CN1165549C - 胰岛素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胰岛素的纯化方法，本方法是：胰岛素盐析物→钠盐结晶→锌盐重结晶→收集干燥得胰岛素结晶粉。本发明和单纯钠盐结晶、单纯锌盐结晶相比，具有生产周期短、效价收率高的优点。
Description
技术领域
本发明是关于胰岛素的纯化方法，更具体地说是胰岛素的结晶方法，用于制备高纯度胰岛素。
背景技术
目前，公知的胰岛素生产大都采用锌盐结晶工艺，其工艺流程为：盐析物溶解液→除酸蛋白→过滤→锌沉淀→溶解→除碱蛋白→过滤→结晶→收集干燥。其缺点是产品收率低，操作步骤多，生产周期长，辅料消耗高，工艺中同时产出需再回收品约15％，尤其是用于高纯度胰岛素生产，显然其工艺不合理，中国专利公开号CN1077203A公开的发明专利申请“一种胰岛素钠盐结晶工艺”，其工艺为：盐析物溶解液→过滤→结晶→干燥收集→胰岛素钠盐结晶粉。该工艺与锌盐结晶工艺相比，工序少，生产周期短，但存在的缺点是效价收率仅提高3-5％。
发明内容
本发明的目的是提供一种胰岛素的纯化方法，该方法不仅使胰岛素纯度高，收率稳定，而且克服了CN1077203A专利申请效价收率偏低的缺点。
本发明的技术方案是：其纯化方法为：胰岛素盐析物→钠盐结晶→重结晶→收集干燥得胰岛素结晶粉；
钠盐结晶的方法为：
胰岛素盐析物用0.1N稀盐酸溶解成20-30％(W/V)的溶解液；用10N氢氧化钠溶液将该溶解液调PH7左右，加入5-20％(V/V)量的30％浓度的氯化钠溶液，搅拌均匀；再用5N氢氧化钠溶液补调至PH7.5-8.5，室温搅拌结晶8-10小时。静置，使结晶完全沉下后，吸去上清液，用离心或过滤的方法收集结晶；用浓度2-10％的冷氯化钠溶液洗结晶1-2次，得胰岛素钠盐湿结晶。
重结晶的方法为：
将胰岛素钠盐湿结晶按26-30％(W/W)折成干重，将干重按0.5-2％(W/V)的浓度计算出重结晶的总体积(毫升)；按每克干品加入固体柠檬酸1-1.5克，再加水溶解成总体积的1/3量；冷室静置10-15小时后过滤得澄清滤液；向滤液中按1-1.5克干品加入浓度为20％醋酸锌溶液1-2ml，冷丙酮16-20ml，再用冷水稀释至总体积后，用4N氨水调PH6.0-6.5，慢速搅拌5小时以上，转入冷室静置使结晶完全沉下。
收集干燥方法为：
吸去上清液用离心方法收集结晶，再用冷蒸馏水水洗1-2次，然后丙酮、乙醚脱水、用五氧化二磷做干燥剂真空干燥，即得胰岛素结晶粉。
术语“胰岛素盐析物”是本技术领域专业人员所熟知的。
所述冷室是指摄氏温度5-10℃。
本发明的优点是：克服了单纯锌盐结晶或单纯钠盐结晶的缺点，使胰岛素结晶收率和纯度提高，效价收率提高10-15％。
具体实施方式
实施例1
将1Kg胰岛素盐析物用0.1N稀盐酸溶解，使成体积5立升，用10N氢氧化钠调PH8.2，加入浓度30％的氯化钠溶液0.5立升，搅拌均匀，再用5N氢氧化钠补调至PH8.2，室温搅拌8小时后静置，待结晶完全沉下后离心收集结晶，用3％氯化钠溶液洗涤结晶1次，得钠盐湿结晶。
重结晶
钠盐湿结晶按26％折成干重，将干重按0.5％(W/V)的浓度计算出重结晶的总体积(毫升)，按每克干品加入固体柠檬酸1克，加水溶解至总体积的1/3量，冷室静置约10小时后，过滤，向滤液中按1.0克干品加入20％的醋酸锌溶液1毫升，冷丙酮20毫升，用5-10℃冷水稀释至总体积，用4N氨水调PH6.1-6.3，慢速搅拌5小时，冷室静置10小时至结晶完全沉下。收集干燥，得胰岛素结晶粉。效价收率提高10-15％。
实施例2
将1Kg胰岛素盐析物用0.1N稀盐酸溶解，使成体积3立升，用10N氢氧化钠调PH7.8，加入浓度30％的氯化钠溶液0.15立升，搅拌均匀，再用5N氢氧化钠补调至PH7.8，室温搅拌8小时后静置，待结晶完全沉下后离心收集结晶，用3％氯化钠溶液洗涤结晶1次，得胰岛素钠盐湿结晶。
重结晶
钠盐湿结晶按30％(W/W)折成干重，将干重按2％(W/V)的浓度计算出重结晶的总体积(毫升)。按每克干品加入固体柠檬酸1.2克，加水溶解至总体积的1/3量，静置约15小时后，过滤，向滤液中按1克干品加入20％的醋酸锌溶液1.5毫升，冷丙酮20毫升，用5-10℃冷水稀释至总体积，用4N氨水调PH6.1-6.3，慢速搅拌5小时，冷室静置10小时至结晶完全。收集干燥，得胰岛素结晶粉，效价收率提高10-15％。
Claims (3)
1、一种胰岛素的纯化方法，其特征是该方法是：胰岛素盐析物→钠盐结晶→重结晶→收集干燥得胰岛素结晶粉；所述钠盐结晶的方法是：
(a)将胰岛素盐析物，用0.1N稀盐酸溶解成20-30％(W/V)的溶解液；
(b)用氢氧化钠溶液对溶解液调PH7.5-8.5，室温搅拌结晶8-10小时；
(c)静置，使结晶完全沉下后用离心法或过滤法收集结晶；
(d)用2-10％的冷氯化钠溶液洗结晶1-2次，得胰岛素钠盐湿结晶；所述重结晶的方法是：
(a)将胰岛素钠盐湿结晶按26-30％(W/W)折成干重，将干重按0.5-2％(W/V)的浓度计算出重结晶的总体积(毫升)，按每克干品加入固体柠檬酸1-1.5克，加水溶解成总体积的1/3量；
(b)冷室静置10-15小时后过滤，滤液需澄清；
(c)向滤液中按1克干品加入浓度为20％醋酸锌溶液1-2ml，冷丙酮16-20ml，再用冷水稀释至总体积，用4N氨水调PH6.0-6.5，慢速搅拌5小时以上使结晶完全，冷室静置至结晶完全沉下；
所述收集干燥方法是：吸去上清液，用离心方法收集结晶，再用冷蒸馏水水洗1-2次，然后丙酮、乙醚脱水、以五氧化二磷做干燥剂真空干燥即得胰岛素结晶粉。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征是：钠盐结晶的(b)步骤是用10N氢氧化钠溶液，将溶解液调PH7左右，再按体积加入5-20％(V/V)量的30％的氯化钠溶液搅拌均匀，再用5N氢氧化钠溶液补调PH7.5-8.5。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征是：冷室温度为摄氏5-10℃。
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