JP5818681B2

JP5818681B2 - インスリンアルブミンコンジュゲート

Info

Publication number: JP5818681B2
Application number: JP2011502376A
Authority: JP
Inventors: ティナモラータグモセ，; ペーターマドセン，; トマスボーグラムケルセン，
Original assignee: ノボ・ノルデイスク・エー／エス
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2029-03-31
Also published as: CN102065903A; CN102065903B; US20110039769A1; EP2262539A1; EP2262539B1; US9242011B2; WO2009121884A1; ES2563553T3; JP2011518779A

Description

本発明は、新規なインスリンアルブミンコンジュゲート、そのようなインスリンアルブミンコンジュゲートの調製方法、インスリンアルブミンコンジュゲートを含むインスリン調製物及びこれらインスリンアルブミンコンジュゲートを使用して真性糖尿病を治療する方法に関する。

真性糖尿病（１型及び２型糖尿病）は、グルコースを利用する能力が部分的に又は完全に失われる代謝性疾患である。全人口の約５％が糖尿病に苦しみ、この病気は蔓延している。１９２０年代のインスリンの発見以来、絶え間ない努力が糖尿病の治療を改善するために行われてきた。糖尿病に苦しむ人々は、数十年にもわたって、長期間の治療を受けるので、安全で便利で生活の質を改善するインスリン系治療剤に対する大きな需要がある。

ヒトインスリンは、２１及び３０のアミノ酸残基を含むいわゆるＡ及びＢ鎖である２つのポリペプチド鎖からなる。インスリンアナログは、アミノ酸の一又は複数が他のアミノ酸と交換されているヒトインスリンである。商業的に入手可能なインスリン製剤の幾つかは、速い作用の発現を特徴とし、他の製剤は、作用発現は比較的遅いが、程度の差はあるが、長時間にわたる作用を示す。
１型及び２型糖尿病の治療は、典型的には、食事で誘発される高血糖症に対しての速効型の摂食前ボーラスインスリンでの治療と併せて、食事と夜間の間の血糖管理に対しての長時間作用基礎インスリンでの治療を含む。治療の目標は長期にわたるほぼ正常血糖の管理の維持である。

インスリンのような治療用ペプチド又はタンパク質のヒト血清アルブミン又はその誘導体へのコンジュゲーションは、プロテアーゼに対する治療用ペプチド又はタンパク質の保護をもたらす。治療剤のサイズの増加はクリアランスの減少を生じる。よってコンジュゲーションはコンジュゲートの延長された滞留時間を生じる（国際公開第０１／７７１３７号及び国際公開第２００６／０１２３４６号を参照）。アルブミンへのインスリンのコンジュゲーションは、持続作用プロファイルを生じ、それによって注射の頻度を低減させる。ほぼ正常血糖の維持は低血糖のリスクを低下させる（Diabetes 2005, vol 54, 251-258、及びBioconjugate Chem. 2005, vol 16, 1000-1008を参照せよ）。

国際公開第００／６９９００号の請求項７は、例えばペプチド−血液成分コンジュゲートを形成することを含むペプチダーゼ活性から治療用ペプチドを保護する方法に関し、そこでは、請求項１４に記載の血液成分はアルブミンである。国際公開第００／６９９００号の特定の実施例は何れもインスリンを扱ってはいない。
国際公開第２００５／０１２３４６号の請求項１は、インスリン分子と血液成分に共有的に結合するための反応性基を含むインスリン誘導体に関する。その請求項２によれば、反応性基は、位置ＧｌｙＡ１、ＰｈｅＢ１及びＬｙｓＢ２９から選択された位置で、インスリン分子、つまりヒトインスリンのアミノ酸に結合している。

国際公開第２００５／１０３０８７号の請求項１は、非コンジュゲートアルブミンからアルブミンコンジュゲートを分離する方法に関する。国際公開第２００５／１０３０８７号において例示されているインスリンはヒトインスリンとＡ１、Ｂ１又はＢ２９に伸展を有するインスリンであり、全てＡ２１Ａｓｎ（Ａ２１Ｎ）を含んでいる。
国際公開第２００７／０７１０６８号の請求項１は、ある化合物に共有的に結合したアルブミンを含むコンジュゲートの調製方法に関する。インスリンはそこの第９頁第１６行に述べられている。国際公開第２００７／０７１０６８号には特定の実施例は与えられていない。
通常は、インスリン製剤は皮下注射によって投与される。

発明の態様

この発明の態様は、皮下的に投与される場合、少なくとも約６時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、皮下的に投与される場合、少なくとも約１２時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、皮下的に投与される場合、少なくとも約１８時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、皮下的に投与される場合、少なくとも約２４時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、皮下的に投与される場合、少なくとも約３６時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、皮下的に投与される場合、少なくとも約４８時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。

この発明の態様は、経肺的に投与される場合、少なくとも約６時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、経肺的に投与される場合、少なくとも約１２時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、経肺的に投与される場合、少なくとも約１８時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、経肺的に投与される場合、少なくとも約２４時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、経肺的に投与される場合、少なくとも約３６時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、経肺的に投与される場合、少なくとも約４８時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。

この発明の態様は、経口的に投与される場合、少なくとも約２４時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、経口的に投与される場合、少なくとも約３６時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の態様は、経口的に投与される場合、少なくとも約４８時間の間、ほぼ正常血糖をもたらすインスリン誘導体の提供に関する。

この発明の他の態様は、血糖値の満足できる基礎制御を与えるために毎日一回だけ投与されるものであるインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の他の態様は、治療中に体重増加を生じないか、低い度合いでのみ生じさせるものであるインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の他の態様は、治療中に体重減少を生じさせるインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の他の態様は、血糖降下事象を生じないか、低い度合いでのみ生じさせるものであるインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の他の態様は、肝選択的であるインスリン誘導体の提供に関する。
この発明の目的は、先行技術の不具合の少なくとも一つを解消又は改善し、又は有用な代替手段を提供することにある。

定義
ここで、インスリンなる用語は、自然に生じるインスリン、例えばヒトインスリン、並びにそのインスリンアナログをカバーする。
ここで、アミノ酸残基なる用語は、水素原子がアミノ基から除去された、及び／又はヒドロキシ基がカルボキシ基から除去された、及び／又は水素原子がメルカプト基から除去されたアミノ酸をカバーする。不正確ではあるが、アミノ酸残基はアミノ酸を指す場合がある。
ここで、ペプチド残基なる用語は、水素原子がアミノ基から除去された、及び／又はヒドロキシ基がカルボキシ基から除去された、及び／又は水素原子がメルカプト基から除去されたペプチドをカバーする。不正確ではあるが、ペプチド残基はペプチドを指す場合がある。

ここで、インスリンアナログ（又はインスリンのアナログ）なる用語は、天然インスリン中に生じる一又は複数のアミノ酸残基を欠失及び／又は置換する(置き換える)ことにより、及びＡ２１アミノ酸残基に一又は複数のアミノ酸残基を付加することにより、例えばヒトインスリン等の自然に生じるインスリンの構造から形式的に誘導することができる分子構造を有するポリペプチドをカバーする。好ましくは、付加及び／又は置換されたアミノ酸残基は、コード性アミノ酸残基である。例えば、Ａ鎖はそのＣ末端が、例えば（ヒトインスリンと比較して）１、２、３又は４のアミノ酸残基だけ伸展され得、その位置はそれぞれＡ２２、Ａ２３、Ａ２４及びＡ２５と称する。たとえインスリンアナログがＡ２１／Ａ２２位に伸展を有していても、該インスリンアナログ中の他の位置に欠失がありうる。ヒトインスリンにおける場合と同様に、この発明の化合物中に存在するインスリンアナログでは、Ａ２１アミノ酸残基がＮ末端的に２０位のＣｙｓ残基に連結され、そのＣｙｓ残基が鎖間ジスルフィド架橋の形成に関与する。ここで、親インスリン又は親インスリンアナログなる用語はまたインスリンアナログに対して使用される。主として、親なる用語は、例えばアシル化によって化学的に導入されうる側鎖を有するインスリンアナログと区別する場合に使用される。

ここで、変異なる用語は、アミノ酸配列中の任意の変化（コード性アミノ酸を用いた置換及び挿入並びに欠失）をカバーする。
ここで、Ａ１、Ａ２、Ａ３等の用語は、それぞれ、(Ｎ末端から数えて)インスリンのＡ鎖の位置１、２及び３を示す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３等の用語は、それぞれ、(Ｎ末端から数えて)インスリンのＢ鎖の位置１、２及び３を示す。アミノ酸に対して１文字コードを使用すると、Ａ２１Ａ、Ａ２１Ｇ及びＡ２１Ｑ等の用語は、Ａ２１位にあるアミノ酸が、それぞれＡ、Ｇ及びＱであることを示す。アミノ酸のための３文字コードを使用すると、対応する表現は、それぞれＡｌａＡ２１、ＧｌｙＡ２１及びＧｌｎＡ２１となる。

ここで、ｄｅｓＢ２９及びｄｅｓＢ３０等の用語は、それぞれＢ２９又はＢ３０アミノ酸残基を欠くインスリンアナログを示す。
インスリンアナログ及びＡ及びＢ鎖における位置の番号付けは、親化合物がそのために使用される番号を有するヒトインスリンであるようになされる。
ここで、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド又はペプチド残基のような用語と関連した「コード性」なる表現は、ヌクレオチドのトリプレット（「コドン」）によってコードされうるアミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド又はペプチド残基を示すために使用される（遺伝子工学参照）。

ここで、アルブミンなる用語は、様々な種、例えばヒト（ＨＳＡ，ヒト血清アルブミン）、ラット（ＲＳＡ，ラット血清アルブミン）、マウス（ＭＳＡ，マウス血清アルブミン）、ブタ（ＰＳＡ，ブタ血清アルブミン）、ウシ（ＢＳＡ，ウシ血清アルブミン）、イヌ（ＣＳＡ，イヌ血清アルブミン）及びウサギ（ＲａＳＡ，ウサギ血清アルブミン）、組換えアルブミン、例えばＮ末端残基（Ａｓｐ）の欠失を伴う組換えヒト血清アルブミン及びゲノム源からのアルブミンをカバーする。
アルブミン中の位置の番号付けは、親化合物がヒト血清アルブミンであるようになされる。Ｃｙｓ３４のような用語は、３４位のＣｙｓを示す。最初のアミノ酸を欠く組換えヒト血清アルブミンであるアルバゲン（Albagen）では、遊離のＣｙｓはＣｙｓ３４と称される。

ここで、マイケルアクセプターなる用語は、限定するものではないが、α,β-不飽和カルボニル部分、マレイミド基及びビニルスルホン基をカバーする。
ここで、チオール反応性基なる用語は、限定するものではないが、ヨードアセトアミド基、非対称ジスルフィド類であって、（ここで定義した）二官能性リンカーが非対称ジスルフィド中のメルカプト官能基の一つと離脱基としての他の官能基を提供する。このような非対称ジスルフィド類の例は、ピリジルジスルフィド、(メトキシ-又はエトキシカルボニル)ジスルフィド類、及び(ｏ-ニトロフェニル)ジスルフィド類である。

インスリン活性を有するインスリンアルブミンコンジュゲートとは、例えば静脈内、皮下又は経肺投与による適切な投与後に例えばラット、ウサギ、イヌ又はブタモデルでありうる適切な動物モデルにおいて測定して哺乳動物における血糖を低下させる能力か又はインスリンレセプター結合親和性を有するインスリンアルブミンコンジュゲートを意味する。

ここで、肝選択的なる用語は、筋肉及び／又は脂肪のような末梢組織へのインスリン作用に対して、肝臓へのインスリン作用に対しての選択性をカバーする。肝臓への作用は、筋肉及び／又は脂肪のような末梢組織へのインスリン作用に対して、好ましくは５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上強い。作用の選択性は、例えば、インスリンアルブミンコンジュゲートの投与後に様々な組織中のインスリンレセプターリン酸化（つまり、活性化）過程を測定することによって測定することができる。別法では、肝選択性は、Ｒａ（グルコース出現速度、つまり肝臓グルコース生産）及びＲｄ（グルコース廃棄速度、つまり筋肉及び脂肪でのグルコース取り込み）の測定によってクランプ技術によって測定することができる。

インスリンレセプター親和性及びＩＧＦ-１レセプター親和性を有するポリペプチドは、適切な結合アッセイにおいてインスリンレセプター及びヒトＩＧＦ-１レセプターと相互作用可能なポリペプチドである。このようなレセプターアッセイは当該分野で良く知られており、実施例に更に記載される。本インスリンアルブミンコンジュゲートはＩＧＦ-１レセプターに結合せず、又は上記レセプターに対してかなり低い親和性を有する。より正確には、この発明のインスリンアルブミンコンジュゲートは、ヒトインスリンのものと実質的に同じ大きさか又はそれ以下の親和性をＩＧＦ-１レセプターに対して有する。

ここで使用される治療及び治療するという用語は、疾患、疾病又は症状に抗することを目的として、患者を管理し世話することを意味する。該用語には、疾患、疾病又は症状の進行を遅延させ、徴候及び合併症を軽減し、徴候及び合併症を軽減又は緩和し、及び／又は疾患、疾病又は症状を治癒又は除去することが含まれるものである。治療される患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。

ここで使用される疾患の治療なる用語は、疾病、症状又は疾患を発症した患者の管理及び世話(ケア)を意味する。治療の目的は、疾病、症状又は疾患と闘うことである。治療には、疾病、症状又は疾患を排除し又は制御するため、並びに疾病、症状又は疾患に伴う徴候又は合併症を緩和するための、活性な化合物の投与を含む。
ここで使用される疾患の予防なる用語は、疾患の臨床的発症より前に疾患の発病の危険性について個人を管理及びケアすることとして定義される。予防の目的は疾病、症状又は疾患の発病と闘うことであり、徴候又は合併症の発症を予防又は遅らせるため、及び関連する疾病、症状又は疾患の発病を予防又は遅らせるために、活性な化合物を投与することを含む。

ここで使用される有効量なる用語は、治療されない場合と比較して患者の治療に有効であるのに十分な投薬量を意味する。
明示的に示されない限り、ここに述べられるアミノ酸はＬ-アミノ酸である。更に、ペプチドのアミノ酸配列の左及び右端は、別の記載がない限り、それぞれＮ末端及びＣ末端である。

便宜上、ここに、コード性の天然アミノ酸の名前をカッコ内に通常の３文字コードと１文字コードを伴って示す：グリシン（Ｇｌｙ及びＧ）、プロリン（Ｐｒｏ及びＰ）、アラニン（Ａｌａ及びＡ）、バリン（Ｖａｌ及びＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ及びＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ及びＩ）、メチオニン（Ｍｅｔ及びＭ）、システイン（Ｃｙｓ及びＣ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ及びＦ）、チロシン（Ｔｙｒ及びＹ）、トリプトファン（Ｔｒｐ及びＷ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ及びＨ）、リジン（Ｌｙｓ及びＫ）、アルギニン（Ａｒｇ及びＲ）、グルタミン（Ｇｌｎ及びＱ）、アスパラギン（Ａｓｎ及びＮ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ及びＥ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ及びＤ）、セリン（Ｓｅｒ及びＳ）及びスレオニン（Ｔｈｒ及びＴ）。タイピングエラーにより、一般的に用いられるコードからのずれがある場合は、一般的に用いられるコードが適用される。この発明のインスリン中に存在するアミノ酸は、好ましくは、核酸によってコードされうるアミノ酸である。

ここで使用される略語は次の通りである：ｈは時間、ＡｃＣＮはアセトニトリル、ＤＣＭはジクロロメタン、ＤＩＰＥＡはジイソプロピルエチルアミン、ＤＭＦはジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ＥｔＯＡｃは酢酸エチル、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＴＳＴＵはＯ-(Ｎ-スクシミジル)-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、ＨＯＳｕはＮ-ヒドロキシスクシンイミド、ＨＯＡｔは１-ヒドロキシ-７-アザ-ベンゾトリアゾール、ＨＯＢｔは１-ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＭＷＣＯは分子量カットオフ、ＣＶはカラム容量である。

インスリンＡ鎖のＣ末端のリジン残基へのインスリンへのアルブミンのコンジュゲーションが、従来はＢ２０リジンを介して結合していた類似のインスリンアルブミンコンジュゲートの相対親和性よりも、ヒトインスリンレセプターに対して高い相対親和性を有するインスリンアルブミンコンジュゲートを生じることが意外にも見出された。本発明は二官能性リンカーの合成を必要とする。一官能基がリンカーの一端をインスリン分子へ結合させ、他の官能基がリンカーの他端をアルブミンに結合させる。

１６週齢の意識ある給餌されたＺＤＦラットに実施例１のインスリンアルブミンコンジュゲート（８７．３ｎｍｏｌ／ｋｇ）並びにビヒクルの皮下投与後の時間（ｈｒ）に対する血糖（ｍｍｏｌ／ｌ）の依存性を示す。結果は、実施例１のインスリンアルブミンコンジュゲートによるグルコースのクリアランスは速く、効果的で、持続性があった。実施例１のインスリンアルブミンコンジュゲートによる肝臓のインスリンレセプターのリン酸化を示す。試験の結果は、肝臓インスリンレセプターの活性化の増加によって表される肝選択性を示すものであった。実施例１のインスリンアルブミンコンジュゲートによる筋肉として表される末梢組織のインスリンレセプターのリン酸化を示す。試験の結果は、筋肉のインスリンレセプターの活性化の減少によって表される肝選択性を示すものであった。実施例１のインスリンアルブミンコンジュゲートによる脂肪として表される末梢組織のインスリンレセプターのリン酸化を示す。試験の結果は、脂肪組織のインスリンレセプターの活性化の減少によって表される肝選択性を示すものであった。

形式的には、この発明のインスリンアルブミンコンジュゲートはインスリンアナログ、リンカー及びアルブミンからなる。一実施態様では、インスリンアナログはＡ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンであり、リンカーは８-[３-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}オクタノイルであり、アルブミンはアルバゲン（以下の実施例１を参照）である。
この発明のインスリンアルブミンコンジュゲートの一部であるインスリンアナログは、形式的には、Ａ２１アミノ酸残基と比較して単一のアミノ酸残基、つまりリジン残基、又はペプチド残基、好ましくは２−５のアミノ酸残基からなるものからなり、場合によってはインスリンの位置Ａ１−Ａ２１及びＢ１−Ｂ３０のアミノ酸残基の一又は複数が欠失ｓれ又は他のアミノ酸残基によって置換されたＡ鎖の伸展のＣ末端を含む、Ａ鎖のＣ末端にリジン残基を有するヒトインスリンとして例示することができる。命名法については、Ａ２１位のアミノ酸残基にＣ末端的に連結されたアミノ酸残基はＡ２２位にある。同様に、Ａ２１のアミノ酸残基にＣ末端的に連結されたペプチド残基中に存在するアミノ酸残基は、位置Ａ２２、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２５等にある。インスリンアナログは、ヒトインスリンのＡ鎖と比較して、Ａ鎖のＣ末端にリジン残基を有するか、又はリジン残基はＡ差のアミノ酸伸展のＣ末端にあり、Ａ鎖の上記伸展はそのＣ末端にある。

二官能性リンカーの一端はＡ鎖のＣ末端リジンに結合されなければならない。二官能性リンカーの他端はアルブミンに結合されなければならない。
二官能性リンカーからアルブミンへの結合は好ましくは３４位の遊離Ｃｙｓに対してでなければならない。
二官能性リンカーは、一般式（Ｉ）：
Ｍ-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｗ（Ｉ）
［上式中、Ｍは、マレイミド基、ビニルスルホン等によって表されるマイケルアクセプター、ヨウ化物、ピリジルジスルフィド、メトキシ−又はエトキシカルボニルジスルフィド及びｏ−ニトロフェニルジスルフィドによって表されるチオール反応性基を含み；
Ｚは共有結合又は次の式の部分：
-ＮＨ-(ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ)_ｐ-ＣＨ_２-ＣＯ-；
-ＮＨ-(ＣＨ_２)_ｑ-ＣＨ_２-ＣＯ-；
-ＮＨ-(ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ)_ｒ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＯ-；
-ＨＮ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＯ；
-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＯ-；又は
-ＮＨ-Ｃ_６Ｈ_４-ＣＯ-
から選択され(ここで、そのＮ末端はＺ（又は存在するならばＹ）と標記されている部分に連結されている）；
ｐは０又は１から２４の範囲の整数であり；
ｑは０又は１から２４の範囲の整数であり；
ｒは０又は１から２４の範囲の整数であり；
-Ｃ_６Ｈ_４-はパラ−フェニレンであり；
ｎは１から１０の範囲の整数又はより好ましくは１又は２であり；
ＹはＺ又は共有結合として定義され；
ｏは０又は１から１０の範囲の整数又はより好ましくは０又は１であり；かつ
Ｗは一般的に使用される活性エステルの離脱基である）
によって表すことができる。

そのような活性エステル離脱基の非限定的な例は、ＨＯＳｕ（Ｎ-ヒドロキシスクシミジル）、ＨＯＡｔ、ＨＯＢｔ、ベンゾトリアゾール等である。
一実施態様では、式Ｉ（Ｍ-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｗ）の二官能性リンカーは次の６の一般式：

［上式中、基-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｗは上の通りであり、ｓは１から５の範囲の整数又はゼロ（０）であり、ｔは１から５の範囲の整数である］を有する。

他の実施態様では、二官能性リンカーは、一般式Ｉａ：
Ｍ-(ＣＨ_２)_ｍ-ＣＯ-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｗ（Ｉａ）
［上式中、Ｍは、マレイミド基、ビニルスルホン等によって表されるマイケルアクセプター、ヨウ化物、ピリジルジスルフィド、メトキシ−又はエトキシカルボニルジスルフィド及びｏ−ニトロフェニルジスルフィドによって表されるチオール反応性基であり；
ｍは１から５の範囲の整数であり；
Ｚは次の式：
-ＮＨ-(ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｘ)_ｐ-ＣＨ_２-ＣＯ-；
-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＯ-；
-ＨＮ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-；
-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＯ-；
-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＯ-；又は
-ＮＨ-Ｃ_６Ｈ_４-ＣＯ-
の部分から選択され；
Ｘは-Ｏ-又は-ＣＨ_２-であり；
ｐは０又は１から２４の範囲の整数であり；
-Ｃ_６Ｈ_４-はパラ-フェニレンであり；
ｎは１から１０の範囲の整数であり、又はより好ましくは１又は２であり；
ＹはＺ又は共有結合として定義され；
ｏは０又は１から１０の範囲の整数又はより好ましくは０又は１であり；かつ
Ｗは一般的に使用される活性エステルの離脱基である］
を有する。そのような活性エステル離脱基の非限定的な例はＨＯＳｕ（Ｎ-スクシミジルオキシ）、ＨＯＡｔ、ＨＯＢｔ、ベンゾトリアゾール等である。

ここでの請求項に記載した化合物を調製する一つの方法は次の通りである：
式（Ｉ）の二官能性リンカーの活性エステルをインスリンのＡ鎖Ｃ末端のリジンのεアミノ基［Ｎ^ε］と反応させて、一般式（ＩＩ）：
Ｍ-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｉｎｓ（ＩＩ）
（上式中、Ｉｎｓは、形式的にはＡ鎖のＣ末端リジン残基に存在するアミノ基から水素原子が除去されたインスリン又はインスリンアナログを表し；
Ｍ、ｍ、Ｚ、ｎ、Ｙ及びｏはここに定義された通りである）
のインスリン誘導体を得る。

ついで、リンカーが結合したインスリン（式ＩＩのインスリン）を所望ならばアルブミンと反応させることができる。この反応はエキソビボ（つまり、インビトロ）又はインビボの何れかで実施することができる。アルブミン中のシステイン残基の遊離チオールが、インスリンに結合した離ナーのチオール反応性官能基と（例えばマイケル反応又は置換反応で）反応し、一般式（ＩＩＩ）：
Ａｌｂ-Ｍ’-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｉｎｓ（ＩＩＩ）
（上式中、Ｍ’は、アルブミンのチオール基（好ましくはＣｙｓ-３４）との反応後のチオール反応性基（Ｍ）であり、
ｐ、ｑ、ｒ、ｔ、Ｚ、ｐ、-Ｃ_６Ｈ_４-、ｎ、Ｙ及びｏはここに定義された通りであり、
Ａｌｂは、Ｃｙｓ残基、好ましくはＣｙｓ-３４残基の遊離チオール基を介して連結されたここに記載のアルブミンである）
によって表されるインスリンアルブミンコンジュゲートを形成する。

一実施態様では、Ｍ’は次の一般式：

（上式中、ｔは上で定義された通りである）
の４つの基の一つである。

符号Ｉｎｓによって示される基は一般式Ｉｎｓ-Ｈ（ここで、Ｉｎｓは上で定義された通りである）の化合物から由来する。一般式Ｉｎｓ-Ｈ（ここで、Ｉｎｓは上で定義された通りである）の化合物は、既知の化合物又は既知の化合物の調製と同様にして調製することができる化合物である。

一般式ＩＩＩ（式中、Ａｌｂ及びＩｎｓがそれぞれ上で定義された通りである）の本発明に係るインスリンアルブミンコンジュゲートの非限定的な特定の例は、この発明の一実施態様を構成する次のものである：

一実施態様では、一般式-Ｍ’-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-の部分は、一般式ＩＩＩのこの発明に係るインスリンアルブミンコンジュゲートの上記の１２６の非限定的な特定の例に存在する部分からなる群から選択される。

他の実施態様では、この発明の化合物中に存在する親インスリンは、Ａ２２位のリジンは別にして、またＡ２１アミノ酸残基にＣ末端的に連結した任意のペプチド残基は別にして、またＢ２９Ｒ及び／又はｄｅｓＢ３０変異とは別にして、次の変異の一又は複数を含む。ここで、Ａ又はＢ鎖の位置が最初に与えられ、その後に、可能なアミノ酸残基が一文字コードとして与えられる。Ａ２２位のリジンは別にして、またＡ２１アミノ酸残基にＣ末端的に連結した任意のペプチド残基は別にして、またＢ２９Ｒ及び／又はｄｅｓＢ３０変異とは別にして、一実施態様では、６の変異があり、他の実施態様では、５の変異があり、他の実施態様では、４の変異があり、他の実施態様では、３の変異があり、他の実施態様では、２の変異があり、他の実施態様では、１の変異があり、他の実施態様では、変異がない：

Ａ４：Ａ又はＱ
Ａ５：Ｌ
Ａ８：Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ又はＷ
Ａ９：Ｒ又はＬ
Ａ１４：Ｅ又はＤ
Ａ１５：Ａ又はＴ
Ａ１６：Ｍ
Ａ１７：Ｄ又はＦ
Ａ１８：Ｒ、Ｌ、又はＶ
Ａ２１：Ｇ、Ａ又はＫ

Ｂ３：Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ又はＴ
Ｂ１０：Ｄ又はＥ
Ｂ２５：Ｙ、Ｈ又はｄｅｓＢ２５
Ｂ２６：Ｑ、Ｅ、Ｓ又はｄｅｓＢ２６
Ｂ２７：Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｗ又はＹ
Ｂ２８：Ｄ又はＥ

他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ４Ａ又はＡ４Ｑ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ５Ｌ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ８Ｌ、Ａ８Ｎ、Ａ８Ｑ、Ａ８Ｅ、Ａ８Ｈ、Ａ８Ｌ、又はＡ８Ｗ変異を含む。他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ８Ｈ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ９Ｒ又はＡ９Ｌ変異を含む。他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ９Ｌ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ１４Ｅ又はＡ１４Ｄ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ１５Ａ又はＡ１５Ｔ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ１６Ｍ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ１７Ｄ又はＡ１７Ｆ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ１８Ｒ、Ａ１８Ｌ、又はＡ１８Ｖ変異を含む。他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ１８Ｌ又はＡ１８Ｖ変異を含む。

他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ２１Ｇ又はＡ２１Ａ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＢ３Ａ、Ｂ３Ｒ、Ｂ３Ｈ、Ｂ３Ｉ、Ｂ３Ｌ、Ｂ３Ｍ、Ｂ３Ｆ、Ｂ３Ｗ、Ｂ３Ｙ、Ｂ３Ｓ又はＢ３Ｔ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＢ１０Ｄ又はＢ１０Ｅ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＢ２５Ｙ、Ｂ２５Ｈ、又はｄｅｓＢ２５変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＢ２６Ｑ、Ｂ２６Ｅ、Ｂ２６Ｓ、はｄｅｓＢ２６変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＢ２７Ｈ、Ｂ２７Ｌ、Ｂ２７Ｍ、Ｂ２７Ｗ、又はＢ２７Ｙ変異を含む。他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＢ２７Ｗ又はＢ２７Ｙ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＢ２８Ｄ又はＢ２８Ｅ変異を含む。
他の好ましい実施態様では、本発明の親インスリンはＡ２１Ｑ、Ｂ１Ｑ、ｄｅｓＢ１、Ｂ３Ｑ、Ｂ３Ｓ、Ｂ３Ｔ、Ｂ１３Ｑ、又はｄｅｓＢ２７変異を含む。

この発明のインスリンアルブミンコンジュゲート中に存在し得、この発明の一態様である親インスリンアナログの非限定的な特定の例は、次のものを含む：

親インスリンはそれ自体知られている方法で調製することができる。例えば、それらは、例えばＥＰ１２４６８４５に開示されたよく知られた技術によって適切な宿主細胞中で問題の単鎖インスリンをコードするＤＮＡ配列を発現させることによって生産することｇできる。インスリンは、例えばＥＰ１６３５２９及びＥＰ２１４８２６に開示された酵素的及び化学的インビトロプロセスによって所望のインスリン分子に転換される前駆体分子として、形質転換された宿主細胞において発現される。前駆体分子は、例えばＥＰ１２４６８４５に開示されたようにして後で切断されるＮ末端伸展をもって発現されうる。本発明に適したタイプのＮ末端伸展の例は、例えば米国特許第５３９５９２２号及び欧州特許第７６５３９５号に開示されている。より詳細には、国際公開第２００６／０８２２０５号の第３７頁第３１行から第３９頁第２９行を参照することができる。

上記一般式ＩＩの化合物がヒトに投与される場合、それはヒト血清アルブミンと結合し、上記一般式ＩＩＩの化合物を形成する。よって、上記一般式ＩＩの化合物と上記一般式ＩＩＩの化合物は、例えば糖尿病の治療において、医薬として使用することができる。一般式ＩＩの化合物と一般式ＩＩＩの化合物は、集合的に、一般式ＩＶ：
Ａ-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｉｎｓ（ＩＶ）
（上式中、ＡはＭ及び集合的にＡｌｂ-Ｍ’-と同じ意味を有し、Ｚ、ｎ、Ｙ、ｏ、Ｉｎｓ、Ｍ、Ａｌｂ及びＭ’はそれぞれここに記載されている）
によって表すことができる。

薬学的組成物
この発明の化合物は、皮下的、経鼻的、経口的又は経肺的に投与されうる。
皮下投与のためには、この発明の化合物は、既知のインスリンの製剤と同じようにして製剤化される。更に、皮下投与のためには、この発明の化合物は、既知のインスリンの投与と同じようにして投与され、一般に医師はこの手順に通じている。
この発明の化合物は、循環インスリンレベルを増加させ、及び／又は循環グルコースレベルを低下させるために効果的な用量で、吸入によって投与されうる。このような投与は、糖尿病又は高血糖症のような疾患を治療するのに効果的でありうる。インスリンの効果的な用量を達成するには、この発明の化合物を、約５μｇ／ｋｇを越え約５００μｇ／ｋｇまでの吸入用量で投与することが必要である。治療的有効量は、インスリンレベル、血糖値、患者の身体状態、患者の肺の状態等を含む要因を考慮する、博識な医師により決定されうる。

この発明の化合物は、吸収の遅延化、及び／又はその全身的クリアランスの低減を達成するために、吸入により送達されうる。類似の粒径及び類似の肺沈着レベルで比較する場合、異なった吸入装置が典型的には類似の薬物動態をもたらす。
この発明の化合物は、吸入による治療剤の投与について、当該分野で知られている様々な吸入装置の何れかにより送達されうる。これらの装置には、定量噴霧式吸入器、ネブライザー、乾燥パウダー発生器、噴霧器等が含まれる。好ましくは、この化合物は、乾燥パウダー吸入器又は噴霧器により送達される。この発明の化合物を投与するための吸入装置には、幾つかの所望される特徴がある。例えば、吸入装置による送達は、有利には信頼性、再現性及び正確性がある。良好な呼吸性のためには、吸入装置は、小粒子又はエアゾール、例えば約１０μｍ未満、例えば約１−５μｍのものを送達すべきである。この発明の実施に適した商業的に入手可能な吸入装置の幾つかの特定の例は、Turbohaler^ＴＭ(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、Spiros^ＴＭ吸入器(Dura)、Inhale Therapeuticsにより市販されている装置、AERx^ＴＭ(Aradigm)、Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)、Acorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)、Ventolin(登録商標)定量噴霧式吸入器(Glaxo)、Spinhaler(登録商標)パウダー吸入器(Fisons)等である。

当業者には分かるように、この発明の化合物の処方、送達される製剤の量、及び単一用量の投与の持続時間は、使用される吸入装置のタイプに依存する。ネブライザー等の幾つかのエアゾール送達システムでは、投与の頻度及びシステムが稼働している時間長さは、主としてエアゾール中の化合物の濃度に依存するであろう。例えば、短い投与時間は、ネブライザー溶液中のより高い濃度の化合物で使用されうる。定量噴霧式吸入器等の装置は、高濃度のエアゾールを生成することができ、所望量の化合物の送達を、より短い時間で作動させることができる。パウダー吸入器等の装置は、与えられた充填量の薬剤が装置から排出されるまで、活性剤を送達する。このタイプの吸入器では、与えられたパウダー量のこの発明の化合物の量が、一回の投与で送達される用量を決定する。

吸入装置により送達される製剤におけるこの発明の化合物の粒径は、肺、好ましくは気道下部及び肺胞内中へ吸入されるインスリンの能力に関して重要である。好ましくは、この発明の化合物は、送達される化合物の少なくとも約１０％、好ましくは約１０％から約２０％、又はそれ以上が肺に沈着するように製剤化される。口呼吸するヒトにとって肺沈着の最大効率は、約２μｍから約３μｍの粒径の場合に得られることが知られている。粒径が約５μｍを越えると、肺沈着は大幅に低減する。粒径が約１μｍ以下であると、肺沈着の低下が引き起こされ、治療に有効な十分な量の粒子を送達することが困難になる。よって、吸入器により送達される化合物の粒子は、好ましくは約１０μｍ未満、より好ましくは約１μｍから約５μｍの範囲の粒径を有する。化合物の製剤化は、選択された吸入装置で所望される粒径が得られるように選択される。

乾燥パウダーとしての投与の場合、有利には、この発明の化合物は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍから約５μｍの粒径を有する微粒形態に調製される。好ましい粒径は、患者の肺の肺胞に送達するのに効果的なものである。好ましくは、乾燥パウダーは、大半の粒子が所望の範囲のサイズを有するように製造された粒子から主としてなる。有利には、乾燥パウダーの少なくとも約５０％が、約１０μｍ未満の直径を有する粒子から作製される。このような製剤は、この発明の化合物と他の所望の成分を含む溶液を、噴霧乾燥、製粉、又は臨界点濃縮することにより達成可能である。また、本発明に有用な粒子を作製するのに適切な他の方法も、当該分野で知られている。

粒子は、通常、容器中で乾燥パウダー製剤から分離され、ついで運搬気流を介して患者の肺に輸送される。典型的には、今の乾燥パウダー吸入器では、固形物を破壊する力は、患者の吸入だけでもたらされる。他のタイプの吸入器では、患者の吸入により生じる気流が、粒子を凝集させない推進モーターを駆動する。

乾燥パウダー吸入器からの投与のためのこの発明の化合物の製剤は、典型的には、誘導体を含む微細に分割された乾燥パウダーを含むが、パウダーは、増量剤、担体、賦形剤、他の添加剤等をまた更に含みうる。例えば特定のパウダー吸入器からの送達に必要とされるパウダーを希釈するため、製剤のプロセシングを容易にするため、製剤に有利なパウダー性を付与するため、吸入装置からのパウダーの分散を容易にするため、製剤を安定させるため（例えば、酸化防止剤又はバッファー）、製剤に味を付与するため等に、添加剤を化合物の乾燥パウダー製剤に含有させることができる。有利には、添加剤は患者の気道に悪影響を与えないものである。化合物は分子レベルで添加剤と混合させることができ、又は固体製剤は添加剤の粒子と混合されて又はそれで被覆された化合物の粒子を含みうる。典型的な添加剤には、単糖類、二糖類、及び多糖類；糖アルコール類及び他のポリオール類、例えばラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール(lactitol)、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、デンプン、又はそれらの組合せ；界面活性剤、例えばソルビトール類、ジホスファチジルコリン、又はレシチン等が含まれる。典型的には、添加剤、例えば増量剤は、上述の目的に対して有効な量、しばしば製剤の重量に対して約５０％から約９０％の量で存在している。インスリンアナログタンパク質等のタンパク質の製剤について、当該分野で知られている更なる薬剤もまた製剤に含めることができる。

この発明の化合物を含むスプレーは、化合物の懸濁液又は溶液を加圧下でノズルを強制的に通過させることにより、生成させることができる。ノズルサイズ及び構造、適用圧力、及び液体供給速度は、所望される排出量及び粒径が達成されるように選択することができる。例えば、キャピラリー又はノズルフィード部に接続された電場により、エレクトロスプレーを製造することができる。有利には、噴霧器により送達されるインスリンコンジュゲートの粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍから約５μｍの範囲の粒径を有する。

噴霧器と共に使用するのに適したこの発明の化合物の製剤は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり約１ｍｇから約５００ｍｇの濃度で水溶液中に化合物を含む。選択される化合物及び医師に知られている他の要因に応じて、溶液１ｍｌ当たりの化合物の上限はより低く、例えば４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１２０、１００又は５０ｍｇ以下でありうる。製剤は、賦形剤、バッファー、等張剤、保存料、界面活性剤、好ましくは亜鉛等の薬剤を含みうる。また製剤は、賦形剤、又は化合物の安定化のための薬剤、例えばバッファー、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物をまた含みうる。インスリンコンジュゲートの製剤化に有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。化合物の製剤化に有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース、シクロデキストリン等が含まれる。また化合物の製剤は、エアゾールの形成において溶液の噴霧化により生じるインスリンコンジュゲートの表面誘起凝集を低減又は防止可能な界面活性剤を更に含みうる。様々な一般的な界面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル類及びアルコール類、及びポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル類を使用することができる。量は、一般には、製剤の約０．００１から約４重量％の範囲である。

この発明の化合物を含む薬学的組成物は、またこのような治療が必要な患者に非経口的に投与されうる。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内又は静脈内注射により実施されうる。あるいは、非経口投与は、輸液ポンプにより実施されうる。

この発明の化合物の注射用組成物は、所望される最終生成物が得られるように、適切に成分を溶解させ、混合することを含む製薬工業の一般的な技術を使用して調製することができる。よって、一手順に従えば、化合物は、調製されるべき組成物の最終容量よりも幾分少ない量の水に溶解される。必要に応じて、亜鉛、等張剤、保存料及び／又はバッファーが添加され、必要ならば、塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム水溶液等の塩基を使用して、溶液のｐＨ値が調節される。最後に、溶液の容量は、所望の濃度の成分が得られるように水で調節される。

この発明の更なる実施態様では、バッファーは酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、及び他の有機酸又はそれらの塩又は混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーの各一がこの発明の別の実施態様を構成する。

この発明の更なる実施態様では、製剤は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(３-(４-クロロフェノキシ)-１,２-プロパンジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択されうる薬学的に許容可能な保存料を更に含有する。この発明の更なる実施態様では、保存料は約０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明の更なる実施態様では、保存料は約０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明の更なる実施態様では、保存料は約５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明の更なる実施態様では、保存料は約１０ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の保存料の各一が、この発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。

この発明の更なる実施態様では、製剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン又はスレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、又は１,３-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択されうる等張剤を更に含有する。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４−Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されうる。糖又は糖アルコールが液状調製物に可溶性であり、この発明の方法を使用して達成される安定化効果に悪影響を与えない限り、使用される量に決まった限定はない。一実施態様では、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌから約１５０ｍｇ／ｍｌである。この発明の更なる実施態様では、等張剤は約１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明の更なる実施態様では、等張剤は約１ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明の更なる実施態様では、等張剤は約８ｍｇ／ｍｌから２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明の更なる実施態様では、等張剤は約２５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の等張剤の各一がこの発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物に等張剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。

典型的な等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ジメチルスルホン及びグリセロールであり、典型的な保存料は、フェノール、ｍ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル及びベンジルアルコールである。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ(４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸)及びリン酸ナトリウムである。
この発明の化合物の鼻投与用の組成物は、例えば、欧州特許第２７２０９７号に記載されているようにして調製されうる。

この発明の化合物を含む組成物は、インスリンに対して敏感な状態の治療に使用することができる。よって、それらは、１型糖尿病、２型糖尿病及び高血糖症で、例えば重症を負ったヒト及び大手術を受けたヒトに時折見られるようなものの治療に使用することができる。任意の患者に対する最適な用量レベルは、用いられる特定のインスリン誘導体の有効性、年齢、体重、身体活動、患者の食習慣、他の薬剤との可能な組合せ、及び治療される状態の重篤度を含む様々な要因に依存する。この発明の化合物の毎日の投与量は、既知のインスリン組成物と同様にして、当業者により、それぞれの個々の患者に対して決定されることが推奨される。

この発明の好ましい特徴
ここでの説明をまとめ、補充するため、この発明の特徴は次の通りである：
１．一般式（ＩＩＩ）
Ａｌｂ-Ｍ’-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｉｎｓ（ＩＩＩ）
［上式中、
Ｉｎｓは、Ａ鎖のＣ末端リジン残基中に存在するアミノ基から形式的に水素原子が除去されたここで定義されたインスリン又はインスリンアナログを表し；
Ｍ’はＡｌｂ（アルブミン）のチオール基との反応後のＭと命名されたチオール反応性基を表し、
Ｍは、マレイミド基、ビニルスルホン基、ビニルスルホン等によって表されるマイケルアクセプター、ヨウ化物、ピリジルジスルフィド、メトキシ-又はエトキシカルボニルジスルフィド及びｏ-ニトロフェニルジスルフィドによって表されるチオール反応性基を表し；
Ｚは共有結合であるか又は次の式：
-ＮＨ-(ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ)_ｐ-ＣＨ_２-ＣＯ-；
-ＮＨ-(ＣＨ_２)_ｑ-ＣＨ_２-ＣＯ-；
-ＮＨ-(ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ)_ｒ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＯ-；
-ＨＮ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＯ-；
-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＯ-；又は
-ＮＨ-Ｃ_６Ｈ_４-ＣＯ-
の一つの部分を表し；
ｐは０（ゼロ）又は１から２４の範囲の整数であり；
ｑは０（ゼロ）又は１から２４の範囲の整数であり；
ｒは０（ゼロ）又は１から２４の範囲の整数であり；
-Ｃ_６Ｈ_４-はパラ-フェニレンであり；
ｎは１から１０の範囲の整数か又はより好ましくは１又は２を表し；
ＹはＺに対して与えた意味の一つを有し；
ｏは０から１０又はより好ましくは０、１又は２であり；かつ
Ａｌｂはここで定義されたアルブミンを表す］の化合物。
２．一般式（ＩＩＩａ）：Ａｌｂ-Ｍ’-(ＣＨ_２）_ｍ-ＣＯ-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-ＣＯ-Ｉｎｓ（ＩＩＩａ）［上式中、Ｍ’はアルブミンのチオール基との反応後のチオール反応性基（Ｍ）であり、ここで、Ｍはマレイミド基、ビニルスルホン等によって表されるマイケルアクセプター、ヨウ化物、ピリジルジスルフィド、メトキシ-又はエトキシカルボニルジスルフィド及びｏ-ニトロフェニルジスルフィドによって表されるチオール反応性基であり；ｍは１から５の範囲の整数であり；Ｚは次の６つの部分：-ＮＨ-(ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｘ）_ｐ-ＣＨ_２-ＣＯ-；-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＯ-；-ＨＮ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-；-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＯ-；-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＯ-；及び-ＮＨ-Ｃ_６Ｈ_４-ＣＯ-から選択され；Ｘは-Ｏ-又は-ＣＨ_２-であり；ｐは０又は１から２４の範囲の整数であり；-Ｃ_６Ｈ_４-はパラ-フェニレンであり；ｎは１から１０の範囲の整数又はより好ましくは１又は２であり；ＹはＺ又は共有結合として定義され；ｏは０又は１から１０の範囲の整数又はより好ましくは０又は１であり；そしてＡｌｂはここで定義されたアルブミンを表し、好ましくはＣｙｓ残基の遊離チオール基を介して連結されている］の化合物。
３．Ｚが次の式：-ＮＨ-(ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｘ)_ｐ-ＣＨ_２-ＣＯ-；-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＯ-；-ＨＮ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ−；-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＯ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＯ-；-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＯ-；又は-ＮＨ-Ｃ_６Ｈ_４-ＣＯ-（ここで、Ｘは-Ｏ-又は-ＣＨ_２−である）の次の部分から選択され；ｍは１から５の範囲の整数であり、Ａｌｂ、Ｍ’、ｎ、Ｙ、ｏ、Ｗ及びＩｎｓはそれぞれ第１項に定義された通りである一般式ＩＩＩ又はＩＩＩａの化合物。
４．Ｉｎｓが、Ａ鎖のＣ末端にリジン残基を有し、場合によってはペプチド残基のＣ末端中のリジン残基又はＡ２１アミノ酸残基にＣ末端的に連結されたリジン残基を有するインスリンアナログである上記項の何れか一項に記載の化合物。
５．Ｉｎｓが、Ａ鎖のＣ末端にリジン残基を有し、場合によってはＡ鎖Ｃ末端のアミノ酸伸展のＣ末端中のリジン残基を有するインスリンアナログである、上記項に記載の化合物。
６．ＩｎｓのＡ２２位のアミノ酸残基がＣ末端アミノ酸残基であり、Ａ２２アミノ酸残基がＫ（Ｌｙｓ）である上記項の何れか一項に記載の化合物。
７．ＩｎｓのＡ２２位のアミノ酸残基がＣ末端アミノ酸残基であり、Ａ２２アミノ酸残基がＫ（Ｌｙｓ）であり、Ａ１８がＬ（Ｌｅｕ）である上記項の何れか一項に記載の化合物。
８．ＩｎｓのＡ２３位のアミノ酸残基がＣ末端アミノ酸残基であり、Ａ２３アミノ酸残基がＫ（Ｌｙｓ）である上記項の何れか一項に記載の化合物。
９．Ａ２２位のアミノ酸残基がＧである、可能な限度において先行する項の何れか一項に記載の化合物。
１０．Ｂ２９位のアミノ酸残基がＲ（Ａｒｇ）である先行する項に記載の化合物。
１１．Ｂ３０位のアミノ酸残基が欠失されている先行する項に記載の化合物。
１２．ＩｎｓがＡ２２Ｋ，Ｂ２９Ｒ，ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ２２Ｇ，Ａ２３Ｋ，Ｂ２９Ｒ，ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ２２Ｇ，Ａ２３Ｇ，Ａ２４Ｋ，Ｂ２９Ｒ，ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ２２Ｇ，Ａ２３Ｇ，Ａ２４Ｇ，Ａ２５Ｋ，Ｂ２９Ｒ，ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；又はＡ２１Ｑ，Ａ２２−３９Ｇ，Ａ４０Ｋ，Ｂ２９Ｒ，ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである、可能な限度において上記項の何れか一項に記載の化合物。
１３．ＩｎｓのＡ２１位のアミノ酸残基がＣ末端アミノ酸残基であり、Ａ２１アミノ酸残基がＫ（Ｌｙｓ）である上記項に記載の化合物。
１４．ＩｎｓのＡ１８位のアミノ酸残基がＬ（Ｌｅｕ）である上記項に記載の化合物。
１５．ＩｎｓのＡ２１位のアミノ酸残基がＣ末端アミノ酸残基であり、Ａ２１アミノ酸残基がＫ（Ｌｙｓ）であり、Ａ１８がＬ（Ｌｅｕ）である上記項に記載のインスリンアルブミンコンジュゲート。
１６．ＩｎｓのＡ５位のアミノ酸残基がＬ（Ｌｅｕ）である上記項の何れか一項に記載の化合物。
１７．Ｍ’が

である上記項の何れか一項に記載のインスリンアルブミンコンジュゲート。
１８．ｍが２である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載の化合物。
１９．ｔが２である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載の化合物。
２０．Ｍ’が-ＣＨ_２-ＣＯ-である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載のインスリンアルブミンコンジュゲート。
２１．Ｚが部分-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＯ-である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載の化合物。
２２．Ｚが部分-ＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＣＯ-である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載の化合物。
２３．ｎが１である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載の化合物。
２４．Ｙが共有結合である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載の化合物。
２５．ＹがＮＨ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＯ-である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載の化合物。
２６．ｏが２である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載の化合物。
２７．Ａｌｂがヒト血清アルブミン又はアルバゲン(Ｎ末端残基（Ａｓｐ）が欠失したヒト血清アルブミン）である、可能な限度での上記項の何れか一項に記載の化合物。
２８．一般式ＩＩ：
Ｍ-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｉｎｓ（ＩＩ）
（上式中、Ｍ、Ｚ、ｎ、Ｙ、ｏ及びＩｎｓはそれぞれここで定義された通りであり、特に上項で定義された通りである）の化合物。
２９．この明細書、例えば特定の実施例、特に以下に記載する実施例１以下の何れかに特に記載されている化合物の何れか一である、可能な度合いでの先行する生成物の項のいずれか１項の化合物。
３０．糖尿病を治療する薬学的組成物の調製のための、可能な度合いでの先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
３１．糖尿病を治療するために皮下投与可能な薬学的組成物の調製のための、可能な度合いでの先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
３２．糖尿病を治療するために皮下投与可能で、長期間作用する効果をもたらす薬学的組成物の調製のための、可能な度合いでの先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
３３．糖尿病を治療するために肺投与可能な薬学的組成物の調製のための、可能な度合いでの先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
３４．糖尿病を治療するために肺投与可能で、長時間の作用効果をもたらす薬学的組成物の調製のための、可能な度合いでの先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
３５．糖尿病を治療するために肺投与可能なパウダー状薬学的組成物の調製のための、可能な度合いでの先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
３６．糖尿病を治療するために肺投与可能な液状薬学的組成物の調製のための、可能な度合いでの先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
３７．糖尿病を治療するために経口投与可能な薬学的組成物の調製のための、可能な度合いでの先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
３８．先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、糖尿病の治療方法。
３９．ヒトインスリン、並びに先行する項の何れか一項の化合物を含有する組成物。
４０．インスリンアスパルト、並びに先行する項の何れか一項の化合物を含有する組成物。
４１．インスリンリスプロ、並びに先行する項の何れか一項の化合物を含有する組成物。
４２．インスリングルリシン、並びに先行する項の何れか一項の化合物を含む組成物。
４３．インスリンアナログに関連する先行する項の何れか一項のインスリンアナログの生物活性量と薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物。
４４．インスリンアナログに関連する上述した項の何れか一項のインスリンアナログ、又は上述した項の何れか一項の薬学的組成物を患者に投与することを含む、患者の高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、Ｘ症候群、又は脂質代謝異常を治療、予防又は緩和する方法。
４５．高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、Ｘ症候群、又は脂質代謝異常を治療又は予防する薬学的製剤を調製するための、インスリンアナログに関する上述した項の何れか一項のインスリンアナログの治療的有効量の使用。
４６．糖尿病の処置方法であって、該方法が、先行する生成物の項の何れか一項のインスリンアルブミンコンジュゲートの治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。

場合によっては、一又は複数の以下の請求項と、ここに記載の一又は複数の項とを組合せることで、更なる項が得られ、本発明は該項と請求項の全ての可能な組合せに関する。
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりその全内容がここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決してこの発明を限定するものと解すべきではない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単にこの発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。文献のここでの記載は、それらが従来技術を構成することを自認するものではない。
ここで、「含有する」なる単語は、広義には「含む」、「有する」又は「包含する」を意味すると解釈される(ＥＰＯガイドラインＣ４.１３)。
この発明は、適用される法律に容認される場合、ここに添付された特許請求の範囲に記載された主題事項の全ての変更及び均等物を含む。

次の実施例は例証する方法を提供するものであって、限定するものではない。
一般的方法
ＬＣＭＳ法
Waters Micromass ZQ 質量分析計を使用し、Waters Alliance HT HPLCシステムからの溶出後に、試料の質量を同定した。
溶出液：
Ａ：水中０．１％のトリフルオロ酢酸
Ｂ：アセトニトリル中０．１％のトリフルオロ酢酸
カラム：Phenomenex, Jupiter C4 ５０×４．６０ｍｍ、内径５μｍ
勾配：７．５分にわたって１０％−９０％Ｂ、１．０ｍｌ／分

実施例１
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε８-{３-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}オクタノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

工程１：Ａ２２Ｋ(Ｎ^ε-８-[３-(２,５-ジオキソ-２,５-ジヒドロピロール-１-イル)プロピオニルアミノ]オクタノイル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Ａ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（国際公開第２００７０９６４３１号)(１．００ｇ)をＤＭＳＯ(８０ｍｌ)及びトリエチルアミン(０．５０ｍｌ)に溶解させた。ＴＨＦ(８．３５ｍｌ)に溶解させた８-[３-(２,５-ジオキソ-２,５-ジヒドロピロール-１-イル)プロピオニルアミノ]オクタン酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(８４ｍｇ)を添加した。１６５分後、数滴のＴＦＡ、Ａ-及びＢ-バッファー(以下参照)を添加し、ｐＨ５−６で１５０ｍｌを得た。
分取ＨＰＬＣによる精製：Ｃ１８、３ｃｍカラム(Gemini)、Ａ-バッファー：MiliQ水に０．１％のＴＦＡ、Ｂ-バッファー：ＡｃＣＮに０．１％のＴＦＡ、流量：２０ｍｌ／分、勾配：６０分にわたって２０−４０％のＢ。
収量：１１７ｍｇ、ＭＡＬＤＩ：６１５２．８９。

工程２：Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε８-[３-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ]オクタノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
アルバゲン(New Century Pharmaceuticals, Inc.による特注の２００ｍｇのバイアル、水から凍結乾燥、安定していない組換え体)を、反応バッファー(０．１５ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ６．５、２％のマンニトール、５ｍｌ)に溶解させた。１０％の酢酸(０．５０ｍｌ)にＡ２２Ｋ-(Ｎ^ε-８-[３-(２,５-ジオキソ-２,５-ジヒドロピロール-１-イル)プロピオニルアミノ]オクタノイル)Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(１８．５ｍｇ)が入った溶液を、沈殿下で添加した。１ＮのＮａＯＨを用い、ｐＨを７．０に調節し、ほぼ透明な反応混合物を得た。混合物を室温で４−６時間、ゆっくりと攪拌した。硫酸アンモニウム(１ｇ)を添加し、Millexの０．２２μｍフィルターを通して、混合物を濾過した。HIC-ISO(２５ｍｌ)カラムを使用し、Akta Purifierにおいて精製を実施した。Ａ-バッファー、０．０５ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７、２％のマンニトール：Ｂ-バッファー、０．０５ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７、２％のマンニトール。
勾配：２０ＣＶに対して０−１００％のＢ。流量１０ｍｌ／分。コンジュゲートを含有するフラクションをプール化し、Vivaspin 20, 30000 MWCOチューブを使用し、３０００ｇでの遠心分離により濃縮した。HiPrep 26/10カラムとＢ-バッファーを使用し、濃縮した生成物を脱塩した。Vivaspin 20, 30000 MWCOチューブを使用し、３０００ｇでの限外濾過により、収集したフラクションをもう一度濃縮した。冷凍庫において、生成物をバッファーに保存した。吸光係数：４１４７９を使用し、吸光測定により、濃度を決定した。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：１９６０．０(Ｍ＋３７)、組合せ：７２４７８。

８-[３-(２,５-ジオキソ-２,５-ジヒドロピロール-１-イル)プロピオニルアミノ]オクタン酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル：
工程１：３-(２,５-ジオキソ-２,５-ジヒドロピロール-１-イル)プロピオン酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル：
マレイミド(Malimido)プロピオン酸(５００ｍｇ)を無水ＴＨＦ(１５ｍｌ)に溶解させた。ＴＳＴＵ(７９０ｍｇ)及びＤＩＰＥＡ(０．６２ｍｌ)を添加した。混合物を、室温、窒素下にて一晩攪拌した。黄色の粘度のある懸濁液が濃縮された。残留物をＤＣＭに溶解させ、０．１ＮのＨＣｌ(２×)及びブライン(１×)で抽出した。有機相を乾燥させ(Ｎａ_２ＳＯ_４)、濃縮し、白色の固形物を得た。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：２６７．２６(Ｍ＋１)。

工程２：８-[３-(２,５-ジオキソ-２,５-ジヒドロピロール-１-イル)プロピオニルアミノ]オクタン酸
３-(２,５-ジオキソ-２,５-ジヒドロピロール-１-イル)プロピオン酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(７８７ｍｇ、粗物質)をＤＭＦ(１５ｍｌ)に溶解させた。８-アミノオクタン酸(３５０ｍｇ)及びＤＩＰＥＡ(０．４５ｍｌ)を添加した。混合物を、室温、窒素下にて一晩攪拌した。混合物を濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解させ、０．１ＮのＨＣｌ(２×)で抽出した。相分離は容易ではなかった。有機相をブライン(２×)で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ_２ＳＯ_４)、濃縮し、白色の固形物を得た。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：３１１．３４(Ｍ＋１)。

工程３：８-[３-(２,５-ジオキソ-２,５-ジヒドロピロール-１-イル)プロピオニルアミノ]オクタン酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル
無水ＴＨＦ(１５ｍｌ)に８-[３-(２,５-ジオキソ-２,５-ジヒドロピロール-１-イル)プロピオニルアミノ]オクタン酸(９１７ｍｇ、粗物質)が入った溶液に、ＴＳＴＵ(１．０７ｍｇ)及びＤＩＰＥＡ(０．６５ｍｌ)を添加した。混合物を窒素下にて一晩攪拌した。混合物を濃縮した。残留物にＥｔＯＡｃを添加し、沈殿物を濾過した。濾液を０．１ＮのＨＣｌ(２×)及びブライン(１×)で抽出し、乾燥させ(Ｎａ_２ＳＯ_４)、濃縮し、オフ-ホワイト色の固形物を得た。全体の収量：３７％(４４４ｍｇ)。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：４０８．３９(Ｍ＋１)。

実施例２
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１２-{２-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イルアセチルアミノ)}ドデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

工程１：Ａ２２Ｋ(Ｎ^ε-１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカノイル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
０．１Ｍの炭酸ナトリウム(２０ｍｌ)及びエタノール(１０ｍｌ)、ｐＨ１０．６にＡ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(国際公開第2007096431号)(１．００ｇ)が入った溶液に、ＴＨＦ(０．５ｍｌ)に１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカン酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(９９ｍｇ)が入った溶液を添加した。反応混合物のｐＨを１０．６に保持した。３０分、ゆっくりと攪拌した後、水(５０ｍｌ)を添加し、１ＮのＨＣｌを用いて、ｐＨを５．５に調節し、沈殿物を得た。生成物を３０００ｇで１０分、沈降させた。上清を廃棄し、固体状生成物を分取ＨＰＬＣ：Ｃ１８、３ｃｍカラム(Gemini)、Ａ-バッファー：MiliQ水に０．１％のＴＦＡ、Ｂ-バッファー：ＡｃＣＮに０．１％のＴＦＡ、流量：２５ｍｌ／分、勾配：４５分にわたって２５−６０％のＢで精製した。
収量：３３０ｍｇ、ＭＡＬＤＩ：６２２８．２１。

工程２：Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１２{[２-アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イルアセチルアミノ}ドデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
アルバゲン(New Century Pharmaceuticals, Inc.による特注の２００ｍｇのバイアル、水から凍結乾燥、安定していない組換え体)を、反応バッファー(０．１５ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０、２％のマンニトール、３ｍｌ)に溶解させた。反応バッファー／アセトニトリル１：１(２．０ｍｌ)にＡ２２Ｋ(Ｎ^ε-１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカノイル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(２０ｍｇ)が入った溶液を添加し、溶液を得た。ｐＨは７．３であった。混合物を、室温、暗所で一晩、ゆっくりと攪拌した。硫酸アンモニウム(１ｇ)を添加し、Millexの０．２２μｍフィルターを通して、混合物を濾過した。実施例１に記載したようにして精製を実施した。冷凍庫において、生成物をＢ-バッファーに保存した。吸光係数：４１４７９を使用し、吸光測定により、濃度を決定した。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：１５４２．２９(Ｍ＋４７)、組合せ：７２４３０。

１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカン酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル
工程１：１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカン酸
ヨード酢酸(１．００ｇ)をジクロロメタンに溶解させ、暗所で保持した。ＴＳＴＵ(１．６２ｇ)及びＤＩＰＥＡ(１．０３ｍｌ)を添加した。４５分攪拌した後、ＤＩＰＥＡ(１．０３ｍｌ)とＮＭＰ(１０ｍｌ)に１２-アミノドデカン酸(１．１４ｇ)が入った懸濁液を添加した。４時間攪拌した後、０．５ＮのＨＣｌ(３００ｍｌ)に混合物を注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機相を０．１ＮのＨＣｌで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮し、油を得た。ジエチルエーテルと酢酸エチルの混合物に残留物を溶解させ、水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮し、固形物を得た。この固形物をジエチルエーテルにおいて粉砕し、濾過し、パウダーを得た。収量：１．０５ｇ、５０％。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：３８４．２(Ｍ＋１)。

工程２：１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカン酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル
ＴＨＦ(１０ｍｌ)に１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカン酸(４６０ｍｇ)が入った溶液に、ＴＳＴＵ(４１５ｍｇ)及びＤＩＰＥＡ(０．３１５ｍｌ)を添加した。室温で２時間攪拌した後、混合物を０．５ＮのＨＣｌ(２００ｍｌ)に注ぎ、酢酸エチル(２×２００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を０．１ＮのＨＣｌ及びブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮した。残留物をさらなる精製をすることなく使用した。収量：９９％(５７５ｍｇ)。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：４８１．２(Ｍ＋１)。

実施例３
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-{２-[２-(２-{２-[２-(１２-{２-アルバゲン-Ｃｙｓ-３４-イルアセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

工程１：Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-{２-[２-(２-{２-[２-(１２-{２-ヨードアセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)-エトキシ]エトキシ}アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
０．１Ｍの炭酸ナトリウム(１６ｍｌ)、ｐＨ１０．５にＡ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(国際公開第２００７０９６４３１号)(０．８００ｇ)が入った溶液に、アセトニトリル／エタノール１：１(１０ｍｌ)に(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)酢酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(１０５ｍｇ)が入った溶液を添加した。反応混合物のｐＨを１０．６に保持した。３０分、ゆっくりと攪拌した後、水(５０ｍｌ)を添加し、１ＮのＨＣｌを用いてｐＨを５．５に調節し、沈殿物を得た。生成物を３０００ｇで１０分、沈降させた。上清を廃棄し、固体状生成物を分取ＨＰＬＣ：Ｃ１８、３ｃｍカラム(Gemini)、Ａ-バッファー：MiliQ水に０．１％のＴＦＡ、Ｂ-バッファー：ＡｃＣＮに０．１％のＴＦＡ、流量：２０ｍｌ／分、勾配：６０分にわたって５−８０％のＢにより精製した。
収量：２８０ｍｇ、ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：１６３０．２３(Ｍ＋４)。

工程２：Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-{２-[２-(２-{２-[２-(１２-{２-アルバゲン-Ｃｙｓ-３４-イルアセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
アルバゲン(New Century Pharmaceuticals, Inc.による特注の２００ｍｇのバイアル、水から凍結乾燥、安定していない組換え体)を、反応バッファー(０．１５ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０、２％のマンニトール、３ｍｌ)に溶解させた。反応バッファー／アセトニトリル１：１(２．０ｍｌ)にＡ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１２-({２-ヨードアセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(２０ｍｇ)が入った溶液を添加し、溶液を得た。ｐＨは７．３であった。混合物を、室温、暗所で一晩、ゆっくりと攪拌した。硫酸アンモニウム(１ｇ)を添加し、Millexの０．２２μｍフィルターを通して、混合物を濾過した。実施例１に記載したようにして精製を実施した。冷凍庫において、生成物をＢ-バッファーに保存した。吸光係数：４１４７９を使用し、吸光測定により、濃度を決定した。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：１７７４．７１(Ｍ＋３１)、１７３２(Ｍ＋３２)、１５４８(Ｍ＋４７)。

(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)酢酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イル
工程１：(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}-エトキシ)酢酸
０．１Ｍの炭酸ナトリウムに[２-(２-{２-[２-(２-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]酢酸(１９４ｍｇ)が入った溶液に、アセトニトリル(５ｍｌ)、続いてアセトニトリル(６ｍｌ)に１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカン酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(２６０ｍｇ)が入った溶液を添加した。４５分攪拌した後、１ＮのＨＣｌを用いて、ｐＨを４に調節し、混合物を分取ＨＰＬＣ：Ｃ１８、３ｃｍカラム(Gemini)、Ａ-バッファー：MiliQ水に０．１％のＴＦＡ、Ｂ-バッファー：ＡｃＣＮに０．１％のＴＦＡ、流量：２０ｍｌ／分、勾配：３０分にわたって１０−８０％のＢ、により精製した。生成物を含有するフラクションをプールし、濃縮し、４９％の収率(１８０ｍ)で表題の化合物を得た。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：６７４．３(Ｍ＋１)。

工程２：(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}-エトキシ)酢酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イル
エタノール(１．５ｍｌ)に(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]-エトキシ}エトキシ)酢酸(５０ｍｇ)が入った溶液に、ＴＳＴＵ(２４ｍｇ)及びＤＩＰＥＡ(０．０２０ｍｌ)を添加した。室温で一晩攪拌した後、精密検査及び精製をすることなく、インスリン誘導体のアシル化に、混合物を直接使用した。

実施例４
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-{２-[２-(２-{２-[２-(１２-{２-アルバゲン-Ｃｙｓ-３４-イル-アセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}-アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

工程１：Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-{２-[２-(２-{２-[２-(１２-{２-ヨードアセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
０．１Ｍの炭酸ナトリウム(４ｍｌ)とエタノール(３ｍｌ)、ｐＨ１０．７に、Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(０．３００ｇ)が入った溶液に、エタノール(１．５ｍｌ)に(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-ヨードアセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)酢酸２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(５５ｍｇ)が入った溶液を添加した。反応混合物のｐＨを１０．７に保持した。６０分、ゆっくりと攪拌した後、水(４０ｍｌ)を添加し、１ＮのＨＣｌを用いてｐＨを５．５に調節し、沈殿物を得た。生成物を３０００ｇで１０分、沈降させた。上清を廃棄し、固体状生成物を分取ＨＰＬＣ：Ｃ１８、３ｃｍカラム(Gemini)、Ａ-バッファー：MiliQ水に０．１％のＴＦＡ、Ｂ-バッファー：ＡｃＣＮに０．１％のＴＦＡ、流量：２０ｍｌ／分、勾配：４５分にわたって１０−７０％のＢにより精製した。
収量：７２ｍｇ、ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：１３０４．６(Ｍ＋５)。

工程２：Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-{２-[２-(２-{２-[２-(１２-{２-アルバゲン-Ｃｙｓ-３４-イル-アセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
アルバゲン(New Century Pharmaceuticals, Inc.による特注の２００ｍｇのバイアル、水から凍結乾燥、安定していない組換え体)を、反応バッファー(０．１５ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０、２％のマンニトール、３ｍｌ)に溶解させた。反応バッファー／アセトニトリル１：１(２．０ｍｌ)にＡ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１２-({２-ヨードアセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(１８．３ｍｇ)が入った溶液を添加し、溶液を得た。１ＮのＮａＯＨを用い、ｐＨを７．４に上昇させた。混合物を、室温、暗所で一晩、ゆっくりと攪拌した。硫酸アンモニウム(１ｇ)を添加し、Millexの０．２２μｍフィルターを通して、混合物を濾過した。実施例１に記載したようにして精製を実施した。冷凍庫において、生成物をＢ-バッファーに保存した。吸光係数：４１４７９を使用し、吸光測定により、濃度を決定した。ＬＣ-ＭＳ、Ｍ／ｚ：７２７１６．１８。

次の実施例における本発明のアルブミン-インスリンコンジュゲートを、同様にして調製してよい。
実施例５
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１２-{２-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}ドデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例６
Ａ５Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１２-{２-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}ドデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例７
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１２-{２-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}ドデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例８
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１２-{２-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}ドデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例９
Ａ５Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１２-{２-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イルアセチルアミノ)}ドデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１０
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε８-{３-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}オクタノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１１
Ａ５Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε８-{３-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}オクタノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１２
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε８-{３-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}オクタノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１３
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε８-{３-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}オクタノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１４
Ａ５Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε８-{３-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}オクタノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１５
Ａ５Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-{アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１６
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-{ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１７
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-{ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１８
Ａ５Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１２-(２-{ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)ドデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例１９
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１０-{２-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}デカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２０
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１０-{２-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}デカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２１
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１０-{２-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}デカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２２
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１０-{２-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}デカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２３
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１０-{３-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}デカノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２４
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１０-{３-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}デカノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２５
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１０-{３-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}デカノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２６
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１０-{３-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}デカノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２７
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１６-{２-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}ヘキサデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２８
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１６-{２-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}ヘキサデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例２９
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１６-{２-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}ヘキサデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３０
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１６-{２-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル)アセチルアミノ}ヘキサデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３１
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１６-{３-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}ヘキサデカノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３２
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１６-{３-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}ヘキサデカノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３３
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１６-{３-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}ヘキサデカノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３４
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１６-{３-(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}ヘキサデカノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３５
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１０-(２-{アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３６
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１０-(２-{アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)デカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３７
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１０-(２-{ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３８
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１０-(２-{ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例３９
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１６-(２-{アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)ヘキサデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４０
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１６-(２-{アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)ヘキサデカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４１
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１６-(２-{ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)ヘキサデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４２
Ａ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１６-(２-{ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル}アセチルアミノ)ヘキサデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル])Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４３
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１０-(３-{(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)２,５-ジオキソピロリジン-１-イル}プロピオニルアミノ)デカノイルアミノ)]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４４
１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１０-(３-{(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)２,５-ジオキソピロリジン-１-イル}プロピオニルアミノ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４５
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１０-(３-{(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル)２,５-ジオキソピロリジン-１-イル}プロピオニルアミノ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４６
１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１０-(３-{(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３５-イル)２,５-ジオキソピロリジン-１-イル}プロピオニルアミノ)デカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４７
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１６-(３-{(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)２,５-ジオキソピロリジン-１-イル}プロピオニルアミノ})ヘキサデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４８
１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１６-(３-{(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル)２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}ヘキサデカノイルアミノ)エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例４９
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１６-(３-{(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル}プロピオニルアミノ)ヘキサデカノイルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例５０
１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[１６-(３-{(ヒト血清アルブミン-Ｃｙｓ３４)イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル}プロピオニルアミノ]ヘキサデカノイルアミノ)エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン

実施例５１
ＺＤＦラットへの実施例１のインスリンアルバゲンコンジュゲートの皮下投与
１６匹のオス１６週で食餌を与えられたＺＤＦラット(約４００ｇ)を、２つのグループに分けた。実験の開始時に食物を取り除いた。一方のグループにはビヒクルを投与し、他方のグループには、ｔ＝０時に、実施例１のインスリンコンジュゲートを８７．３ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。ｔ＝３０-、６０-、９０-、１２０-、１８０-及び２４０分、及びｔ＝５-、６-、７-、８-、９-及び１０時間に、血液試料を尾静脈から取り出した。

実施例５２
正常なマウスにおけるインスリン感受性組織でのインスリン刺激性細胞内シグナル伝達
２１匹のオスで空腹ではないＮＭＲＩマウス(３０-４０ｇ)を：１つの基本グループ、３つのヒトインスリン(ＨＩ)処置用グループ、及び３つの実施例１のインスリンアルブミンコンジュゲート処置用グループの、７つのグループに分けた。実験の開始時に食物を取り除いた。グルコース測定用の血液試料を、投与前に全てのマウスから取り出した。基本グループ(未処置)を犠牲にし(頸椎脱臼による)、組織を取り出し、基本値を決定した。他のマウスには、ＨＩ(６ｎｍｏｌ／ｋｇ)又は実施例１のインスリンＨＳＡコンジュゲート(９．９ｎｍｏｌ／ｋｇ)を静脈内に投与した。同様の血糖低下が、双方の群で達成された。５、１５及び１２０分の時点のそれぞれの後、尾端血液試料を、ＨＩ処置された群、及び実施例１で処置された群から取り出し、その後、これらの動物を犠牲にし、組織を除去した。BioSourceのＥＬＩＳＡにより、インスリンレセプターホスホリル化分子を肝臓、下肢筋肉及び精巣上体脂肪において測定した。

実施例５３
この発明のインスリンアルブミンコンジュゲートのインスリンレセプター結合性
ヒトインスリンレセプターに対する、この発明のインスリンアルブミンコンジュゲートの親和性を、ＳＰＡアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより測定する。ＳＰＡ-ＰＶＴ抗体結合ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017)を、２５ｍｌの結合用バッファー(１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．０２５％のトゥイーン-２０)と混合する。単一のPackard Optiplate(Packard No. 6005190)用の試薬混合物は、１：５０００に希釈され精製された組換えヒトインスリンレセプター(エクソン１１を有する又は有さない)を２．４μｌ、試薬混合物１００μｌ当たり５０００ｃｐｍに相当するＡ１４Ｔｙｒ[^１２５Ｉ]-ヒトインスリンの保存溶液を所定量、Ｆ１２抗体の１：１０００希釈液を１２μｌ、ＳＰＡ-ビーズを３ｍｌ、及び全体で１２ｍｌになるような結合用バッファーからなる。ついで、全体で１００μｌの試薬混合物をPackard Optiplateに各ウェルに添加し、適切な試料から、Optiplateにおいて、インスリン誘導体の希釈シリーズを作製する。ついで、ゆっくりと振盪させつつ、試料を１６時間インキュベートする。ついで、１分間の遠心分離により相分離させ、Topcounterにてプレートを計測する。GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego, CA)にて、非線形回帰アルゴリズムを使用し、結合データを適合させた。

２つの既知のインスリンと４つの本発明の選択されたインスリンのインスリンレセプター親和性：

＜配列表＞
実施例において、ヒトインスリンから次のずれ：Ａ５Ｌ，Ａ２２Ｋ；Ａ１８Ｌ，Ａ２２Ｋ；及びＡ２２Ｋを持つ次のＡ鎖はそれぞれ配列番号１−３として与えられ、ヒトインスリンから次のずれ：Ｂ２９Ｒ，ｄｅｓＢ３０を持つ次のＢ鎖は配列番号４として与えられる。

Claims

式ＩＩＩ：Ａｌｂ-Ｍ’-Ｚ_ｎ-Ｙ_ｏ-Ｉｎｓ［上式中、ＩｎｓはＡ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン及びＡ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンからなる群から選択されるインスリンアナログを表し、ここで、インスリンアナログはＣ末端リジン残基（Ａ２２Ｋ）中に存在するアミノ基においてコンジュゲートされ；Ａｌｂはアルバゲン及びヒト血清アルブミンからなる群から選択され、Ｃｙｓ-３４残基の遊離チオール基を介して連結され；及び-Ｍ’-Ｚ _ｎ -Ｙ _ｏ -と命名された部分が、-ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＯ-；-ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＯ-；-ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＯ-；-ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＯ-；-ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＯ-；-ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＨ _２ -Ｏ-ＣＨ _２ -ＣＯ-；

からなる群から選択される］のインスリンアルブミンコンジュゲート。
Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε８-{３-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)プロピオニルアミノ}オクタノイル],Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-１２-{２-(アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イルアセチルアミノ)}ドデカノイル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-{２-[２-(２-{２-[２-(１２-{２-アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イルアセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；又はＡ１８Ｌ,Ａ２２Ｋ[Ｎ^ε-{２-[２-(２-{２-[２-(１２-{２-アルバゲン-Ｃｙｓ３４-イル-アセチルアミノ}ドデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル]Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである請求項１に記載のインスリンアルブミンコンジュゲート。
医薬として使用されるための請求項１又は２に記載のインスリンアルブミンコンジュゲート。
糖尿病の治療に医薬として使用されるための請求項１又は２に記載のインスリンアルブミンコンジュゲート。
高血糖症、２型糖尿病、耐糖能異常、１型糖尿病、肥満症、Ｘ症候群又は脂質異常症の治療又は予防のための請求項１又は２に記載のインスリンアルブミンコンジュゲートを含む医薬。