KR100310122B1

KR100310122B1 - 아실화된인슐린

Info

Publication number: KR100310122B1
Application number: KR1019960701400A
Authority: KR
Inventors: 하벨룬트 스벤트; 브로베르그 할스트룀 존; 요나센 이브; 스로드 안데르센 아세르; 마루쿠센 잔
Original assignee: 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느; 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 1993-09-17
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 2002-04-24
Also published as: JP2002308899A; BG61611B1; DE69428134D1; NO2004006I2; DE122004000035I2; NO2017041I1; FI961220A0; PL178466B1; NL300160I1; DE122004000035I1; FR04C0020I1; HUT75991A; IL110977A0; EP0792290B1; FI961220A; PL313444A1; RU2164520C2; WO1995007931A1; SI0792290T1; NO2017041I2

Abstract

본 발명은 A21 및 B3 아미노산 잔기는, 독립적으로, Lys, Arg 및 Cys를 제외한 유전암호에 의해 암호될 수 있는 어떤 아미노산 잔기이며; Phe^B1이 결실될 수도 있으며; B30 아미노산 잔기는 a) 10개에서 24개의 탄소원자를 갖는 비암호성, 친유성 아미노산이며, 이 경우에 탄소원자 5개까지 갖는 카르복실산의 아실기는 Lys^B29의 ε-아미노기에 결합되거나 또는, b)B30 아미노산 잔기는 결실되거나 Lys, Arg 및 Cys를 제외한 유전암호에 의해 암호될 수 있는 어떤 아미노산 잔기이며, 그 경우들중 어느 한 경우에 있어서 Lys^B29의 ε-아미노기는 친유성 치환체를 갖고 있는 지속성 인간 인슐린 유도체 그리고 B30이 Thr 또는 Ala이고 A21및 B3 둘다가 Asn이고 Phe^Bl이 존재할때의 조건하에서 그것의 어떤 Zn²⁺복합체, 즉 존재하는 인슐린 유도체에 관한 것이다.

Description

아실화된 인슐린

본 발명은 여기에 첨부된 도면을 참고함으로써 설명되어진다.

제 1도는 플라스미드 pEA5.3.2의 구성을 보여주며;

제 2도는 플라스미드 pEA108의 구성을 보여주며; 그리고

제 3도는 플라스미드 pEA113의 구성을 보여준다.

발명의 분야

본 발명은 가용성이고 지속적 작용의 형태를 갖는 신규한 인간 인슐린 유도체, 그런 유도체를 제공하는 방법, 그것들을 함유하는 약제학적 조성물, 그리고 당뇨병 치료에 그런 인슐린 유도체의 사용에 관한 것이다.

발명의 배경

많은 당뇨병 환자들은 식사에 관련된 요구사항을 충족시키기 위해 신속하게 작용하는 인슐린의 거환주사제를 보충해 기본적 요구사항을 충족시키기 위해 지속성이 있는 인슐린을 1일 1회 또는 2 회 주사로 이루어진 규정식이법으로 1 일 수회의 인슐린을 주사해 치료를 받는다.

지속성이 있는 인슐린 조성물은 본 분야에서 잘 알려져 있다. 따라서, 지속성 인슐린조성물의 한가지 주요형태는 인슐린 결정 또는 무결정 인슐린의 주사용수성현탁액으로 이루어졌다.

이들 조성물에서, 전형적으로 이용되는 인슐린 화합물은 프로타민인슐린, 아연인슐린 또는 프로타민아연인슐린이다.

인슐린 현탁액을 사용하는데 있어 몇가지 결점들이 발견된다. 따라서, 확실하게 정확한 양을 투여하기 위해, 인슐린 입자들은, 현탁액의 규정부피를 작은병으로부터 회수되거나 카트리지로부터 방출하기 전에, 부드럽게 흔들어서 균질하게 현탁시켜야 한다. 또한, 인슐린 현탁액의 저장시에는 덩어리 형성 또는 응고를 피하기 위하여 인슐린용액의 경우보다 더 정확한 온도를 유지해야 한다.

전에는 프로타민이 비- 면역원인 것으로 믿었지만, 현재 프로타민이 사람에게 면역원일수 있고 의학적 목적으로 그것들을 사용하면 항체의 형성을 유도한다고 밝혀졌다 (Samuel et al., Studies on the immunogenecity of protamines in humans and experimental animals by means of a micro-complement fixation test, Clin. Exp. Immunol. 33, pp 252-260 (1978)).

또한, 프로타민- 인슐린 복합체 그 자체도 면역원이라는 증거가 발견되었다 (Kurtz et al., Circulating IgG antibody to protamine in patients treatcd with protamine-insulins. Diabetologica 25, pp. 322-324 (1983)). 그러므로, 어떤 환자의 경우 프로타민을 함유하는 지속성 인슐린 조성물의 사용을 피해야 한다.

지석성 인슐린 조성물의 또 다른 형태는 본 용액이 주사될 때 pH값이 상승하기 때문에 인슐린이 침전되는 생리학적 pH이하의 pH값을 갖는 용액이다. 이들 용액의 결점은 주사시 조직에 형성되는 침전물의 입자크기분포 그리고 약물치료의 타이밍은 주사부위의 혈류(blood flow) 그리고 다소 예견할 수 없는 방식의 다른 변수에 달려 있다는 것이다. 다른결점은 인슐린의 고체입자가 주사부위의 조직에 염증을 일으키는 국소자극제로서 작용할 수도 있다는 것이다.

WO 91/12817 (Novo Nordisk A/S)는 코발트(III) 의 인슐린 복합체로 이루어진 지속적, 가용성 인슐린 조성물을 개시한다. 이들 복합체의 지속성은 단지 중간정도이고 생물학적이용가능성은 감소된다.

인간 인슐린은 3 개의 1 차 아미노기를 갖는다: A-사슬 및 B-사슬의 N-말단기 및 Lys^B29의 ε-아미노기. 이들 기중에서 하나 또는 그 이상이 치환된 여러 인슐린 유도체는 종래의 기술에서 공지되었다. 따라서, 미국 특허 No. 3,528,960 (Eli Lilly) 은 인슐린 분자의 하나, 둘 또는 세개의 1 차 아미노기가 카르복시아로일기를 갖는 N-카르복시아로일 인슐린에 관한 것이다. 구체적으로 N.^εB29-치환 인슐린은 개시되지 않았다.

영국 특허 No. 1.492.997 (Nat. Res. Dev. Corp.)에 따르면, N^εB29에 카르바밀 치환을 가진 인슐린은 저혈당(hypoglycaemic) 효과를 개선한 형태를 갖는다는 것이 밝혀졌다.

일본 공개 특허출원 No. 1-254699 (Kodama Co., Ltd.) 은 지방산이 Phe^Bl의 아미노기 또는 Lys^B29의 ε- 아미노기 또는 이들 양자에 결합된 인슐린을 개시한다. 진술된 유도화의 목적은 약리학적으로 허용가능하고, 안정된 인슐린 제조물을 얻는데 있다.

뉴클레오티드의 삼중체(triplet) 에 의해 필연적으로 암호될 수 없는, 적어도 다섯 개의 탄소원자를 가진 아미노산을 B30 위치에 갖는 인슐린이 일본 공개특허출원 No. 57-067548(Shionogi)에 기재되어 있다. 인슐린 유사체는 진성당뇨병의 치료, 특히 소 또는 돼지 인슐린 항체의 생성에 기인한 인슐린 저항성인 환자에 유용한 것으로 주장되었다.

여기서 사용된 "인슐린 유도체" 는 Cys^A7와 Cys^B7사이 그리고 Cys^A20와 Cys^Bl9사이의 이황화물가교 그리고 Cys^A6와 Cys^A11사이의 내부 이황화물가교를 포함하는 인간 인슐린의 구조와 유사한 분자구조를 가지며, 그리고 인슐린 활성을 가진 화합물을 의미한다.

그러나, 용액이고 주사후에도 용액으로 남아 있는 인슐린을 함유하고 최소 염증성 및 면역성을 갖는 주사용 지속성 인슐린 조성물을 여전히 필요로 한다.

본 발명의 한가지 목적은 생리적 pH 값에서 가용성인, 지속적 작용의 형태를 가진 인간인슐린 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 인간 인슐린 유도체로 이루어진 약제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명 인간 인슐린 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

발명의 개요

놀랍게도, Lys^B29의 ε- 아미노기가 친유성 치환체를 가진 어떤 인간 인슐린 유도체는 지속적 작용의 형태를 갖고 생리적 pH 값에서 가용성이라는 것이 밝혀졌다.

따라서, 가장 넓은 관점에서 본 발명은 다음의 서열:

[상기 서열에서, A21 및 B3 위치의 Xaa 는, 독립적으로, 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg 및 Cys 를 제외한 어떤 아미노산 잔기도 되며;

B1 위치의 Xaa 는 Phe 이거나 결실되며;

B30 위치의 Xaa 는 (a) 10 내지 24개의 탄소원자를 가진 비암호성, 친유성 아미노산이며 (이 경우에 탄소원자를 5 개까지 갖는 카르복실산의 아실기는 Lys^B29의 ε- 아미노기에 결합된다), (b) 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg 및 Cys 를 제외한 어떤 아미노산 잔기도 되며 (이 경우에 Lys^B29의 ε- 아미노기가 친유성 치환체를 갖는다) 또는 (c) 결실된다(이 경우에 Lys^B29의 ε- 아미노기가 친유성 치환체를 갖는다)]을 가진 인슐린 유도체와 그것의 어떤 Zn²⁺복합체에 관한 것이다. 단, B30 위치의 Xaa 가 Thr 또는 Ala 이고, A21 및 B3 위치의 Xaa 가 둘다 Asn 이고, B1 위치의 Xaa 가 Phe 일 때 인슐린 유도체는 Zn²⁺복합체이다.

한 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산 잔기가 결실되거나 유전암호에 의해 암호될 수 있는, lys, Arg 및 Cys 를 제외한 어떤 아미노산 잔기도 되며; A21 및 B3 아미노산 잔기가, 독립적으로, 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg 및 Cys 를 제외한 어떤 아미노산 잔기이며; Phe^B1이 결실될 수 있으며; Lys^B29의 ε- 아미노기가 적어도 6 개의 탄소원자로 이루어진 친유성 치환체를 가지며; 만일 B30 이 Thr 또는 Ala 이고 A21 및 B3이 둘다 Asn 이고, Phc^B1이 결실될 때 2-4 개의 Zn²⁺이온이 인슐린 유도체의 각각의 6 량체에 결합된다는 조건하에 2-4개의 Zn²이온이 인슐린 6 량체 각각에 결합될 수 있는 인간 인슐린유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산 잔기가 결실되거나 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg, 및 Cys 를 제외한 어떤 아미노산잔기도 되며; 만일 B30 아미노산잔기가 Ala 또는 Thr 이라면 A21 및 B3 아미노산 잔기가, 독립적으로, 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg 및 Cys 를 제외한 어떤 아미노산 잔기도 되고, 이때 A21 및 B3 잔기의 적어도 하나는 Asn 이 아니며; Phe^B1은 결실될 수 있으며; Lys^B29의 ε-아미노기가 적어도 6 개의 탄소원자로 이루어진 친유성 치환체를 갖는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, B30 아미노산 잔기가 결실되거나 유전암호에 의해 암호될 수 있는 lys, Arg 및 Cys 를 제외한 어떤 아미노산 잔기이며; A21 및 B3 아미노산 잔기가, 독립적으로, 유전암호에 의해 암호될 수 있는 Lys, Arg 및 Cys를 제외한 어떤 아미노산 잔기이며, Phe^B1은 결실될 수 있으며, Lys^B29의 ε- 아미노기는 적어도 6 개의 탄소원자로 이루어진 친유성 치환체를 가지며; 그리고 2-4 개의 Zn²⁺온이 각 인슐린 6 량체에 결합되는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산 잔기가 결실된 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산 잔기가 Asp 인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산 잔기가 Glu 인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산 잔기가 Thr 인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 적어도 10개의 탄소원자를 갖는 친유성 아미노산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 10 내지 24개의 탄소원자를 갖는 친유성 α- 아미노산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 10 내지 24개의 탄소원자를 갖는 직쇄, 포화, 지방족 α- 아미노산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 D 또는 L-N^ε- 도데칸오일리신인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 α-아미노 데칸산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 α-아미노 운데칸산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 α-아미노 도데칸산인 인간 인슐린유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 α-아미노 트리데칸산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 α-아미노 테트라데칸산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 α-아미노 펜타데칸산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 α-아미노 헥사데칸산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B30 아미노산이 α-아미노산인 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 A21 아미노산 잔기가 Ala 인 인간인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 A21 아미노산 잔기가 Gln 인 인간인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 A21 아미노산 잔기가 Gly 인 인간인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 A21 아미노산 잔기가 Ser 인 인간인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B3 아미노산 잔기가 Asp 인 인간인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B3 아미노산 잔기가 Gln 인 인간인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 B3 아미노산 잔기가 Thr 인 인간인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Lys^B29의 ε-아미노기가 적어도 6 개의 탄소원자를 갖는 카르복실산에 상응하는 아실기인 친유성 치환체를 갖는 인간인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 8 내지 24 원자길이의 탄소원자 사슬을 갖는 카르복실산에 상응하는, 분지된 또는 분지되지 않은 아실기인 친유성치환체를 갖는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 적어도 6 개의 탄소원자를 갖는 지방산에 상응하는 아실기인 친유성 치환체를 갖는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 6 내지 24개의 탄소원자를 갖는 선형, 포화 카르복실산에 상응하는 아실기인 친유성 치환체를 갖는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 8 내지 12개의 탄소원자를 갖는 선형, 포화 카르복실산에 상응하는 아실기인 친유성 치환체를갖는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 10 내지 16개의 탄소원자를 갖는 선형, 포화 카르복실산에 상응하는 아실기인 친유성 치환체를 갖는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 10개, 바람직하게는, 5 개까지의 옥시에틸렌 단위체로 이루어진 올리고옥시에틸렌기인 친유성 치환체를 갖는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 10개, 바람직하게는, 5 개까지의 옥시프로필렌 단위체로 이루어진 올리고옥시프로필렌기인 친유성 치환체를 갖는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 각 인슐린 6 량체가 2 개 Zn²⁺이온과 결합하는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 각 인슐린 6량체가 3개 Zn²⁺이온과 결합하는 인간인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 각 인슐린 6 량체가 4 개 Zn²⁺이온과 결합하는 인간 인슐린 유도체에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 당뇨병 치료용 약제의 제조를 위한 본발명에 따른 인간 인슐린 유도체의 사용에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 치료하는데 효과적인 양의 본 발명에 따른 인간 인슐린 유도체로 이루어진, 치료가 필요한 환자의 당뇨병을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 신속하게 작용이 개시되는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로, 치료하는데 효과적인 양의 본 발명에 따른 인간 인슐린 유도체로 이루어진, 당뇨병의 치료가 필요한 환자의 당뇨병을 치료하기 위한 약제 조성물에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 생리적 pH 값에서 가용성인, 본 발명에 따른 인간인슐린 유도체로 이루어진 약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 약 6.5 내지 약 8.5 사이의 pH 값에서 가용성인, 본 발명에 따른 인간 인슐린 유도체로 이루어진 약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간 인슐린 유도체로 이루어진 지속성 약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간 인슐린 유도체 약 120nmol/ml 내지 약 1200nmol/ml, 바람직하게는 약 600nmol/ml를 함유하는 용액인 약제조성물에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 치료하는데 효과적인 양의 본 발명에 따른 인슐린 유도체를 환자에게 투여하는것으로 이루어진, 치료가 필요한 환자의 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 신속하게 작용이 개시되는 인슐린 또는 인슐린 유사체와 혼합된 치료하는데 효과적인 양의 본 발명에 따른 인슐린 유도체를 환자에게 투여하는 것으로 이루어진, 치료가 필요한 환자의 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Zn²⁺이온이 결합되지 않는,본 발명에 따른 인간 인슐린 유도체의 바람직한 예는 다음과 같다:

인슐린 6 량체당 2 개의 Zn²⁺이온이 결합되는, 본 발명에 따른 인간 인슐린유도체의 바람직한 예는 다음과 같다:

인슐린 6 량체당 4 개의 Zn²⁺이온이 결합되는, 본 발명에 따른 인간 인슐린 유도체의 바람직한 예는 다음과 같다:

발명의 상세한 설명

용어

여기서 사용된 아미노산 잔기에 대한 3 문자암호 및 1 문자암호는 J. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968) 에 기술된 것들이다.

DNA서열에서, A 는 아데닌, C 는 시토신, G는 구아닌, 그리고 T는 티민이다.

다음의 약어가 사용되었다:

DMSO는 디메틸 술폭시드, DMF 는 디메틸포름아미드, Boc는 tert- 부톡시카르보닐, RP-HPLC는 역상고속액체 크로마토그래피, X-OSu 는 N-히드록시숙신이미드에스테르, X 는 아실기,그리고 TFA는 트리플루오로아세트산이다.

친유성 인슐린 유도체의 제조

본 발명에 따른 인슐린 유도체는 특히 다음에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

1. B30 위치에 유전암호에 의해 암호될 수 있는 아미노산 잔기, 예컨대 트레오닌 (인간 인슐린) 또는 알라닌 (돼지 인슐린) 이 존재하는 것이 특징인 인슐린 유도체

1.1. 인간 인슐린으로부터 출발

인간 인슐린은 (A1,B1)-diBoc 인간 인슐린을 구성하기 위해 Boc-시약(예. 디-tert-부틸디카보네이트)으로 처리되는데 양사슬의 N-말단끝이 Boc-기로 보호되어 있다. 예컨대 HPLC 로 선택적으로 정제한 후, 생성물을 X-OSu 식 (여기서 X 는 도입되어질 아실기이다) 의 히드록시숙신이미드 에스테르와 반응시킴으로써 아실기를 Lys^B29의 ε- 아미노기에 도입한다.

최종단계에서, TFA 를 사용하여 Boc-기를 제거하고 생성물, N^εB29_X 인간 인슐린을 분리한다.

1.2. 단일 사슬 인슐린 전구체로부터 출발

아르기닌 잔기를 경유하여 B1에 연결된 연장체(Ext) 로 B1위치에서 연장되고, B30 으로부터 A1으로의 가교가 아르기닌 잔기인 단일 사슬 인슐린 전구체, 즉, 일반식 Ext-Arg-B(1-30)-Arg-A(1-21)의 화합물을 출발물질로서 사용할 수 있다. 이 출발물질을 X 가 아실기인 일반식 X-OSu 의 N-히드록시숙신이미드 에스테르로 아실화함으로써 Lys^B29의 ε-아미노기 그리고 전구체의 N-말단 아미노기에 아실기 X를 도입시킨다 식 (N^εB29-X), X-Ext-Arg-B(1-30)-Arg-A(1-21) 의 이 아실화된 전구체를, 물과 적합한 수혼화성 유기용매, 예컨대, DMF, DMSO 또는 저급 알코올의 혼합물에서, 트립신으로 처리함으로써, 식 (N^εB29-X), Arg^B3l인슐린의 중간 생성물을 얻는다. 이 중간생성물을 카르복시펩티다제 B 로 처리함으로써 원하는 생성물, (N^εB29-X) 인슐린을 얻는다.

2. B30 위치에 아미노산 잔기가 없는 인슐린 유도체, 즉 데스(des)(B30) 인슐린

2.1 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린으로부터 출발

인간 인슐린 및 돼지 인슐린 양자를 암모늄 완충액에서 카르복시펩티다제 A로 처리하여 데스(B30) 인슐린을 얻는다. 선택적 정제후, 데스(B30) 인슐린은 (A1,B1)-diBoc 데스(B30) 인슐린을 구성하기 위해 Boc-시약(예. 디-tert-부틸디카보네이트)으로 처리되고 양사슬의 N-말단끝은 Boc-기로 보호된다. 예컨대 HPLC로 선택적으로 정제한 후, 생성물을 X-OSu 식 (여기서 X 는 도입되어질 아실기이다) 의 히드록시숙신이미드 에스테르와 반응시킴으로써 아실기를 Lys^B29의 ε- 아미노기에 도입한다.

최종단계에서, TFA를 사용하여 Boc-기를 제거하고 생성물, N^εB29-X 데스(B30) 인슐린을 분리한다.

2.2. 단일 사슬 인간 인슐린 전구체로부터 출발

B30에서 A1까지 가교되 있는 아르기닌 잔기를 경유해 B1에 연결되 있는 연장체(Ext)로 B1위치에서 연장되 있는 단일사슬 인간 인슐린 전구체는유용한 출발물질 일 수 있다. 바람직하게는, 가교는 식 Y_n-Arg (여기서 Y 는 리신 및 아르기닌을 제외한 암호가능한 아미노산이고, n 은 0 또는 1과 35사이에 있는 정수이다) 의 펩티드이다. n>1 일때, Y들은 다른 아미노산을 지시할 수도 있다. B30 으로부터 A1으로의 가교중 바람직한 예는 AlaAlaArg, SerArg, SerAspAspAlaArg 및 Arg 이다 (유럽특허 163529). 일반식 Ext-Arg-B(1-30)-Y_n-Arg-A(1-21)의 그런 전구체를 리실엔도펩티다제, 예컨대, Achromobacter lyticus 프로테아제로 처리하여 Ext-Arg-B(1-29) Thr-Y_n-Arg-A(1-21) 데스(B30) 인슐린을 얻는다. 이 중간생성물을 일반식 X-OSu (여기서 X는 아실기이다) 의 N-히드록시숙신이미드에스테르로 아실화하여 Lys^B29의 ε-아미노기 그리고 A-사슬 및 B-사슬의 N-말단 아미노기에 아실기X를 도입함으로써 (N^εB29-X)-X-Ext-Arg-B(1-29) X-Thr-Y_n-Arg-A(1-21) 데스(B30)인슐린을 얻는다. 이 중간생성물을 물과 적합한 유기용매, 예컨대, DMF, DMSO 또는 저급 알코올의 혼합물에서 트립신으로 처리하여 원하는 유도체, (N^εB29-X) 데스(B30) 인간 인슐린을 얻는다.

N^εB29변형 인슐린에 관한 자료

N^εB29변형 인슐린에 관한 어떤 실험자료는 표 1에 주어진다.

인간 인슐린에 관한 인슐린 유도체의 친유성 k'_rel는 용리액으로서 A) 10%아세토니트릴을 함유하는 0.1M 인산나트륨 완충액, pH 7.3, 그리고 B) 물중의 50%아세토니트릴의 혼합물을 사용하여 40℃에서 등용매 용리에 의해 Lichrosorb RP18 (5㎛, 250x4mm) HPLC 컬럼상에서 측정하였다. 이어서 214nm 에서 용출액을 자외선을 흡수시켜 용리를 모니터하였다.

공극(void) 시간, t_o을 0.1mM 질산나트륨을 주사함으로써 발견하였다. 인간 인슐린, t_human, 에 대한 체류시간을 A 와 B 용액의 비를 다양하게 함으로써 적어도 2t_o로 조정하였다. k'_rel=(t_유도체- t_o) / (t_인간- t_o).

혈당저하효과의 연장의 정도를 토끼에서 연구하였다. 1 일 지체시험중의 6 마리 토끼각각에 인슐린 유도체 12nmol을 피하주사함으로써 각 인슐린 유도체를 시험하였다. 글루코즈 분석을 위한 혈액 채취를 주사전 그리고 주사후 1, 2, 4 및 6 시간 뒤에 실행하였다. 발견된 글루코즈값을 처음값의 백분율로 나타내었다. 혈당값으로부터 계산된 지속지수는 일정율로 확대된 지속 (연장) 지수이다. p. 211 in Markussen et al., Proteie Engineering 1 (1987) 205-213 참조. 소의 울트라 렌테인슐린으로 100 의 값을 갖도록 그리고 Actrapid인슐린으로 0의 값을 갖도록 식을 일정율로 확대시켰다 (Novo Nordisk A/S, 2880, Bagsvaerd, Denmark).

구체적으로 Zn이 없는 것으로 지시된 것들을 제외하고는, 표 1에 기재된 인슐린 유도체를 인슐린 6 량체당 3 개의 Zn²⁺을 함유하는 용액에 투여하였다.

초기에 혈당의 감소가 너무 적어 지속지수를 산정할 수 없기 때문에 매우 지속성인 유사체를 위하여는 토끼모델은 부적당하다. 그런 유사체의 연장성은 돼지에서의 소실비에 의해 잘 특성지워진다. T_50%은 외부 γ - 계수기로 측정시 A14Tyr(¹²⁵I) 유사체의 50%가 주사부위로부터 소실될 때의 시간이다 (Ribel, U et al., The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man. In: M. serrano-Rios and P.J. Lefebre (Eds): Diabetes 1985; Proceedings of the 12th Congress of the International Diabetes Federation, Madrid, Spain, 1985 (Excerpta Medica, Amsterdam, (1986) 891-96).

표 2에 일련의 매우 지속성인 인슐린 유사체의 T_50%값이 주어진다. 유사체를인슐린 6량체당 3개의 Zn²⁺을 함유하는 용액에 투여하였다.

가용성

인슐린 6 량체당 3 개의 Zn²⁺이온을 함유하는, 표 1에 기재된 모든 N^εB29변형 인슐린의 가용성은 방부제로서 0.3% 페놀, 그리고 등장성을 얻기 위한 1.6% 글리세롤이 부가되어 이루어진 중성(pH 7.5), 수성, 약학적 제조물내에서 600nmol/ml을 넘는다.

600nmol/ml는 임상에서 통상 사용되는 100IU/ml 조성물에서 발견되는 인간 인슐린의 농도이다.

ε-B29 아미노기는 아미드 결합, 술폰아미드 결합, 카르바미드, 티오카르바미드, 또는 카르바메이트의 성분일 수 있다. ε-B29 아미노기에 의해 수반된 친유성 치환체는 또한 알킬기일 수 있다.

본 발병에 따른 인간 인슐린 유도체를 함유하는 약학적 조성물은 그런 치료가 필요한 환자에게 비경구적으로 투여될 수도 있다. 비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜같은 주사기에 의해 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 실행될 수도 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 주입펌프에 의해 실행될 수 있다. 경비 분무(nasal spray) 형태로 인간 인슐린 유도체의 투여를 위한 분말 또는 액체일 수 있는 조성물은 또다른 선택이다.

본 발명의 주사용 인간 인슐린 조성물은 적당한 성분을 용해시키고 혼합하여 원하는 최종생성물을 얻는 방식의 종래의 약제 산업의 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

따라서, 한 절차에 따르면, 인간 인슐린 유도체를 제조될 조성물의 최종부피보다도 약간 적은 양의 물에 용해시킨다.

등장화제(isotonic agent), 방부제 및 완충액을 요구된 바와 같이 첨가하고, 필요하다면, 용액의 pH 값을 산, 예컨대, 염산 또는 염기, 예컨대, 수성 수산화나트륨을 필요한 만큼 사용하여 조정한다. 최종적으로, 용액의 부피를 물로 조정하여 본 성분의 원하는 농도를 얻는다.

등장화제의 예에는 염화나트륨, 만니톨 및 글리세롤이 있다.

방부제의 예에는 페놀, m-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트 및 벤질알코올이 있다.

적합한 완충액의 예에는 아세트산나트륨 및 인산나트륨이 있다.

본 발명에 따른 인슐린 유도체의 경비투여용 조성물은, 예를 들면, 유럽 특허 No. 272097(Novo Nordisk A/S) 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 인슐린 조성물은 당뇨병의 치료에 사용될 수 있다. 어떤 환자를 위한 최적투여량 수준은 사용되어진 특이적 인간 인슐린 유도체의 효험, 연령, 체중, 물리적활성 및 환자의 식이를 포함한 다양한 인자, 다른 약과의 가능한 조합, 그리고 당뇨병 증상의 정도에 의해 결정될 것이다.

본 발명의 인간 인슐린 유도체의 1 일 투여량은 공지된 인슐린 조성물과 유사한 방식으로 본 발명에서 기술적인 사항에 의해 개개의 환자 각각에 대해 결정되어야 한다는 것을 권고하고 있다.

편의에 따라, 본 발명의 인간 인슐린 유도체는, 다른 형의 인슐린, 예컨대, 더 신속하게 작용이 개시되는 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린 또는 인슐린 유도체와 혼합되어 사용될 수도 있다. 그런 인슐린 유도체의 예는 예컨대 공보 Nos. EP 214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordksk A/S) 및 EP 383472 (EliLilly & Co.)의 유럽 특허출원에 기재되어 있다.

그리고 본 발명은 보호범위를 제한하는 것으로 해석되는 것이 아닌 다음의 실시예에 의해 더욱 설명될 것이다.

전술한 설명 및 다음의 실시예에 개시된 특징은 별도로 그리고 조합되어 다양한 형태의 본 발명을 이해하기 위한 자료일 수 있다.

실시예

플라스미드 및 DNA재료

모든 발현 플라스미드는 cPOT 타입이다. 그러한 플라스미드는 EP 특허출원번호 171142 에 기술되고, 플라스미드 선택 및 안정화를 위해 Schizosaccharomyces pombe 트리오스포스페이트 이소머라제 유전자(POT) 를 함유한다는 점에서 특징지워진다. POT-유전자를 함유하는 플라스미드는 기탁된 E.coli 균주(ATCC 39685)로부터 구할 수 있다. 플라스미드는 또한 S. cerevisiae 트리오스포스페이트 이소머라제 프로모터 및 터미네이터(P_TP1및 T_TP1)를 함유한다.

그것들은 EoRI-XbaI 제한 부위에 의해 한정된 영역이 신호/ 리더/ 산물을 위한 암호화 영역을 포함한다는 것을 제외하고, pMT742(Egel-Mitani, M. et al., Gene 73(1988)113-120)와 동일하다( 제 1도참조).

합성 DNA단편은 포스포르아미다이트 화학 및 상업적으로 구할 수 있는 시약(Beaucage, S.L. 및 Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22(1981)1859-1869)을 사용하여 자동 DNA합성기(Applied Biosystems 모델 380A)상에서 합성했다.

사용된 모든 다른 방법 및 재료는 당업계에 주지되어 있다( 예를들어 Sambrook, J., Fritsch, E.F 및 Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).

분석법

제조된 인슐린의 분자량은 MS(질량분광기) 에 의해, 즉 Bio-Ion 20 기구(Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Sweden)를 사용한 PDMS(플라즈마 탈리 질량분석법) 또는 APIIII BiomolecularMass Analyzer(Perkin-Elmer Sciex Instruments, Thornhill, Canada)를 사용한 ESMS(전자분무질량분광측정법) 에 의해 얻었다.

실시예 1

LaC212spx3신호/ 리더를 사용한 효모균주 yEA002 로부터의 Ala^A21Asp^B3인간 인슐린전구체의 합성

다음과 같이 올리고뉴클레오티드를 합성했다:

다음 중합효소 연쇄반응(PCR) 은 제조자의 지시서예 따라 Gene Amp PCR 시약키트(Perkin Elemr, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA)를 사용하여 수행했다.

모든 경우에, PCR 혼합물을 100μl 의 미네랄오일(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. USA)로 피복했다.

2.5μl 의 올리고뉴클레오티드 #98(2.5pmol)

2.5μl 의 올리고뉴클레오티드 #128(2.5pmol)

10μl 의 10 × PC 완충액

16μl 의 dNTP혼합물

0.5μl 의 Taq효소

58.5μl 의 물

1 사이클을 수행했다: 45초동안 94℃, 1 분동안 49℃, 2 분동안 72℃ 이어서 5μl 의 올리고 뉴클레오티드 #61 및 #126을 첨가하고, 15사이클을 수행했다: 45초동안 94℃, 1 분동안 45℃, 1.5 분동안 72℃.

PCR 혼합물을 2.5% 아가로스겔상에 적하(loading) 하고, 표준기술(Sambrook et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) 을 사용하여 전기영동(Novo Nordisk A/S) 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 인슐린 조성물은 당뇨병의 치료에 사용될 수 있다. 어떤 환자를 위한 최적 투여량 수준은 사용되어진 특이적 인간 인슐린 유도체의 효험, 연령, 체중, 물리적활성 및 환자의 식이를 포함한 다양한 인자, 다른 약과의 가능한 조합, 그리고 당뇨병 증상의 정도에 의해 결정될 것이다.

편의에 따라, 본 발명의 인간 인슐린 유도체는, 다른 형의 인슐린, 예컨대, 더 신속하게 작용이 개시되는 인간 인슐린 또는 돼지 인슐린 또는 인슐린 유도체와혼합되어 사용될 수도 있다. 그런 인슐린 유도체의 예는 예컨대 공보 Nos, EP 214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordksk A/S) 및 EP 383472 (EliLilly & Co.)의 유럽 특허출원에 기재되어 있다.

실시예

플라스미드 및 DNA재료

모든 발현 플라스미드는 cPOT 타입이다. 그러한 플라스미드는 EP 특허출원번호 171142 에 기술되고, 플라스미드 선택 및 안정화를 위해 Schizosaccharomyces pombe 트리오스포스페이트 이소머라제 유전자(POT) 를 함유한다는 점에서 특징지워진다. POT-유전자를 함유하는 플라스미드는 기탁된 E.coli 균주(ATCC 39685)로부터 구할 수 있다.

플라스미드는 또한 S. cerevisiae 트리오스포스페이트 이소머라제 프로모터 및 터미네이터(P_TP1및 T_TP1)를 함유한다.

그것들은 EoRI-Xbal 제한 부위에 의해 한정된 영역이 신호/ 리더/ 산물을 위한 암호화 영역을 포함한다는 것을 제외하고, pMT742(Egel-Mitani, M. et al., Gene 73(1988)113-120)와 동일하다( 제 1도참조).

합성 DNA단편은 포스포르아미다이트 화학 및 상업적으로 구할 수 있는시약(Beaucage, S.L. 및 Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22(1981)1859-1869)을 사용하여 자동 DNA합성기(Applied Biosystems 모델 380A)상에서 합성했다.

사용된 모든 다른 방법 및 재료는 당업계에 주지되어 있다( 예를들어 Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).

분석법

제조된 인슐린의 분자량은 MS(질량분광기) 에 의해, 즉 Bio-Ion 20 기구(Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Sweden)를 사용한 PDMS(플라즈마 탈리 질량분석법) 또는 APIⅢ Biomolecular Mass Analyzer(Perkin-Elmer Sciex Instruments, Thornhill, Canada)를 사용한 ESMS(전자분무질량분광측정법) 에 의해 얻었다.

실시예 1

LaC212spx3신호 / 리더를 사용한 효모균주 yEA002 로부터의 A1a^A21Asp^B3인간 인슐린전구체의 합성

다음과 같이 올리고뉴클레오티드를 합성했다:

다음 중합효소 연쇄반응(PCR) 은 제조자의 지시서에 따라 Gene Amp PCR 시약키트(Perkin Elemr, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA)를 사용하여 수행했다.

2.5μl 의 올리고뉴클레오티드 #98(2.5pmol)

2.5μl 의 올리고뉴클레오티드 #128(2.5pmol)

10μl 의 10 × PC 완충액

16μl 의 dNTP혼합물

0.5μl 의 Taq효소

58.5μl 의 물

1 사이클을 수행했다: 45초동안 94℃, 1 분동안 49℃, 2 분동안 72℃ 이어서 5μl 의 올리고 뉴클레오티드 #61 및 #126을 첨가하고, 15사이클을 수행했다: 45초동안 94℃, 1분동안 45℃, 1.5 분동안 72℃.

PCR 혼합물을 2.5% 아가로스겔상에 적하(loading) 하고, 표준기술(Sambrook et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) 을 사용하여 전기영동시켰다.

결과의 DNA단편을 아가로스겔로부터 절단하고, 제조자의 지시서에 따라 Gene Clean Kit(Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) 를 사용하여 분리했다. 정제된 PCR DNA 단편을 10μl 의 물과 제한효소 완충액에 용해시키고, 표준기술에 따라 제한효소 NcoI 및 XbaI 으로 절단하고, 2.5%아가로스겔상에 전개시키고, 상기 Gene Clean kit 를 사용하여 정제했다.

플라스미드 pAK 188은 412bp의 DNA서열로 구성되며, 이것은 합성효모 신호/ 리더유전자 LaC 212spx₃(WO89/02463 의 실시예 3에 기술) 을 암호화 하는 EcoRI/NcoI 단편에 이어서, 벡터(파지미드)pBLUESCRIPT II sk(+/-)(Stratagene, USA)의 EcoRI/XbaI 단편에 삽입된 B29및 A1 아미노산 잔기를 연결하는 SerAspAspAlaLys 가교(SEQ ID NO: 14-15 및 16)를 갖는 인슐린 전구체 MI5 를 암호화하는 합성 NcoI/XbaI단편으로 이루어진다. 플라스미드pAKl88은 제 1도에 보여진다.

플라스미드 pAK 188을 또한 제한효소 NcoI 및 XbaI 으로 절단하고, 3139 bp 의 벡터단편을 분리했다. 두개의 DNA단편을 T4 DNA 리가제 및 표준조건(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989)을 사용하여 함께 연결(ligation)시켰다. 연결 혼합물로 수용성(competent) E. coli균주(R-, M+)을 형질전환시킨후에, 암피실린에 저항성이 있는 것을 선택했다.표준 DNA 미니프렙(miniprep)기술(Sambrook et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989)을 사용하여, 결과로 얻은 E, coli 콜로니로부터 플라스미드를 분리해서 적당한 제한효소, 즉 EcoRI, XbaI, NcoI 및 HpaI로 검사하였다.

선택된 플라스미드는 DNA서열분석(Sequenase, U.S. Biochemical Corp.) 에 의해 Ala^A2l, Asp^B3인간 인슐린 전구체를 위한 정확한 서열을 함유한다고 밝혀졌고, pEA 5.3 이라 칭했다.

플라스미드 pKFN 1627은 단일 XbaI 부위의 상류의 짧은 DNA서열을 제외하고, EP특허번호 375718 에 기술된 플라스미드 pKFN 1003과 동일한 E. coli-S, cerevisiae 왕복벡터이다. pKFN 1003 에서, 이 서열은 효모교배인자 알파 1 신호- 리더서열에 인프레임(IN-frame) 융합된 합성아프로티닌 유전자를 암호화하는 178bp단편이다. pKFN 1627 에서, 대응184bp 서열은 교배인자 알파 1서열(SEQ ID NO:17, 18 및 19참조)에 인프레임(IN-frame)이 융합된 인슐린 전구체 MI5(Glu^b1, Glu^b28)(즉 B(1-29, Glu^b1, Glu^b28)-SerAspAspAlaLys-A(1-21)을 암호화 한다. 벡터 pKFN 1627은 제 1도에 보여진다.

pEA 5.3을 제한효소 EcoRI 및 XbaI 로 절단하고, 결과물인 412bp의 DNA단편을 분리했다. 효모발현벡터 pKFN 1627을 제한 효소 NcoI 및 XbaI 으로, 그리고 NcoI 및 EcoRI으로 절단하고, 9273bp의 DNA단편을 제 1분해로 부터 분리하고, 1644bp의 DNA단편을 제 2분해로부터 분리했다. 그다음 412bp EcoRI/XbaI 단편을 표준기술을 사용하여 9273 bp NcoI/XbaI단편 및 1644bp NcoI/EcoRI단편인 다른 두가지 단편에 연결시켰다.

이 연결 혼합물로 상기 E.coli 을 형질전환시켰다.

결과의 E.coli 로부터의 플라스미드를 표준기술을 사용하여 분리하고, 적당한 제한효소, 즉 EcoRI, XbaI, NcoI, HpaI 으로 검사했다. 선택된 플라스미드는 DNA서열분석( 제조자인 U.S. Biochemical에의해 기술된 바와같이 Sequenase키트를 사용) 에 의해 Ala^A2lAsp^B3인간 인슐린 전구체 DNA를 위한 정확한 서열을 함유하고, LaC212spx3 신호/ 리더 DNA를 암호화하는 DNA뒤에 삽입된다고 밝혀졌다. 그 플라스미드를 pEA 5.3.2라고 칭했고, 제 1도에 보여진다. LaC212spx3 신호/ 리더/Ala^A21Asp^B3인간 인슐린 전구체 복합체를 암호화하는 DNA서열과 그것의 아미노산 서열은 SEQ ID NOS. 20, 21및 22 이다.

플라스미드 pEA 5.3.2로 공보번호 214826 을 갖는 유럽특허출원에 기술된 바와같이 S. cerevisiae균주 MT663를 형질전환시켰고, 결과물인 균주를 yEA002 라고 칭했다.

실시예 2

LaC212spx3 신호 / 리더를 사용한 효모균주 yEA005 로부터의 Ala^A21Thr^B3인간 인슐린 전구체의 합성

다음과 같이 올리고뉴클레오티드를 합성시켰다:

Ala^A21Thr^B3인간 인슐린 전구체를 암호화 하는 DNA를 실시예 1에서 Ala^A21Asp^B3인간 인슐린 전구체를 암호화하는 DNA에 대해 기술된 것과 동일한 방법으로 구성했다.

LaC212spx3 신호/리더/Ala^A21Thr^B3인간 인슐린 전구체의 복합체를 암호화는 DNA서열과 그것의 아미노산서열은 SEQ ID NOS. 23,24 및 25 이다. 플라스미드 pEA 8.1 1은 원하는 서열을 함유한다고 밝혀졌고, 이것으로 실시예 1에 기술된 바와같이 S. cerevisiae 균주MT663을 형질전환시켰으며, 결과로 얻어진 균주를 yEA005 라고 칭했다.

실시예 3

LaC212spx3 신호 / 리더를 사용한 효모균주 yEA007 로부터의 Gly^A21Asp^B3인간 인슐린 전구체의 합성

다음과 같이 올리고뉴클레오티드를 합성시켰다:

Cly^A21Asp^A3인간 인슐린 전구체를 암호화 하는 DNA를 실시예 1에서 Ala^A21Asp^B3인간 인슐린 전구체를 암호화 하는 DNA에 대해 기술된 것과 동일한 방법으로 구성했다.

LaC212spx3 신호/리더/Gly^A21Asp^B3인간 인슐린 전구체 복합체를 암호화 하는 DNA서열과 그것의 아미노산 서열을 SEQ ID NOS. 26,27 및 28 이다. 플라스미드 pEA 1.5.6은 원하는 서열을 함유한다고 밝혀졌고, 실시예 1에 기술된 바와같이 S. cerevisiae균주 MT663을 형질전환시켰으며, 결과로 얻은 균주를 yEA007 이라 칭했다.

실시예 4

LaC212spx3 신호 / 리더를 사용한 효모균주 yEA006 으로부터의 Gly^A21Thr^B3인간 인슐린전구체의 합성

다음과 같이 올리고뉴클레오티드를 합성시켰다:

Gly^A21Thr^B3인간 인슐린 전구체를 암호화 하는 DNA를 실시예 1에서 A1a^A21Asp^B3인간 인슐린 전구체를 암호화 하는 DNA를 위해 기술된 것과 동일한 방법으로 구성했다.

LaC212spx3 신호/리더/Gly^A21Thr^B3인간 인슐린 전구체 복합체를 암호화 하는 DNA서열과 그것의 아미노산 서열은 SEQ ID NOS. 29,30 및 31 이다. 플라스미드 pEA 4.4.11 은 원하는 DNA 서열을 함유한다고 밝혀졌고, 이것으로 실시예 1에 기술된 바와같이 S. cerevisiae 균주 MT663을 형질전환시켰으며, 결과로 얻은 균주를 yEA006 이라 칭했다.

실시예 5

알파 인자 리더를 사용한 효모균주 yEA113 으로 부터의 N-말단 연장체(GluGluAlaGlu AlaGluAlaArg)를 갖는 Arg^B-1Arg^B31단일 사슬 인간 인슐린 전구체의 합성

A)

다음과 같이 올리고뉴클레오티드를 합성했다:

다음 중합효소연쇄반응(PCR) 을 제조자의 지시서에 따라 Gene Amp PCR 시약키트(Perkin Eleme, 761Main Avewalk, CT 06859, USA)를 사용하여 수행했다.

모든 경우에, PCR 혼합물을 100μl 의 미네랄오일(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO. USA)로 피복했다. 플라스미드 pAK220(pAK188과 동일함) 은 합성효모 신호/ 리더 LaC212spx3 (WO 89/02463의 실시예 3에 기술됨) 을 암호화하는 412bp의 DNA서열에 이어서 벡터(파지미드)pBLUESCRIPTⅡ sk(+/-)(Stratagene, USA)내로 삽입된 인슐린 전구체 MI 5(SEQ ID NOS. 14,15 및 16 참조) 로 구성된다.

5μl의 올리고뉴클레오티드 #220(100pmol)

5μl 의 올리고뉴클레오티드 #263(100pmol)

0μl 의 10 × PCR완충액

16μl 의 dNTP 혼합물

0.5μl 의 Taq효소

0.5μl 의 주형(0.2㎍ 의 DNA) 으로서의 pAK220 플라스미드(pAK188 과 동일)

63μl의 물

총16사이클을 수행했고, 각각의 사이클은 95℃에서 1 분; 40℃에서 1분; 72℃에서 2분으로 이루어진다. 그다음 PCR혼합물을 2% 아가로스겔상에 적하하고, 표준기술을 사용하여 전기영동시켰다. 결과의 DNA단편을 아가로스겔로부터 잘라내고, 제조자의 지시서에 따라 Gene Clean 키트(Bio 101/Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) 를 사용하여 분리했다. 정제된 PCR DNA 단편을 10μl 의 물및 제한효소 완충액에 용해시키고, 표준기술에 따라 제한효소 Hind Ⅲ 및 XbaI 로 절단했다. HindⅢ/XbaI DNA단편을 상기 Gene Clean키트를 사용하여 정제했다.

플라스미드 pAK 406은 효모알파인자리더와 인슐린 전구체의 일부를 암호화하는 pMT636(WO 90/10075 에 기술됨) 으로부터 유래된 EcoRI/Hind Ⅲ 단편에 연결된 벡터 cPOT내로 삽입된 인슐린 전구체 MI5(SEQ ID NO: 32,33 및 34)의 나머지를 암호화하는 pAK188로부터의 Hind Ⅲ/XbaI 단편 이루어진 520bp의 DNA서열로 구성된다. 벡터 pAK40은 제 2도에 보여진다.

플라스미드 pAK 233은 합성효모신호/리더 LaC212spx3 (WO 89/02463의 실시예 3에 기술됨)을 암호화 하는 412bp의 DNA서열에 이어서 벡터 cPOT 내로 삽입된 인슐린 전구체 B(1-29)-GluLysArg-A(1-21)(A21-Gly)에 대한 유전자(SEQ ID NOS. 35,36 및 37)로 구성된다.

플라스미드 pAK233 은 제 2도에 보여진다.

플라스미드 pAK233 을 제한효소 NcoI 및 XbaI 로 절단하고, 9273bp의 벡터단편을 분리했다.

플라스미드 pAK406 을 제한효소 NcoI 및 Hind Ⅲ로 절단하고, 2012bp의 벡터단편을 분리했다.

이들 두가지 DNA단편을 T4 DNA 리가제 및 표준조건을 사용하여 Hind Ⅲ/XbaI PCR 단편과 함께 연결시켰다. 그다음 연결 혼합물을 수용성 E.coli 균주(R-,M+) 내로 형질전환한후, 암피실린에 대해 저항성이 있는 것을 선택했다. 플라스미드를 표준 DNA 미니프렙기술을 사용하여 결과물인 E. coli콜로니로 부터 분리하고, 적당한 제한효소, 즉 EcoRI, XbaI, NcoI, HindⅢ로 검사했다. 선택된 플라스미드는 DNA서열분석에 의해 Arg^B31단일사슬 인간 인슐린 전구체 DNA를 위한 정확한 서열을 함유하고, S. cerevisiae 알파인자 DNA를 암호화 하는 DNA뒤에 삽입된다고 밝혀졌다. 그 플라스미드를 pEA108이라 칭했고, 제 2도에 보여진다. 알파인자 리더/Arg^B31단일사슬 인간 인슐린 전구체 복합체를 암호화하는 DNA서열과 그것의 아미노산 서열은 SEQ ID NOS. 38.39 및 40 이다.

플라스미드 pEA 108로 실시예 1에 기술된 바대로 S. cerevisiae균주 MT663을 형질전환시켰고, 결과로 얻은 균주를 yEA108 이라 칭했다.

B)

다음 중합효소연쇄반응(PCR) 을 제조자의 지시서에 따라 Gene Amp PCR 시약키트(PerKin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) 를 사용하여 수행했다. 모든 경우에, PCR 혼합물을 100μl 의 미네랄오일(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로 피복했다.

5μl 의 올리고뉴클레오티드 #220(100pmol)

5μl 의 올리고뉴클레오티드 #307(100pmol)

10μl 의 10 × PCR완충액

16μl 의 dNTP 혼합물

0.5μl 의 Taq효소

0.2μl 의 주형으로서의 pEA108 플라스미드(0.1㎍ 의 DNA)

63μl의 물

총 16 사이클을 수행했으며, 각각의 사이클은 95℃에서 1분; 40℃에서 1분; 및 72℃에서 2분으로 이루어진다. 그다음 PCR혼합물을 2% 아가로스겔상에 적하하고, 표준기술을 사용하여 전기영동했다. 결과로 얻은 DNA단편을 아가로스겔로부터 잘라내고, 제조자의 지시서에 따라 Gene Clean 키트(Bio 101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA)를 사용하여 분리했다. 정제된 PCR DNA단편을 10μl 의 물 및 제한효소 완충액에 용해시키고, 표준기술에 따라 제한효소 NcoI 및 XbaI 으로 절단했다. NcoI/XbaI DNA 단편을 상기 Gene Clean 키트를 사용하여 정제했다.

플라스미드 pAK401 은 알파인자 리더를 암호화하는 pMT636(WO 90/10075 에 기술)(부위-지정 돌연변이에 의해 Ncol 부위를 알파리더의 3'-말단에 도입함으로써 구성) 으로부터 유래된 EcoRI/NcoI 단편에 이어서 벡터( 파지미드)pBLUESCRIPTⅡsk(+/-)(Stratagene, USA)내로 삽입된 인슐린 전구체 M15(SEQ ID NOS. 41,42 및 43 참조) 를 암호화하는 pAK188 으로부터의 NcoI/XbaI 단편으로 이루어진 523bp의 DNA서열로 구성된다. 플라스미드pAK401 은 제 3도에 보여진다.

플라스미드 pAK 401을 제한효소 NcoI 및 XbaI 으로 절단하고, 3254bp의 벡터단편을 분리하여 NcoI/XbaI PCR단편과 함께 연결시켰다. 그다음 연결 혼합물로 수용성 E. coli균주를 형질전환시키고, 플라스미드를 표준 DNA미니프렙 기술을 사용하여 결과물인 E. coli콜 로니로부터 분리하고, 적당한 제한효소, 즉 EcoRI, XbaI, NcoI으로 검사했다. p113A(제 3도에 도시) 라고, 칭하여진 선택된 플라스미드를 EcoRI 및 XbaI으로 절단하고, 535bp의 단편을 분리했다.

플라스미드 pAK 233을 제한효소 NcoI 및 XbaI 으로, 그리고 EcoRI/NcoI 으로 절단하고, 9273 및 1644bp 의 단편을 분리했다. 이들 두가지 DNA단편을 T4 DNA 리가제 및 표준조건을 사용하여 EcoRI/XbaI 단편과 함께 연결시켰다. 그다음 연결혼합물로 수용성 E. coli균주(R-, M+)를 형질전환 시킨후, 암피실린 저항성이 있는 것을 선택했다. 플라스미드를 표준 DNA미니프렙 기술을 사용하여 결과물인 E. coli 콜로니로부터 분리하고, 적당한 제한효소, 즉 EcoRI, XbaI, NcoI, HindⅢ로 검사했다.

선택된 플라스미드는 DNA서열분석에 의해 N- 말단 연장체 GluGluAlaGluAlaGluAlaArg 를 갖는 Arg^B31단일사슬 인간인슐린 전구체 DNA에 대한 정확한 서열을 함유하고, S. cerevisiae 알파인자 DNA를 암호화하는 DNA뒤에 삽입된다고 밝혀졌다. 그 플라스미드를 pEA113이하 칭했고, 제 3도에 보여진다. N-말단 연장체(GluGluAlaGluAlaGluAlaArg)를 갖는 알파인자 리더/Arg^B-1Arg^B31단일사슬 인간인슐린 전구체를 암호화하는 DNA서열과 그것의 아미노산서열은 SEQ ID NOS. 44,45 및 46 이다. 플라스미드 pEA113 으로 실시예 1에 기술된 바대로 S.cerevisiae균주 MT663을 형질전환시켰고, 결과로 얻은 균주를 yEA113이라칭했다.

실시예 6

알파 인자 리더를 사용한 효모균주 yEA136 으로 부터의 N- 말단 연장체(GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg)를 갖는 Arg^B-1Arg^B31단일 사슬 인간 인슐린 전구체의 합성

다음과 같이 올리고뉴클레오티드를 합성했다:

다음 PCR을 Gene Amp PCR시약 키트를 사용하여 수행했다.

5μl 의 올리고뉴클레오티드 #220(100pmol)

5μl 의 올리고뉴클레오티드 #389(100pmol)

10μl 의 10 × PCR완충액

16μl 의 dNTP 혼합물

0.5μl 의 Taq효소

2μl 의 주형으로서의 pEA113 플라스미드(0.5㎍ 의 DNA)

63μl의 물

총 12 사이클을 수행했고, 각각의 사이클은 95℃에서 1분; 37℃에서 1분; 및 72℃에서 2분으로 이루어진다.

N- 말단연장체(GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) 를 갖는 알파 인자 리더/Arg^B-1Arg^B31단일사슬 인간인슐린 전구체를 암호화하는 DNA를 실시예 5에서 N- 말단연장체(GluGluAlaGluAlaGluAlaArg)을 갖는 알파인자리더/Arg^B-1Arg^B31단일사슬 인간인슐린 전구체를 암호화하는 DNA를 위해 기술된 것과 동일한 방법으로 구성했다. 그 플라스미드를 pEA136이라 칭했다.

N-말단 연장체(GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) 를 갖는 알파인자리더/Arg^B-1Arg^B31단일 사슬 인간인슐린 전구체를 암호화 하는 DNA서열과 그것의 아미노산 서열은 SEQ ID NOS. 47,48 및 49이다. 플라스미드 pEA136 으로 실시예 1에 기술된 바대로 S. cerevisiae 균주MT663을 형질전환시키고, 결과로 얻은 균주를 yEA136 이라 칭했다.

실시예 7

(A1, B1)-diBoc 인간 인슐린의 합성

아연이 없는 인간 인슐린 5g을 41.3ml 의 DMSO 에 용해시켰다. 용액에 3.090ml 의 아세트산을 첨가했다. 반응을 실온에서 수행하고, 5.650ml 의 DMSO 에 용해된 565mg의 디-tert-부틸피로카보네이트를 첨가함으로써 개시했다.

반응을 5 1/2시간동안 계속한 다음, 250μl 의 에탄올아민을 첨가시킴으로써 중단시켰다. 1500ml의 아세톤을 첨가하여 생성물을 침전시켰다.

침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 진공에서 건조했다. 6.85g물질의 수율을 얻었다. (A1, B1)-diBoc인슐린을 다음과 같이 역상 HPLC 에 의해 정제했다: 미정제 생성물을 물중의 25%에탄올 100ml에 용해시키고, HCl 로 pH 3.0 으로 조정하고, 옥타데실디메틸실릴- 치환된 실리카 입자( 평균입경 15㎛, 공극크기 100 ) 로 충전되고 용출완충액으로 평형화된 컬럼(5cm직경, 30cm 높이) 에 적용했다.

용출을 21/h 의 유속으로 에탄올 및 1mM 수성 HCl, 0.3M KCl의 혼합물을 사용하여 수행했다. 에탄올 함량을 30%에서 45%로 증가시킴으로써 인슐린을 용출했다.

적당한 분획을 20%에탄올까지 희석하고, pH 4.8에서 침전시켰다. 침전된 물질을 원심분리에 의해 분리하고 진공에서 건조했다. 그래서 1.70lg 의 (A1, B1)-diBoc 순도가 94.5%인 인간 인슐린을 얻었다.

실시예 8

(N^εB29-벤조일 인간 인슐린)₆, 3Zn²⁺의 합성

400mg의 (A1, B1)-diBoc인간 인슐린을 2ml의 DMSO 에 용해시켰다. 용액에 748μl 의 N-메틸모르폴린 및 DMSO(1:9, v/v) 의 혼합물을 첨가했다. 반응을 15℃에서 수행하고, 132μl DMF 에 용해된 14.6mg의 벤조산 N- 히드록시숙신이미드에스테르를 첨가함으로써 개시했다.

반응을 100ml의 아세톤을 첨가함으로써 2시간후에 중단했다.

침전물질을 원심분리에 의해 분리하고, 진공에서 건조했다.

343mg의 물질을 수거했다.

Boc보호기를 4ml TFA의 첨가에 의해 제거했다.

용해된 물질을 30 분동안 배양한 다음, 50ml의 아세톤의 첨가에 의해 침전시켰다.

침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 진공에서 건조했다.

N^εB29-벤조일 인간인슐린을 실시예 7에 기술된 역상 HPLC 에 의해 정제했다.

230mg 의 수율을 얻었다. pH 5.5에서 6mM Zn²⁺및 50mM 시트레이트를 함유하는 15%수성에탄올로 부터의 재결정화에 의해 표제화합물의 결정을 얻었고, 이것을 원심분리에 의해 분리하고, 진공에서 건조하였다. 수율은 190mg이었다.

MS 에 의한 실측치 분자량: 5911, 이론치 분자량: 5911.

실시예 9

(N^εB29-리토콜로일 인간 인슐린 )₆, 3Zn²⁺의 합성

400mg 의 (A1, B1)-diBoc인간 인슐린을 2ml의 DMSO 에 용해시켰다, 그 용액에 748μl의 N- 메틸모르폴린 및 DMSO(1:9, v/v) 의 혼합물을 첨가했다. 반응을 15℃에서 수행하고, 300μl 의 DMF에 용해된 31.94mg의 리토콜산 N- 히드록시숙신이미드에스테르를 첨가함으로써 개시했다.

2시간후에 100ml의 아세톤을 첨가함으로써 반응을 중단했다.

침전물질을 원심분리에 의해 분리하고, 진공에서 건조했다.

331mg의 물질을 얻었다.

Boc보호기를 4ml의 TFA의 첨가에 의해 제거했다.

용해된 물질을 30분동안 배양한 다음, 50ml의 아세톤의 첨가에 의해 침전시켰다.

침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 진공에서 건조했다. 수율은 376mg이었다.

B29- 리토콜로일 인슐린을 실시예 7에 기술된 역상 HPLC 에 의해 정제했다. 67mg의 최종수율을 94%의 순도로 얻었다. pH 5.5에서 6mM Zn²⁺및 50mM 시트레이트를 함유하는 15%수성 에탄올로부터의 재결정화에 의해 표제화합물을 결정을 얻었고, 이것을 원심분리에 의해 분리하고 진공에서 건조했다. 수율은 49mg 이었다.

MS에 의한 실측치 분자량: 6160, 이론치 분자량: 6166.

실시예10

(N^επ29-데카노일 인간 인슐린)₆, 3Zn²⁺의 합성

400mg 의 (A1,B1)-diBoc인간 인슐린을 2ml의 DMSO 에 용해시켰다. 용액에 748μl의 N- 메틸모르폴린 및 DMSO(1:9, v/v) 의 혼합물을 첨가했다. 반응을 15℃에서 수행하고, 132μl 의 DMF에 용해된 18.0mg의 데칸산 N- 히드록시숙신이미드 에스테르를 첨가함으로써 개시했다.

60 분후에 반응을 중단하고, 생성물을 100ml의 아세톤의 첨가에 의해 침전시켰다. 침전물질을 원심분리에 의해 분리하고, 진공에서 건조했다.

420mg의 중간생성물을 수거했다.

Boc보호기를 4ml의 TFA의 첨가에 의해 제거했다.

용해된 물질을 30분동안 배양한 다음, 생성물을 50ml의 아세톤의 첨가에 의해 침전시켰다. 침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 진공에서 건조했다.

미정제 생산물의 수율은 420mg이었다.

미정제 생산물을 실시예 7에 기술된 역상 HPLC 에 의해 정제했다. 표제화합물의 254mg의 최종 수율을 얻었다.

순도는 96.1%이었다. pH 5.5에서 6mM Zn²⁺및 50mM 시트레이트를 함유하는 15%수성에탄올로 부터의 재결정화에 의해 표제화합물의 결정을 얻었고, 이것을 원심분리에 의해 분리하고 진공에서 건조했다. 수율은 217mg이었다.

MS에 의한 실측치 분자량: 5962, 이론치 분자량: 5962.

실시예11

des(B30)인간 인슐린의 합성

des(B30)인간 인슐린의 합성을 Markussen(Methods in diabetes research, Vol. I, Laboratory msthods, part B, 404-410, Ed: J. Larner 및 S. Phol, John Wiley & Sons, 1984)에 의해 기술된 바와같이 수행했다. 5g의 인간 인슐린을 500ml의 물에 용해시키는 동안, 용액의 pH 값을 0.5M황산을 첨가해 2.6으로 유지시켰다.

이어서 인슐린을 100g 의 암모늄 술페이트의 첨가에 의해 염석시키고, 침전물을 원심분리에 의해 분리했다. 펠렛을 800ml의 0.1M 탄산수소 암모늄에 용해시키고, 용액의 pH 값을 1M 암모니아로 8.4로 조정했다.

50mg 의 소 카르복시펩티다제 A를 25ml 의 물에 현탁시키고, 원심분리에 의해 분리했다. 결정을 25ml 의 물에 현탁시키고, 최종 pH 10에서 깨끗한 용액이 얻어질때까지 1M 암모니아를 첨가했다. 카르복시펩티나제 용액을 인슐린 용액에 첨가하고, 반응을 24 시간동안 계속했다. 몇 방울의 톨루엔을 첨가하여 반응동안 방부제로서 작용케했다.

24시간후에 des(B30) 인간인슐린을, 용액을 교반하면서 80g 의 염화나트륨을 연속첨가함으로써, 결정화 했다. 그다음 pH 값을 8.3으로 조정하고, 결정화를 부드러운 교반과 함께 20 시간동안 계속했다. 결정을 1.2㎛ 필터상에서 분리하고, 250ml 의 빙냉 2-프로판올로 세척하고, 마지막으로 진공에서 건조했다.

실시예12

(A1, B1)-diBoc des(B30) 인간 인슐린의 합성

표제화합물을 출발물질로서 des(B30) 돼지인슐린을 사용하여, 실시예 7에 기술된 것과 유사한 방법에 의해 합성했다.

미정제 생성물을 아세톤으로 침전시키고, 진공에서 건조했다.

(A1, B1)-diBos des(B30)인간 인슐린을 실시예 7에 기술된 역상 고속액체크로마토그래피에 의해 정제했다.

실시예13

(N^εB29)-데카노일 des(B30) 인간 인슐린의 합성

실시예 10에 기술된 절차에 따라, 400mg 의 (A1,B1)-diBoc des(B30) 인간 인슐린을 N^εB29-데칸오일 des(B30) 인간 인슐린의 합성을 위한 출발물질로서 사용했다. 미정제 생성물을 아세톤으로 침전시키고, 진공에서 건조하고, TFA를 사용하여탈보호 했다. 결과로 얻은 생성물을 아세톤으로 침전시키고, 진공에서 건조했다. 그다음 N^εB29-데칸오일 des(B30)인간 인슐린을 실시예 10 에서 기술된 것처럼 역상 HPLC 에 의해 정제했다.

MS 에 의한 실측치 분자량: 5856, 이론치 분자량: 5861.

실시예14

(N^εB29-도데칸오일 des(B30) 인간 인슐린의 합성

a. A. lyicus 프로테아제의 고정화

5ml의 수성 0.2M NaHCO 완충액, pH 9.4에 용해된 13mg 의 A. lyticus 프로테아제를 동일한 완충액으로 세척된 4ml의 침강된 MiniLeakMedium 겔(MiniLeak 은 디비닐술폰 활성화된 Sepharose CL 6B 이고, KemEnTec, Copenhagen으로 부터 얻음) 과 혼합했다. 겔을 실온에서 24 시간동안 부드러운 교반에 의해 현탁액 상태로 유지했다. 그다음 겔을 여과에 의해 분리하고, 물로 세척하고, 20ml의 1M 에탄올아민 완충액, pH 9.4에 현탁시키고, 실온에서 24 시간동안 현탁액 상태로 유지했다. 마지막으로 겔을 물로 세척하고 이어서 0.1M 아세트산으로 세척하고, 4℃에 저장했다. 여과물의 효소활성은 초기용액에서의 효소활성의 13%이었으며, 이는 약 87%의 고정화 반응에서의 수율을 가리킨다.

b. 돼지 트립신의 고정화

돼지 트립신을 A. lyticus 이 고정화를 위해 상기된 조건을 사용하여 겔의 ml 당 1mg의 치환의 정도로 MiniLeak Low에 고정화했다.

c. 고정화된 A. lyticus 프로테아제를 사용한 Glu(GluAla)₃Arg-B(1-29), ThrArg-A(1-21)인슐린의 합성

20ml의 0.1M NaHCO₃완충액, pH 9.0에 용해된 200mg의 Glu(GluAla) Arg-B(1-29)-ThrArg-A(1-21)단일-사슬 인간인슐린 전구체에 고정화된 A. lyticus 프로테아제를 수반하는 4ml의 겔을 첨가했다. 겔을 실온에서 6시간동안 반응혼합물에서 현탁액 상태로 유지한후, 가수분해를 완료하여 Glu(GluAla) -Arg-B(1-29), ThrArg-A(1-21)인간 인슐린을 얻었다

(반응은 역상 HPLC 에 의해 이어짐). 가수분해후에, 겔을 여과에 의해 제거했다. 여과물에 5ml의 에탄올 및 15μl 의 1M 2ZCl 를 첨가하고, pH를 HCl을 사용하여 5.0으로 조정했다. 생성물의 침전을 부드럽게 교반하면서 4℃에서 밤새 방치하여 완료했다. 생성물을 원심분리에 의해 분리했다.

1ml 의 빙냉 20%에탄올로 한번 세척하고, 진공에서 건조한후, 수율은 190mg이었다.

d. 도데칸산 N- 히드록시숙신이미드에스테르를 사용한 N^αAl, N^αB1, N^εB29_트리도데칸오일Glu(GluAla)3Arg-B(1-29), Thr-Arg-A(1-21) 인간인슐린의 합성

190mg(30㎛ol)의 Glu(GluAla)₃Arg-B(1-29), Thr-Arg-A(1-21) 인슐린을 DMSO 1ml 그리고 DMF중의 N,N- 디이소프로필에틸아민의 0.572M용액 1.05ml 에 용해시켰다. 용액을 15℃로 냉각시키고, 0.6ml 의 DMSO 에 용해된 36mg( 120㎛ol)의 도데칸산 N- 히드록시숙신이 미드에스테르를 첨가했다. 반응을 24 시간이내에 완료했다.친유성 표제화합물은 분리되지 않았다.

e. N^εB29-도데칸오일 des(B30) 인간 인슐린의 합성

약 2.65ml 의 DMSO/DMF/N,N-디이소프로필에틸아민에 함유된 선행 단계 d. 로부터의 생성물을 20% 에탄올을 함유하는 10.6ml 의 50mM 글리신 완충액으로 희석하고, NaOH로 pH를 10으로 조정했다. 실온에서 1시간동안 방치한후, 겔의 ml 당 1mg의 고정화된 트립신을 수반하는 1ml의 MiniLeak 겔을 첨가했다. 반응혼합물을 실온에서 48 시간동안 부드럽게 교반했다.

원하는 생성물을 분리하기 위해, 반응혼합물을 옥타데실디메틸실릴- 치환된 실리카 입자(평균입경 15㎛, 공극크기 100Å) 로 충전된 역상 HPLC 컬럼(5cm직경, 30cm높이) 에 적용했다. 용출을 위해 pH 7.7 로 조정되고 40%에서 44%(v/v) 로 증가하는 에탄올의 농도로 이루어진 20mM 트리스/HCl완충액을 2000ml/h의 속도로 사용했다.

약 43-44% 의 에탄올에서 용출하는 주요피크는 표제화합물을 함유했다. 주요 피크를 함유하는 분획을 폴(pool)로 만들고, 물을 첨가하여 에탄올 농도를 20%(v/v) 로 감소시키기, pH를 5.5로 조정했다. 용액을 -20℃에서 밤새 방치하고, 그것에 의해 생성물을 침전시켰다.

침전물을 -8℃에서 원심분리에 의해 분리하고, 진공에서 건조했다.

표제화합물의 수율은 90mg 이었다.

MS 에 의한 실측치 분자량: 5892, 이론치 분자량: 5890

실시예15

(N^εB29-(N- 미리스토일-α-글루타밀) 인간 인슐린의 합성

500mg의 (A1, B1)-diBoc인간 인슐린을 2.5ml의 DMSO 에 용해시키고, 2.5ml 의 DMSO/DMF1/1(v/v) 로 희석된 428μl 의 에틸디이소프로필아민을 첨가했다. 온도를 15℃로 조정하고, 2.5ml의 DMSO/DMF 1/1(v/v)에 용해된 85mg 의 N- 미리스토일-Glu(OBut)N-히드록시숙신이미드에스테르를 첨가했다. 30분후예 반응혼합물을 60ml 의 물에 The아붓고, pH를 5로 조정하고, 침전물을 원심분리에 의해 분리했다. 침전물을 진공에서 건조했다. 건조된 반응혼합물을 25ml 의 TFA에 용해시키고, 용액을 실온에서 30분동안 방치했다. TFA를 진공하에서 증발시켜 제거했다. 겔라틴성 잔류물을 60ml 의 물에 용해시키고, 농축암모니아를 사용하여 pH 11.2 로 조정했다.

6N HC1을 사용하여 pH 를 8.5로 조정함으로써 이 용액으로 부터 표제화합물을 결정화했다. 생성물을 원심분리에 의해 분리하고, 10ml의 물로 한번 세척하고, 진공에서 건조했다. 수율은 356mg. HPLC에 의한 순도는 94%. 본 실시예의 생성물은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 다음 구조: CH₃(CH₂)₁₂CONHCH(CH₂CH₂COOH)CO-의 치환체를 갖는 인간 인슐린이다.

MS 에 의한 실측치 분자량: 6146, 이론치 분자량: 6148.

실시예16

N^εB29-운데칸오일 des(B30) 인간 인슐린의 합성

표제화합물은 도데칸산 N- 히드록시숙신이미드에스테르 대신에 운데칸산 N-히드록시숙신이미드에스테르를 사용함으로써, 실시예14에 기술된 N^εB29-도데칸오일 des(B30) 인간 인슐린과 유사하게 합성했다.

MS 에 의한 생성물의 실측치 분자량: 5876, 이론치 분자량: 5876.

실시예17

N^εB29-트리데칸오일 des(B30) 인간 인슐린의 합성

표제화합물은 도데칸산 N- 히드록시숙신이미드에스테르 대신에 트리데칸산 N- 히드록시숙신 이미드에스테르를 사용함으로써, 실시예14에 기술된 N^εB29_도데칸오일 des(B3O) 인간 인슐린과 유사하게 합성했다.

MS 에 의한 생성물의 실측치 분자량: 5899, 이론치 분자량: 5904.

실시예18

NεB29-미리스토일 des(B30) 인간 인슐린의 합성

표제화합물은 도데칸산 N- 히드록시숙신이미드에스테르 대신에 미리스트산 N- 히드록시숙신 이미드에스테르를 사용함으로써, 실시예14에 기술된 NεB29-도데칸오닐 des(B30) 인간 인슐린과 유사하게 합성했다.

MS 에 의한 생성물의 실측치 분자량: 5923, 이론치 분자량: 5918.

실시예19

N^εB29-팔미토일 des(B30) 인간 인슐린의 합성

표제화합물은 도데칸산 N- 히드록시숙신이미드에스테르 대신에 팔미트산 N-히드록시숙신 이미드에스테르를 사용함으로써, 실시예14에 기술된 N^εB29-도데칸오닐 des(B30) 인간 인슐린과 유사하게 합성했다.

MS 에 의한 생성물의 실측치 분자량: 5944, 이론치 분자량: 5946.

실시예20

N^εB29-수베로일-D-티록신 인간 인슐린의 합성

a. N-(숙신이미딜수베로일)-D-티록신의 제조

디숙신이미딜 수베레이트(1.0g, Pierce)를 DMF(50ml)에 용해시키고, D-티록신(2.0g, Aldrich)을 20℃에서 교반하면서 첨가했다. 티록신을 서서히 용해시키고, 20시간후에 용매를 진공하에서의 증발에 의해 제거했다. 오일성 잔류물을 2- 프로판올로부터 결정화하여 0.6g 의 N-(숙신이미딜세로일)-D-티록신을 얻었으며, 녹는점은 128-133℃이었다. b. N-(숙신이미딜수베로일)-D-티록신과 (A1, B1)-diBoc 인간 인슐린의 반응

(A1, B1)-diBoc 인간 인슐린(200mg) 을 실온에서 트리에틸아민(20 μl)의 첨가에 의해 건조 DMF(10ml) 에 용해시켰다. 그다음 N-(숙신이미딜수베로일)-D-티록신(80mg)을 첨가했다. 반응을 역상 HPLC 에 의해 모니터하고, 반응이 약 90%완료되었을때, 용매를 진공에서 제거했다, 증발잔류물에 무수트리플루오로아세트산(5ml) 을 첨가하고, 용액을 실온에서 1시간동안 방치했다. 진공에서 트리플루오로아세트산의 제거후에, 잔류물을 1M아세트산(5ml) 및 아세토니트릴(1.5ml) 의 혼합물에 용해시키고, 제조용 역상 HPLC에 의해 정제하고, PD-10 컬럼상에서 탈염시켰다.N^εB29-수베로일-D- 티록신 인간 인슐린의 수율은 50mg 이었다.

따라서 본 실시예의 생성물은 Lys^B29의 ε-아미노기가 다음구조: Thyrox-CO(CH₂)₆CO-의 치환체를 갖는 인간 인슐린이며, 상기 티록스(Thyrox)는 그것의 α- 아미노기에의 아미드 결합을 통해 옥탄디오산 부분에 결합된 티록신이다.

MS 에 의한 생성물의 실측치 분자량: 6724, 이론치 분자량: 6723.

실시예21

N^εB29-(2-숙시닐아미도) 미리스트산 인간 인슐린의 합성

a. α- 아미노미리스트산 메틸에스테르, 염산의 제조

-10℃에서 메탄올(5ml, Merck)에 티오닐크로라이드(0.2ml, Aldrich)를 세찬교반을 하면서 적가했다. 그다음 α- 아미노미리스트산(0.7g, 암모니아와의 반응에 의해 α-브로모산으로부터 제조) 을 첨가했다. 반응혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 증발시켜 건조했다. 미정제 생성물(0.7g)을 단계 b. 에서 직접사용했다.

b. N- 숙시노일- α- 아미노미리스트산메틸에스테르의 제조

α- 아미노미리스트산메틸에스테르, HCl(0.7g) 을 클로로포름(25ml, Merck) 에 용해시켰다.

트리에틸아민(0.35ml, Fluka) 을 첨가한후, 숙신무수물(0.3g, Fluka) 을 첨가했다.

반응혼합물을 2시간동안 실온에서 교반하고, 농축하여 건조시키고, 잔류물을에틸아세테이트/석유에테르(1/1) 로부터 재결정화 했다.

수율: 0.8g,

c. N-(숙신이미딜숙시노일)-α-아미노미리스트산메틸에스테르의 제조

N- 숙신오일- α- 아미노미리스트산메틸에스테르(0.8g)를 건조 DMF(10ml, Merck, 4Å 분자체(molecular sieve) 상에서 건조) 에 용해시켰다.

건조 피리딘( 80μl, Herck) 및 디(N- 숙신이미딜) 카보네이트(1.8g, Fluka) 를 첨가하고, 반응혼합물을 실온에서 밤새 교반했다.

증발잔류물을 실리카겔 60(Merck)상의 순간 크로마토그래피에 의해 정제하고, 2-프로판올/석유에테르(1/1) 로부터 재결정화 했다.

N-(숙신이미딜숙신오일)-α- 아미노미리스트산메틸에스테르의 수율: 0.13g, 녹는점 64-66℃.

d. N-(숙신이미딜숙신오일)-α- 아미노미리스트산메틸에스테르과(A1,B1)-diBoc 인간 인슐린의 반응

반응은 N-(숙신이미딜수베로일)-D-티록신 대신에 N-(숙신이미딜숙신오일)-α- 아미노미리스트산메틸에스테르(16mg)를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 20b. 에서와 동일한 방법으로 수행했다.

진공에서, 트리플루오로아세트산의 제거후에, 증발잔류물을 0℃에서 0.1M수산화나트륨으로 처리하여 메틸에스테르를 비누화했다. 비누화가 역상 HPLC에 의해 완료되었다고 판단될때, 용액에서의 pH 값을 3으로 조정하고, 용액을 동결건조시켰다. 제조용 역상 HPLC에 의해 정제하고, PD-10 컬럼상에서 탈염시킨후, N^εB29-(2-숙시닐아미도) 미리스트산인간 인슐린의 수율은 39mg 이었다.

따라서 본 실시예의 생성물은 Lys^B29의 ε-아미노기가 다음구조 CH₃(CH₂)₁₁CH(COOH)NHCOCH₂CH₂CO-의 치환체를 갖는 인간 인슐린이다.

MS 에 의해 밝혀진 생성물의 분자량: 6130, 이론상 분자량: 6133.

실시예22

N^εB29-옥틸 옥시카르보닐 인간 인슐린의 합성

합성은 N-(숙신이미딜수베로일)-D-티록신 대신에 n- 옥틸옥시카르보닐 N- 히드록시숙신이미드(9mg, n-옥틸클로로포르메이트(Aldrich) 및 N- 히드록시숙신이미드로부터 제조) 를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 20b. 에서와 동일한 방법으로 수행했다.

N^εB29-옥틸옥시카르보닐 인간 인슐린의 수율은 86mg 이었다.

따라서 본 실시예의 생성물은 Lys^B29의 ε-아미노기가 다음구조: CH₃(CH₂)₇OCO-의 치환체를 갖는 인간 인슐린이다.

MS에 의한 생성물의 실측치 분자량: 5960, 이론치 분자량: 5964.

실시예23

N^εB29-(2-숙신일아미도) 팔미트산 인간 인슐린의 합성

a. N-(숙신이미딜숙신오일)-α- 아미노팔미트산메틸에스테르의 제조

이 화합물은 α- 아미노미리스트산 대신에 α- 아미노팔미트산을 사용하여, 실시예 21a.-c.,에 기술된 바 대로 제조했다.

b. N-(숙신이미딜숙신오일)-α- 아미노팔미트산메틸에스테르와 (A1,B1)-diBoc 인간 인슐린의 반응

반응은 N-(숙신이미딜숙신오일)-α- 아미노미리스트산메틸에스테르 대신에 N-(숙신이미딜숙신오일)-α- 아미노팔미트산메틸에스테르를 사용하는 것을 제외하고, 실시예21d., 에서와 동일한 방법으로 수행하여, N^εB29-(2- 숙시닐아미도) 팔미트산 인간 인슐린을 얻었다.

따라서 본 실시예의 생성물은 Lys^B29의 ε-아미노기가 다음구조: CH₃(CH₂)₁₃CH(COOH)NHCOCH₂CH₂CO-의 치환체를 갖는 인간 인슐린이다.

실시예24

N/^εB29-(2-숙시닐아미도에틸옥시) 팔미트산 인간 인슐린의 합성

a. N-(숙신이미딜숙신오일)-2-아미노에틸옥시팔미트산 메틸에스테르의 제조

이 화합물은 α- 아미노미리스트산 대신에 2- 아미노에틸옥시팔미트산(R. TenBrink, J.Org. Chem. 52(1987) 418-422에 기술된 일반절차에 의해 합성) 을 사용하는 것을 제외하고, 실시예21a.-c. 에 기술된 바대로 제조했다.

b. N-(숙신이미딜숙신오일)-2-아미노에틸옥시팔미트산메틸에스테르와 (A1,B1)-diBoc인간 인슐린의 반응

반응은 N-(숙신이미딜숙신오일)-α- 아미노미리스트산 메틸에스테르 대신에 N-(숙신이미딜숙신오일)-2-아미노에틸옥시팔미트산메틸에스테르를 사용하는 것을 제외하고, 실시예21d. 에서와 동일한 방법으로 수행하여 N^εB29-(2- 숙시닐아미도에틸옥시) 팔미트산 인간인슐린을 얻었다.

따라서, 본 실시예의 생성물은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 다음구조: CH₃(CH₂)₁₃CH(COOH)NHCH₂CH₂OCOCH₂CH₂CO- 의 치환체를 갖는 인간 인슐린이다.

실시예25

N^εB29-리토콜로일- α- 글루타밀 des(B30) 인간 인슐린의 합성

합성은 데칸산 N- 히드록시숙신이미드에스테르 대신에 N- 리토콜로일-L- 글루탐산 α-N-히드록시숙신이미드에스테르, γ(감마)-tert- 부틸에스테르를 사용하여 실시예13에서와 같이 수행했다.

따라서 본 실시예의 생성물은 Lys^B29의 ε- 아미노기가 다음구조: 리토콜로일- NHCH(CH₂CH₂COOH)CO-의 치환기를 갖는 des(B30) 인간 인슐린이다.

MS 에 의한 생성물의 실측치 분자량: 6194, 이론치 분자량: 6193.

실시예26

N^εB29-3,3',5,5'-테트라이오도티로아세틸 인간 인슐린의 합성

합성은 데칸산 N- 히드록시숙신이미드에스테르 대신에 3,3',5,5'- 테트라이오도티로아세트산 N- 히드록시숙신이미드에스테르를 사용하여, 실시예10에서와 같이 수행했다.

MS 에 의한 생성물의 실측치 분자량: 6536, 이론치 분자량. 6538.

실시예27

N^εB29-L-티록실 인간 인슐린의 합성

합성은 데칸산 N- 히드록시숙신이미드에스테르 대신에 Boc-L- 티록신 N- 히드록시숙신이미드에스테르를 사용하여, 실시예10에서와 같이 수행했다.

MS 에 의한 생성물의 실측치 분자량: 6572, 이론치 분자량: 6567.

실시예28

용액중의 600nmol/ml의 N^εB29-데칸오일 des(B30) 인간인슐린, 1/3 Zn²⁺로 이루어진 약학적 조성물

N^εB29-데칸오일 des(B30) 인간인슐린(1.2㎛ol)을 물(0.8ml) 에 용해시키고, pH 값을 0.2M 수산화나트륨의 첨가에 의해 7.5로 조정했다. 0.01M 아연아세테이트(60μl)와 0.75%의 페놀 및 4% 의 글리세롤을 함유하는 용액(0.8ml) 를 첨가했다. 용액의 pH 값을 0.2M 수산화나트륨을 사용하여 7.5로 조정하고, 용액의 부피를 물을 사용하여 2ml로 조정했다.

결과물인 용액을 여과에 의해 멸균시키고, 카트리지 또는 작은 병에 무균적으로 옮겼다.

실시예29

용액중의 600nmol/ml의 N^εB29-데칸오일 인간인슐린, 1/2 Zn^2+로이루어진 약학적 조성물

1.2㎛ol 의 표제화합물을 물(0.8ml) 에 용해시키고, pH값을 0.2M 수산화나트륨의 첨가에 의해 7.5로 조정했다.

0.75%의 페놀 및 1 75%의 염화나트륨을 함유하는 용액(0.8ml) 을 첨가했다.

용액의 pH 값을 0.2M 수산화나트륨을 사용하여 7.5로 조정하고, 용액의 부피를 물을 사용하여 2ml 조정했다.

실시예30

용액중의 600nmol/ml 의 N^εB29-리토콜로일 인간 인슐린으로 이루어진 약학적 조성물

1.2㎛ol 의 표제화합물을 물(0.8ml) 에 현탁시키고, 용액의 pH값을 0.2M 수산화나트륨을 사용하여8.5 로 조정함으로써 용해시켰다. 그다음 용액에 물중의 0.75% 크레졸 및 4% 글리세롤을 함유하는 0.8ml의 원액을 첨가했다. 마지막으로 pH 값을 다시 8.5로 조정하고, 용액의 부피를 물 2ml로 조정했다.

Claims

다음의 서열:

[상기 서열에서, A21 및 B3 위치의 Xaa는, 독립적으로 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg 및 Csy를 제외한 어떤 아미노산 잔기도 되며;

B1 위치의 Xaa는 Phe이거나 결실되며;

B30 위치의 Xaa는 (a) 10 내지 24개의 탄소원자를 가진 비암호성, 친유성 아미노산 이며(이 경우에 탄소원자를 5 개까지 갖는 카르복실산의 아실기는 Lys^B29의 ε-아미노기에 결합된다), (b) 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg 및 Cys를 제외한 어떤 아미노산 잔기도 되며 (이 경우에 Lys^B29의 ε-아미노기가 친유성 치환체를 갖는다) 또는 (c) 결실된다 (이 경우에 Lys^B29의 ε-아미노기가 친유성 치환체를 갖는다)]을 가진 인슐린 유도체; 그리고 B30 위치의 Xaa 가 Thr 또는 Ala이고, A21 및 B3 위치의 Xaa가 둘다 Asn 이고, B1 위치의 Xaa가 Phe 일 때 인슐린 유도체는 Zn²⁺복합체인 조건하에서의 상기 인슐린 유도체의 Zn²⁺복합체.
제 1항에 있어서, A21 및 B3 위치의 Xaa가, 독립적으로, 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg 및 Cys를 제외한 어떤 아미노산 잔기도 되며;

B1 위치의 Xaa 는 Phe 이거나 결실되며;

B30 위치의 Xaa는 10 내지 24개의 탄소를 갖는 비암호성, 친유성 아미노산이고, 탄소원자를 4 개까지 갖는 모노카르복실산 또는 탄소원자를 5 개까지 갖는 디카르복실산의 아실기가 Lys^B29의 ε-아미노기에 결합되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항에 있어서, A21 및 B3 위치의 Xaa가 독립적으로, 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg 및 Cys를 제외한 어떤 아미노산 잔기도 되며;

B1 위치의 Xaa는 Phe 이거나 결실되며;

B30 위치의 Xaa는 결실되거나 유전암호에 의해 암호될 수 있는, Lys, Arg및Cys 를 제외한 어떤 아미노산 잔기도 되고, Lys^B29의 ε-아미노기가 적어도 6 개의 탄소원자로 이루어진 친유성 치환체를 갖는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 2항에 있어서, B30 위치의 Xaa 가 α-아미노데칸산, α-아미노도데칸산, α-아미노테트라데칸산 및 α-아미노헥사데칸산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 2항에 있어서, Lys^B29의 ε-아미노기에 결합된 아실기가 포밀, 아세틸, 프로피오닐 및 n-부티릴로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 2항에 있어서, Lys^B29의 ε-아미노기에 결합된 아실기가 숙신산의 아실기인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 3항에 있어서, B30 위치의 Xaa는 결실되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 3항에 있어서, B30 위치의 Xaa가 Asp, Glu 또는 Thr 인 것을 특징으로 하는 인슐린유도체.
제 3항에 있어서, Lys^B29의 ε-아미노기에 결합된 친유성 치환체가 적어도 6 개의 탄소원자를 가진 카르복실산으로부터 유도된 아실기인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 9항에 있어서, 분지될 수도 있는 아실기가 8-24 원자길이의 탄소원자 주사슬로 이루어진 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 9항에 있어서, 아실기는 적어도 6 개의 탄소원자를 갖는 지방산의 아실기인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 9항에 있어서, 아실기는 6 내지 24개의 탄소원자를 갖는 선형, 포화 카르복실산의 아실기인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 9항에 있어서, 아실기는 도데칸산, 트리데칸산 및 테트라데칸산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항에 있어서, A21 위치의 Xaa는 Ala, Gln, Gly또는 Ser 인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항에 있어서, B3 위치의 Xaa는 Asp, Gln 또는 Thr 인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 1항에 있어서, B1 위치의 Xaa는 결실되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 치료하는데 효과적인 양의 제 1항에 따른 인슐린 유도체로 이루어진, 치료가 필요한 환자의 당뇨병을 치료하기 위한 약학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체와 함께, 신속하게 작용이 개시되는 인슐린 또는 인슐린 유사체와의 혼합물로, 치료하는데 효과적인 양의 제 1항에 따른 인슐린 유도체로 이루어진, 치료가 필요한 환자의 당뇨병을 치료하기 위한 약학적 조성물.
제 1항에 따른 인슐린 유도체를 사용하는 것을 포함하는 당뇨병 치료에 사용하는 약제의 제조방법.
제 3항에 있어서, N^εB29-테트라데카노일데스(B30) 인간 인슐린인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 3항에 있어서, N^εB29-테트라데카노일데스(B30) 인간 인슐린의 Zn²⁺복합체인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 3항에 있어서, 인슐린 6량체당 2,3 또는 4개의 Zn²⁺이온을 함유하고 있는 N^εB29-테트라데카노일데스(B30) 인간 인슐린의 Zn²⁺복합체인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 3항에 있어서, N^εB29-(리토콜로일-글루타밀)데스(B30) 인간 인슐린인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 3항에 있어서, N^εB29-(리토콜로일-글루타밀)데스(B30) 인간 인슐린의 Zn²⁺복합체인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
제 3항에 있어서, 인슐린 6량체당 2,3 또는 4개의 Zn²⁺이온을 함유하고 있는 N^εB29-(리토콜로일-글루타밀)데스(B30) 인간 인슐린의 Zn²⁺복합체인 것을 특징으로 하는 인슐린유도체.