MX2014012096A - Formulaciones de insulina. - Google Patents

Abstract

Se describe una formulación farmacéutica estable que contiene un derivado de insulina se puede preparar convenientemente al agregar glicerol, fenol, m-cresol y iones de zinc a esta.

Description

FORMULACIONES DE INSULINA CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a formulaciones farmacéuticas de insulina que se pueden usar para evitar, tratar y curar la diabetes y aspectos naturalmente relacionados a ella.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La insulina es una hormona de polipéptido secretada por células ß del páncreas.

La insulina se usa para el tratamiento de diabetes y enfermedades relacionadas con las mismas o que resultan de ella. La insulina es esencial en mantener regulación metabólica normal. Ya que la introducción de terapia de insulina hace 90 años, la vida de millones de pacientes con diabetes se ha salvado, prolongado y mejorado. En las últimas décadas, ha resultado que es extremadamente importante para un paciente diabético para mantener el control cerrado del nivel de glucosa en la sangre.

En Prog. Biophys. Mole. Biol . 91 (2006), 199 et seg., hay una visión general de diferentes formas de insulinas.

Usualmente, la insulina se administra por inyecciones (subcutáneamente). En Nat. Reviews Drug Disc. 1 (2002), 529 et seg. , hay una visión general de vías alternativas para la administración de insulina.

En la O 2009/115469, los análogos de insulina acilados ef. 251436 en donde un aminoácido hidrofóbico se ha substituido con aminoácidos hidrofílicos se mencionan. En la WO 2009/115469, no hay ninguna mención de formulaciones farmacéuticas de insulina inyectables específicas.

En la WO 2008/015099, insulinas extendidas, PEGiladas se mencionan. En la WO 2008/015099, no hay ninguna mención de formulaciones farmacéuticas de insulina específicas.

Brevemente, la WO 02/067969 se refiere a formulaciones de insulina que se estabilizan ya que contienen dos diferentes especies de insulina y, aparentemente, la descripción se centra en insulina lispro que es una de las dos especies de insulina.

Durante décadas, las formulaciones de insulina con diferentes propiedades se han desarrollado y poner en el mercado y aquellas formulaciones se han preparado usando una variedad muy grande de aditivos. Se presume que en las formulaciones de insulina neutral puestas en el mercado, ninguna contiene insulina todas de las cuales están en la forma monomérica.

Muchos pacientes toman 2-4 inyecciones de insulina por día, por ejemplo, para el tratamiento basal y tratamiento prandial .

En el 2007, hay 246 millones de diabéticos en el mundo. En el 2025, el número se espera que sea alrededor de 380 millones.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION El objeto de esta invención es superar o mejorar al menos una de las desventajas del arte previo, o para producir una alternativa útil.

Otro aspecto de esta invención se refiere al suministro de formulaciones de insulina que tienen un contenido relativamente alto de insulina, por ejemplo, una concentración de insulina por arriba de alrededor de 1.5 mM insulina, preferiblemente por arriba de alrededor de 3 mM de insulina, y más preferido por arriba de alrededor de 4 mM y una concentración por debajo de alrededor de 9 mM de insulina .

Otro aspecto de esta invención se refiere al suministro de formulaciones de insulina que tienen una estabilidad física suficiente.

Otro aspecto de esta invención se refiere al suministro de formulaciones de insulina que tienen una estabilidad química suficiente.

Otro aspecto de esta invención se refiere al suministro de formulaciones de insulina que tienen una viscosidad suficientemente baja.

Otro aspecto de esta invención se refiere al suministro de formulaciones de insulina que tienen una suficiente solubilidad.

Otro aspecto de esta invención se refiere al suministro de formulaciones de insulina que tienen un patrón de oligomerización estable suficiente.

Otro aspecto de esta invención se refiere al suministro de formulaciones de insulina en donde la insulina que está presente en una concentración relativamente alta está en forma disuelta en un valor de pH de alrededor de 6 o por arriba de alrededor de 6, preferiblemente en un valor de pH de alrededor de 6.5 o por arriba de alrededor de 6.5, más preferido en un valor de pH de alrededor de 7 o por arriba de alrededor de 7, aún más preferido en un valor de pH de alrededor de 7.4 o por arriba de alrededor de 7.4 y por debajo de un valor de pH de alrededor de 8.2.

DEFINICIONES El término "diabetes" o "diabetes mellitus" incluye diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, diabetes gestacional (durante el embarazo) y otros estados que causan hiperglucemia . El término se usa para un trastorno metabólico en el cual el páncreas produce cantidades insuficientes de insulina, o en las cuales las células del cuerpo no responden apropiadamente a insulina evitando así las células de glucosa absorbente. Como un resultado, glucosa se acumula en la sangre .

La diabetes tipo 1, también llamada diabetes mellitus dependiente de insulina (IDD , por sus siglas en inglés) y diabetes de inicio juvenil, se causa por destrucción de célula ß, usualmente que lleva a deficiencia absoluta de insulina. La diabetes tipo 2, también conocida como diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM, por sus siglas en inglés) y diabetes de inicio adulto, se asocia con resistencia de insulina predominante y por lo tanto deficiencia de insulina relativa y/o un predominantemente defecto secretor de insulina con resistencia a la insulina.

En la presente, el término "formulación" se usa como sinónimos con el término "composición" .

La fuerza iónica de una solución es una medida de la concentración de iones en esa solución. Los compuestos iónicos, cuando se disuelven en agua, se disocian en iones. La concentración de electrolito total en la solución afectará propiedades importantes tal como la disociación o la solubilidad de diferentes sales. Una de las principales características de una solución con iones disueltos es la fuerza iónica. La fuerza iónica (en la presente designada "I") de una solución es una función de la concentración de todos los iones presentes en esa solución: donde a es la concentración molar de ion i (mol-dm-3), z± es el número de carga de ese ion, y la suma se toma sobre todos los iones en la solución. Para un electrolito 1:1 tal como cloruro de sodio, la fuerza iónica es igual a la concentración, pero para MgSC la fuerza iónica es cuatro veces superior. Generalmente los iones multivalentes contribuyen en gran medida a la fuerza iónica.

En la presente, las siguientes abreviaturas se usan: "Ac" para acetato, "YGIU" O "gGlu" para L-glutamil gamma con la fórmula -CO-CH2CH2-CH (COOH) -NH- ; "HMWP" para péptidos de peso molecular alto; "OEG" para el aminoácido con la fórmula NH2- (CH2) 2-0- (CH2) 2-O-CH2-COOH que corresponde al grupo -NH-(CH2) 2-0- (CH2) 2-0-CH2-C0- también designado [2- (2-amino-etoxi) -etoxi] -metil-carbonil ; y "ThT" se usa para Tioflavina T.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Asombrosamente se ha encontrado que las formulaciones de los derivados de insulina mencionados en la presente especificación tal como en las cláusulas y reivindicaciones en la presente que contienen los aditivos mencionados en la presente especificación tal como en las cláusulas y reivindicaciones en la presente en las concentraciones mencionadas en la presente especificación tal como en las cláusulas y reivindicaciones en la presente cumplan muchos de los objetos anteriores. Por ejemplo, tales formulaciones son solubles y tienen un perfil farmacocinético deseado.

Los derivados de insulina que son para estabilizarse por la presente invención tienen la fórmula general I: Acy-X-Yn-Ins . En esta fórmula, "Ins" designa un análogo de insulina al cual una cadena lateral (designada Acy-X-Yn-) se ha enlazado al grupo amino e presente en el aminoácido de lisina B29 en tal análogo de insulina. En otras palabras: "Ins" designa un análogo de insulina; y, de acuerdo a la fórmula I, una cadena lateral (designada Acy-X-Yn-) se ha enlazado a tal análogo de insulina, esto es, enlazado al grupo amino e presente en el aminoácido de lisina B29 en tal análogo de insulina. Tal análogo de insulina es insulina humana que contiene ácido glutámico en la posición A14 , histidina en la posición B25, opcionalmente histidina en la posición B16 y, opcionalmente, los aminoácidos B27 y/o B30 se han eliminado. En tal cadena lateral que tiene la fórmula general II (y designada Acy-X-Yn-) , Acy es un diácido graso con 8-24 átomos de carbono de los cuales un grupo hidroxilo se ha eliminado, X es yGlu en donde el residuo amino se ha conectado a "Acy" y - si n es diferente de cero - el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado a Y o - si n es cero - el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado al grupo amino e en lisina en la posición B29 en el análogo de insulina, Y es -NH- (CH2) 2-0- (CH2) 2-O-CH2-CO-en donde el residuo amino se conecta a X y el grupo carbonilo se conecta al grupo amino e en lisina en la posición B29 en el análogo de insulina, y n es 0 (cero), 1, 2 o 3.

Un ejemplo específico de tal derivado de insulina de la fórmula I es A14E, B16H, B25H, B29K- ( (Ne-eicosanedioil-yGlu- [2- (2- {2- [2- (2-aminoetoxi) -etoxi] -acetil-amino} -etoxi) -etoxi] -acetil) ) , insulina humana desB30. Este compuesto se puede también designar A14E, B16H, B25H, B29K (Neeicosandioil -YGlu-OEG-OEG) , insulina humana desB30 que tiene la siguiente fórmula : La lista de secuencia de las cadenas A y B del análogo de insulina precursor se da en SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. Los ejemplos de otros derivados de insulina específicos de la fórmula I son A14E, B16H, B25H, B29K-(NEhexa-decan-dioil-YGlu) , insulina humana desB30; A14E, B16H, B25H, B29K (ISFeicosanedioil -yGlu) , insulina humana desB30; y A14E, B25H, desB27, B29K (W - (octadecandioil -yGlu) , insulina humana desB30. Las fórmulas de los tres últimos compuestos mencionados se establecen en los ejemplos 27, 60 y 151, respectivamente, en WO 2009/115469.

Sorprendentemente, en el aspecto más amplio de la presente invención, las formulaciones farmacéuticas que cumplen los requisitos anteriores se pueden preparar al mezclar un derivado de insulina de la fórmula I anterior con fenol, m-cresol, iones de zinc, opcionalmente , uno o más compuestos dando la fuerza iónica deseada y, opcionalmente, glicerol, todos en las cantidades mencionados en esta especificación.

La fuerza iónica deseada se puede obtener al agregar cloruro de sodio y/o acetato de sodio, y/o TRIS (2-amino-2-hidroximetil - 1 , 3-propanediol) y/o arginina en cantidades apropiadas en las cantidades mencionadas en esta especificación .

Sorprendentemente, en un aspecto de la presente invención, las formulaciones farmacéuticas que cumplen los requisitos anteriores se pueden preparar al mezclar un derivado de insulina de la fórmula I anterior con glicerol, fenol, m-cresol, iones de zinc y, opcionalmente, cloruro de sodio en cantidades apropiadas y estos ingredientes se pueden presentar en las cantidades establecidas en la reivindicación 1 abajo, preferiblemente 4.2 mM del derivado de insulina, alrededor de 1.6% (peso/peso) de glicerol, alrededor de 25 mM de fenol, alrededor de 25 mM de m-cresol, alrededor de 4.5 Zn/6 moles de derivado de insulina, alrededor de 20 mM de cloruro de sodio y que tienen un valor de pH de alrededor de 7.4.

Las formulaciones farmacéuticas se hacen isotónicas por la adición de cloruro de sodio y glicerol.

Dentro del campo de la insulina, es común para dar las figuras para la cantidad de zinc presente como la cantidad de iones de zinc que se presentan por seis mol de la insulina o derivado de insulina que está presente en la preparación. Algunas veces, tales seis moles de insulina o de derivado de insulina son, incorrectamente, referidos como un hexámero, a pesar de que todas las moléculas de insulina no participan en la formación de una configuración de hexámero y, en tales casos, la cantidad de zinc presente actualmente es la cantidad de iones de zinc presentes por seis mol de la insulina o derivado de insulina, independiente de si tales insulinas o derivados de insulina participan en la formación de una configuración de hexámero o no. Para este cálculo, uno no tiene que considerar que forma tales iones de zinc están presentes .

Es deseable que, después de la inyección de la formulación de insulina, los derivados de insulina auto-asociados para formar, en particular, dímeros, hexámeros, di-hexámeros (dodecámeros) y multi-hexámeros . En la presente, el término multi-hexámeros cubre montajes de insulina que contienen más de 12 moléculas del derivado de insulina. Se cree que, después de la inyección de la formulación de esta invención a humanos, los muíti -hexámeros se disociarán debido a la difusión de los aditivos en la formulación y que los dímeros liberados se disociarán rápidamente en monómeros.

Un patrón de oligomerización suficiente de una formulación significa que el patrón es substancialmente sin cambios, a través de la vida útil de la formulación. Además, tal formulación puede consistir de diversos componentes, esto es, dodecámero más monómero o hexámero más monómero pero no dodecámero, hexámero, dímero más monómero y no oligómeros diferentes no especificados que varían desde dodecámeros hasta monómeros .

Las formulaciones de insulina se administran a los pacientes de una manera conocida per se, por ejemplo, de acuerdo a los conocimientos generales del paciente combinado con los conocimientos generales del médico. Esta invención se usa mejor en la conveniencia del paciente. El modo final de uso por lo tanto depende tanto de las capacidades del producto como de la disposición y preferencia del paciente. Esto es debido al hecho de que el efecto de cualquier producto de insulina depende de la insulina necesaria del paciente individual y la sensibilidad a las acciones farmacodinámicas de tal insulina y por último también a las preferencias del paciente en una situación dada. Estas condiciones pueden cambiar durante el tiempo, ambas en términos de periodos más largos (años) y de día a día. El nivel de dosis óptima para cualquier paciente dependerá de una variedad de factores que incluyen la edad, peso corporal, actividad física, y dieta del paciente, en una combinación posible con otros fármacos, y en la severidad del estado a tratarse. Se recomienda que el régimen de dosificación se determina para cada paciente individual por aquellos de experiencia en la técnica de una manera similar como ahora se hace para formulaciones de insulina conocidas.

Las enfermedades y afecciones que son los principales objetivos para esta invención son diabetes mellitus (tipo 1 o 2) u otras afecciones caracterizadas por hiperglucemia, pero también enfermedades y afecciones metabólicas en general donde los efectos metabólicos de insulina tiene una relevancia clínica o son de interés, tal como pre-diabetes , tolerancia a la glucosa mejorada, síndrome metabólico, obesidad, caquexia, pérdida/muerte de célula beta in vivo, apetito excesivo, e inflamación. Todos estos tipos de afecciones son conocidos o se cree que beneficiarán a un estado metabólico estable en el sujeto que tiene la enfermedad o afección.

Con objeto de ejercer esta invención, una preparación de insulina se puede administrar parentalmente a pacientes que necesitan de tal tratamiento. La administración parenteral se puede realizar por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma. Alternativamente, la administración parenteral se puede realizar por medio de una bomba de infusión. Las opciones adicionales son para administrar la composición de insulina nasalmente o pulmonarmente , preferiblemente en composiciones, polvos o líquidos, específicamente diseñadas para el propósito.

RASGOS PREFERIDOS DE ESTA INVENCIÓN Para resumir y complementar las declaraciones anteriores, los rasgos y cláusulas de esta invención son como sigue: 1. Una formulación farmacéutica que contiene un derivado de insulina de la fórmula general I, glicerol, fenol, m-cresol e iones de zinc. 2. Una formulación farmacéutica que contiene un derivado de insulina que tiene la fórmula general I: Acy-X-Yn-Ins , en donde "Ins" designa un análogo de insulina y una cadena lateral (designada Acy-X-Yn-) se ha enlazado al grupo amino e presente en el aminoácido de lisina B29 en tal análogo de insulina, tal análogo de insulina es insulina humana que contiene ácido glutámico en la posición A14 , histidina en la posición B25, opcionalmente histidina en la posición B16 y, opcionalmente, el aminoácido B27 y/o B30 se han eliminado, Acy es un diácido graso con 8-24 átomos de carbono de los cuales un grupo hidroxilo se ha eliminado, X es yGlu en donde el residuo amino se ha conectado a "Acy" y - si n es diferente de cero - el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado a Y o - si n es cero - el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado al grupo amino e en lisina en la posición B29 en tal análogo de insulina, Y es -NH- (CH2) 2-O- (CH2) 2-O-CH2-CO-en donde el grupo amino se conecta a X y el grupo carbonilo se conecta al grupo amino e en lisina en la posición B29 en tal análogo de insulina, y n es 0 (cero) , 1, 2 o 3, no más de alrededor de 2% (peso/peso) de glicerol, desde alrededor de 16 hasta alrededor de 35 mM de fenol, desde alrededor de 16 hasta alrededor de 35 mM de m-cresol, desde alrededor de 3.5 hasta alrededor de 8 mol de iones de zinc por seis mol de tal derivado de insulina y que tiene una fuerza iónica en el intervalo desde alrededor de 0 hasta alrededor de 150. 3. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de glicerol en el intervalo desde alrededor de 0.3% (peso/peso) . 4. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de glicerol en el intervalo desde alrededor de 0.7% (peso/peso). 5. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de iones de zinc por seis moles de derivado de insulina que está por debajo de 7.1. 6. Una formulación farmacéutica de acuerdo a la cláusula precedente que contiene un derivado de insulina que tiene la fórmula general I: Acy-X-Yn-Ins, en donde "Ins" designa un análogo de insulina al cual una cadena lateral (designada Acy-X-Yn-) se ha enlazado al grupo amino e presente en el aminoácido de lisina B29 en tal análogo de insulina, tal análogo de insulina es insulina humana que contiene ácido glutámico en la posición A14 , histidina en la posición B25, opcionalmente histidina en la posición B16 y, opcionalmente, el aminoácido B27 y/o B30 se han eliminado, Acy es un diácido graso con 8-24 átomos de carbono de los cuales un grupo hidroxilo se ha eliminado, X es yGlu en donde el residuo amino se ha conectado a "Acy" y - si n es diferente de cero -el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado a Y o - si n es cero - el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado al grupo amino e en lisina en la posición B29 en tal análogo de insulina, Y es -NH- (CH2) 2-O- (CH2) 2-O-CH2-CO- en donde el grupo amino se conecta a X y el grupo carbonilo se conecta al grupo amino e en lisina en la posición B29 en tal análogo de insulina, y n es 0 (cero), 1, 2 o 3, desde alrededor de 1 hasta alrededor de 2% (peso/peso) de glicerol, desde alrededor de 16 hasta alrededor de 35 mM de fenol, desde alrededor de 16 hasta alrededor de 35 mM de m-cresol, desde alrededor de 3.5 hasta alrededor de 5.5 mol de iones de zinc por seis mol de tal derivado de insulina y no más de alrededor de 75 mM de cloruro de sodio. 7. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de un derivado de insulina de la fórmula general I que está por arriba de alrededor de 1.2 mM, preferiblemente por arriba de alrededor de 2.1 mM, y más preferido por arriba de 3.8 mM. 8. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de un derivado de insulina de la fórmula general I que está por debajo de alrededor de 9 mM, preferiblemente por debajo de alrededor de 7.1 mM, y más preferido por debajo de alrededor de 6 mM. 9. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 2.1 mM de un derivado de insulina de la fórmula general I. 10. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 4.2 mM de un derivado de insulina de la fórmula general I. 11. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de glicerol en el intervalo desde alrededor de 1 hasta alrededor de 2% (peso/peso) . 12. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 1.6% (peso/peso) de glicerol. 13. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de fenol que está por arriba de alrededor de 16, preferiblemente por arriba de alrededor de 20 mM. 14. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de fenol que está por debajo de alrededor de 35 mM, preferiblemente por debajo de alrededor de 30 mM. 15. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 25 mM de fenol. 16. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de m-cresol que está por arriba de alrededor de 16 mM, preferiblemente por arriba de alrededor de 20. 17. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de m-cresol que está por debajo de alrededor de 35 mM, preferiblemente por debajo de alrededor de 30 mM. 18. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 25 mM de m-cresol. 19. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de iones de zinc por seis moles de derivado de insulina que está por arriba de alrededor de 3.5, preferiblemente por arriba de alrededor de 4, más preferido por arriba de alrededor de 4.2. 20. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contienen una cantidad de iones de zinc por seis moles de derivado de insulina que está por debajo de alrededor de 7.8. 21. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de iones de zinc por seis moles de derivado de insulina que está por debajo de alrededor de 6.8. 22. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de iones de zinc por seis moles de derivado de insulina que está por debajo de alrededor de 5.5, preferiblemente por debajo de alrededor de 5.1, más preferido por debajo de alrededor de 5 , y aún más preferido por debajo de alrededor de 4.8. 23. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 4.5 iones de zinc por seis mol del derivado de insulina. 24. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que tiene una fuerza iónica por arriba de alrededor de 1, preferiblemente por arriba de alrededor de 10. 25. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que tiene una fuerza iónica por debajo de alrededor de 150 mM, preferiblemente por debajo de alrededor de 120, más preferido por debajo de alrededor de 100. 26. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de cloruro de sodio que está por arriba de alrededor de 1 mM, preferiblemente por arriba de alrededor de 10 mM. 27. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de cloruro de sodio que está por debajo de alrededor de 150 mM, preferiblemente por debajo de alrededor de 120 mM, más preferido por debajo de alrededor de 100 mM. 28. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de cloruro de sodio que está por debajo de alrededor de 75 mM, preferiblemente por debajo de alrededor de 50 mM, más preferido por debajo de alrededor de 30 mM. 29. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 20 mM de cloruro de sodio. 30. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de acetato de sodio que está por arriba de alrededor de 1 mM, preferiblemente por arriba de alrededor de 10 mM. 31. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de acetato de sodio que está por debajo de alrededor de 150 mM, preferiblemente por debajo de alrededor de 120 mM, más preferido por debajo de alrededor de 100 mM. 32. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que tiene un valor de pH que está por arriba de alrededor de 6.5, preferiblemente por arriba de alrededor de 6.8, más preferido por arriba de alrededor de 7 , y aún más preferido por arriba de alrededor de 7.2. 33. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que tiene un valor de pH que está por debajo de alrededor de 8, preferiblemente por debajo de alrededor de 7.8, más preferido por debajo de alrededor de 7.6. 34. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que tiene un valor de pH de alrededor de 7.4. 35. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de Zn por seis moles de derivado de insulina en el intervalo desde alrededor de 4 hasta alrededor de 5.1 y que tiene un valor de pH en el intervalo desde alrededor de 7 hasta alrededor de 8.2. 36. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene una cantidad de Zn por seis moles de derivado de insulina en el intervalo desde alrededor de 4 hasta alrededor de 5.1 y que tiene un valor de pH en el intervalo desde alrededor de 7 hasta alrededor de 7.8. 37. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene desde alrededor de 2.1 hasta alrededor de 8.4 m del derivado de insulina, desde alrededor de 2 hasta alrededor de 6 iones de zinc por seis mol del derivado de insulina y que tiene una fuerza iónica desde alrededor de O hasta alrededor de 150. 38. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene desde alrededor de 2.1 hasta alrededor de 6 mM del derivado de insulina, desde alrededor de 3 hasta alrededor de 5 iones de zinc por seis mol del derivado de insulina y que tiene una fuerza iónica desde alrededor de 10 hasta alrededor de 100. 39. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene desde alrededor de 2.1 hasta alrededor de 6 mM del derivado de insulina, desde alrededor de 3 hasta alrededor de 5 iones de zinc por seis mol del derivado de insulina y que tiene una fuerza iónica desde alrededor de 20 hasta alrededor de 80. 40. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 2.1-5.2 mM del derivado de insulina, alrededor de 0.5-1.8% (peso/peso) de glicerol, alrededor de 22-28 mM de fenol, alrededor de 22-28 mM de m-cresol, alrededor de 3.8-5 iones de zinc por seis mol de derivado de insulina, alrededor de 10-90 mM de cloruro de sodio y que tiene un valor de pH de alrededor de 7.2-8.2. 41. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 4.2 mM del derivado de insulina, alrededor de 1.6% (peso/peso) de glicerol, alrededor de 25 mM de fenol, alrededor de 25 mM de m-cresol, alrededor de 4.5 iones de zinc por seis mol de derivado de insulina, alrededor de 20 mM de cloruro de sodio y que tiene un valor de pH de alrededor de 7.4. 42. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 3.8-5.2 mM del derivado de insulina, alrededor de 1.3-1.8% (peso/peso) de glicerol, alrededor de 22-28 mM de fenol, alrededor de 22-28 mM de m-cresol, alrededor de 3.8-5 iones de zinc por seis mol de derivado de insulina, alrededor de 10-30 mM de cloruro de sodio y que tiene un valor de pH de alrededor de 7.2-8.2. 43. La formulación de acuerdo a la cláusula precedente en donde el derivado de insulina se selecciona del grupo que consiste de A14E, B16H, B25H, B29K- ( (NE-eicosanedioil-YGIU- [2- (2 - { 2 - [2- ( 2 -amino-etoxi ) -etoxi ] -acetil-amino}-etoxi) etoxi] -acetil) ) , insulina humana desB30, A14E, B16H, B25H, B29K- (NEhexa-decandioil-YGlu) , insulina humana desB30; A14E, B16H, B25H, B29K (NEeicosanedioil -yGlu) , insulina humana desB30; y A14E, B25H, desB27, B29K(N2-octadecandioil-yGlu) , insulina humana desB30, preferiblemente A14E, B16H, B25H, B29K( (NEeicosanedioil-YGlu- [2 - (2-{2- [2- (2-aminoetoxi) etoxi] -acetilamino} etoxi ) etoxi] acetil ) ) , insulina humana desB30. 44. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 4.2 mM del derivado de insulina, alrededor de 0.7% (peso/peso) de glicerol, alrededor de 25 mM de fenol, alrededor de 25 mM de m-cresol, alrededor de 4.5 iones de zinc por seis mol de derivado de insulina, alrededor de 75 mM de cloruro de sodio y que tiene un valor de pH de alrededor de 7.4. 45. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, que contiene alrededor de 3.8-5.2 mM del derivado de insulina, alrededor de 0.5-1% (peso/peso) de glicerol, alrededor de 22-28 mM de fenol, alrededor de 22-28 mM de m-cresol, alrededor de 3.8-5 iones de zinc por seis mol de derivado de insulina, alrededor de 60-90 mM de cloruro de sodio y que tiene un valor de pH de alrededor de 7.2-8.2. 46. La formulación de acuerdo a la cláusula precedente en donde el derivado de insulina se selecciona del grupo que consiste de A14E, B16H, B25H, B29K( (Neeicosanedioil-YGlu- [2-(2- {2- [2- (2-aminoetoxi) etoxi] acetilaminojetoxi) etoxi] -acetil)), insulina humana desB30, A14E, B16H, B25H, B29K- (Ix hexadecandioil-YGlu) , insulina humana desB30; A14E, B16H, B25H, B29K(Nfeicosanedioil-YGlu) , insulina humana desB30; y A14E, B25H, desB27, B29K(NE-octadecandioil-YGlu) , insulina humana desB30, preferiblemente A14E, B16H, B25H, ?29?((?e-eicosanedioil-YGlu- [2- (2- {2- [2- (2-aminoetoxi) etoxi] acetil-amino} etoxi) etoxi] acetil) ) , insulina humana desB30. 47. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes en donde una gran parte de la misma, por ejemplo 50% (peso/peso) , del derivado de insulina es en forma de monómero. 48. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, en donde la secuencia de aminoácido del análogo de insulina presente en el derivado de insulina de la fórmula general no se desvía de insulina humana en más de 5 posiciones y, preferiblemente, no se desvía de insulina humana en más de 4 posiciones. 49. La formulación, de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, en donde el derivado de insulina se selecciona del grupo que consiste de A14E, B16H, B25H, ?29?((?e-eicosanedioil-YGlu- [2- (2- {2- [2- (2-aminoetoxi) etoxi] acetil-amino} etoxi ) etoxi] acetil )) , insulina humana desB30, A14E, B16H, B25H, B29K(I\Fhexadecandioil-YGlu) , insulina humana desB30; A14E, B16H, B25H, B29K(NEeicosanedioil-YGlu) , insulina humana desB30; y A14E, B25H, desB27, B29K(N£-octa- decandioil-YGlu) , insulina humana desB30. 50. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, en donde el análogo de insulina de la fórmula general es A14E, B16H, B25H, B29K(NEhexadecandioil-YGlu) , insulina humana desB30. 51. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, en donde el análogo de insulina de la fórmula general es A14E, B16H, B25H, B29K (N£eicosanedioil-yGlu) , insulina humana desB30. 52. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, en donde el análogo de insulina de la fórmula general es A14E, B25H, desB27, B29K(NEoctadecandioil-YGlu) , insulina humana desB30. 53. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, en donde el análogo de insulina de la fórmula general es A14E, B16H, B25H, B29K ( (Neeicosanedioil -gGlu- [2 -(2- {2- [2- (2 -aminoetoxi) etoxi] acetilamino}etoxi ) etoxi] -acetil) ) , insulina humana desB30. 54. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, en donde el derivado de insulina, después de la inyección, está en una forma de multihexámero o una gran parte de la misma, preferiblemente más de 50% de la misma, aún más preferido más de 75% (peso/peso) de la misma, está en forma de multihexámero. 55. La formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, cuyas formulaciones contienen menos de 5%, preferiblemente menos de 1%, aún más preferido menos de 0.1%, (peso/peso) de material sólido. 56. Una formulación de acuerdo a cualquiera de las cláusulas de la formulación precedentes, en la medida de lo posible, como se define en la descripción, especialmente como se define en las cláusulas anteriores. 57. Cualquier producto novedoso, aparato, método o uso definido por un rasgo y/o una reivindicación y/o una combinación de rasgos y/o reivindicaciones descritas en la presente .

Combinar una o más de las cláusulas y modalidades descritas en la presente, opcionalmente también con una o más de las reivindicaciones abajo, resulta en modalidades adicionales y la presente invención se refiere a todas las combinaciones posibles de tales cláusulas, modalidades y reivindicaciones .

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, no por limitación.

Ej emplo 1 Ob etivo El objetivo de este experimento fue medir la estabilidad química y física como una función de concentración de zinc en formulación con A14E, B16H, B25H, B29K( (Neeicosanedioil-gGlu-[2-(2-{2-[2- (2-aminoetoxi) etoxi] -acetilaminojetoxi) etoxi] acetil) ) , insulina humana desB30.

Formulación A14E, B16H, B25H, B29K ( (N¾icosanedioil -gGlu- [2 - ( 2 - { 2 -[2- (2-aminoetoxi) etoxi] acetilaminojetoxi) etoxi] acetil) ) , insulina humana desB30 se disolvió en agua Milliq a una concentración final de 26.2 mM en un valor de pH de alrededor de 8. Fenol, cresol, cloruro de zinc (Zn) y glicerol se agregaron en el orden mencionado de acuerdo a la concentración de Zn/ 6 insulinas (en la presente abreviada en "ins") en la tabla abajo que resulta en una concentración de insulina final de 7.1 mM.

Distribución de las especies como se observa por SEC en pH neutral se midió usando Método 1.

La estabilidad física de las formulaciones se midió como tiempo de retraso en ensayo de Tioflavina T.

La estabilidad química de las formulaciones se midió como incremento en Proteína de Peso Molecular Alto (HM P) y desamidaciones después del almacenamiento por dos semanas a 37 °C relativamente a la cantidad de HMWP y desamidación medida después de dos semanas de almacenamiento a 4°C. El contenido de HMWP después de dos semanas de almacenamiento a 4°C es 0.6%. El contenido de desamidación después de dos semanas de almacenamiento a 4°C es 5.4%.

La HMWP se midió usando método 1 de HMWP.

La formación de insulina relacionada a impurezas como desamidaciones se midió usando cromatografía de fase inversa (UPLC) .

La cantidad de desamido A21 y B3 se determinaron como área de absorbancia medida en porcentaje de área de absorbancia total determinada después de la elución de los conservadores .

Tabla 1.

Lo siguiente se puede concluir Con base en la tabla anterior, se puede concluir que la oligomerización incrementa y disminuye como una función de concentración de zinc. La cantidad más grande de hexámero está en las formulaciones que contienen 2.3 Zn/6 de insulina. La cantidad más grande de di-hexámeros está en las formulaciones que contienen entre 3.5 Zn/6 ins y 5.9 Zn/6. El incremento en concentración de Zn desde 5.9 Zn/6 de insulinas hasta 7.1 Zn/6 de insulinas disminuye la cantidad de di-hexámero.

La estabilidad física es óptima en la formulación por arriba de 2.3 Zn/6 ins ya que el tiempo de retraso en ensayo THT incrementa como una función de concentración de zinc, y es óptima por arriba de 2.3 Zn/6 ins y la recuperación después de la prueba de ThT incrementa hasta 100% cuando la formulación contiene 2.3 Zn/6 ins o más.

La estabilidad química incrementa como una función de concentración de zinc; ya que la formación de HMWP es óptima en las formulaciones que contienen desde 2.3 Zn/6 insulina hasta 5.9 Zn/6 ins. La formación de desamidación es igualmente óptima en las formulaciones que contienen desde 2.3 Zn/6 insulina hasta 5.9 Zn/6 ins.

La oligomerización de la insulina se liga con la estabilidad física y química de la muestra. Las formulaciones principalmente que contienen monómeros de insulina (0 y 1.2 Zn/6 ins) tienen baja estabilidad física y química. Las formulaciones que contienen especies di -hexaméricas parece ser la conformación químicamente más estable.

Ejemplo 2 Objetivo El objetivo de este experimento fue para medir la estabilidad química y física como una función de A14E, B16H, B25H, B29K( (Neeicosanedioil -gGlu- [2- (2-{2- [2- (2-aminoetoxi) -etoxi] acetilaminojetoxi) etoxi] acetil) ) , concentración de insulina humana desB30 en una formulación fija. La estabilidad de insulina se ha demostrado que depende del grado de oligomerización,- insulina hexamérica con zinc es más estable que insulina sin zinc (Brange and Langkjasr 1992) . Ya que la oligomerización también es impulsado por dilución, la concentración de insulina en la muestra puede influir la estabilidad .

Formulación A14E, B16H, B25H, B29K ( (N¾icosanedioil -gGlu- [2 - ( 2 - {2 - [2- (2-aminoetoxi) etoxi] acetilaminojetoxi) etoxi] acetil) ) , insulina humana desB30 se disolvió en agua Milliq en un valor de pH de alrededor de 8. Fenol, cresol, cloruro de zinc (Zn) y glicerol se agregaron en el orden mencionado que resulta en una formulación final que contiene: 4.7 Zn/6 de insulinas, 1.6% de glicerol, 16 mM fenol, 20 mM cresol, 20 mM NaCl pH, 7.4 y la concentración de insulina establecida en la tabla abaj o .

La estabilidad física de las formulaciones se midió como tiempo de retraso en horas en ensayo Tioflavina T (ThT) y la recuperación de insulina se midió por HPLC después del ensayo ThT de las muestras recientemente preparadas.

La estabilidad química de las formulaciones se midió como incremento en HMWP y las desamidaciones después del almacenamiento dos semanas a 37°C relativamente a la cantidad de HMWP y la desamidación se midió después de dos semanas de almacenamiento a 4°C. La HWMP se midió usando el método 1 HMWP. La formación de desamidación se midió usando cromatografía de fase inversa. El contenido de HMWP después de dos y cinco semanas de almacenamiento a 4°C es 0.4-0.5%. El contenido de desamidación después de dos semanas de almacenamiento a 4°C es 5.4%.

Tabla 2.

Con base en la tabla anterior, se puede concluir que estabilidad física de las formulaciones fueron similares en el intervalo de concentración 0.51-7.1 mM insulina.

La formación de HMWP es similar para A14E, B16H, B25H, B29K( (NEeicosanedioil-gGlu- [2- (2- {2- [2- (2-aminoetoxi) etoxi] -acetilaminojetoxi) etoxi] acetil) ) , insulina humana desB30 en el intervalo de concentración analizada 0.51-7.1 mM insulina después de dos semanas a 37°C. La desamidación y desarrollo de HMWP son similares en el intervalo de concentración 3.5 mM-7.1 mM insulina e intervalo de tiempo de 5 semanas a 30°C y 45 días a 37°C. Además, el desarrollo de HMWP es bajo ya que únicamente 1% de HMWP se forma en 45 días y las desamidaciones son igualmente bajas ya que únicamente 1-1.5% de HMWP se forma.

Ejemplo 3 El objetivo con el estudio fue investigar la estabilidad en las condiciones de la formulación que varía pH, NaCl y Zn como se especifica a continuación en la tabla de resultados. Las formulaciones que tienen los números 1-12 en la Tabla 3 contienen 4.2 mM de insulina 7 25 mM de fenol, 20 mM de m-cresol así como los ingredientes mencionados en la Tabla 3 abajo. El control de excipiente NovoRapid® (formulación No. 13 en la Tabla 3) consistió de 600 µ? de insulina como parte, 0.3 mM de acetato de zinc, 20 mM de NaCl, 16 mM de fenol, 16 mM de cresol, 1.6% de glicerol y 7 mM de fosfato (pH 7.4) . Tabla 3 Las diferentes formulaciones para los experimentos en esta prueba y resultados medidos en estabilidad física y química La conclusión de las tablas anteriores es que el tiempo de retraso THT de la formulación se incrementa como una función de contenido de zinc y es óptima cuando la formulación contiene más de 4 átomos de Zn por 6 moléculas de insulina. Una conclusión adicional es que la formación de HMWP de insulina 7 está dentro del intervalo de NovoRapid en las formulaciones probadas.

Ej emplo 4 Objetivo El objetivo de este experimento fue para medir la estabilidad química y física como una función de concentración de zinc en la formulación con insulina 7, insulina 3, insulina 6, insulina 2 e insulina 8 en una concentración de insulina de 4.2 mM.

Formulación Insulina 7, insulina 3, insulina 6, insulina 2 e insulina 7 se disolvieron en agua Milliq a una concentración final de alrededor de 9 mM en un valor de pH de alrededor de 8. Fenol, cresol, acetato de zinc (Zn) , cloruro de sodio y glicerol se agregaron en el orden mencionado de acuerdo a la concentración de Zn/6 de insulinas (en la presente abreviada en "ins") en la tabla abajo que resulta en una concentración de insulina final de 4.2 mM de insulina, 20 mM de cloruro de sodio, 25 mM de fenol, 25 mM de cresol, pH 7.4.

Tendencia de fibrilación como se mide por tiempo de retraso ??? en horas como se especifica en la "sección de métodos".

La estabilidad química de las formulaciones se midió como incremento en Proteína de Peso Molecular Alto (HMWP) incremento en insulina relacionado con impurezas después del almacenamiento por ocho semanas (w) a 37°C relativamente a la cantidad de HMWP después del almacenamiento a 4°C.

La HMWP se midió usando el método 1. En la presente, la letra "s" se usa como una abreviatura para semanas.

Cantidad de monomero se midió usando Filtración de gel nativo, método 2.

Conclusión .

Cuando la insulina 7, insulina 3, insulina 6, insulina 2, e insulina 8 se formulan en 4.2 mM de insulina con zinc en el intervalo 3 zinc/6 ins hasta 6 zinc/6 ins estos tienen tiempos de retraso más largos en THT, formación de HMWP menor y formación de impurezas menor que NovoRapid.

Ej em lo 5 Obj e ivo El objetivo de este experimento fue para medir la estabilidad química y física como una función de concentración de insulina con concentración de zinc fijado en la formulación que contiene insulina 7, insulina 3, insulina 6, insulina 2 e insulina 8. La estabilidad de la insulina se ha demostrado que depende del grado de oligomerización; la insulina hexamérica con zinc es más estable que insulina sin zinc (Brange and Langkjaer 1992) . Ya que oligomerización también es impulsado por dilución, la concentración de insulina en la muestra puede influir la estabilidad.

Formulación La insulina 7, insulina 3 insulina 6, insulina 2 e insulina 8 se disolvieron en agua Milliq en un valor de pH de alrededor de 8.

Fenol, cresol, acetato de zinc (Zn) , cloruro de sodio y glicerol se agregaron en el orden mencionado que resulta en una formulación final que contiene: 4.5 Zn/6 insulinas, 1.6% de glicerol, 25 mM de fenol, 25 mM de cresol, 20 mM de NaCl, pH 7.4 y la concentración de insulina establecida en la tabla abajo.

La estabilidad química de las formulaciones se midió como incremento en Proteína de Peso molecular Alto (HMWP) incremento en insulina relacionado con impurezas después del almacenamiento por ocho semanas a 37°C relativamente a la cantidad de HMWP después del almacenamiento a 4°C.

La HMWP se midió usando el método 1.

La cantidad de desamidación como impurezas se midió como incremento en impurezas medido en cromatografía de fase inversa después de ocho semanas a 37°C relativamente a la cantidad de impurezas medida después del almacenamiento de ocho semanas a 4°C.

Tendencia de fibrilación como se mide por tiempo de retraso THT en horas como se especifica en la "sección de métodos" .

Cantidad de monómero se midió en método 2 de filtración de gel nativo en eluyente con fenol.

Conclusión Cuando la relación de zinc se fija a 4.5 Zn/6 ins, la insulina 7, insulina 3 insulina 6, insulina 2 e insulina 8 tienen cantidad de monómero superior en menor concentración que en concentración de insulina superior.

Esto corresponde con los tiempos de retraso THT superiores generales en concentraciones de insulina superiores y estabilidad química superior en concentraciones de insulina superiores.

Además la insulina 7, insulina 3, insulina 6, insulina 2 e insulina 8 tienen tiempos de retraso más largos en ensayo THT, formación de HM P menor y formación de impureza que NovoRapid a pesar del contenido monomérico de hasta 80% cuando se analiza en filtración de gel nativo .

Ejemplo 6 Obj etivo El objetivo de este experimento fue para investigar la oligomerización por cromatografía de exclusión de tamaño como una función de NaCl contenido en la formulación que contiene insulina 7 en 4.2 mM de insulina y zinc/6 insulinas fijados. Además, el objetivo fue para medir la estabilidad física y química .

Formulación La insulina 7 se disolvió en agua Milliq en un valor de pH de alrededor de 8. Fenol, cresol, acetato de zinc (Zn) y glicerol se agregaron en el orden mencionado que resulta en una formulación final que contiene: 4.5 Zn/6 insulinas, 25 mM de fenol, 25 mM de cresol, pH 7.4 una concentración de insulina de 4.2 mM y cloruro de sodio (NaCl) , acetato de zinc y glicerol como se establece en la tabla abajo.

Estabilidad física se evaluó al medir 1. Tendencia de fibrilación. Medida por ensayo Tioflavina T. La tendencia de fibrilación se midió en ensayo de Tioflavina T (THT) como tiempo de retraso a la fibrilación. El ensayo THT se midió como se describe en las muestras recientemente preparadas. 2. Radios de oligómero en nm y la ormación de agregados por debajo de 4 um por Dispersión de luz dinámica.

La estabilidad química de las formulaciones se midieron como incremento en Proteína de Peso Molecular Alto (HM P) incremento en insulina relacionado a impurezas después del almacenamiento por cuatro semanas (4 s) a 37°C relativamente a la cantidad de HMWP después del almacenamiento a 4°C.

La HMWP se midió usando método 2 de HMWP.

La formación de insulina relacionada a impurezas como desamidaciones se midió usando cromatografía de fase inversa (UPLC) Cantidad de monómero se midió en método 2 de filtración de gel nativo en eluyente sin fenol.

Formación de H WP y tiempo de retraso a la fibrilación en ensayo THT de insulina 7 Conclusión La cantidad de insulina 7 de monómero disminuye como una función de concentración de cloruro de sodio con un efecto grande de adición de solo hasta 50 mM de NaCl .

La degradación química medida como formación de HMWP y formación de impureza es baja en todas las formulaciones a pesar del contenido monomérico.

Los tiempos de retraso THT incrementan con contenido de zinc y contenido de cloruro de sodio.

Promedio de radios hidrodinámicos Rh prom. en nm e intensidad normalizada Inora prom. en 106 cuenta/seg (4°C) . Nota: Las muestras no se midieron en t=0. 5 20 Conclusión • Los radios hidrodinámicos incrementan con concentración de sal incrementada.

• La concentración de Zn tiene un impacto menor en tamaño excepto en 7 Zn por 6 Ins .

Ningún efecto significativo en tamaño de oligómero y estabilidad física de la temperatura de incubación.

Ejemplo 7 Ob etivo El objetivo de este experimento fue para medir la estabilidad química y física como una función de cloruro de sodio y concentración de acetato de sodio en la formulación con 4.2 mM de insulina 7.

Formulación La insulina 7 se disolvió en agua Milliq a una concentración final de alrededor de 9 mM en un valor de pH de alrededor de 8. Fenol, cresol, acetato de zinc (Zn) , cloruro de sodio, acetato de sodio y glicerol se agregaron en el orden mencionado que resulta en una formulación final que contiene: 4.5 Zn/6 insulinas, 25 mM de fenol, 25 mM de cresol, pH 7.4 una concentración de insulina de 4.2 mM y cloruro de sodio (NaCl) , acetato de sodio (NaAc) y glicerol como se establece en la tabla abajo.

Estabilidad física se evaluó al medir 3. Tendencia de fibrilación. Medida por ensayo de Tioflavina T. La tendencia de fibrilación se midió en ensayo de Tioflavina T (THT) como el tiempo de retraso a fibrilación. El ensayo THT se midió como se describe en las muestras recientemente preparadas. 4. Radios de oligómero en nm y formación de agregados por debajo de 4 um por Dispersión de Luz Dinámica.

La estabilidad química de las formulaciones se midió como incremento en la Proteína de Peso Molecular Alto (HMWP) incremento en insulina relacionado con impurezas después del almacenamiento por cuatro semanas (4 w) a 37 °C relativamente a la cantidad de HMWP después del almacenamiento a 4°C.

La HMWP se midió usando método 2 HMWP.

La formación de insulina relacionada con impurezas como desamidaciones se midió usando cromatografía de fase inversa (UPLC) Cantidad de monómero se midió en método 2 de filtración de gel nativo en eluyente con fenol .

Formación HWMP, Formación de Impureza y Tiempo de Retraso a fibrilación en ensayo THT Promedio de radios hidrodinámicos Rh prom. en mti e intensidad normalizada Inorm prom. en 106 cuenta/seg (4°C).

Promedio de radios hidrodinámicos Rh prom. en nm e intensidad normalizada Inora prom. en 10* cuenta/seg (37°C) .

Conclusión: • Los radios hidrodinámicos incrementan con fuerza iónica incrementada.

• Cambios muy pequeños en tamaño e intensidad dispersada sobre tiempo (similar o mejor que NovoRapid. ) Ningún efecto significativo en el tamaño de oligómero y estabilidad física de la temperatura de incubación.

Conclusión Cuando la insulina 7 en 4.2 mM de insulina y 4.5 zink/6 moles de insulina se formula con concentración de cloruro de sodio incrementada o cloruro de sodio combinado con acetato disminuir el contenido monomérico cuando se analiza con la filtración de gel nativo.

El efecto de cloruro de sodio y acetato de sodio es similar a la fuerza iónica total disminuye la cantidad de monómero .

Ejemplo 8 Objetivo El objetivo de este experimento fue medir la estabilidad química y física de la insulina 7 como una función de concentración de cloruro de sodio.

Formulación La insulina 7 se disolvió en agua Milliq en un valor de pH de alrededor de 8. Fenol, cresol, acetato de zinc (Zn) y glicerol se agregaron en el orden mencionado que resulta en una formulación final que contiene: 4.5 Zn/6 insulinas, 25 mM de fenol, 25 mM de cresol pH 7.4 y cloruro de sodio y cloruro de sodio como se establece abajo en la tabla .

La estabilidad física de las formulaciones se midió usando tres diferentes ensayos que dirigen diferentes aspectos de estabilidad física. 1. El tiempo de retraso a fibrilación se midió como tiempo de retraso en horas en ensayo de Tioflavina T (ThT) y recuperación de insulina medida por HPLC después del ensayo THT. 2. Reunión y formación de partícula en intervalo de tamaño por debajo de 4 pm se midió por Dispersión de luz dinámica (DLS) . 3. Reunión y formación de partícula en intervalo de tamaño por arriba de 4. ym se midió por formación de imágenes de micro flujo (MFI) de las formulaciones al estimar la concentración de las partículas de proteína por partícula MFI como función de tiempo de incubación y temperatura.

La estabilidad química de las formulaciones se midió como incremento en Proteína de peso molecular alto (HMWP) incremento en insulina relacionado a impurezas después del almacenamiento por cuatro semanas (4 w) a 37°C relativamente a la cantidad de HMWP después del almacenamiento a 4°C.

La HMWP se midió usando el método 2 HMWP.

La formación de insulina relacionada a impurezas como desamidaciones se midió usando cromatogra ía de fase inversa (UPLC) .

Medición de formación de imágenes de micro flujo de formación de partícula.

Radios hidrodinámicos promedio Rh prom. en nm e intensidad normalizada Inorm prom. en 106 cuenta/seg (4°C) .

Radios hidrodinámicos promedio Rh prom. en nm e intensidad normalizada Inorm prom. en 106 cuenta/seg (30°C) .

Radios hidrodinámicos promedio Rh prom. en nm e intensidad normalizada Inorm prom. en 106 cuenta/seg (37 °C) .

Aquí, la letra "d" es una abreviatura para días.

Radios hidrodinámicos promedio Rh prom. en nm e intensidad normalizada Inorm prom. en 106 cuenta/seg (45°C) .

Conclusión • Las muestras forman un oligómero cuyo tamaño depende de la concentración de sal.

• Los oligómeros permanecen estables a través de todo el experimento .

• Las temperaturas no afectan el tamaño de oligómero y la estabilidad bajo las afecciones especificadas.

Métodos Estabilidad química La estabilidad química de las formulaciones se midieron como incremento en Proteína de Peso Molecular Alto (HMWP) incremento en insulina relacionado a impurezas después del almacenamiento por ocho semanas (s) a 37°C relativamente a la cantidad de HMWP después del almacenamiento a 4°C.

Método 1 para medición de HMWP .

La HMWP se midió como sigue. La determinación cuantitativa de péptido (monomérica) así como el contenido de HMWP se realizó en Waters (300 x 7.8 mm, parte nr wat 201549) con un eluyente que contiene: 4 mM de L-arginina HCl, 496 mM de NaCl, 10 mM de NaH2P04/ 5 mM de H3P04/ 50% (volumen/volumen) 2-propanol en una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y 50°C. La detección se realizó con un detector de absorbancia sintonizable (Waters 486) en 276 nm. El Volumen de inyección fue 2 µ? y una insulina humana estándar 600 µ? se incluyó. La cantidad de HWMP se determinó en porcentaje de área relativamente al área total de la insulina en el cromatograma .

Método 2 para medición de HMWP.

La HMWP se midió como sigue. La determinación del contenido de HMWP relativamente a contenido de monómero de péptido se realizó en Waters (150 x 4.5 mm, parte nr wat) con un eluyente que contiene: 4 mM de L-arginina, 496 mM de NaCl, 10 mM de NaH2P04( 5 mM de H3P04, 50% (volumen/volumen) 2-propanol en una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y 50°C. La detección se realizó con un detector de absorbancia sintonizable (Waters 486) en 276 nm. Una insulina humana estándar 600 µ? se incluyó. La cantidad de HWMP se determinó en el porcentaje de área relativamente al área total de la insulina en el cromatograma.

La formación de la insulina relacionada con impurezas como desamidaciones se midió como sigue.

Cromatografía de fase inversa (UPLC) La determinación de la insulina relacionada con impurezas se realizaron en un sistema UPLC usando un Phenomenex Kinetix RP C18 2.1 x 150 mm columna, tamaño de partícula de 1.7 µp? con una velocidad de flujo de 0.3 ml/min. , en detección de 50°C en 220 nm. La elución se realizó con una fase móvil que consiste de lo siguiente: A. 10% (V/V) acetonitrilo, fosfato ácido di-amonio 0.09 M pH 3.6 B. 80% (volumen/volumen) acetonitrilo. Gradiente: 0-7 min cambio lineal 85%/l5% de A/B hasta 74%/26% A/B, 7-34 min cambio lineal hasta 60%/40% A/B, 34-36 min cambio lineal hasta 20%/80% de A/B, 36-38 min. gradiente isocrático en 20%/80% de A/B, 38-39 min cambio lineal hasta 85%/15% de A/B, 39-42 min. gradiente isocrático en 85%/15% de A/B.

Introducción general a ensayos de fibrilación ThT para la evaluación de estabilidad física de formulaciones de proteína La baja estabilidad física de un péptido puede llevar a formación de fibrillas de amiloide, que se observa así ordenada, estructuras macromoleculares de tipo filiforme en la muestra eventualmente que resulta en formación de gel . Esto se ha medido tradicionalmente por inspección visual de la muestra. Sin embargo, esta clase de medición es muy subjetiva y depende del observador. Por lo tanto, la aplicación de una sonda de indicador de molécula pequeña es mucho más ventajosa. La tioflavina T (ThT) es tal sonda y tiene una firma de fluorescencia distinta cuando se enlaza a fibrillas [Naiki et al. in Anal. Biochem. 177 (1989), 244-249; y LeVine in Methods . Enzymol . 309 (1999), 274-284] .

El curso del tiempo para formación de fibrilla se puede describir por una curva sigmoidal con la siguiente expresión [Nielsen et al. in Biochemistry 40 (2001), 6036-6046]: Aquí, F es la fluorescencia ThT en el tiempo t. La constante to es el tiempo necesario para alcanzar 50% de la fluorescencia máxima. Los dos parámetros importantes que describen la formación de fibrilla son el tiempo de retraso calculado por to - 2t y la constante de velocidad aparente kapp = 1/T · La formación de un intermediario parcialmente plegado del péptido se sugiere como un mecanismo de iniciación en general para fibrilación. Pocos de aquellos intermediarios se nuclean para formar una plantilla sobre la cual los intermediarios adicionales pueden montarse y la fibrilación procede. El tiempo de retraso corresponde al intervalo en el cual la masa crítica de núcleo se construye y la constante de velocidad aparente es la velocidad con la cual las fibrillas por sí mismas se forman.

Preparación de la muestra Las muestras se prepararon recientemente antes de cada ensayo. Cada composición de la muestra se describe en los ejemplos. El pH de la muestra se ajustó al valor deseado usando cantidades apropiadas de NaOH concentrado y HCl . Tioflavina T se agregó a las muestras de una solución de reserva en H2O a una concentración final de 1 |1M.

Las alícuotas de muestra de 200 µ? se colocaron en una placa de microtítulo de 96 pozos (Packard OptiPlate™-96 , poliestireno blanco) . Típicamente cuatro (u ocho) replicas de cada muestra (que corresponden a una condición de prueba) se colocaron en una columna de pozos. La placa se selló con Scotch Pad (Qiagen) .

Incubación y medición de fluorescencia La incubación en temperatura determinada, agitación y medición de la emisión de fluorescencia ThT se hicieron en un lector de placas de fluorescencia Fluoroskan Ascent FL (Thermo Labsystems) . La temperatura se ajustó a 37°C. La placa se incubó ya sea sin agitación (ninguna tensión física externa) o con agitación orbital ajustada a 960 rpm con una amplitud de 1 mm. La medición de fluorescencia se hizo usando la excitación a través de un filtro 444 nm y medición de emisión a través de un filtro 485 nm. Cada corrida se inició al incubar la placa en la temperatura de ensayo por 10 min.

La placa se midió cada 20 minutos por un periodo deseado de tiempo. Entre cada medición, la placa se agitó y calentó como se describió. El ensayo se realizó por hasta 45 horas.

Medición de concentración HPLC: Recuperación Después de la finalización del ensayo ThT, las cuatro u ocho réplicas de cada muestra se agruparon y centrifugaron a 20,000 rpm por 30 minutos a 18°C. El sobrenadante se filtró a través de un filtro 0.22 µ?? y una alícuota se transfirió a un vial HPLC.

La concentración de péptido en la muestra inicial y en el sobrenadante filtrado se determinó por HPLC de fase inversa usando un estándar apropiado como referencia. La fracción de porcentaje de la concentración de la muestra filtrada constituida en relación a la concentración de muestra inicial se reportó como la recuperación.

Manejo de datos Los puntos de medición se salvaron en formato de Microsoft Excel para procesamiento adicional y el dibujo de la curva y ajuste se realizó usando GraphPad Prism. La emisión de fondo de ThT en la ausencia de fibrillas fue insignificante. Los puntos de datos son típicamente una media de cuatro u ocho muestras y se muestran con barras de error de desviación estándar. Únicamente los datos obtenidos en el experimento de muestra (esto es muestras en la misma placa) se presentan en la misma gráfica asegurando una medida de fibrilación relativa entre experimentos.

Los datos establecidos se pueden instalar en la Ecuación (1) . Sin embargo, el tiempo de retraso antes de la fibrilación se puede evaluar por inspección visual de la curva que identifica el punto de tiempo en el cual la fluorescencia ThT incrementa significativamente por arriba del nivel de fondo. Si no se observó incremento de fluorescencia ThT para cualquiera de las réplicas en una muestra dentro del tiempo de ensayo de 45 horas, un tiempo de retraso de 45 horas se asignó.

Estabilidad física medida por Dispersión de Luz Dinámica (DLS) Dispersión de luz dinámica En la dispersión de luz dinámica, las fluctuaciones de microsegundos en incidente de luz láser dispersada en una muestra acuosa se detecta y transforma en coeficientes de difusión (Df) de las especies individuales por medio de la denominada función de autocorrelación . Por conveniencia, los coeficientes de difusión se reportan típicamente en radios hidrodinámicos (J?h) suponiendo que la muestra consiste de especies esféricas. Además, de los radios, una estimación empírica del peso molecular se obtiene. La dispersión de luz dinámica es un método altamente sensible, que puede resolver cambios pequeños en tamaño así como cantidades pequeñas de especies agregadas que son indeseables en formulaciones farmacéuticas.

El promedio, intensidad estática registrada por el detector también sirve como una medida general de la estabilidad física de la muestra como desarrollo de especies más grandes incrementa la intensidad dispersada drásticamente .

Método: Dispersión de luz dinámica Las muestras se prepararon en 20 mM de fosfato pH 7.5 solución amortiguadora y tenían concentraciones de 0.9 mg/mL o 45.5 mg/mL (11.5 y 0.23 mM, respectivamente). Las mediciones se realizaron en un lector de placas Wyatt (Santa Barbara, CA) DynaPro DLS a 25°C, y las muestras se mantuvieron a 37°C entre las mediciones. Las muestras se midieron por hasta dos semanas en puntos de tiempo indicados en la Tabla 1. Las mediciones se realizaron en 25-uL triplicado o quintuplicado en placas de microtitulación de 384 pozos Corning 3540 (Corning, NY) selladas con láminas de plástico transparente (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) con veinte adquisiciones de 10 segundos por medición. Las curvas de autocorrelación se ajustaron con un ajuste de regularización en Dinámicos 7.1.7.16 y los coeficientes de difusión resultantes se transformaron en radios hidrodinámicos y masa molecular que asume una forma esférica y una relación empírica entre tamaño y masa. Las Intensidades dispersas se normalizaron con respecto a intensidad láser y sensibilidad del detector.

Formación de partícula por arriba de 4 µ?a medida por Formación de Imágenes de Micro Flujo (MFI) .

Las soluciones se incubaron en los cartuchos Penfill® en las temperaturas establecidas en la tabla. Después de los periodos de incubación determinados, los cartuchos Penfill® se vaciaron en tubos de halcón 14mL. 2xlmL de la muestra se analizó en el sistema MFI5200+Botl . La concentración de partículas como proteína (?0?>4µt? y Circularity*AspectRat io* IntensitySTD <70) se midieron para filtrar lejos variabilidad de Penfill18 a Penfil® en la concentración de aceite de silicona como gotas.

Distribución de las especies como se observa por SEC en pH neutral.

Método 1.

La solución amortiguadora de ejecución fue 150 mM de NaCl, 2 mM de fenol y 10 mM de Tris pH 7.6. Un estándar de M comprende una insulina monomérica (X2) (19.0 min) , insulina hexamérica sin disociación (Co(III)HI ("HI" es insulina humana)) (16.0 min), HSA (14.0 min) y dímero HSA (12.5 min) se usó para la asignación de las especies. El límite de exclusión de columna fue 2x106 Da. El envolvente cromatográf ico se integró y los dihexameros se definieron como AUC 12.5 min - 14.3 min, los hexámeros como 14.3 min - 16.0 min y los oligómeros más pequeños que hexámeros como 16.0 min -21.0 min.

Método 2 La columna, BEH200, 1.7 µp?, 4.6 x 150mm columna de Waters con flujo 0.3 ml/min a 22°C de 8 mM de fenol en el método con fenol o 0 mM de fenol en método sin fenol, 140 mM de NaCl , 10 mM de Tris/HCl pH 7.4. La distribución de las especies se detecta por UVVis y evalúa contra estándares de proteína MW apropiados.

Todas las referencias, que incluyen publicaciones, solicitudes de patentes, y patentes, citadas en la presente se incorporan en la presente como referencia en su totalidad y en el mismo grado como si cada referencia fuera individualmente y específicamente indicada para incorporarse como referencia y se establecieron en su totalidad en la presente (en la medida máxima permitida por la ley) .

La cita e incorporación de los documentos de patentes en la presente se hace por conveniencia únicamente y no refleja ningún punto de vista de la validez, patentabilidad, y/o exigibilidad de tales documentos de patentes. La mención en la presente de las referencias no hay admisión de que constituyen el arte previo.

Todos los títulos y sub-títulos se usan en la presente por conveniencia únicamente y no deben interpretarse como que limitan la invención de ninguna manera .

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por uno de experiencia ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. En el caso de inconsistencia entre la presente descripción y las patentes emitidas, solicitudes y referencias que se citan en la presente o en otros lugares, la presente descripción prevalecerá.

El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionados en la presente, se pretende únicamente iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique de otra manera. Ningún lenguaje en la especificación se debe interpretar como que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial a la práctica de la invención.

En la presente, la palabra "comprende" es para interpretarse en sentido amplio que significa "incluye", "contiene" o "comprender" (vide, Guidelines for Examination in the Europe Patent Office, part C, chapter III, 4.21, December 2007) .

Esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia objeto referidas en las reivindicaciones y cláusulas anexas a la presente según lo permitido por la ley aplicable.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque contiene un derivado de insulina que tiene la fórmula general I: Acy-X-Yn-Ins, en donde "Ins" designa un análogo de insulina al cual un cadena lateral (designada Acy-X-Yn-) se ha enlazado al grupo amino e presente en el aminoácido de lisina B29 en el análogo de insulina, el análogo de insulina es insulina humana que contiene ácido glutámico en la posición A14, histidina en la posición B25, opcionalmente histidina en la posición B16 y, opcionalmente, los aminoácidos B27 y/o B30 se han eliminado, Acy es un diácido graso con 8-24 átomos de carbono de los cuales un grupo hidroxilo se ha eliminado, X es yGlu en donde el residuo amino se ha conectado a "Acy" y - si n es diferente de cero -el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado a Y o - si n es cero - el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado al grupo amino e en lisina en la posición B29 en el análogo de insulina, Y es -NH- (CH2) 2-0- (CH2) 2-0-CH2-CO- en donde el grupo amino se conecta a X y el grupo carbonilo se conecta al grupo amino e en lisina en la posición B29 en el análogo de insulina, y n es 0 (cero), 1, 2 o 3, no más de alrededor de 2% (peso/peso) de glicerol, desde alrededor de 16 hasta alrededor de 35 mM de fenol, desde alrededor de 16 hasta alrededor de 35 mM de m-cresol, desde alrededor de 3.5 hasta alrededor de 8 mol de iones de zinc por 6 mol del derivado de insulina y que tiene una fuerza iónica en el intervalo desde alrededor de 0 hasta alrededor de 150.

2. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizada porque tiene los rasgos preferidos mencionados en las cláusulas anteriores.

3. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque contiene un derivado de insulina que tiene la fórmula general I: Acy-X-Yn-Ins , en donde "Ins" designa un análogo de insulina al cual una cadena lateral (designada Acy-X-Yn-) se ha enlazado al grupo amino e presente en el aminoácido de lisina B29 en el análogo de insulina, el análogo de insulina es insulina humana que contiene ácido glutámico en la posición A14, histidina en la posición B25, opcionalmente histidina en la posición B16 y, opcionalmente, los aminoácidos B27 y/o B30 se han eliminado, Acy es un diácido graso con 8-24 átomos de carbono de los cuales un grupo hidroxilo se ha eliminado, X es yGlu en donde el residuo amino se ha conectado a "Acy" y - si n es diferente de cero -el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado a Y o - si n es cero - el grupo carbonilo en yGlu se ha conectado al grupo amino e en lisina en la posición B29 en el análogo de insulina, Y es -NH- (CH2) 2-O- (CH2) 2-O-CH2-CO- en donde el grupo amino se conecta a X y el grupo carbonilo se conecta al grupo amino e en lisina en la posición B29 en el análogo de insulina, y n es 0 (cero) , 1, 2 o 3, desde alrededor de 1 hasta alrededor de 2% (peso/peso) de glicerol, desde alrededor de 16 hasta alrededor de 35 mM de fenol, desde alrededor de 16 hasta alrededor de 35 mM de m-cresol, desde alrededor de 3.5 hasta alrededor de 5.5 mol de iones de zinc por seis mol del derivado de insulina y no más de alrededor de 75 mM de cloruro de sodio.

4. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizada porque tiene los rasgos preferidos mencionados en las cláusulas anteriores.

5. La formulación de conformidad con la reivindicación anterior, caracterizada porque el derivado de insulina se selecciona del grupo que consiste de A14E, B16H, B25H, B29K( (N^eicosanedioil-YGlu- [2- (2-{2- [2- (2-aminoetoxi) etoxi] acetilamino} etoxi) etoxi] acetil) ) , insulina humana desB30, A14E, B16H, B25H, B29K(N£hexadecandioil-YGlu) , insulina humana desB30; A14E, B16H, B25H, B29K(NEeicosanedioil-YGlu) , insulina humana desB30; y A14E, B25H, desB27, ?29?(?e- (octadecandioil-YGlu) , insulina humana desB30.

6. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la medida de lo posible. caracterizada porque contienen una cantidad de un derivado de insulina de la fórmula general I que está por arriba de alrededor de 1.2 mM, preferiblemente por arriba de alrededor de 2.1 mM .

7. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la medida de lo posible, caracterizada porque contienen una cantidad de un derivado de insulina de la fórmula general I que está por debajo de alrededor de 9 mM, preferiblemente por debajo de alrededor de 7.1 mM, más preferido por debajo de alrededor de 6 mM.

8. La formulación de de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la medida de lo posible, caracterizada porque contienen alrededor de 2.1-5.2 mM del derivado de insulina, alrededor de 0.5-1.8% (peso/peso) de glicerol, alrededor de 22-28 mM de fenol, alrededor de 22-28 mM de m-cresol, alrededor de 3.8-5 iones de zinc por seis mol de derivado de insulina, alrededor de 10-90 mM de cloruro de sodio y que tiene un valor de pH de alrededor de 7.2-8.2.

9. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque contiene alrededor de 4.2 mM del derivado de insulina, alrededor de 1.6% (peso/peso) de glicerol, alrededor de 25 mM de fenol, alrededor de 25 mM de m-cresol, alrededor de 4.5 Zn iones por 6 moles del derivado de insulina, alrededor de 20 mM de cloruro de sodio y que tiene un valor de pH de alrededor de

10. La formulación, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la medida de lo posible, caracterizada porque contiene alrededor de 4.2 mM del derivado de insulina, alrededor de 0.7% (peso/peso) de glicerol, alrededor de 25 mM de fenol, alrededor de 25 mM de m-cresol, alrededor de 4.5 iones de zinc por seis mol de derivado de insulina, alrededor de 75 mM de cloruro de sodio y que tiene un valor de pH de alrededor de 7.4.