また、生理活性ペプチドと乳糖との重量比は、投与時の粉末の取扱いに不便でない限り両者合わせての投与重量を少なくする方が良いという観点から、より好ましくは１：１〜１：４０、更に好ましくは１：１〜３０、特に好ましくは１：１〜２０である。
【０００８】
更に、該粒子の平均粒子経が１〜10μｍ、更に好ましくは２〜５μｍであるとき、吸入された粒子は気流に乗って呼吸器の深部まで到達しやすい。そのような粒子経としたとき、上記生理活性ペプチド含有粉末は、これを経肺投与することにより粒子が肺内に到達しやすく、その結果該生理活性ペプチドを優れた効率でかつ比較的持続的に持続的に循環血中へ移行させることができる。すなわち本発明は更に、重量比１：１〜１：５０で生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子よりなり且つ該粒子の平均粒子経が１〜10μｍ、更に好ましくは２〜５μｍであることを特徴とする生理活性ペプチド含有粉末をも提供する。
【０００９】
上記生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子よりなる活性ペプチド含有粉末は、種々の方法で製造したものであってよいが、例えば、生理活性ペプチドと乳糖とを相互の重量比１：１〜１：５０で水に溶解させ、得られた該生理活性ペプチドと乳糖とを含有する水溶液を乾燥させることにより得られる粒子よりなるものであってよい。製造に際して、更に好ましくは、平均粒子経が１〜10μｍ更に好ましくは２〜５μｍとなるように、乾燥条件が調節される。
【００１０】
上記粉末の製造において、生理活性ペプチド及び乳糖と含有する水溶液の乾燥方法は適宜選択してよく、例えば、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥又は凍結乾燥により行うことができる。噴霧乾燥には、流動層コーティングや流動層造粒において行われる噴霧による乾燥もこれに包含される。
【００１１】
上記粉末中の該生理活性ペプチドとしては、成長ホルモン類、インスリン類、カルシトニン類、エリスロポエチン、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、インターフェロン、インターロイキン、スーパオキシドジスムターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー形成刺激因子、カリクレイン、リゾチーム、フィブロネクチン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管新生因子及び血管新生阻害因子よりなる群より選ぶことができる。このうち例えば、ヒト成長ホルモン及びインスリンは、これまでは、患者が長期間、皮下注射により自家投与を続けるほかなかった関係上、本願において特に好ましい生理活性ペプチドである。
【００１２】
本発明は更に、上記生理活性ペプチド含有の粒子を含んでなることを特徴とする、生理活性ペプチド含有吸入用製剤をも提供する。該吸入用製剤は、上記生理活性ペプチド含有の粒子そのままであってもよいが、該粒子が相互に緩く凝集したもの又は該粒子を、より粗大な不活性の担体粒子（例えば乳糖）表面に緩く付着させたものであってもよい。それらの緩い凝集体粒子又は緩い複合粗大粒子は、製剤の吸引時に吸入装置から放出されるに際して空気流により崩壊して生理活性ペプチド含有の各粒子が凝集体又は担体から遊離し単独粒子となるような緩さのものであればよい。そのような緩い凝集体粒子又は緩い複合粗大粒子の製造は、粉末を構成する１〜数μｍオーダーの粒子を緩く凝集させ又はより粗大な不活性の担体粒子表面に緩く付着させる当業者に周知の種々の技術を適宜用いて行うことができる。それらの緩い凝集体粒子又は緩い複合粗大粒子は、吸入装置で用いる所定のカプセル等に吸入用製剤を一回投与量毎に充填する際に、製剤の流動性を高めて、充填を容易にし充填量の正確さを高めることを目的とするものである。従って、カプセル等に充填後は、外部からの衝撃等によりカプセル等の中で一部又は全部の粒子が遊離して単独粒子となって粉末を形成していてもよい。
【００１３】
本発明は更に、生理活性ペプチドをその水溶液から乾燥させて該生理活性ペプチドを含んでなる粒子よりなる粉末を製造する方法であって、該生理活性ペプチド及び乳糖を水に溶解させることによって該生理活性ペプチド及び乳糖を含有した該水溶液を調製し、該水溶液を乾燥させて粉末とすることを特徴とする方法をも提供する。乳糖を水溶液中で生理活性ペプチドと共存させることにより、生理活性ペプチドの粉末化に際し安定化を顕著に改善することができる。
【００１４】
ここにおいて、該生理活性ペプチドと乳糖とは、広い範囲の重量比で用いて高い安定化を達成できるが、製造工程における取扱い易さ、製造コスト、及び得られる粉末粒径を考慮すると、該水溶液中における該生理活性ペプチドと乳糖の重量比が１：１〜１：５０であることが好ましく、１：１〜１：４０であることがより好ましく、１：１〜３０であることが更に好ましく、１：１〜２０であることが特に好ましい。製造に際して、更に好ましくは、平均粒子経が１〜10μｍ、より好ましくは２〜５μｍとなるように、乾燥条件が調節される。
【００１５】
上記方法において、生理活性ペプチド及び乳糖を含有する水溶液の乾燥方法は適宜選択してよく、例えば、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥又は凍結乾燥により行ってよい。噴霧乾燥には、流動層コーティングや流動層造粒において行われる噴霧による乾燥もこれに包含される。
【００１６】
上記方法において、該生理活性ペプチドとしては、成長ホルモン類、インスリン類、カルシトニン類、エリスロポエチン、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、インターフェロン、インターロイキン、スーパオキシドジスムターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー形成刺激因子、カリクレイン、リゾチーム、フィブロネクチン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管新生因子及び血管新生阻害因子よりなる群より選ぶことができる。このうち例えば、ヒト成長ホルモン及びヒトインスリンは、特に好ましい例である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子が高い経肺吸収をもたらすという発見に基づいており、従って、生理活性ペプチド含有粉末を製造するに当たり、適宜の製法を選択してよい。本発明はまた、活性ペプチド含有水溶液から活性ペプチドを粉末化する際において、活性ペプチドを顕著に安定化する作用を乳糖が有するという発見に基づいており、従って、生理活性物質及び乳糖を含有する水溶液の乾燥は、通常用いられる適宜の方法を採用して行ってよい。
【００１８】
本発明において、安定化の対象となる生理活性ペプチドの例としては、成長ホルモン類、インスリン類、カルシトニン類、エリスロポエチン、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、インターフェロン（α型、β型、又はγ型）、インターロイキン（Ｉ、II、III、IV、Ｖ、VI、又はVII）スーパオキシドジスムターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー形成刺激因子、カリクレイン、リゾチーム及びフィブロネクチン、並びに、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管新生因子及び血管新生阻害因子等、各種の細胞増殖・分化を調節する因子等が挙げられる。生理活性ペプチドは、化学的には複数のアミノ酸がペプチド結合によって連結したという共通の構造を有しており、従って、本発明は、上記以外にも広範な種々の生理活性ペプチドに適用可能である。また、それらのペプチドが天然物から抽出されたものか遺伝子組換えにより製造されたものかは、ペプチドの基本的物性に影響を及ぼさないから、何れの方法により得られたものかは問わない。
【００１９】
また、本発明において特に好ましく用いられる生理活性ペプチドの一例として、ヒト成長ホルモンがある。本発明において、「ヒト成長ホルモン」の語は、ヒト下垂体より抽出できる191個のアミノ酸からなる分子量22,125の22Ｋ ｈＧＨののみならず、23〜46番目の15アミノ酸の欠失した20Ｋ ｈＧＨをも包含する。20Ｋ ｈＧＨは22Ｋ ｈＧＨと同等の成長促進作用を示す。また、本発明において、「ヒト成長ホルモン」の語は、これら天然型ヒト成長ホルモンのみならず、天然ヒト成長ホルモンと実質的に同等の作用を有する遺伝子組換えにより得られたタンパク質をも含む。遺伝子組換えによるヒト成長ホルモンとしては、192個のアミノ酸よりなるＮ末端メチオニン型のものが例示されるほか、一部のアミノ酸が欠失、置換、負荷又は挿入されているが天然型のヒト成長ホルモンと実質的に同等の活性を有する変異体もこれに包含される。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されることは意図しない。特に、下記実施例では、ヒト成長ホルモンとして組換えヒト成長ホルモンを使用しているが、物性において組換えヒト成長ホルモンと天然のヒト成長ホルモンとの間に差はないから、実施例において得られた結果は、天然、組換えを問わず、あらゆるタイプのヒト成長ホルモンに適合する。
【００２１】
＜ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−１＞
成長ホルモン（ＧＨ）分子は、水溶液中での激しい撹拌時に気液界面に接触して立体構造変化を起こし、単量体の減少及び２量体、多量体又は不溶性凝集体の形成を起こす性質が強い。ＧＨの粉末化の工程において、噴霧乾燥などの乾燥段階では気液界面の増大によるＧＨの変性をできるだけ抑制する必要がある。この目的で、ｒ−ｈＧＨ溶液に添加しておくことで粉末化に際してＧＨを安定化する化合物を求めて種々検討した結果、並びに経肺投与における安全性についての考察及び可能な限り成分数の少ない処方とすることが望ましいとの視点に基づいて、下記の添加剤を最終的に候補として選択した。ＧＨの噴霧乾燥におけるそれらの安定化効果についての試験及び結果を記す。
【００２２】
（材料）
ＧＨとしては、組換えヒト成長ホルモン（ｒ−ｈＧＨ）原体（BTG社製：末端Ｎメチオニンを選択的に酵素切断除去してなり、アミノ酸191個の天然ヒト成長ホルモンと同一アミノ酸配列を有する。）を、安定化のための添加剤としては、乳糖（１水和物）及びマンニトールを用いた。
【００２３】
（ｒ−ｈＧＨ溶液調製）
下記の各処方に従い、ｒ−ｈＧＨ及び添加剤（対照では含まず）を秤取し、15.0ｍｌの精製水に溶解させて噴霧溶液とした。
【００２４】
処方Ｎｏ．２３６：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・・29.25ｍｇ （6.5重量％）
Ｄ−マンニトール・・・・・ 420.75 ｍｇ （ 93.5 重量％）
計 450.00ｍｇ
【００２５】
処方Ｎｏ．２３７：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・・29.25ｍｇ （6.5重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 420.75 ｍｇ （ 93.5 重量％）
計 450.00ｍｇ
【００２６】
対照処方：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・・ 29.25 ｍｇ
計 29.25ｍｇ
【００２７】
（噴霧乾燥）
噴霧乾燥装置としてEYELA SD-1000 Spray Dryerを用い、上記の各ｒ−ｈＧＨ溶液を噴霧乾燥して、乾燥粉末を得た。噴霧乾燥条件は次の通りとした。
入口温度： 90℃
乾燥空気量： 0.2ｍ3／分
噴霧圧： 100ｋＰａ
送液ポンプ流量： 2.6ｍｌ／分
【００２８】
（ＨＰＬＣ／単量体含量測定）
ｒ−ｈＧＨ単量体の測定のためのＨＰＬＣ条件は次の通りとした。
ＨＰＬＣ装置： LC10A（島津製作所）
サンプル量： 約0.02ｇ／精製水0.5ｍｌ
検出器： ＵＶ（280ｎｍ）
分析カラム： TSK G3000SWXL （TOSOH）
カラム温度： 室温
移動相： 0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.1Ｍリン酸水素ナトリウム、0.2Ｍ塩化ナトリウム
流速： 0.6ｍｌ／分
注入量： 50μｌ
【００２９】
（ＨＰＬＣ／脱アミド体含量測定）
ｒ−ｈＧＨの脱アミド体の測定のためのＨＰＬＣ条件は次の通りとした。
ＨＰＬＣ装置： LC10A（島津製作所）
サンプル量： 約0.02ｇ／精製水0.5ｍｌ
検出器： ＵＶ（280ｎｍ）
分析カラム： Protein C4カラム（VYDAC, Cat.No. 214ATP54）
カラム温度： 45℃
移動相： 50ｍＭトリス塩酸（ｐＨ7.5）／ｎ−プロパノール（71:29）緩衝液
流速： 0.5ｍｌ／分
注入量： 50μｌ
【００３０】
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
１） サンプルの調製：
サンプルとして約0.04ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、その10μｌに水10μｌ及びサンプル緩衝液20μｌを加えた。標準サンプルとしては、ｒ−ｈＧＨ原体約1.6ｍｇ／ｍｌを調製し、その10μｌに水10μｌ及びサンプル緩衝液20μｌを加えた。
２） 泳動緩衝液の調製：
（Ａ） 10×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動緩衝液は、トリス30.3ｇ、グリシン144ｇ、ＳＤＳ10ｇに水を加えて1000ｍｌとすることにより調製した（保存用）
（Ｂ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動緩衝液は、10×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動緩衝液100ｍｌに水900ｍｌを加えることにより調製した。
（Ｃ） 0.25Ｍトリス塩酸（ｐＨ6.8）緩衝液は、トリス30.25ｇに水を加えて800ｍｌとし室温にて６Ｎ塩酸でｐＨ6.8に合わせた後、水で1000ｍｌにメスアップすることにより調製した（冷凍保存）。
（Ｄ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液は、0.25Ｍトリス塩酸（ｐＨ6.8）緩衝液25ｍｌ、ＳＤＳ２ｇ、ショ糖５ｇ、ブロムチモールブルー（ＢＰＢ）２ｍｇに水を加えて50ｍｌとすることにより調製した。
３） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記サンプル及び緩衝液を用いて、20ｍＡ／ゲルで常法により電気泳動を行った。
【００３１】
（結果）
噴霧乾燥により得られたｒ−ｈＧＨ粉末中のｒ−ｈＧＨ単体含量及び脱アミド体含量の測定結果を次の表に示す。
【表１】
表１より明らかな通り、処方Ｎｏ．２３６及び２３７共に、対照処方に対して遙かに高いｒ−ｈＧＨ単量体残存率を示した。また、サンプル調製に用いたｒ−ｈＧＨ原体自体３．１％の脱アミド体を含有しており、処方Ｎｏ．２３６及び２３７における脱アミノ体の増加は、ごく僅かであった。また処方Ｎｏ．２３６及び２３７とを比較すると、処方Ｎｏ．２３７（すなわち、乳糖配合）の方がより優れた安定性を有していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検討でも、処方Ｎｏ．２３７（乳糖配合）の方が処方Ｎｏ．２３６よりも純度の高いことを示す泳動像を示した。
【００３３】
＜ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−２＞
上記試験結果より、乳糖がｒ−ｈＧＨ粉末化のための安定化剤として特に好ましいことが判明したことから、乳糖を用いたｒ−ｈＧＨ粉末の製造のための諸状件につき検討した。
【００３４】
（ｒ−ｈＧＨ溶液調製）
下記の各処方に従い、ｒ−ｈＧＨ及び乳糖を秤取し、10ｍｌ、20ｍｌ又は30ｍｌの精製水に溶解させて３通りの濃度の噴霧溶液を調製した。これらの溶液中のｒ−ｈＧＨ濃度及び乳糖濃度は、それぞれ、ｒ−ｈＧＨは、0.4、0.2及び0.13ｗ／ｗ％、乳糖は4.6、2.3及び1.5ｗ／ｗ％である。
（処方）
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・ 40ｍｇ（ 8重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 460 ｍｇ（ 92 重量％）
計 500ｍｇ
【００３５】
（噴霧乾燥及び分析）
これら各濃度の溶液につき、噴霧乾燥装置（EYELA SD-1000 Spray Dryer）を用い、入口温度を80℃、100℃、120℃又は140℃とした以外は前記「ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−１」の部に記載したのと同一の条件で噴霧乾燥した。得られた各粉末につき、前記と同一の方法で分析した。結果を次に示す。
表において：
・単量体残存率（％）＝（噴霧乾燥品ｒ−ｈＧＨの単量体ピーク面積／ｒ−ｈＧＨ原体の単量体ピーク面積）×100
・脱アミド体ピーク面積率（％）＝〔脱アミド体ピーク面積／（脱アミド体ピーク面積＋未変化ｒ−ｈＧＨピーク面積）〕×100。
・原体＝ｒ−ｈＧＨ原体（噴霧乾燥せず）
【００３６】
（結果）
【表２】
表２に見られるように、試験した水量及び入口温度で、単量体残存率及び脱アミド体ピーク面積率に大きな変化は認められなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいても、何れのサンプルも、同等の泳動像を示した。表２において、サンプルＮｏ．２４７で、単量体残存率がやや低いが、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動像が何れのサンプルも同等であったこと、他のサンプルで温度依存性が見られないこと等から総合的に判断すると、微量の吸湿性の乾燥粉末を取り扱う場合に起こりやすい測定誤差による異常値と思われる。上記結果から、少なくとも、試験した入口温度80〜140℃及びｒ−ｈＧＨ濃度0.40〜0.13ｗ／ｖ％の範囲では、許容し得る安定性をもってｒ−ｈＧＨの粉末化を行うことができることが分かる。また、このように、乳糖を添加剤として用いて粉末化するに際して明らかな温度依存性もｒ−ｈＧＨの濃度依存性も見られないことから、入口温度及び濃度は、試験した範囲外からも選択可能である。
【００３８】
＜ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−３＞
ＧＨ含有水溶液の粉末化に際してＧＨと乳糖との相互比率の変更がＧＨの安定性に及ぼす影響につき、次いで検討した。
【００３９】
（ｒ−ｈＧＨ溶液調製）
下記の各処方に従い、ｒ−ｈＧＨ及び乳糖を秤取し、15ｍｌの精製水に溶解させて噴霧溶液を調製した。
処方Ｎｏ．２７４：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・250ｍｇ（50重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 250 ｍｇ（ 50 重量％）
計 500ｍｇ
処方Ｎｏ．２７５：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・200ｍｇ（40重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 300 ｍｇ（ 60 重量％）
計 500ｍｇ
処方Ｎｏ．２７６：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・100ｍｇ（20重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 400 ｍｇ（ 80 重量％）
計 500ｍｇ
処方Ｎｏ．２７７：
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・ 50ｍｇ（10重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 450 ｍｇ（ 90 重量％）
計 500ｍｇ
【００４０】
（噴霧乾燥及び分析）
これら各濃度の溶液につき、噴霧乾燥装置（EYELA SD-1000 Spray Dryer）を用い、次の条件で噴霧乾燥し、得られた粉末につき、「ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−１」の部に記載したのと同一の方法で分析した。。
入口温度： 120℃
乾燥空気量： 0.2ｍ3／分
噴霧圧： 100ｋＰａ
送液ポンプ流量： 2.6ｍｌ／分
【００４１】
（結果）
次の表に結果を示す。
【表３】
表３は、試験した範囲内で、ｒ−ｈＧＨと乳糖の重量比率の変更によっては、噴霧乾燥を経た後の脱アミド体のピーク面積（％）は、実質的に影響を受けないことを示している。噴霧乾燥後の単量体残存率が100％を超えているものがあるが、微量の吸湿性の乾燥粉末の取扱いに際して生じがちな測定操作上の誤差によるものと考えられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、何れの処方も、同等の、純度の高ことを示す泳動像を示した。
【００４３】
＜in vivo試験用の乳糖配合ｒ−ｈＧＨ経肺投与粉末の製造＞
下記の処方に従い、ｒ−ｈＧＨ及び乳糖を秤取し、120ｍｌの精製水に溶解させて噴霧溶液とした。噴霧溶液中のｒ−ｈＧＨ濃度及び乳糖濃度は、それぞれ、0.20ｗ／ｗ％及び2.30ｗ／ｗ％である。
（処方）
ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・0.240ｇ（ 8.0重量％）
乳糖（１水和物）・・・・・ 2.760 ｇ（ 92.0 重量％）
計 3.000ｇ
【００４４】
上記の噴霧溶液をそれぞれ次の条件で噴霧乾燥した。
入口温度： 120℃
乾燥空気量： 0.2ｍ3／分
噴霧圧： 100ｋＰａ
送液ポンプ流量： 2.6ｍｌ／分
【００４５】
上記噴霧乾燥して得られたｒ−ｈＧＨ粉末につき、ＨＰＬＣによる単量体及び脱アミド体の測定並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥを、既に記載したのと同一の方法で確認した。結果は、次の表４に示す通り、上記「ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−２」と同様であり、噴霧乾燥品で脱アミド体の比率が標準品（噴霧乾燥せず）より高いものの、その差は僅かである。またＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、純度の高いことを示す泳動像が得られた。
【００４６】
【表４】
上記噴霧乾燥して得られたｒ−ｈＧＨ乾燥粉末を光学顕微鏡観察し、300個の粒子をランダムに選び粒子経を測定した。その結果、粒子経は2.7±0.7μｍであった。
【００４８】
＜ＧＨ粉末のラット経肺投与による血液動態の検討＞
ＧＨの粉末をラットに経肺投与し、その後の血中ＧＨ動態を調べた。また、経肺投与したのと同量のＧＨ粉末を水溶液にしてラットに皮下注射し、その後の血中ＧＨ動態を、経肺投与で得られた結果と比較した。
【００４９】
（使用動物）
経肺投与及び経皮投与のそれぞれにつき、９週齢の雄性Wistarラット６匹を使用した。
【００５０】
（被検ＧＨ粉末）
上記「in vivo試験用の乳糖配合ｒ−ｈＧＨ経肺投与粉末の製造」の部で得られたｒ−ｈＧＨ粉末を使用した。
【００５１】
（ｒ−ｈＧＨの投与）
経肺投与群のラットを１昼夜絶食させた後、ウレタン麻酔し、ラット体重当たり２ｍｇ／ｋｇのｒ−ｈＧＨ粉末をラット用の経肺投与器具（PennCentury）に入れ、装置のデリバリーチューブを気管内に挿入し、装置に連結したシリンジより３ｍｌの空気を素早く押し出すことによりｒ−ｈＧＨ粉末を肺内に放出した。経皮投与群のラットも同様に１昼夜絶食させた後、ｒ−ｈＧＨ粉末を精製水に懸濁させ、ラット体重当たりｒ−ｈＧＨ２ｍｇ／ｋｇ相当量を皮下注射した。
【００５２】
（血中サンプルの採取及び処理）
採血は、ｒ−ｈＧＨ投与直前及び投与後0、15、30、60、120、240、480、1440分の時点に行った。採血は、ラットを固定して頸静脈より行い、各回の採血量は300μｌとした。各回の採血後、同量（300μｌ）の生理食塩水を頸静脈内投与した。採取した血液は、室温にて１時間及び４℃にて一晩放置した後遠心分離（15000ｒｐｍ、10分間、４℃）し、血清を分取した。
【００５３】
（ＧＨ−ＥＬＩＳＡによる血中ｒ−ｈＧＨ濃度の測定）
常法により作製した抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体を、0.05Ｍトリス緩衝液で希釈して、吸光度ＯＤ280＝0.02となるように調整した。これを96穴プレートに100μｌずつ注入し、37℃にて２時間インキュベートした。0.01Ｍリン酸緩衝液（洗浄緩衝液）でプレートを５回洗浄した。ブロック液（ブロックエース：大日本製薬）をプレートに満たし、４℃にて一晩放置した。上記の血清及び標準曲線用ｒ−ｈＧＨを10倍ブロックエース水溶液で適当に希釈し、洗浄したプレートに100μｌずつ注入し、37℃にて２時間プレインキュベートした。
【００５４】
抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体を用いて常法により西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体を作製し、これを10倍ブロックエース水溶液で50000倍に希釈し、洗浄したプレートに100μｌずつ注入し、37℃にて２時間プレインキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ試薬（BIORAD）のを100μｌずつプレートに注入し、室温にて10分間反応させた後、１Ｎ硫酸により反応を停止させた。450ｎｍにおける吸光度を測定した。標準溶液の吸光度より検量線を作成し、これを用いて各サンプルの吸光度から、それぞれのサンプル中のｒ−ｈＧＨ濃度を求めた。
【００５５】
（結果）
ｒ−ｈＧＨ粉末の経肺投与又はｒ−ｈＧＨ懸濁液の皮下注射後のｒ−ｈＧＨの血中濃度測定結果を次の表５及び図１に示す。
【表５】
上記の表４及び図１より、ｒ−ｈＧＨ血中濃度は、皮下注射に比して経肺投与において顕著に高かったことが分かる。また、ｒ−ｈＧＨの投与開始（０分）から投与1440分後までのＡＵＣ（血液動態曲線下の面積）は、経肺投与で81829ｎｇ／ｍｌ・分、皮下注射では31502ｎｇ／ｍｌ・分であった。すなわち、経肺投与でのＡＵＣは皮下投与のそれの2.6倍であった。このことは、上記粉末の経肺投与によるｒ−ｈＧＨのバイオアベイラビリティーは、等しい量のｒ−ｈＧＨの皮下投与に較べて格段に優れていることを示している。
【００５７】
天然のヒト成長ホルモンは、191個のアミノ酸よりなり、分子内に２個のＳ−Ｓ結合を有する。これに対して、ヒトインスリンは51個のアミノ酸よりなり、やはり分子内に２個のＳ−Ｓ結合を有する。ヒトインスリンが、ヒト成長ホルモンより遙かに小型の分子である点で粘膜からの吸収に有利であること、及び２個のＳ−Ｓ結合を分子内に有するという構造的類似性をヒト成長ホルモンと共有することから、ヒト成長ホルモン含有の乳糖配合粉末を用いて上記の通り実証された経肺吸収は、ヒトインスリンを用いても起こることが十分に予測できる。また同様に、更にヒトインスリンのほぼ半分のサイズであるカルシトニン（32アミノ酸）、ソマトスタチン（28アミノ酸）についても、本発明の粉末とすることにより、経肺吸収させることのできる蓋然性が高い。
【００５８】
【発明の効果】
本発明は、これまで皮下投与が行われてきた生理活性ペプチド、特にヒト成長ホルモン及びヒトインスリンを、吸入用製剤の形で提供することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト成長ホルモン粉末の経肺投与及び同量の皮下投与後のラット血中の成長ホルモン濃度の推移を示すグラフ。
Claims (5)
- ヒト成長ホルモンと乳糖とを相互の重量比１：１〜１：５０で且つヒト成長ホルモンの濃度が０．４０〜０．１３ｗ／ｖ％の範囲となるように水に溶解させ、得られた水溶液を入口温度８０〜１４０℃で噴霧乾燥させることにより得られる粒子よりなることを特徴とする、生理活性ペプチド含有粉末。
- 該粒子の平均粒子経が１〜10μｍであることを特徴とする、請求項１の生理活性ペプチド含有粉末。
- 請求項１又は２の粒子を含んでなることを特徴とする、生理活性ペプチド含有吸入用製剤。
- ヒト成長ホルモンをその水溶液から乾燥させてヒト成長ホルモンを含んでなる粒子よりなる粉末を製造する方法であって、ヒト成長ホルモン及び乳糖を相互の重量比１：１〜１：５０で且つヒト成長ホルモンの濃度が０．４０〜０．１３ｗ／ｖ％の範囲となるように水に溶解させることによりヒト成長ホルモン及び乳糖を含有する水溶液を調製し、該水溶液を入口温度８０〜１４０℃で噴霧乾燥させて粉末とすることを特徴とする方法。
- 該粉末を構成する粒子の平均粒子経が１〜10μｍである、請求項４の方法。
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