JP2002179589A - 生理活性ペプチド含有粉末 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 吸入により投与するのに特に適した生理活性
ペプチド含有粉末を提供すること。 【解決手段】 重量比１：１〜１：５０で生理活性ペプ
チドと乳糖とを含んでなる粒子よりなることを特徴とす
る、生理活性ペプチド含有粉末。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生理活性ペプチド
含有粉末特に、吸入により投与するのに適した生理活性
ペプチド含有粉末に関する。本発明は更に、生理活性ペ
プチド含有の水性液体を乾燥させて粉末化する工程にお
いて生理活性ペプチドの変性を防止して安定化するため
の方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで、成長ホルモン、インスリン等
の生理活性ペプチド含有の医薬品は、注射により投与さ
れてきた。その関係上、それらの製剤の製造には凍結乾
燥が専ら用いられてきた。このため、それらの製剤にお
いて、主薬である生理活性ペプチドの安定化についての
研究は、完成品である製剤の乾燥状態での生理活性ペプ
チドの長期保存安定性、及び乾燥したペプチド含有組成
物を溶解した後の液体中での生理活性ペプチドの保存安
定性に、これまで集中してきた。例えば、カルシトニン
溶液の安定化については、特開平7-179364号公報、特開
平7-188060号公報、特表平7-188061号公報等に、また、
成長ホルモン凍結乾燥品の安定化については、特表平10
-504531号公報、特表平10-511965号公報、特表平10-507
183号公報等に開示されている。

【０００３】生理活性ペプチドの投与方法が注射に限ら
れてきたのは、経口投与では消化管内で消化されてしま
うためであり、実用可能な新たな投与経路が開発できれ
ば、患者にとって非常に有益である。取り分け、成長ホ
ルモンやインスリン等のように、ほぼ生涯にわたって投
与を続ける必要のある活性ペプチドの場合、従来の注射
による投与は患者に不便と苦痛を強いている。従って、
これらの生理活性ペプチドに関して、注射以外の投与経
路の開発は患者に切望されている。

【０００４】吸入用の製剤は、体内に直接注入するため
のものでなく、外気に常に接している気道内に吸入され
る関係上、注射剤に比して微生物学的品質基準は緩やか
である。このため、その製造には、凍結乾燥装置を用い
得ることは勿論、それ以外に流動層造粒装置、噴霧乾燥
装置、噴霧凍結乾燥装置等の製造装置も用い得る。これ
ら流動層造粒装置、噴霧乾燥装置、噴霧凍結乾燥装置を
用いた製剤の製造段階における生理活性ペプチドの安定
化に関しては、メイラード反応に対する阻害剤を添加す
ることで安定性を確保することが報告されている（特表
平10-505591号公報）。しかし、製造段階における生理
活性ペプチドの安定化は、もし可能であるなら、医薬品
添加物として現在許可されており、安全性が高く、長年
の使用実績のある添加物を用いて行う方が、得られる医
薬品につき高い安全性が期待できるという点で、好まし
い。また、生理活性ペプチド含有吸入用製剤に配合され
る主薬以外の成分は、刺激性のないことが必要であると
共に、吸入による投与（以下、「経肺投与」という。）
によって、生理活性ペプチドの吸収（以下、「経肺吸
収」という。）が十分な効率で達成できるものでなけれ
ばならない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記背景の下で、本発
明は、吸入により投与するのに特に適した生理活性ペプ
チド含有粉末を提供することを目的とする。また本発明
は、製造工程における生理活性ペプチドの安定性を改善
した、生理活性ペプチド含有粉末の製造方法を提供する
ことも目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、生理活性
ペプチド含有粉末を得るに当たって、生理活性ペプチド
水溶液からこれを乾燥させて粉末する際における生理活
性ペプチドの安定化を達成すると同時に、粉末粒子から
生理活性ペプチドを高い効率で経肺吸収させる物質を求
めて検討した。その結果、本発明者等は、生理活性ペプ
チドであるヒト成長ホルモン含有の粉末を製造するに当
たり生理活性ペプチド水溶液に乳糖を配合することによ
り、乾燥させ粉末化する工程において生理活性ペプチド
の安定性が著しく高められることを見出した。また、乳
糖を配合したヒト成長ホルモン含有の粉末を動物に経肺
投与したとき、ヒト成長ホルモンの血中移行性が、同じ
製剤を皮下注射したときよりも顕著に優れていることを
見出した。本発明は、これらの発見に基づいてなされた
ものである。

【０００７】すなわち本発明は、重量比１：１〜１：５
０で生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子よりな
ることを特徴とする、生理活性ペプチド含有粉末を提供
する。該生理活性ペプチド含有組成物の製法は限定され
ない。該組成物中において、該生理活性ペプチドに対し
上記に規定された範囲で含有される乳糖は、該生理活性
ペプチドの安定性を高める働きをする。また、生理活性
ペプチドと乳糖との重量比は、投与時の粉末の取扱いに
不便でない限り両者合わせての投与重量を少なくする方
が良いという観点から、より好ましくは１：１〜１：４
０、更に好ましくは１：１〜３０、特に好ましくは１：
１〜２０である。

【０００８】更に、該粒子の平均粒子経が１〜10μｍ、
更に好ましくは２〜５μｍであるとき、吸入された粒子
は気流に乗って呼吸器の深部まで到達しやすい。そのよ
うな粒子経としたとき、上記生理活性ペプチド含有粉末
は、これを経肺投与することにより粒子が肺内に到達し
やすく、その結果該生理活性ペプチドを優れた効率でか
つ比較的持続的に持続的に循環血中へ移行させることが
できる。すなわち本発明は更に、重量比１：１〜１：５
０で生理活性ペプチドと乳糖とを含んでなる粒子よりな
り且つ該粒子の平均粒子経が１〜10μｍ、更に好ましく
は２〜５μｍであることを特徴とする生理活性ペプチド
含有粉末をも提供する。

【０００９】上記生理活性ペプチドと乳糖とを含んでな
る粒子よりなる活性ペプチド含有粉末は、種々の方法で
製造したものであってよいが、例えば、生理活性ペプチ
ドと乳糖とを相互の重量比１：１〜１：５０で水に溶解
させ、得られた該生理活性ペプチドと乳糖とを含有する
水溶液を乾燥させることにより得られる粒子よりなるも
のであってよい。製造に際して、更に好ましくは、平均
粒子経が１〜10μｍ更に好ましくは２〜５μｍとなるよ
うに、乾燥条件が調節される。

【００１０】上記粉末の製造において、生理活性ペプチ
ド及び乳糖と含有する水溶液の乾燥方法は適宜選択して
よく、例えば、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥又は凍結乾燥に
より行うことができる。噴霧乾燥には、流動層コーティ
ングや流動層造粒において行われる噴霧による乾燥もこ
れに包含される。

【００１１】上記粉末中の該生理活性ペプチドとして
は、成長ホルモン類、インスリン類、カルシトニン類、
エリスロポエチン、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマ
トスタチン誘導体、インターフェロン、インターロイキ
ン、スーパオキシドジスムターゼ、ウロキナーゼ、プロ
テアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー形成刺激因子、カリ
クレイン、リゾチーム、フィブロネクチン、インスリン
様増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小
板由来増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管
新生因子及び血管新生阻害因子よりなる群より選ぶこと
ができる。このうち例えば、ヒト成長ホルモン及びイン
スリンは、これまでは、患者が長期間、皮下注射により
自家投与を続けるほかなかった関係上、本願において特
に好ましい生理活性ペプチドである。

【００１２】本発明は更に、上記生理活性ペプチド含有
の粒子を含んでなることを特徴とする、生理活性ペプチ
ド含有吸入用製剤をも提供する。該吸入用製剤は、上記
生理活性ペプチド含有の粒子そのままであってもよい
が、該粒子が相互に緩く凝集したもの又は該粒子を、よ
り粗大な不活性の担体粒子（例えば乳糖）表面に緩く付
着させたものであってもよい。それらの緩い凝集体粒子
又は緩い複合粗大粒子は、製剤の吸引時に吸入装置から
放出されるに際して空気流により崩壊して生理活性ペプ
チド含有の各粒子が凝集体又は担体から遊離し単独粒子
となるような緩さのものであればよい。そのような緩い
凝集体粒子又は緩い複合粗大粒子の製造は、粉末を構成
する１〜数μｍオーダーの粒子を緩く凝集させ又はより
粗大な不活性の担体粒子表面に緩く付着させる当業者に
周知の種々の技術を適宜用いて行うことができる。それ
らの緩い凝集体粒子又は緩い複合粗大粒子は、吸入装置
で用いる所定のカプセル等に吸入用製剤を一回投与量毎
に充填する際に、製剤の流動性を高めて、充填を容易に
し充填量の正確さを高めることを目的とするものであ
る。従って、カプセル等に充填後は、外部からの衝撃等
によりカプセル等の中で一部又は全部の粒子が遊離して
単独粒子となって粉末を形成していてもよい。

【００１３】本発明は更に、生理活性ペプチドをその水
溶液から乾燥させて該生理活性ペプチドを含んでなる粒
子よりなる粉末を製造する方法であって、該生理活性ペ
プチド及び乳糖を水に溶解させることによって該生理活
性ペプチド及び乳糖を含有した該水溶液を調製し、該水
溶液を乾燥させて粉末とすることを特徴とする方法をも
提供する。乳糖を水溶液中で生理活性ペプチドと共存さ
せることにより、生理活性ペプチドの粉末化に際し安定
化を顕著に改善することができる。

【００１４】ここにおいて、該生理活性ペプチドと乳糖
とは、広い範囲の重量比で用いて高い安定化を達成でき
るが、製造工程における取扱い易さ、製造コスト、及び
得られる粉末粒径を考慮すると、該水溶液中における該
生理活性ペプチドと乳糖の重量比が１：１〜１：５０で
あることが好ましく、１：１〜１：４０であることがよ
り好ましく、１：１〜３０であることが更に好ましく、
１：１〜２０であることが特に好ましい。製造に際し
て、更に好ましくは、平均粒子経が１〜10μｍ、より好
ましくは２〜５μｍとなるように、乾燥条件が調節され
る。

【００１５】上記方法において、生理活性ペプチド及び
乳糖を含有する水溶液の乾燥方法は適宜選択してよく、
例えば、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥又は凍結乾燥により行
ってよい。噴霧乾燥には、流動層コーティングや流動層
造粒において行われる噴霧による乾燥もこれに包含され
る。

【００１６】上記方法において、該生理活性ペプチドと
しては、成長ホルモン類、インスリン類、カルシトニン
類、エリスロポエチン、グルカゴン、ソマトスタチン、
ソマトスタチン誘導体、インターフェロン、インターロ
イキン、スーパオキシドジスムターゼ、ウロキナーゼ、
プロテアーゼ、腫瘍壊死因子、コロニー形成刺激因子、
カリクレイン、リゾチーム、フィブロネクチン、インス
リン様増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、
血小板由来増殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、
血管新生因子及び血管新生阻害因子よりなる群より選ぶ
ことができる。このうち例えば、ヒト成長ホルモン及び
ヒトインスリンは、特に好ましい例である。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明は、生理活性ペプチドと乳
糖とを含んでなる粒子が高い経肺吸収をもたらすという
発見に基づいており、従って、生理活性ペプチド含有粉
末を製造するに当たり、適宜の製法を選択してよい。本
発明はまた、活性ペプチド含有水溶液から活性ペプチド
を粉末化する際において、活性ペプチドを顕著に安定化
する作用を乳糖が有するという発見に基づいており、従
って、生理活性物質及び乳糖を含有する水溶液の乾燥
は、通常用いられる適宜の方法を採用して行ってよい。

【００１８】本発明において、安定化の対象となる生理
活性ペプチドの例としては、成長ホルモン類、インスリ
ン類、カルシトニン類、エリスロポエチン、グルカゴ
ン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、インター
フェロン（α型、β型、又はγ型）、インターロイキン
（Ｉ、II、III、IV、Ｖ、VI、又はVII）スーパオキシド
ジスムターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、腫瘍壊死
因子、コロニー形成刺激因子、カリクレイン、リゾチー
ム及びフィブロネクチン、並びに、インスリン様増殖因
子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増
殖因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管新生因子
及び血管新生阻害因子等、各種の細胞増殖・分化を調節
する因子等が挙げられる。生理活性ペプチドは、化学的
には複数のアミノ酸がペプチド結合によって連結したと
いう共通の構造を有しており、従って、本発明は、上記
以外にも広範な種々の生理活性ペプチドに適用可能であ
る。また、それらのペプチドが天然物から抽出されたも
のか遺伝子組換えにより製造されたものかは、ペプチド
の基本的物性に影響を及ぼさないから、何れの方法によ
り得られたものかは問わない。

【００１９】また、本発明において特に好ましく用いら
れる生理活性ペプチドの一例として、ヒト成長ホルモン
がある。本発明において、「ヒト成長ホルモン」の語
は、ヒト下垂体より抽出できる191個のアミノ酸からな
る分子量22,125の22Ｋ ｈＧＨののみならず、23〜46番
目の15アミノ酸の欠失した20Ｋ ｈＧＨをも包含する。2
0Ｋ ｈＧＨは22Ｋ ｈＧＨと同等の成長促進作用を示
す。また、本発明において、「ヒト成長ホルモン」の語
は、これら天然型ヒト成長ホルモンのみならず、天然ヒ
ト成長ホルモンと実質的に同等の作用を有する遺伝子組
換えにより得られたタンパク質をも含む。遺伝子組換え
によるヒト成長ホルモンとしては、192個のアミノ酸よ
りなるＮ末端メチオニン型のものが例示されるほか、一
部のアミノ酸が欠失、置換、負荷又は挿入されているが
天然型のヒト成長ホルモンと実質的に同等の活性を有す
る変異体もこれに包含される。

【００２０】

【実施例】以下、実施例を参照して本発明を更に具体的
に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されること
は意図しない。特に、下記実施例では、ヒト成長ホルモ
ンとして組換えヒト成長ホルモンを使用しているが、物
性において組換えヒト成長ホルモンと天然のヒト成長ホ
ルモンとの間に差はないから、実施例において得られた
結果は、天然、組換えを問わず、あらゆるタイプのヒト
成長ホルモンに適合する。

【００２１】＜ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−１
＞成長ホルモン（ＧＨ）分子は、水溶液中での激しい撹
拌時に気液界面に接触して立体構造変化を起こし、単量
体の減少及び２量体、多量体又は不溶性凝集体の形成を
起こす性質が強い。ＧＨの粉末化の工程において、噴霧
乾燥などの乾燥段階では気液界面の増大によるＧＨの変
性をできるだけ抑制する必要がある。この目的で、ｒ−
ｈＧＨ溶液に添加しておくことで粉末化に際してＧＨを
安定化する化合物を求めて種々検討した結果、並びに経
肺投与における安全性についての考察及び可能な限り成
分数の少ない処方とすることが望ましいとの視点に基づ
いて、下記の添加剤を最終的に候補として選択した。Ｇ
Ｈの噴霧乾燥におけるそれらの安定化効果についての試
験及び結果を記す。

【００２２】（材料）ＧＨとしては、組換えヒト成長ホ
ルモン（ｒ−ｈＧＨ）原体（BTG社製：末端Ｎメチオニ
ンを選択的に酵素切断除去してなり、アミノ酸191個の
天然ヒト成長ホルモンと同一アミノ酸配列を有する。）
を、安定化のための添加剤としては、乳糖（１水和物）
及びマンニトールを用いた。

【００２３】（ｒ−ｈＧＨ溶液調製）下記の各処方に従
い、ｒ−ｈＧＨ及び添加剤（対照では含まず）を秤取
し、15.0ｍｌの精製水に溶解させて噴霧溶液とした。

【００２４】 処方Ｎｏ．２３６： ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・・29.25ｍｇ （6.5重量％）Ｄ−マンニトール・・・・・ 420.75ｍｇ （93.5重量％） 計 450.00ｍｇ

【００２５】 処方Ｎｏ．２３７： ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・・29.25ｍｇ （6.5重量％）乳糖（１水和物）・・・・・ 420.75ｍｇ （93.5重量％） 計 450.00ｍｇ

【００２６】対照処方：ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・・29.25ｍｇ 計 29.25ｍｇ

【００２７】（噴霧乾燥）噴霧乾燥装置としてEYELA SD
-1000 Spray Dryerを用い、上記の各ｒ−ｈＧＨ溶液を
噴霧乾燥して、乾燥粉末を得た。噴霧乾燥条件は次の通
りとした。 入口温度： 90℃ 乾燥空気量： 0.2ｍ³／分 噴霧圧： 100ｋＰａ 送液ポンプ流量： 2.6ｍｌ／分

【００２８】（ＨＰＬＣ／単量体含量測定）ｒ−ｈＧＨ
単量体の測定のためのＨＰＬＣ条件は次の通りとした。 ＨＰＬＣ装置： LC10A（島津製作所） サンプル量： 約0.02ｇ／精製水0.5ｍｌ 検出器： ＵＶ（280ｎｍ） 分析カラム： TSK G3000SW_XL （TOSOH） カラム温度： 室温 移動相： 0.1Ｍリン酸二水素ナトリウム、0.1Ｍリン酸
水素ナトリウム、0.2Ｍ塩化ナトリウム 流速： 0.6ｍｌ／分 注入量： 50μｌ

【００２９】（ＨＰＬＣ／脱アミド体含量測定）ｒ−ｈ
ＧＨの脱アミド体の測定のためのＨＰＬＣ条件は次の通
りとした。 ＨＰＬＣ装置： LC10A（島津製作所） サンプル量： 約0.02ｇ／精製水0.5ｍｌ 検出器： ＵＶ（280ｎｍ） 分析カラム： Protein C4カラム（VYDAC, Cat.No. 214
ATP54） カラム温度： 45℃ 移動相： 50ｍＭトリス塩酸（ｐＨ7.5）／ｎ−プロパ
ノール（71:29）緩衝液 流速： 0.5ｍｌ／分 注入量： 50μｌ

【００３０】（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動） １） サンプルの調製：サンプルとして約0.04ｍｇ／ｍ
ｌの溶液を調製し、その10μｌに水10μｌ及びサンプル
緩衝液20μｌを加えた。標準サンプルとしては、ｒ−ｈ
ＧＨ原体約1.6ｍｇ／ｍｌを調製し、その10μｌに水10
μｌ及びサンプル緩衝液20μｌを加えた。 ２） 泳動緩衝液の調製： （Ａ） 10×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動緩衝液は、トリス
30.3ｇ、グリシン144ｇ、ＳＤＳ10ｇに水を加えて1000
ｍｌとすることにより調製した（保存用） （Ｂ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動緩衝液は、10×ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ用泳動緩衝液100ｍｌに水900ｍｌを加えるこ
とにより調製した。 （Ｃ） 0.25Ｍトリス塩酸（ｐＨ6.8）緩衝液は、トリ
ス30.25ｇに水を加えて800ｍｌとし室温にて６Ｎ塩酸で
ｐＨ6.8に合わせた後、水で1000ｍｌにメスアップする
ことにより調製した（冷凍保存）。 （Ｄ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液は、0.25Ｍ
トリス塩酸（ｐＨ6.8）緩衝液25ｍｌ、ＳＤＳ２ｇ、シ
ョ糖５ｇ、ブロムチモールブルー（ＢＰＢ）２ｍｇに水
を加えて50ｍｌとすることにより調製した。 ３） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 上記サンプル及び緩衝液を用いて、20ｍＡ／ゲルで常法
により電気泳動を行った。

【００３１】（結果）噴霧乾燥により得られたｒ−ｈＧ
Ｈ粉末中のｒ−ｈＧＨ単体含量及び脱アミド体含量の測
定結果を次の表に示す。

【表１】

【００３２】表１より明らかな通り、処方Ｎｏ．２３６
及び２３７共に、対照処方に対して遙かに高いｒ−ｈＧ
Ｈ単量体残存率を示した。また、サンプル調製に用いた
ｒ−ｈＧＨ原体自体３．１％の脱アミド体を含有してお
り、処方Ｎｏ．２３６及び２３７における脱アミノ体の
増加は、ごく僅かであった。また処方Ｎｏ．２３６及び
２３７とを比較すると、処方Ｎｏ．２３７（すなわち、
乳糖配合）の方がより優れた安定性を有していた。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる検討でも、処方Ｎｏ．２３７（乳糖
配合）の方が処方Ｎｏ．２３６よりも純度の高いことを
示す泳動像を示した。

【００３３】＜ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−２
＞上記試験結果より、乳糖がｒ−ｈＧＨ粉末化のための
安定化剤として特に好ましいことが判明したことから、
乳糖を用いたｒ−ｈＧＨ粉末の製造のための諸状件につ
き検討した。

【００３４】（ｒ−ｈＧＨ溶液調製）下記の各処方に従
い、ｒ−ｈＧＨ及び乳糖を秤取し、10ｍｌ、20ｍｌ又は
30ｍｌの精製水に溶解させて３通りの濃度の噴霧溶液を
調製した。これらの溶液中のｒ−ｈＧＨ濃度及び乳糖濃
度は、それぞれ、ｒ−ｈＧＨは、0.4、0.2及び0.13ｗ／
ｗ％、乳糖は4.6、2.3及び1.5ｗ／ｗ％である。 （処方） ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・ 40ｍｇ（ 8重量％）乳糖（１水和物）・・・・・460ｍｇ（92重量％） 計 500ｍｇ

【００３５】（噴霧乾燥及び分析）これら各濃度の溶液
につき、噴霧乾燥装置（EYELA SD-1000 Spray Dryer）
を用い、入口温度を80℃、100℃、120℃又は140℃とし
た以外は前記「ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−
１」の部に記載したのと同一の条件で噴霧乾燥した。得
られた各粉末につき、前記と同一の方法で分析した。結
果を次に示す。 表において： ・単量体残存率（％）＝（噴霧乾燥品ｒ−ｈＧＨの単量
体ピーク面積／ｒ−ｈＧＨ原体の単量体ピーク面積）×
100 ・脱アミド体ピーク面積率（％）＝〔脱アミド体ピーク
面積／（脱アミド体ピーク面積＋未変化ｒ−ｈＧＨピー
ク面積）〕×100。 ・原体＝ｒ−ｈＧＨ原体（噴霧乾燥せず）

【００３６】（結果）

【表２】

【００３７】表２に見られるように、試験した水量及び
入口温度で、単量体残存率及び脱アミド体ピーク面積率
に大きな変化は認められなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
おいても、何れのサンプルも、同等の泳動像を示した。
表２において、サンプルＮｏ．２４７で、単量体残存率
がやや低いが、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動像が何
れのサンプルも同等であったこと、他のサンプルで温度
依存性が見られないこと等から総合的に判断すると、微
量の吸湿性の乾燥粉末を取り扱う場合に起こりやすい測
定誤差による異常値と思われる。上記結果から、少なく
とも、試験した入口温度80〜140℃及びｒ−ｈＧＨ濃度
0.40〜0.13ｗ／ｖ％の範囲では、許容し得る安定性をも
ってｒ−ｈＧＨの粉末化を行うことができることが分か
る。また、このように、乳糖を添加剤として用いて粉末
化するに際して明らかな温度依存性もｒ−ｈＧＨの濃度
依存性も見られないことから、入口温度及び濃度は、試
験した範囲外からも選択可能である。

【００３８】＜ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−３
＞ＧＨ含有水溶液の粉末化に際してＧＨと乳糖との相互
比率の変更がＧＨの安定性に及ぼす影響につき、次いで
検討した。

【００３９】（ｒ−ｈＧＨ溶液調製）下記の各処方に従
い、ｒ−ｈＧＨ及び乳糖を秤取し、15ｍｌの精製水に溶
解させて噴霧溶液を調製した。 処方Ｎｏ．２７４： ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・250ｍｇ（50重量％）乳糖（１水和物）・・・・・250ｍｇ（50重量％） 計 500ｍｇ 処方Ｎｏ．２７５： ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・200ｍｇ（40重量％）乳糖（１水和物）・・・・・300ｍｇ（60重量％） 計 500ｍｇ 処方Ｎｏ．２７６： ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・100ｍｇ（20重量％）乳糖（１水和物）・・・・・400ｍｇ（80重量％） 計 500ｍｇ 処方Ｎｏ．２７７： ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・ 50ｍｇ（10重量％）乳糖（１水和物）・・・・・450ｍｇ（90重量％） 計 500ｍｇ

【００４０】（噴霧乾燥及び分析）これら各濃度の溶液
につき、噴霧乾燥装置（EYELA SD-1000 Spray Dryer）
を用い、次の条件で噴霧乾燥し、得られた粉末につき、
「ＧＨの噴霧乾燥における安定化検討−１」の部に記載
したのと同一の方法で分析した。。 入口温度： 120℃ 乾燥空気量： 0.2ｍ³／分 噴霧圧： 100ｋＰａ 送液ポンプ流量： 2.6ｍｌ／分

【００４１】（結果）次の表に結果を示す。

【表３】

【００４２】表３は、試験した範囲内で、ｒ−ｈＧＨと
乳糖の重量比率の変更によっては、噴霧乾燥を経た後の
脱アミド体のピーク面積（％）は、実質的に影響を受け
ないことを示している。噴霧乾燥後の単量体残存率が10
0％を超えているものがあるが、微量の吸湿性の乾燥粉
末の取扱いに際して生じがちな測定操作上の誤差による
ものと考えられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、何れの処方
も、同等の、純度の高ことを示す泳動像を示した。

【００４３】＜in vivo試験用の乳糖配合ｒ−ｈＧＨ経
肺投与粉末の製造＞下記の処方に従い、ｒ−ｈＧＨ及び
乳糖を秤取し、120ｍｌの精製水に溶解させて噴霧溶液
とした。噴霧溶液中のｒ−ｈＧＨ濃度及び乳糖濃度は、
それぞれ、0.20ｗ／ｗ％及び2.30ｗ／ｗ％である。 （処方） ｒ−ｈＧＨ・・・・・・・・0.240ｇ（ 8.0重量％）乳糖（１水和物）・・・・・2.760ｇ（92.0重量％） 計 3.000ｇ

【００４４】上記の噴霧溶液をそれぞれ次の条件で噴霧
乾燥した。 入口温度： 120℃ 乾燥空気量： 0.2ｍ³／分 噴霧圧： 100ｋＰａ 送液ポンプ流量： 2.6ｍｌ／分

【００４５】上記噴霧乾燥して得られたｒ−ｈＧＨ粉末
につき、ＨＰＬＣによる単量体及び脱アミド体の測定並
びにＳＤＳ−ＰＡＧＥを、既に記載したのと同一の方法
で確認した。結果は、次の表４に示す通り、上記「ＧＨ
の噴霧乾燥における安定化検討−２」と同様であり、噴
霧乾燥品で脱アミド体の比率が標準品（噴霧乾燥せず）
より高いものの、その差は僅かである。またＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより、純度の高いことを示す泳動像が得られ
た。

【００４６】

【表４】

【００４７】上記噴霧乾燥して得られたｒ−ｈＧＨ乾燥
粉末を光学顕微鏡観察し、300個の粒子をランダムに選
び粒子経を測定した。その結果、粒子経は2.7±0.7μｍ
であった。

【００４８】＜ＧＨ粉末のラット経肺投与による血液動
態の検討＞ＧＨの粉末をラットに経肺投与し、その後の
血中ＧＨ動態を調べた。また、経肺投与したのと同量の
ＧＨ粉末を水溶液にしてラットに皮下注射し、その後の
血中ＧＨ動態を、経肺投与で得られた結果と比較した。

【００４９】（使用動物）経肺投与及び経皮投与のそれ
ぞれにつき、９週齢の雄性Wistarラット６匹を使用し
た。

【００５０】（被検ＧＨ粉末）上記「in vivo試験用の
乳糖配合ｒ−ｈＧＨ経肺投与粉末の製造」の部で得られ
たｒ−ｈＧＨ粉末を使用した。

【００５１】（ｒ−ｈＧＨの投与）経肺投与群のラット
を１昼夜絶食させた後、ウレタン麻酔し、ラット体重当
たり２ｍｇ／ｋｇのｒ−ｈＧＨ粉末をラット用の経肺投
与器具（PennCentury）に入れ、装置のデリバリーチュ
ーブを気管内に挿入し、装置に連結したシリンジより３
ｍｌの空気を素早く押し出すことによりｒ−ｈＧＨ粉末
を肺内に放出した。経皮投与群のラットも同様に１昼夜
絶食させた後、ｒ−ｈＧＨ粉末を精製水に懸濁させ、ラ
ット体重当たりｒ−ｈＧＨ２ｍｇ／ｋｇ相当量を皮下注
射した。

【００５２】（血中サンプルの採取及び処理）採血は、
ｒ−ｈＧＨ投与直前及び投与後0、15、30、60、120、24
0、480、1440分の時点に行った。採血は、ラットを固定
して頸静脈より行い、各回の採血量は300μｌとした。
各回の採血後、同量（300μｌ）の生理食塩水を頸静脈
内投与した。採取した血液は、室温にて１時間及び４℃
にて一晩放置した後遠心分離（15000ｒｐｍ、10分間、
４℃）し、血清を分取した。

【００５３】（ＧＨ−ＥＬＩＳＡによる血中ｒ−ｈＧＨ
濃度の測定）常法により作製した抗ｈＧＨウサギポリク
ローナル抗体を、0.05Ｍトリス緩衝液で希釈して、吸光
度ＯＤ₂₈₀＝0.02となるように調整した。これを96穴プ
レートに100μｌずつ注入し、37℃にて２時間インキュ
ベートした。0.01Ｍリン酸緩衝液（洗浄緩衝液）でプレ
ートを５回洗浄した。ブロック液（ブロックエース：大
日本製薬）をプレートに満たし、４℃にて一晩放置し
た。上記の血清及び標準曲線用ｒ−ｈＧＨを10倍ブロッ
クエース水溶液で適当に希釈し、洗浄したプレートに10
0μｌずつ注入し、37℃にて２時間プレインキュベート
した。

【００５４】抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体を用い
て常法により西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接
合抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体を作製し、これを
10倍ブロックエース水溶液で50000倍に希釈し、洗浄し
たプレートに100μｌずつ注入し、37℃にて２時間プレ
インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ試薬（BIORAD）の
を100μｌずつプレートに注入し、室温にて10分間反応
させた後、１Ｎ硫酸により反応を停止させた。450ｎｍ
における吸光度を測定した。標準溶液の吸光度より検量
線を作成し、これを用いて各サンプルの吸光度から、そ
れぞれのサンプル中のｒ−ｈＧＨ濃度を求めた。

【００５５】（結果）ｒ−ｈＧＨ粉末の経肺投与又はｒ
−ｈＧＨ懸濁液の皮下注射後のｒ−ｈＧＨの血中濃度測
定結果を次の表５及び図１に示す。

【表５】

【００５６】上記の表４及び図１より、ｒ−ｈＧＨ血中
濃度は、皮下注射に比して経肺投与において顕著に高か
ったことが分かる。また、ｒ−ｈＧＨの投与開始（０
分）から投与1440分後までのＡＵＣ（血液動態曲線下の
面積）は、経肺投与で81829ｎｇ／ｍｌ・分、皮下注射
では31502ｎｇ／ｍｌ・分であった。すなわち、経肺投
与でのＡＵＣは皮下投与のそれの2.6倍であった。この
ことは、上記粉末の経肺投与によるｒ−ｈＧＨのバイオ
アベイラビリティーは、等しい量のｒ−ｈＧＨの皮下投
与に較べて格段に優れていることを示している。

【００５７】天然のヒト成長ホルモンは、191個のアミ
ノ酸よりなり、分子内に２個のＳ−Ｓ結合を有する。こ
れに対して、ヒトインスリンは51個のアミノ酸よりな
り、やはり分子内に２個のＳ−Ｓ結合を有する。ヒトイ
ンスリンが、ヒト成長ホルモンより遙かに小型の分子で
ある点で粘膜からの吸収に有利であること、及び２個の
Ｓ−Ｓ結合を分子内に有するという構造的類似性をヒト
成長ホルモンと共有することから、ヒト成長ホルモン含
有の乳糖配合粉末を用いて上記の通り実証された経肺吸
収は、ヒトインスリンを用いても起こることが十分に予
測できる。また同様に、更にヒトインスリンのほぼ半分
のサイズであるカルシトニン（32アミノ酸）、ソマトス
タチン（28アミノ酸）についても、本発明の粉末とする
ことにより、経肺吸収させることのできる蓋然性が高
い。

【００５８】

【発明の効果】本発明は、これまで皮下投与が行われて
きた生理活性ペプチド、特にヒト成長ホルモン及びヒト
インスリンを、吸入用製剤の形で提供することを可能に
する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒト成長ホルモン粉末の経肺投与及び同量の
皮下投与後のラット血中の成長ホルモン濃度の推移を示
すグラフ。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/28 Ａ６１Ｋ 37/24 38/26 37/26 38/23 37/28 38/27 37/30 38/43 37/36 38/44 37/48 38/46 37/50 38/48 37/54 38/21 37/547 47/26 37/553 37/66 Ｈ (72)発明者 進藤 千尋 兵庫県神戸市垂水区西舞子８丁目20−34 (72)発明者 堀江 正人 兵庫県神戸市垂水区桃山台１−16 ＪＣＲ コート316 Ｆターム(参考） 4C076 AA29 AA93 BB22 CC29 CC30 DD67Q FF63 4C084 AA03 BA03 CA18 DA12 DA19 DA21 DA25 DB11 DB22 DB31 DB34 DB35 DB52 DB53 DB54 DB55 DB56 DB59 DB62 DC03 DC04 DC05 DC24 MA05 MA57 NA03 NA10 ZC022 ZC032

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】重量比１：１〜１：５０で生理活性ペプチ
   ドと乳糖とを含んでなる粒子よりなることを特徴とす
   る、生理活性ペプチド含有粉末。
2. 【請求項２】該粒子の平均粒子経が１〜10μｍであるこ
   とを特徴とする、請求項１の生理活性ペプチド含有粉
   末。
3. 【請求項３】生理活性ペプチドと乳糖とを相互の重量比
   １：１〜１：５０で水に溶解させ、得られた該生理活性
   ペプチドと乳糖とを含有する水溶液を乾燥させることに
   より得られる粒子よりなることを特徴とする、生理活性
   ペプチド含有粉末。
4. 【請求項４】該粒子の平均粒子経が１〜10μｍであるこ
   とを特徴とする、請求項３の生理活性ペプチド含有粉
   末。
5. 【請求項５】該水溶液の乾燥が、噴霧乾燥、噴霧凍結乾
   燥又は凍結乾燥によりなされるものである、請求項３又
   は４の生理活性ペプチド含有粉末。
6. 【請求項６】該生理活性ペプチドが、成長ホルモン類、
   インスリン類、カルシトニン類、エリスロポエチン、グ
   ルカゴン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体、イ
   ンターフェロン、インターロイキン、スーパオキシドジ
   スムターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、腫瘍壊死因
   子、コロニー形成刺激因子、カリクレイン、リゾチー
   ム、フィブロネクチン、インスリン様増殖因子、上皮増
   殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神
   経成長因子、肝細胞増殖因子、血管新生因子及び血管新
   生阻害因子よりなる群より選ばれるものである、請求項
   １ないし５の何れかの生理活性ペプチド含有粉末。
7. 【請求項７】該生理活性ペプチドがヒト成長ホルモン又
   はヒトインスリンである、請求項１ないし５の何れかの
   生理活性ペプチド含有粉末。
8. 【請求項８】該生理活性ペプチドがヒト成長ホルモンで
   ある、請求項１ないし５の何れかの生理活性ペプチド含
   有粉末。
9. 【請求項９】請求項１ないし８の何れかの粒子を含んで
   なることを特徴とする、生理活性ペプチド含有吸入用製
   剤。
10. 【請求項１０】生理活性ペプチドをその水溶液から乾燥
    させて該生理活性ペプチドを含んでなる粒子よりなる粉
    末を製造する方法であって、該生理活性ペプチド及び乳
    糖を水に溶解させることによって該生理活性ペプチド及
    び乳糖を含有した該水溶液を調製し、該水溶液を乾燥さ
    せて粉末とすることを特徴とする方法。
11. 【請求項１１】該水溶液中における該生理活性ペプチド
    と乳糖の重量比が１：１〜１：５０である、請求項１０
    の方法。
12. 【請求項１２】該水溶液の乾燥が、噴霧乾燥、噴霧凍結
    乾燥又は凍結乾燥によりなされるものである、請求項１
    ０又は１１の方法。
13. 【請求項１３】該粉末を構成する粒子の平均粒子経が１
    〜10μｍである、請求項１０ないし１２の何れかの方
    法。
14. 【請求項１４】該生理活性ペプチドが、成長ホルモン
    類、インスリン類、カルシトニン類、エリスロポエチ
    ン、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導
    体、インターフェロン、インターロイキン、スーパオキ
    シドジスムターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、腫瘍
    壊死因子、コロニー形成刺激因子、カリクレイン、リゾ
    チーム、フィブロネクチン、インスリン様増殖因子、上
    皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因
    子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管新生因子及び
    血管新生阻害因子よりなる群より選ばれるものである、
    請求項１０ないし１３の何れかの方法。
15. 【請求項１５】該生理活性ペプチドがヒト成長ホルモン
    又はヒトインスリンである、請求項１０ないし１４の何
    れかの方法。
16. 【請求項１６】該生理活性ペプチドがヒト成長ホルモン
    である、請求項１０ないし１４の何れかの方法。