CZ287945B6 - Inzulinový derivát a farmaceutický prostředek s jeho obsahem pro léčení diabetu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká protrahovaných derivátů lidského inzulinu, ve kterých A21 a B3 jsou nezávisle aminokyselinové zbytky kódované genetickým kódem kromě zbytku Lys, Arg a Cys; PheB1 je případně vypuštěn; aminokyselinový zbytek B30 je a) zbytek nekódované, lipofilní aminokyseliny, která má 10 až 24 uhlíkových atomů, přičemž acylová skupina s až 5 uhlíkovými atomy je vázána k .epsilon.-aminoskupině LysB29, nebo b) B30 aminokyselinový zbytek je vypuštěn nebo je to jakýkoliv aminokyselinový zbytek, který je kódován genetickým kódem kromě zbytku Lys, Arg a Cys, přičemž .epsilon.-aminoskupina LysB29 má lipofilní substituent; a jakýkoliv jeho Zn2+ komplex, za předpokladu, že B30 je zbytek Thr nebo Ala a A21 a B3 jsou zbytek Asn a je přítomen PheB1, pak je inzulinový derivát Zn2+ komplex.ŕ

Description

Inzulínový derivát a farmaceutický prostředek s jeho obsahem pro léčení diabetů

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových derivátů lidského inzulínu, které jsou rozpustné a mají protrahovanou křivku působení, dále popisuje způsob přípravy těchto derivátů, farmaceutické prostředky, které je obsahují, a použití takových inzulínových derivátů k léčení diabetů.

Dosavadní stav techniky

Mnoho pacientů je léčeno opakovanými denními injekcemi inzulínu v režimu skládajícím se z jedné nebo dvou denních injekcí protrahovaného inzulínu k pokrytí základní potřeby, doplňovaných injekcemi lychle účinkujícího inzulínu k pokrytí potřeby ve vztahu k jídlu.

Prostředky protrahovaného inzulínu jsou v dané oblasti dobře známy. Jeden z hlavních typů prostředků protrahovaného inzulínu tvoři injikovatelná vodní suspenze inzulínových krystalů nebo amorfního inzulínu. V těchto prostředcích je obvykle použit protamin inzulín, Zn inzulín, nebo protamin Zn inzulín.

S použitím suspenze je spojeno několik nedostatků. Proto aby bylo zajištěno přesné dávkování, musí být před odebráním suspenze z lahvičky nebo vytlačení ze zásobníku částice inzulínu homogenně suspendovány jemným třepáním. Také při skladování suspenze inzulínu musí být teplota udržována v užším rozmezí než u roztoku inzulínu, aby nedošlo ke koagulaci.

Zatímco dříve se věřilo, že protaminy jsou neimunogenní, bylo nyní zjištěno, že protaminy mohou být u lidí imunogenní a že jejich použití pro lékařské účely může způsobit tvorbu protilátek (Samuel a kol., Studies on the immunogenecity of protamines in humans and experimental animals by means of a micro-complement fixation test, Clin. Exp. Immunol. 33, str. 252-260 (1978)).

Také bylo objeveno, že protamin-inzulinový komplex je sám o sobě imunogenní (Kurtz a kol., Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine insulins. Diabetologica 25, str. 322-324 (1983)). Proto musí někteří pacienti, kteří užívají protrahované inzulínové prostředky obsahující protaminy, užívání přerušit.

Jiný typ protrahovaných inzulínových prostředků jsou roztoky, které mají hodnotu pH pod fyziologickým pH, při kterém se inzulín sráží, když je roztok ínjikován a pH se zvýší. Nevýhodou těchto roztoků je, že velikostní distribuce částic sraženiny, která vzniká při injikování roztoku v tkáni, a časové rozvržení podávání léku je závislé na proudění krve v místě injekce a dalších faktorech, z nichž některé jsou nepředvídatelné. Dalším nedostatkem je to, že pevné částice inzulínu mohou fungovat jako lokální dráždidlo a způsobit zánět tkáně v místě vpichu.

WO 91/12817 (Novo Nordisk, A/S) popisuje protrahovaný rozpustný inzulínový prostředek obsahující komplexy kobaltu (III). Protrakce těchto komplexů je pouze střední a biodostupnost omezená.

Lidský inzulín má 3 primární aminoskupiny: N-koncovou skupinu A-řetězce a B-řetězce a ε-aminoskupinu Lys^B29. Některé deriváty inzulínu, které jsou substituovány na jedné nebo více těchto skupinách jsou v dané problematice známy. US patent č. 3 528 960 (Eli Lilly) se týká N-karboxyaroylinzulinů, ve kterých jedna, dvě nebo tři primární aminoskupiny inzulínové molekuly mají karboxyaroylovou skupinu. Byly objeveny nespecificky N^cB29-substituované inzulíny.

-1 CZ 287945 B6

Podle GB patentu č. 1 492 997 (Nat. Res. Dev. Corp.) bylo objeveno, že inzulín s karbamylovou substitucí na Ν^εΒ29 má zlepšenou křivku hypoglykemického efektu.

JP předložený patentový návrh č. 1-254699 (Kodama Co., Ltd.) popisuje inzulín, kde je mastná kyselina navázána na aminoskupinu Phe^BI nebo na ε-aminoskupinu Lys^B29 nebo na obě tyto skupiny. Cílem uvedené derivatizace je získání farmakologicky přijatelného, stabilního inzulínového preparátu.

Inzulíny, které v poloze B30 mají aminokyselinu, která má nejméně pět atomů uhlíku a pro kterou nemusí být kódování tripletem nukleotidů, jsou popsány v podaném patentovém návrhu č. 57-067548 (Shionogi). Inzulínové analogy jsou patentově nárokovány jako použitelně k léčení diabetes mellitus, zejména u pacientů, kteří jsou rezistentní proti inzulínu, kvůli vzniku protilátek na hovězí nebo vepřový inzulín.

„Inzulínovými deriváty“, jak je použito v předkládaném dokumentu, jsou míněny sloučeniny, které mají molekulovou strukturu podobnou jako lidský inzulín, včetně disulfídových můstků mezi Cys^A7 a Cys^B7 a mezi Cys“⁰ a Cys^B19 a vnitřní disulfídový můstek mezi Cys^A6 a Cys^AH, a které mají inzulínovou aktivitu.

Nicméně stále přetrvává potřeba protrahovaných injikovatelných inzulínových prostředků, které jsou roztoky a obsahují inzulíny, které zůstanou v roztoku po injikaci a mají minimální zánětlivé a imunogenní vlastnosti.

Jedním předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout deriváty lidského inzulínu s protrahovanou křivkou působení, které jsou rozpustné při fyziologických hodnotách pH.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout farmaceutický prostředek obsahující deriváty lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob přípravy derivátů lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu.

Podstata vynálezu

Překvapivě bylo zjištěno, že některé deriváty lidského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, mají protrahovanou křivku působení a jsou rozpustné při fyziologických hodnotách pH.

V souladu s tím, z širšího hlediska, se předkládaný vynález týká inzulínového derivátu, který má následující sekvenci:

A-řetězec S ----------------S

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12

S

I

B-řetězec S

Xaa-V al-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-V al1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

-2CZ 287945 B6

A-řetězec (pokračování)

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (sekvence id. č.:l) 13 14 15 16 17 18 19 | 21

B-řetězec (pokračování) S

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

B-řetězec (pokračování)

Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Xaa (sekvence id. č.:2)

26 27 28 29 30 kde Xaa v poloze A21 a B3 je nezávisle vybráno ze skupiny sestávající z aminokyselinových zbytků, které mohou být kódovány genetickým kódem, kromě zbytku Lys, Arg a Cys; Xaa v poloze Bl je zbytek Phe neboje vypuštěno; Xaa v poloze B30 je (a) zbytek nekódované, lipofilní aminokyseliny, která má 10 až 24 uhlíkových atomů, v tom případě acylová skupina karboxylové kyseliny s až pěti atomy uhlíku je navázána na ε-aminoskupinu Lys^B29, (b) jakýkoliv aminokyselinový zbytek, kteiý může být kódovaný genetickým kódem kromě zbytku Lys, Arg a Cys, v tom případě ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, nebo (c) je vypuštěno, v tom případě ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent; a jakékoliv jeho Zn²⁺ komplexu, za předpokladu, že pokud Xaa v poloze B30 je zbytek Thr nebo Ala, Xaa v poloze A21 a B3 jsou oba zbytky Asn, a Xaa v poloze Bije Phe, pak je inzulínový derivát Zn²⁺ komplex.

V preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde B30 aminokyselinový zbytek je vypuštěn nebo je to jakýkoliv aminokyselinový zbytek, který může být kódován genetickým kódem kromě zbytku Lys, Arg a Cys; A21 a B3 aminokyselinové zbytky jsou nezávisle vybrány ze skupiny, sestávající z aminokyselinových zbytků, které mohou být kódovány genetickým kódem kromě zbytků Lys, Arg a Cys; Phe^B1 může být vypuštěn; ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, který má nejméně 6 uhlíkových atomů; a 2 až 4 Zn²⁺ ionty mohou být navázány na každý inzulínový hexamer, s podmínkou, že pokud B30 je zbytek Thr nebo Ala a A21 a B3 jsou oba zbytky Asn, a Phe^B1 není vypuštěn, pak jsou 2 až 4 Zn²⁺ ionty navázány na každý hexamer inzulínového derivátu.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde B30 aminokyselinový zbytek je vypuštěn nebo je to jakýkoliv aminokyselinový zbytek, který může být kódován genetickým kódem kromě zbytku Lys, Arg a Cys; A21 a B3 aminokyselinové zbytky jsou nezávisle vybrány ze skupiny, sestávající z jakéhokoliv aminokyselinového zbytku, který může být kódován genetickým kódem kromě zbytku Lys, Arg a Cys; s podmínkou, že když B30 aminokyselinový zbytek je zbytek Ala nebo Thr, pak nejméně jeden zbytek A21 a B3 je jiný než zbytek Asn; Phe^B1 může být vypuštěn; ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, který obsahuje nejméně 6 uhlíkových atomů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselinový zbytek B30 je vypuštěn neboje to jakýkoliv aminokyselinový zbytek, který může být kódován genetickým kódem, kromě zbytku Lys, Arg a Cys; A21 a B3 aminokyselinové zbytky jsou aminokyselinové zbytky nezávisle vybrány ze skupiny, sestávající z jakéhokoliv aminokyselinového zbytku, který může být kódován genetickým kódem kromě zbytku Lys, Arg a

-3CZ 287945 B6

Cys; Phe^B1 může být vypuštěn; ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, kteiý obsahuje nejméně 6 uhlíkových atomů; a 2 až 4 Zn²⁺ ionty jsou navázány na každý hexamer inzulínového derivátu.

V jiném preferovaném provedení se vynález aminokyselinový zbytek B30 je vypuštěn.	týká	derivátů	lidského	inzulínu,	kde
V jiném preferovaném provedení se vynález aminokyselinový zbytek B30 je zbytek Asp.	týká	derivátů	lidského	inzulínu,	kde
V jiném preferovaném provedení se vynález aminokyselinový zbytek B30 je zbytek Glu.	týká	derivátů	lidského	inzulínu,	kde
V jiném preferovaném provedení se vynález aminokyselinový zbytek B30 je zbytek Thr.	týká	derivátů	lidského	inzulínu,	kde

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek lipofilní aminokyseliny, která má nejméně 10 uhlíkových atomů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek lipofilní α-aminokyseliny, která má 10 až 24 uhlíkových atomů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek alifatické nasycené α-aminokyseliny s rovným řetězcem, která má 10 až 24 uhlíkových atomů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek D- nebo L-N^E-dodekanoyllysinu.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek α-aminodekanové kyseliny.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek α-aminoundekanové kyseliny.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek α-aminododekanové kyseliny.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek α-aminotridekanové kyseliny.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek α-aminotetradekanové kyseliny.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek α-aminopentadekanové kyseliny.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek α-aminohexadekanové kyseliny.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde aminokyselina B30 je zbytek a-aminokyseliny.

-4CZ 287945 B6

V jiném preferovaném provedení se vynález aminokyselinový zbytek je zbytek Ala.

V jiném preferovaném provedení se vynález aminokyselinový zbytek je zbytek Gin.

V jiném preferovaném provedení se vynález aminokyselinový zbytek je zbytek Gly.

V jiném preferovaném provedení se vynález aminokyselinový zbytek je zbytek Ser.

týká	derivátů	lidského	inzulínu,	kde	A21
týká	derivátů	lidského	inzulínu,	kde	A21
týká	derivátů	lidského	inzulínu,	kde	A21
týká	derivátů	lidského	inzulínu,	kde	A21

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde B3 aminokyselinový zbytek je zbytek Asp .

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde B3 aminokyselinový zbytek je zbytek Gin .

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde B3 aminokyselinový zbytek je zbytek Thr.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, kterým je acylová skupina odpovídající zbytku karboxylové kyseliny, která má nejméně 6 atomů uhlíku.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, kterým je případně rozvětvená acylová skupina, která odpovídá zbytku karboxylové kyseliny, která má uhlíkový řetězec o délce 8 až 24 atomů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, kterým je acylová skupina odpovídající zbytku mastné kyseliny, která má nejméně 6 uhlíkových atomů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys⁸²⁹ má lipofilní substituent, kterým je acylová skupina odpovídající zbytku lineární, nasycené karboxylové kyseliny, která má 6 až 24 uhlíkových atomů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, kterým je acylová skupina odpovídající zbytku lineární, nasycené karboxylové kyseliny, která má 8 až 12 uhlíkových atomů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, kterým je acylová skupina odpovídající zbytku lineární, nasycené karboxylové kyseliny, která má 10 až 16 uhlíkových atomů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys^B29 má lipofilní substituent, kterým je oligooxyethylenová skupina obsahující až 10, výhodněji až 5, oxyethylenových jednotek.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde ε-aminoskupina Lys⁸²⁹ má lipofilní substituent, kterým je oligooxypropylenová skupina obsahující až 10, výhodněji až 5, oxypropylenových jednotek.

-5CZ 287945 B6

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde jsou na každý inzulínový hexamer navázány 2 Zn²⁺ ionty.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde jsou na každý inzulínový hexamer navázány 3 Zn²⁺ ionty.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu, kde jsou na každý inzulínový hexamer navázány 4 Zn²⁺ ionty.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká derivátů lidského inzulínu podle vynálezu pro přípravu léčiv k léčení diabetů.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká farmaceutických prostředků k léčení diabetů u pacientů, kteří takové léčení potřebují, zahrnujících terapeuticky účinné množství derivátů lidského inzulínu podle vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká farmaceutických prostředků k léčení diabetů u pacientů, kteří takové léčení potřebují, zahrnujících terapeuticky účinné množství derivátů lidského inzulínu podle vynálezu ve směsi s inzulínem nebo s analogy inzulínu, které mají rychlý začátek působení, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká farmaceutických prostředků obsahujících deriváty lidského inzulínu podle vynálezu, které jsou rozpustné při fyziologických hodnotách pH.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká farmaceutických prostředků obsahujících deriváty lidského inzulínu podle vynálezu, které jsou rozpustné při hodnotách pH 6,5 až 8,5.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká protrahovaných farmaceutických prostředků obsahujících deriváty lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká farmaceutických prostředků, které jsou roztoky obsahující 120 nmol/ml až 1200 nmol/ml, výhodněji 600 nmol/ml derivátů lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká způsobu léčení diabetů u pacientů, kteří takové léčení potřebují, zahrnující podávání účinného množství derivátů lidského inzulínu podle vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

V jiném preferovaném provedení se vynález týká farmaceutických prostředků k léčení diabetů u pacientů, kteří takové léčení potřebují, zahrnující podávání účinného množství derivátů lidského inzulínu podle vynálezu ve směsi s inzulínem nebo s analogy inzulínu, které mají rychlý začátek působení, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Příklady preferovaných derivátů lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu, ve kterých nejsou navázány ionty Zn²⁺, jsou následující:

N^EB29-tridekanoyl des (B30) lidský inzulín,

N^EB29-tetradekanoyl des (B30) lidský inzulín,

N^EB29-dekanoyl des (B30) lidský inzulín,

N^EB29-dodekanoyl des (B30) lidský inzulín, N^6B29-tridekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín, N^sB29-tetradekanoyl Gly''²¹ des (B30) lidský inzulín,

-6CZ 287945 B6

N^EB29-dekanoyl Gly*⁴²¹ des (B30) lidský inzulín, N^E829-dodekanoyl Gly'²¹ des (B30) lidský inzulín, N^E829-tridekanoyl Gly'²¹ Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín, N^EB29-tetradekanoyl Gly'⁴²¹ Gln^B3 des (B30) lidský inzulín, N^E829-dekanoyl Gly''²¹ Gln^B3 des (B30) lidský inzulín, N^eB29-dodekanoyl Gly''²¹ Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín, N^E829-tridekanoyl Ala''²¹ des (B30) lidský inzulín, N^EB29-tetradekanoyl Ala''²¹ des (B30) lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Ala'²¹ des (B30) lidský inzulín, N^eB29-dodekanoyl Ala''²¹ des (B30) lidský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Ala''²¹ Gln^B3 des (B30) lidský inzulín, N^EB29-tetradekanoyl Ala^A21 Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Ala⁷'²¹ Gln^B3 des (B30) lidský inzulín, N^eB29-dodekanoyl Ala''²¹ Gln^B3 des (B30) lidský inzulín, N^eB29-tridekanoyl Gln^B3 des (B30) lidský inzulín, N^eB29-tetradekanoyl Gln^B3 des (B30) lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Gln^B3 des (B30) lidský inzulín, N^E829-dodekanoyl Gln^B3 des (B30) lidský inzulín, N^E829-tridekanoyl Gly''²¹ lidský inzulín, N^E829-tetradekanoyl Gly¹'²¹ lidský inzulín, N^E829-dekanoyl Gly''²¹ lidský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Gly''²¹ lidský inzulín, N^eB29-tridekanoyl Gly⁷'²¹ Gln^B3 lidský inzulín, N^EB29-tetradekanoyl Gly¹'²¹ Gln^B3 lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Gly''²¹ Gln^B3 lidský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Gly''²¹ Gln^B3 lidský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Ala'²¹ lidský inzulín, N^EB29-tetradekanoyl Ala¹'²¹ lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Ala''²¹ lidský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Ala¹'²¹ lidský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Ala''²¹ Gln^B3 lidský inzulín, N^EB29-tetradekanoyl Ala''²¹ Gln^B3 lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Ala''²¹ Gln^B3 lidský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Ala^A21 Gln^B3 lidský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Gin ^B3 lidský inzulín, N^E029-tetradekanoyl Gln^B3 lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Gin ^B3 lidský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Gin ^B3 lidský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Glu^B30 lidský inzulín, N^EB29-tetradekanoyl Glu^B3° lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Glu^B3° lidský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Glu ⁸³⁰ lidský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Gly¹'²¹ Glu⁸³⁰ lidský inzulín, N^E829-tetradekanoyl Gly''²¹ Glu^B3° lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Gly''²¹ Glu^B3° lidský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Gly'²¹ Glu^B3° lidský inzulín, N^EB29-tridekanoyl Gly'²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín, N^E829-tetradekanoyl Gly'²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín, N^E829-dekanoyl Gly'²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Gly'²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín, N^E829-tridekanoyl Ala'²¹ Glu⁸³⁰ lidský inzulín,

-7CZ 287945 B6

N^E®²⁹-tetradekanoyl Ala*²¹ Glu^B3° lidský inzulín, N^EB29-dekanoyl Ala''²¹ Glu®³⁰ lidský inzulín, N^E®²⁹-dodekanoyl Ala*²¹ Glu^B3° lidský inzulín, N^E®²⁹-tridekanoyl Ala''²¹ Gln^B3 Glu^B3° lidský inzulín, N^E®²⁹-tetradekanoyl Ala''²¹ Gln^B3 Glu^B3° lidský inzulín, N^E®²⁹-dekanoyl Ala''²¹ Gln^B3 Glu^B3° lidský inzulín, N^EB29-dodekanoyl Ala*²¹ Gln^B3 Glu^B3° lidský inzulín, N^E®²⁹-tridekanoyl Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín, N^E®²⁹-tetradekanoyl Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín, N^E®²⁹-dekanoyl Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín a N^E029-dodekanoyl Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín.

Příklady preferovaných derivátů lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu, ve kterých jsou navázány dva ionty Zn²⁺ na každý inzulínový hexamer, jsou následující:

(N^E029-tridekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^eB29-tridekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Gly''²¹ des (B30) lidský inzulín) e, 2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Gly*²¹ Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Gly*²¹ Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gly*²¹ Gin®³ des (B30) lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Gly*²¹ Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Ala*²¹ des (B30) lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Ala*²¹ des (B30) lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Ala*²¹ des (B30) lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^eB29-dodekanoyl Ala*²¹ des (B30) lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E®²⁹-tridekanoyl Ala*²¹ Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Ala*²¹ Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Ala*²¹ Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^E029dodekanoyl Ala*²¹ Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Gin®³ des (B30) lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Gin®³ des (B30) lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Gly*²¹ lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Gly*²¹ lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^-dekanoyl Gly*²¹ lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Gly*²¹ lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl Gly*²¹ Gin®³ lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Gly*²¹ Gin®³ lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gly*²¹ Gin®³ lidský inzulín)₆, 2Zn²⁺, (N^E®²⁹-dodekanoyl Gly*²¹ Gin®³ lidský inzulín)6, 2Zn²⁺,

-8CZ 287945 B6 (N^E029-tridekanoyl Ala“¹²¹ lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Ala¹'²¹ lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Ala' lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Ala¹ lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Ala¹ Gln^B3 lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Ala*²¹ Gln^B3 lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Ala*²¹ Gln^B3 lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Ala*²¹ Gln^B3 lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Gln^B3 lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Gln^B3 lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gln^B3 lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gln^B3 lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Glu^B3 lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Glu^B3 lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Glu^B3 lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Glu^B3 lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Gly*²¹ Glu^B3° lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Gly*²¹ Glu^B3° lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gly¹ Glu^B3° lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gly*²¹ Glu^B3° lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Gly*²¹ Gln^B3 Glu^B3° lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Gly*²¹ Gln^B3 Glu⁰³⁰ lidský inžulin)6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gly¹ Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gly*²¹ Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Ala*²¹ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Ala*²¹ Glu⁰³⁰ lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Ala*²¹ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Ala*²¹ Glu⁰³⁰ lidský inzulín)6,2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Ala*²¹ Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín)6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Ala*²¹ Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Ala¹ Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Ala*²¹ Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6, 2Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín) 6,2Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Gin⁰³ Glu⁰³⁰ lidský inzulín)₆, 2Zn²⁺.

Příklady preferovaných derivátů lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu, ve kterých jsou navázány tři ionty Zn²⁺ na každý inzulínový hexamer, jsou následující:

(N^E029-tridekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín)¢, 3Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^E029-dodekanoyl Gly¹ des (B30) lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^E029-tridekanoyl Gly¹ Gin⁰³ des (B30) lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^E029-tetradekanoyl Gly¹ Gln^B3des (B30) lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^E029-dekanoyl Gly¹ Gin⁰³ des (B30) lidský inzulín)₆, 3Zn²⁺,

-9CZ 287945 B6 (N^EB29-dodekanoyl Gly''²¹ Gln^B3 des (B30) lidský inzulín) 6,3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Ala'²¹ des (B30) lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Ala''²¹ des (B30) lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Ala'²¹ des (B30) lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Ala^A21 des (B30) lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Ala'²¹ Gin^B3des (B30) lidský inzulín)6,3Zn, (N^EB29-tetradekanoyl Ala'²¹ Gln^B3des (B30) lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Ala'²¹ Gln^B3 des (B30) lidský inzulín) 6,3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Ala'²¹ Gln^B3 des (B30) lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Gln^B3 des (B30) lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Gln^B3 des (B30) lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gln^B3 des (B30) lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gln^B3 des (B30) lidský inzulín) 6,3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl lidský inzulín) 6,3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl lidský inzulín) 6,3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Gly'²¹ lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Gly'²¹ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gly'²¹ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gly'²¹ lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Gly'²¹ Gln^B3 lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Gly'²¹ Gin®³ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gly'²¹ Gln^B3 lidský inzulín)¢, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gly'²¹ Gln^B3 lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Ala'²¹ lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Ala'²¹ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Ala'²¹ lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Ala'²¹ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Ala'²¹ Gin®³ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Ala'²¹ Gln^B3 lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Ala'²¹ Gln^B3 lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Ala'²¹ Gln^B3 lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Gln^B3 lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Gln^B3 lidský inzulín) 6,3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gin⁰³ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gin®³ lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^eB29-dekanoyl Glu^B30lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Gly'²¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Gly'²¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gly'²¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gly'²¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Gly'²¹ Gin®³ Glu^B30lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Gly'²¹ Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gly'²¹ Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gly'²¹ Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tridekanoyl Ala'²¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Ala'²¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,3Zn²⁺,

-10CZ 287945 B6 (N^£B29-dekanoyl Ala''²¹ Glu⁸³⁰ lidský inzulín)6,3Zn²⁺, (N^£B29-dodekanoyl Ala²'²¹ Glu^B3° lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl Ala¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^£B29-tetradekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^£B29-dekanoyl Ala¹ Gin⁸³Glu⁸³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^£B29-dodekanoyl Ala*²¹ Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín)6, 3Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl Gin ⁸³ Glu ⁸³⁰ lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^£B29-tetradekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^£B29-dekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gin⁸³ Glu⁸³⁰ lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺.

Příklady preferovaných derivátů lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu, ve kterých jsou navázány čtyři ionty Zn²⁺ na každý inzulínový hexamer, jsou následující:

(N^£B29-tridekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6, 4Zn²⁺, (N^£B29-tetradekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^eB29-dekanoyl des (B30) lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^e829-dodekanoyl des (B30) lidský inzulín)¢, 4Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-dekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^£B29-dodekanoyl Gly*²¹ des (B30) lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl Gly¹ Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-tetradekanoyl Gly¹ Gin⁸³des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^e829-dekanoyl Gly¹ Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£829-dodekanoyl Gly¹ Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^eB29-tridekanoyl Ala¹ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^cB29-tetradekanoyl Ala¹ des (B30) lidský inzulín)¢, 4Zn²⁺, (N^£B29-dekanoyl Ala¹ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^sB29-dodekanoyl Ala¹ des (B30) lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl Ala¹ Gin⁸³des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-tetradekanoyl Ala¹ Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^£829-dekanoyl Ala¹ Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£829-dodekanoyl Ala¹ Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-tetradekanoyl Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-dekanoyl Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£829-dodekanoyl Gin⁸³ des (B30) lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl lidský inzulín) ¢, 4Zn²⁺, (N^£B29-tetradekanoyl lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^£B29-dekanoyl lidský inzulín) 6, 4Zn²⁺, (N^£B29-dodekanoyl lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^£829-tridekanoyl Gly¹ lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^£829-tetradekanoyl Gly¹ lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^£B29-dekanoyl Gly¹ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-dodekanoyl Gly¹ lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl Gly¹ Gin⁸³ lidský inzulín)e, 4Zn²⁺, (N^£B29-tetradekanoyl Gly¹ Gin⁸³ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-dekanoyl Gly¹ Gin⁸³ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-dodekanoyl Gly¹ Gin⁸³ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^£B29-tridekanoyl Ala¹ lidský inzulín)6, 4Zn²⁺,

- 11 CZ 287945 B6 (N^cB29-tetradekanoyl Ala“¹ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dekanoyl Ala“¹ lidský inzulín) 6, 4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dodekanoyl Ala“¹ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tridekanoyl Ala“¹ Gin®³ lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Ala“¹ Gin⁸³ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dekanoyl Ala“¹ Gin®³ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dodekanoyl Ala“¹ Gin®³ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^EB29_tridekanoyl Gin®³ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Gin®³ lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gin ®³ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dodekanoyl Gin®³ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tridekanoyl Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Glu®³⁰ lidský inzulín)¢, 4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dekanoyl Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dodekanoyl Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tridekanoyl Gly“¹ Glu®³⁰lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Gly“¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dekanoyl Gly“¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dodekanoyl Gly“¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tridekanoyl Gly“¹ Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Gly“¹ Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Gly“¹ Gin®³ Glu^B30lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Gly“¹ Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tridekanoyl Ala“¹ Glu®³⁰ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Ala“¹ Glu®³⁰ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dekanoyl Ala“¹ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^EB29-dodekanoyl Ala “* Glu ®³⁰ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tridekanoyl Ala“* Gin ®³ Glu ®³⁰ lidský inzulín) 6,4Zn²⁺, (N^EB29-tetradekanoyl Ala“¹ Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^EB29-dekanoyl Ala“¹ Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dodekanoyl Ala“¹ Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tridekanoyl Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-tetradekanoyl Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dekanoyl Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6, 4Zn²⁺, (N^E®²⁹-dodekanoyl Gin®³ Glu®³⁰ lidský inzulín)6,4Zn²⁺.

Stručný popis obrázků

Předkládaný vynález je dále popsán s odkazy na přiložené obrázky, kde obr. 1 ukazuje konstrukci plazmidu pEA5.3.2;

obr. 2 ukazuje konstrukci plazmidu pEA108; a obr. 3 ukazuje konstrukci plazmidu pEAl 13.

- 12CZ 287945 B6

Podrobný popis vynálezu

Terminologie

Třípísmenné kódy a jednopísmenné kódy pro aminokyselinové zbytky jsou zde použity tak, jak je uvedeno v J. Biol. Chem. 243, str. 3558 (1968).

V sekvencích DNA: A je adenin, C je cytosin, G je guanin a T je thymin.

Jsou použity následující zkratky:

DMSO pro dimethylsulfoxid, DMF pro dimethylformamid, Boc pro terc-butoxykarbonyl, RPHPLC pro HPLC na reverzní fázi, X-OSu pro N-hydroxysukcinimidester, X pro acylovou skupinu a TFA pro trifluoroctovou kyselinu.

Příprava lipofllních derivátů inzulínu

Deriváty inzulínu podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny např. následujícím způsobem:

1. Deriváty inzulínu, které mají v poloze B30 aminokyselinový zbytek, který může být kódován genetickým kódem, např. threonin (lidský inzulín) nebo alanin (vepřový inzulín)

1.1. Výchozí látka je lidský inzulín

Lidský inzulín reaguje s Boc-činidlem (např. di-tercbutyldikarbonát) za vzniku (Al,Bl)-diBoc lidského inzulínu, tj. lidského inzulínu, kde N-konce obou řetězců jsou chráněny Boc-skupinou. Po nepovinném čištění, např. HPLC, je acylová skupina zavedena na ε-aminoskupinu Lys⁸²⁹ tak, že produkt necháme reagovat s N-hydroxysukcinimidesterem obecného vzorce I:

X-OSu I, kde X je acylová skupina, která má být zavedena. V posledním krokuje použita TFA k odstranění Boc-skupin a je izolován produkt, Ν^εΒ29-Χ lidský inzulín.

1.2. Výchozí látka je jednořetězcový inzulínový prekurzor

Jako výchozí látka může být použit jednořetězcový inzulínový prekurzor, prodloužený v poloze Bl prodloužením (Ext), které je napojeno na Bl přes argininový zbytek a kde můstek od B30 na Al je argininový zbytek, tj. sloučenina obecného vzorce II:

Ext-Arg-B (1-30) -Arg-A (1-21) II.

Acylaci tohoto výchozího materiálu N-hydroxysukcinimidesterem obecného vzorce I, kde X je acylová skupina, je zavedena acylová skupina X na aminoskupinu Lys ⁸²⁹ a na N-koncovou aminoskupinu prekurzoru. Reakcí tohoto acylovaného prekurzoru obecného vzorce III:

(N^eB29-X), Ext-Arg-B (1-30)-Arg-A (1-21) ΠΙ s trypsinem ve směsi s vodou a vhodného s vodou mísitelného rozpouštědla, např. DMF, DMSO nebo nižšího alkoholu, je získán meziprodukt (Ν^εΒ29-Χ), Arg⁸³¹ inzulín. Reakcí tohoto meziproduktu s karboxypeptidázou B získáme žádaný produkt, (N^-X) inzulín.

-13CZ 287945 B6

2. Deriváty inzulínu bez aminokyselinového zbytku v poloze B30, tj. des (B30) inzulíny

2.1. Výchozí látka je lidský inzulín nebo vepřový inzulín

Reakcí lidského inzulínu i vepřového inzulínu s karboxypeptidázou A v amonném pufru získáme v obou případech des (B30) inzulín. Po nepovinném čištění reaguje des (B30) inzulín s Bocčinidlem (např. di-terc-butyl dikarbonát) za vzniku (Al,Bl)-diBoc des (B30) inzulínu, tj. des (B30) inzulín, kde N-konce obou řetězců jsou chráněny Boc-skupinou. Po nepovinném čištění, např. HPLC, je acylová skupina zavedena na ε-aminoskupinu Lys®²⁹ tak, že produkt necháme reagovat s N-hydroxysukcinimidesterem obecného vzorce I, kde X je acylová skupina, která má být zavedena. V posledním krokuje použita TFA k odstranění Boc-skupin a je izolován produkt, (Ν^εΒ29-Χ) des (B30) inzulín.

2.2. Výchozí látka je jednořetězcový inzulínový prekurzor

Jako výchozí látka může být použit jednořetězcový inzulínový prekurzor, prodloužený v poloze Bl prodloužením (Ext), které je napojeno na Bl přes argininový zbytek a který má můstek od B30 na AI. Výhodněji je můstek peptid obecného vzorce V:

Y_n-Arg V, kde Y je kódovaná aminokyselina kromě lysinu a argininu, a n je nula nebo celé číslo 1 až 35. Když a> 1, Y mohou, být jiné aminokyseliny. Preferované příklady můstku mezi B30 na AI jsou: AlaAlaArg, SerArg, SerAspAspAlaArg a Arg (Evropský patent č. 163529). Reakcí takovéhoto prekurzoru obecného vzorce VI:

Ext-Arg-B (1-30) - Y_n -Arg-A (1-21) VI s lysylovou endopeptidázou, např. proteázou Achromobacter lyticus, získáme Ext-Arg-B (1-29) Thr-Y_n -Arg-A (1-21) des (B30) inzulín. Acylací tohoto meziproduktu N-hydroxysukcinimidesterem obecného vzorce I, kde X je acylová skupina, je zavedena acylová skupina X na ε-aminoskupinu Lys®²⁹ a na N-koncovou aminoskupinu A-řetězce a B-řetězce za vzniku (Ν^εΒ29-Χ) X-ExtArg-B (1-29) X-Thr-Y_n-Arg-A (1-21) des(B30) inzulínu. Reakcí tohoto meziproduktu s trypsinem ve směsi s vodou a vhodným organickým rozpouštědlem, např. DMF, DMSO nebo nižším alkoholem, získáme požadovaný derivát, (Ν^εΒ29-Χ) des (B30) lidský inzulín.

Charakteristika Ν^ε®²⁹ modifikovaných inzulínů

Některá experimentální data o modifikovaných inzulínech ukazuje tab. 1.

Lipofilicita derivátů inzulínu ve srovnání s lidským inzulínem, k'_rei, byla měřena na HPLC koloně LiChrosorb RP18 (5 pm, 250 x 4 mm) izokratickou elucí při 40 °C s použitím směsí A) 0,1 M sodný fosfátový pufr, pH 7,3, obsahující 10 % acetonitrilu, a B) 50 % acetonitrilu ve vodě jako eluentu. Eluce byla sledována UV absorpcí eluátu při 214 nm. Mrtvý čas, to, byl zjištěn nastříknutím 0,1 mM dusičnanu sodného. Retenční čas pro lidský inzulín, th„._n,_n. byl nastaven na přinejmenším 2to změnou poměru mezi roztoky A a B.

Ř rel^— (íderivátirfo) ! (tlidskýto)·

Stupeň prolongace účinku na pokles krevní glukózy byl studován na králících. Každý derivát inzulínu byl testován subkutánní injekcí 12 nmol u každého z šesti králíků v jednodenním retardačním testu. Vzorky pro analýzu glukózy byly odebrány před injekcí a 1, 2, 4 a 6 hodin po injekci. Zjištěné hodnoty glukózy byly vyjádřeny jako procenta původních hodnot. Index protrakce, který byl vypočítán z hodnot krevní glukózy, je změřený Index protrakce (prolonga

-14CZ 287945 B6 ce), viz str. 211 v Markussen a kol., Protein Engineering 1 (1987) 205-213. Jako měřítko vzorce sloužily jako hodnota 100 hovězí ultrapomalý inzulín a jako hodnota 0 Actrapid inzulín (Novo Nordisk A/S, 2880 Bagsvaerd, Denmark).

Deriváty inzulínu uvedené v tab. 1 byly podávány v roztocích obsahujících 3 Zn²⁺ na každý inzulínový hexamer, kromě těch, kde je výslovně uvedeno, že jsou bez Zn.

Pro velmi protrahované analogy je králičí model nevhodný, protože pokles krevní glukózy z původní hladiny je příliš malý na určení indexu protrakce. Prolongace těchto analogů je lépe charakterizována lychlostí zmizení u prasat. T₅₀% je doba, kdy 50 % A14 Tyr (¹²⁵I) analogu zmizí z místa injekce, měřeno externím γ-počítadlem (Ribel, U. a kol., The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man. In: M. serrano-Rios a P.J. Lefebre (editoři): Diabetes 1985; Proceedings of the 12th Congress of the Intemational Diabetes Federation, Madrid, Španělsko, 1985 (Excerpta Medica, Amsterdam, (1986) 891-96).

V tab. 2 jsou hodnoty T₅o% skupiny velmi protrahovaných inzulínových analogů. Analogy byly podány v roztocích obsahujících 3 Zn²⁺ na každý inzulínový hexamer.

Tabulka 1

Inzulínový derivát *	Relativní lipofilita	Krevní glukóza, % původní hodnoty	Index protrakce
1 h	2h	4h	6h
NEB29-benzoyl inzulín	1,14
NEB29-fenylacetyl inzulín (bez Zn)	1,28	55,4	58,9	88,8	90,1	10
NEB29-cyklohexylacetyl inzulín	1,90	53,1	49,6	66,9	81,1	28
NEB29-cyklohexylpropionyi inzulín	3,29	55,5	47,6	61,5	73,0	39
NEB29-cyklohexylvaleroyl inzulín	9,87	65	58,3	65,7	71,0	49
NEB29-oktanoyl inzulín	3,97	57,1	54,8	69,0	78,9	33
NEB29-dekanoyl, des(B30) inzulín	11,0	74,3	65,0	60,9	64,1	65
NEB29-dekanoyl inzulín	12,3	73,3	59,4	64,9	68,0	60
NEB29-undekanoyl, des(B30) inzulín	19,7	88,1	80,0	72,1	72,1	80
NEB29-lauroyl, des(B30) inzulín	37,0	91,4	90,0	84,2	83,9	78
NEB29-myristoyl inzulín	113	98,5	92,0	83,9	84,5	97
NeB29-choloyl inzulín	7,64	58,2	53,2	69,0	88,5	20
NEB29-7-deoxycholoyl inzulín (bez Zn)	24,4	76,5	65,2	77,4	87,4	35
NEB29-lithocholoyl inzulín (bez Zn)	51,6	98,3	92,3	100,5	93,4	115
NEB29-4-benzoyl-fenylalanyl	2,51	53,9	58,7	74,4	89,0	14

inzulín

-15CZ 287945 B6

Tabulka 1 - pokračování

Inzulínový derivát *	Relativní lipofilita	Krevní glukóza, % původní hodnoty lh 2h 4h	6h	Index protrakce
ΝεΒ29-3,5-dijodotyrosyl	1,07	53,9 48,3 60,8	82,1	27
inzulín
NEB29-L-thyroxyl inzulín	8,00

Tabulka 2

Derivát lidského inzulínu	Relativní hydrofobicita	Subkutánní vymizení u
600 μΜ, 3Zn2+/hexamer, fenol 0,3%, glycerol 1,6%, pH 7,5	k’reI	T50%, hodiny
NeB29-dekanoyl, des(B30) inzulín	11,0	5,6
NeB29-undekanoyl, des(B30) inzulín	19,7	6,9
NeB29-lauroyl, des(B30) inzulín	37	10,1
NeB29-tridekanoyl, des(B30) inzulín	65	12,9
NeB29-myristoyl, des(B30) inzulín	113	13,8
NE029-palmitoyl, des(B30) inzulín	346	12,4
NeB29-sukcinimidomyristová kyselina inzulín	10,5	13,6
NcB29-myristoyl inzulín	113	11,9
lidský NPH		10

Rozpustnost

Rozpustnost všech Ν^εΒ29 modifikovaných inzulínů uvedená v tab. 1, kdy každý obsahuje 3 ionty Zn²⁺ na každý inzulínový hexamer, přesahuje 600 nmol/ml v neutrálním (pH 7,5), vodném, farmaceutickém prostředku, kteiý dále obsahuje 0,3 % fenolu jako konzervační látky a 1,6 % glycerolu pro udržení izotonicity. 600 nmol/ml je koncentrace lidského inzulínu ve 100 IU/ml v prostředcích obvykle používaných v klinické praxi.

Aminoskupina ε-Β29 se může účastnit amidové vazby, sulfonamidové vazby, karbamidu, thiokarbamidu nebo karbamátu. Lipofilním substituentem, kteiý nese ε-Β29 aminoskupina, může být také alkylová skupina.

Farmaceutické prostředky obsahující deriváty lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu mohou být podávány parenterálně pacientům, kteří potřebují takovouto léčbu. Parenterální podávání může být provedeno jako subkutánní, intramuskulámí nebo intravenózní injekce pomocí injekční stříkačky. Alternativou je parenterální podávání pomocí infuzní pumpy. Další možností je prostředek, kterým může být prášek nebo kapalina pro podávání derivátů lidského inzulínu formou nasálního spreje.

-16CZ 287945 B6

Injikovatelné prostředky obsahující lidský inzulín podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny běžnými technikami farmaceutického průmyslu, které zahrnují rozpouštění a míchání složek za vzniku žádaného výsledného produktu.

Podle jednoho postupu jsou deriváty lidského inzulínu rozpuštěny v takovém objemu vody, který je menší, než výsledný objem směsi, která má být připravena. Izotonické činidlo, konzervační látka a pufr jsou přidány podle potřeby a pH hodnota roztoku je upravena - pokud je to nutné použitím kyseliny, např, kyseliny chlorovodíkové, nebo zásady, např. vodného roztoku hydroxidu sodného. Nakonec je ředěním vodou dosaženo žádaného objemu a koncentrace.

Příklady izotonických činidel jsou chlorid sodný, mannitol a glycerol.

Příklady konzervačních činidel jsou fenol, m-kresol, methylhydroxybenzoát a benzoylchlorid.

Příklady vhodných pufrů jsou octan sodný a fosforečnan sodný.

Prostředek pro nosní podávání derivátů inzulínu podle předkládaného vynálezu může být připraven například tak, jak je popsáno v Evropském patentu č. 272097 (Novo Nordisk A/S).

Inzulínové prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity k léčení diabetů. Výše optimální dávky pro jakéhokoliv pacienta závisí na mnoha faktorech, včetně účinnosti použitých specifických derivátů lidského inzulínu, věku, tělesné hmotnosti, fyzické aktivitě a stravě pacienta, na možných kombinacích dalších léků a na stavu diabetů. Je doporučeno, aby byla optimální denní dávka pro každého pacienta určena individuálně, tyto postupy jsou v daném oboru známé a jsou podobné jako pro známé inzulínové prostředky.

Pokud je to vhodné, mohou být deriváty lidského inzulínu podle předkládaného vynálezu použity ve směsi s dalšími typy inzulínu, např. lidského inzulínu nebo vepřového inzulínu nebo inzulínových analogů s rychlejším nástupem účinnosti. Příklady těchto inzulínových analogů jsou popsány například v Evropských patentových přihláškách, které mají publikační čísla EP 214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordisk A/S) a EP 383472 (Eli Lilly & Co.) .

Předkládaný vynález je dále ilustrován následujícími příklady, kterém ovšem nepředstavují omezení rámce vynálezu. Vlastnosti popsané v předešlém popisu a v následujících příkladech mohou, zvlášť nebo v jakékoliv jejich kombinaci, být výchozím materiálem pro realizaci vynálezu v různých jeho formách.

Příklady provedení vynálezu

Plazmidy a DNA materiál

Všechny expresní plazmidy byly typu cPOT. Tyto plazmidy jsou popsány v EP patentové přihlášce č. 171142 a jsou charakterizovány obsahem Schizosaccharomyces pombe triosového fosfátisomerasového genu (POT) pro účely plazmidové selekce a stabilizace. Plazmid obsahující POTgen lze získat z deponovaného E. coli linie (ATCC 39685). Plazmidy dále obsahují S. cerevisiae triosový fostátisomerasový promotor a terminátor (Pm a T_ra). Jsou identické jako pMT742 (Egel-Mitani, M. a kol., Gene 73 (1988) 113-120) (viz Obr. 1) kromě oblasti definované ECoRI-Xbal restrikčním místem zahrnujícím kódovací oblast pro signal/leader/produkt.

Syntetické DNA fragmenty byly syntetizovány na automatickém DNA syntetizéru (Applied Biosystems model 380A) s použitím fosforamiditové chemie a komerčně dostupných činidel (Beaucage, S.L. a Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1869).

- 17CZ 287945 B6

Všechny ostatní použité metody a materiály jsou v dané oblasti běžné (viz. např Sambrook, J., Fritsch, E.F. a Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).

Analytické metody

Molekulární hmotnosti připravených inzulínů byly získány MS (hmotnostní spektroskopií), buď PDMS (plazmatickou desorpční hmotnostní spektroskopií) s použitím zařízení Bio-Ion 20 (BioIon Nordic AB, Uppsala, Švédsko) a nebo ESMS (elektrosprejovou hmotnostní spektrometrií) s použitím API III Biomolekulárního hmotnostního analyzátoru (Perkin-Elmer Sciex Instruments, Thomhill, Kanada).

Příklad 1

Syntéza Ala“¹ Asp⁸³ prekurzoru lidského inzulínu z kvasinkové linie yEA002 s použitím LaC212spx3 signal/leader

Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:

č. 98 5'-TGGCTAAGAGATTCGTTGACCAACACTTGTGCGGTTCTCA

CTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAA AGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3'(Asp^B3) (id. č. sekvence: 3),

č. 128 5'-CTGCGGGCTGCGTCTAAGCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAA AGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTC GTCAGACTTTGG-3' (Ala“¹) (id. č. sekvence: 4),

č. 126 5'-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTG-3'(Asp^B3) (id. č. sekvence: 5),

č. 16 5'-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (id. č. sekvence: 6).

Následující Polymerasová řetězcová reakce (PCR) byla provedena s použitím reagenční soupravy Gene Amp PCR (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) podle návodu výrobce. Ve všech případech byla směs PCR převrstvena 100 μΐ minerálního oleje (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) .

2,5 μΐ oligonukleotidu č. 98 (2,5 pmol)

2,5 μΐ oligonukleotidu č. 128 (2,5 pmol) μΐ 10X PCR pufru μΐ dNTP směsi

0,5 μΐ Taq enzymu

58,5 μΐ vody.

Jeden cyklus probíhal: 94 °C po dobu 45 s, 49 C po dobu 1 min, 72 °C po dobu 2 min.

Následně bylo přidáno 5 μΐ oligonukleotidů č. 16 a č. 126 a bylo provedeno 15 cyklů: 94 °C po dobu 45 s, 45 °C po dobu 1 min, 72 °C po dobu 1,5 min. Směs PCR byla nanesena na 2,5 % agarosový gel a byla provedena elektroforéza použitím standardních technik (Sambrook a kol., Molekulární klonování, Cold Spring Harbour Laboratoiy Press, 1989). Výsledné DNA

-18CZ 287945 B6 fragmenty byly vyříznuty z agarosového gelu a izolovány použitím Gene Clean Kit (Bio 101 lne., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) podle návodu výrobce. Čištěný PCR DNA fragment byl rozpuštěn v 10 μΐ vody a restrikčního endonukleázového pufru a štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Xba I standardními technikami, elektroforézován na 2,5 % agarosovém gelu a čištěn použitím Gene Clean Kit, jak bylo popsáno.

Plazmid pAK188 se skládá z DNA sekvence 412 bp složené z EcoRI/NcoI fragmetu kódující syntetický kvasinkový signal/leader gen LaC212spx3 (popsáno v příkladu 3 WO 89/02463) a následuje syntetický Ncol/Xbal fragment kódující inzulínový prekurzor MI5, který má SerAspAspAlaLys můstek spojující B29 a Al aminokyselinové zbytky (viz sekvence id. č. 14, 15 a 16), vložené do EcoRI/Xbal fragmentu vektoru (fagemidu) pBLUESCRIPT Hsk(+/-) (Stratagene, USA). Plazmid pAK188 je znázorněn na obr. 1.

Plazmid pAK188 byl také štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Xbal a byl izolován vektorový fragment 3139 bp. Dva DNA fragmenty byly na sebe navázány s použitím T4 DNA ligázy a standardních podmínek (Sambrook a kol., Molekular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). Vazebná směs byla transformována do kompetentní E. coli linie (R-, M+) a následovala selekce na ampicilinovou rezistenci. Plazmidy byly izolovány z výsledných E. coli kolonií s použitím standardních DNA minipreparačních technik (Sambrook a kol., Molekular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989), řízených vhodnými restrikčními endonukleázami, např. EcoRI, Xbal, Ncol a Hpal. DNA sekvenční analýzou (Seyuenase, U.S. Biochemical Corp.) byl zjištěn u selektovaného plazmidu obsah správné sekvence pro Ala^¹, Asp^B3 prekurzoru lidského inzulínu a byl pojmenován pEA5.3.

Plazmid pKFN1627 je E. coli - S. cerevisiae transportní vektor, identický jako plazmid pKFN1003 popsaný v EP patentu č. 375718, až na krátkou DNA sekvenci, která je v protisměrů k specifickému Xbal místu. V pKFN1003 je tato sekvence 178 bp fragment kódující syntetický aprotininový gen fúzovaný do konstrukce kvasinkového pomocného faktoru alfa 1 signal-leader sekvence. V pKFN1627 odpovídající 184 bp sekvence kóduje inzulínový prekurzor MI5 (Glu^BI, G1u^B28), tj. B(l-29, G1u^bi, Glu^B28)-SerAspAspAlaLys-A(l-21) fúzovaný do konstrukce pomocného faktoru alfa 1 sekvence (viz sekvence id. č. 17, 18 a 19). Vektor pKFN1627 je zobrazen na obr. 1).

pEA5.3 byl štěpen restrikčními endonukleázami EcoRI a Xbal a byl izolován fragment s 412 bp. Kvasinkový expresní vektor pKFN1627 byl štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Xbal a pomocí Ncol a EcoRI, a z prvního štěpení byl izolován DNA fragment s 9273 bp a z druhého DNA fragment s 1644 bp. 412 bp EcoRI/Xbal fragment byl poté navázán na dva další fragmenty, což je 9273 bp Ncol Ι/Xbal fragment a 1644 bp NcoI/EcoRI fragment použitím standardních technik.

Vazebná směs byla transformována do E. coli, jak je popsáno výše. Plazmid z výsledné E. coli byl izolován použitím standardních technik, řízených vhodnými restrikčními endonukleázami, jako je EcoRI, Xbal, Ncol, Hpal. Sekvenční DNA analýzou vybraného plazmidu (s použitím Sequenase kit jak je popsáno výrobcem, U.S. Biochemical) bylo zjištěno, že obsahuje správnou sekvenci pro Ala^¹ Asp^B3 DNA prekurzoru lidského inzulínu a je vložen za DNA kódující LaC212spx3 signal/leader DNA. Plazmid byl pojmenován pEA5.3.2. a je na obr. 1. DNA sekvence kódující LaC212spx3 signal/leader/Ala^¹ Asp^B3 lidský inzulínový prekurzorový komplex a jeho aminokyselinová sekvence jsou sekvence id. č. 20, 21 a 22. Plazmid pEA5.3.2 byl transformován do S. cerevisiae linie MT663 jako je popsáno v Evropské patentové aplikaci, která má patentové číslo 214826 a výsledná linie byla pojmenována yEA002.

-19CZ 287945 B6

Příklad 2

Syntéza Ala''²¹ Thr⁸³ prekurzoru lidského inzulínu z kvasinkové linie yEA005 s použitím LaC212spx3 signal/leader

Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:

č. 101 5'-TGGCTAAGAGATTCGTTACTCAACACTTGTGCGGTTCTCACTT GGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACA CTCCAAAGTCTGACGACGCT-3’ (Thr^B3) (id. č. sekvence: 7),

č. 128 5-CTGCGGGCTGCGTCTAAGCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAA GAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTCG TCAGACTTTGG-3' (Ala*²¹) (id. č . sekvence: 4),

č. 15 5-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTA-3'(Thr⁰³) (id. č. sekvence: 8),

č. 16 5-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (id. č. sekvence: 6).

DNA kódující Ala*²¹ Thr⁰³ prekurzor lidského inzulínu byla zkonstruována stejným způsobem, jak je popsáno pro DNA kódující Ala*²¹ Asp⁰³ prekurzor lidského inzulínu v příkladu 1. DNA sekvence kódující LaC212spx3 signal/leader/Ala^Thr⁰³ lidský inzulínový prekurzorový komplex a jeho aminokyselinová sekvence jsou sekvence id. č. 23, 24 a 25. Plazmid pEA8.1.1, u kterého bylo zjištěno, že obsahuje žádoucí sekvenci, byl transformován do S. cerevisiae linie MT663 jak je popsáno v příkladu 1 a výsledná linie byla pojmenována yEA005.

Příklad 3

Syntéza Gly*²¹ Asp⁰³ prekurzoru lidského inzulínu z kvasinkové linie yEA007 s použitím LaC212spx3 signal/leader

Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:

ě. 98 5'-TGGCTAAGAGATTCGTTGACCAACACTTGTGCGGTTCTCACTTG

GTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCT ACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3' (Asp⁰³) (id. č. sekvence: 3),

č. 127 5'-CTGCGGGCTGCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAA

AGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCT TAGCGTCGTCAGACTTTGG-3' (Gly*²¹) (id. č. sekvence: 9),

č. 126 5'-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTG-3' (Asp⁰³) (id. č . sekvence: 5),

č. 16 5-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (id. č. sekvence: 6).

-20CZ 287945 B6

DNA kódující Gly*²¹ Asp⁸³ prekurzor lidského inzulínu byla zkonstruována stejným způsobem, jak je popsáno pro DNA kódující Ala*²¹ Asp^B3 prekurzor lidského inzulínu v příkladu 1. DNA sekvence kódující LaC212spx3 signal/leader/Glý^Asp⁸³ lidský inzulínový prekurzorový komplex a jeho aminokyselinová sekvence jsou sekvence id. č. 26, 27 a 28. Plazmid pEAl.5.6, u kterého bylo zjištěno, že obsahuje žádoucí sekvenci, byl transformován do S.cerevisiae linie MT663 jak je popsáno v příkladu 1 a výsledná linie byla pojmenována yEA007.

Příklad 4

Syntéza Gly*²¹ Thr⁸³ prekurzoru lidského inzulínu z kvasinkové linie yEA006 s použitím LaC212spx3 signal/leader

Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:

č. 101 5-TGGCTAAGAGATTCGTTACTCAACACTTGTGCGGTTCTCACTT GGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACA CTCCAAAGTCTGACGACGCT-3' (Thr⁸³) (id. č. sekvence: 7),

č. 127 5'-CTGCGGGCTGCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAA

AGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCT TAGCGTCGTCAGACTTTGG-3' (Gly*²¹) (id. č. sekvence: 9),

č. 15 5'-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTA-3'(Thr^B3) (id. č. sekvence: 8),

č. 16 5-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (id. č. sekvence: 6).

DNA kódující Gly*²¹ Thr⁸³ prekurzor lidského inzulínu byla zkonstruována stejným způsobem, jak je popsáno pro DNA kódující Ala*²¹ Asp⁸³ prekurzor lidského inzulínu v příkladu 1. DNA sekvence kódující LaC212spx3 signal/leader/Glý^Thr⁸³ lidský inzulínový prekurzorový komplex a jeho aminokyselinová sekvence jsou sekvence id. č. 29, 30 a 31. Plazmid pEA4.4.11, u kterého bylo zjištěno, že obsahuje žádoucí sekvenci, byl transformován do S. cerevisiae linie MT663 jak je popsáno v příkladu 1 a výsledná linie byla pojmenována yEA006.

Příklad 5

Syntéza Arg⁸’¹ Arg⁸³¹ jednořetězcového prekurzoru lidského inzulínu s N-koncovým prodloužením (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) z kvasinkové linie yEA113 s použitím alfa faktor leader

A)

Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:

č. 220 5-ACGTACGTTCTAGAGCCTGCGGGCTGC-3' (id. č. sekvence: 10),

-21 CZ 287945 B6

č. 263 5'-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTC TTCTACACTCCAAAGACTAGAGGTATCGTTGAA-3' (id. č. sekvence: 11),

č. 307 5-GCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCT AGATTCGTTAACCAACAC-3' (id. č. sekvence: 12),

Následující Polymerasová řetězcová reakce (PCR) byla provedena s použitím reagenční soupravy Gene Amp PCR (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) podle návodu výrobce. Ve všech případech byla směs PCR převrstvena 100 μΐ minerálního oleje (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Plazmid pAK220 (kteiý je identický jako pAK188) se skládá z DNA sekvence 412 bp kódující syntetický kvasinkový signal/leader LaC212spx3 (popsáno v příkladu 3 WO 89/02463) a následuje inzulínový prekurzor MI5 (viz id. č. sekvence: 14, 15 a 16), vložené do vektoru (fagemidu) pBLUESCRIPT IIsk(+/-) (Stratagene, USA).

μΐ oligonukleotidu č. 220 (100 pmol) μΐ oligonukleotidu č. 263 (100 pmol) μΐ 10X PCR pufru μΐ dNTP směsi

0,5 μΐ Taq enzymu

0,5 μΙ pAK220 plazmidu (identického k pAK188) jako templátu (0,2 pg DNA) μΐ vody.

Bylo provedeno celkem 16 cyklů, přičemž každý cyklus probíhal 1 minutu při 40 °C a 2 minuty při 72 °C. Směs PCR byla nanesena na 2% agarosový gel a byla provedena elektroforéza použitím standardních technik. Výsledné DNA fragmenty byly vyříznuty z agarosového gelu a izolovány použitím Gene Clean Kit (Bio 101 lne., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) podle návodu výrobce. Čištěný PCR DNA fragment byl rozpuštěn v 10 μΐ vody a restrikčního endonukleázového pufru a štěpen restrikčními endonukleázami HindlII a Xbal standardními technikami. HindlII/Xbal DNA fragment byl čištěn použitím Gene Clean Kit, jak bylo popsáno.

Plazmid pAK406 se skládá z DNA sekvence 520 bp složené z EcoRI/HindlII fragmetu odvozeného z pMT636 (popsaného ve WO 90/10075) kódující kvasinkový alfa faktor leader a část inzulínového prekurzoru připojeného k HindlII/Xbal fragmentu pAK188 kódujícího zbytek inzulínového prekurzoru MI5 (viz id. č. sekvence: 32, 33 a 34) vloženém do vektoru cPOT. Vektor pAK406 je znázorněn na obr. 2.

Plazmid pAK406 se skládá z DNA sekvence 412 bp kódující syntetický kvasinkový signal/leader LaC212spx3 (popsáno v příkladu 3 WO 89/02463) a následuje gen pro inzulínový prekurzor B(l-29)-GluLysArg-A(l-21) (A21-Gly) (viz id. č. sekvence: 35, 36 a 37) vložené vektoru cPOT. Plazmid pAK233 je znázorněn na obr. 2.

Plazmid pAK233 byl štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Xbal a byl izolován vektorový fragment 9273 bp. Plazmid pAK406 byl také štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a HindlII a byl izolován vektorový fragment 2012 bp. Tyto dva DNA fragmenty byly na sebe navázány spolu s HindlII/Xbal PCR fragment s použitím T4 DNA ligázy a standardních podmínek. Vazebná směs byla transformována do kompetentní E. coli linie (R-, M+) a následovala selekce na ampicilinovou rezistenci. Plazmidy byly izolovány z výsledných E. coli kolonií s použitím standardních DNA minipreparačních technik, řízených vhodnými restrikčními endonukleázami, např. EcoRI, Xbal, Ncol a HindTII. DNA sekvenční analýzou byl zjištěn u selektovaného

-22CZ 287945 B6 plazmidu obsah správné sekvence pro Arg^B31 jednořetězcového prekurzoru DNA lidského inzulínu a že je vložen za DNA kódující S. cerevisiae alfa faktoru DNA. Plazmid byl pojmenován pEA108 a je zobrazen na obr. 2. DNA sekvence kódující alfa faktor leader/Arg®³¹ jednořetězcového prekurzorového komplexu lidského inzulínu a jeho aminokyselinová sekvence je sekvence id. č.: 38, 39 a 40. Plazmid pEA108 byl transformován do S. cerevisiae kmenu MT663 jak je popsáno v příkladu 1 a výsledná linie byla pojmenována yEA108.

B)

Následující Polymerasová řetězcová reakce (PCR) byla provedena s použitím reagenční soupravy Gene Amp PCR (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) podle návodu výrobce. Ve všech případech byla směs PCR převrstvena 100 μΐ minerálního oleje (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0, USA).

μΐ oligonukleotidu č. 220 (100 pmol) μΐ oligonukleotidu č. 263 (100 pmol) μΐ 10X PCR pufru μΐ dNTP směsi

0,5 μΐ Taq enzymu

0,2 μΙ pEA108 plazmidu jako templátu (0,1 ug DNA) μΐ vody.

Bylo provedeno celkem 16 cyklů, přičemž každý cyklus probíhal 1 minutu při 40 °C a 2 minuty při 72 °C. Směs PCR byla nanesena na 2% agarosový gel a byla provedena elektroforéza použitím standardních technik. Výsledné DNA fragmenty byly vyříznuty z agarosového gelu a izolovány použitím Gene Clean Kit (Bio 101 lne., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) podle návodu výrobce. Čištěný PCR DNA fragment byl rozpuštěn v 10 μΐ vody a restrikčního endonukleázového pufru a štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Xbal standardními technikami. Ncol/Xbal DNA fragment byl čištěn použitím Gene Clean Kit, jak bylo popsáno.

Plazmid pAK401 se skládá z DNA sekvence 523 bp složené z EcoRI/NcoI fragmetu odvozeného z pMT636 (popsaného ve WO 90/10075) (konstruovaného vložením Ncol centra na 3'-konec alfa leaderu centrálně dirigovanou mutagenezí) kódující alfa faktor leader a Ncol/Xbal fragment zpAK188 kódující inzulínový prekurzor MI5 (viz sekvence id. č.: 41, 42 a 43) vloženém do vektoru (fagemid) pBLUESCRIPT Iisk(+/-) (Stratagene, USA). Plazmid pAK401 je znázorněn na obr. 3.

Plazmid pAK401 byl štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Xbal a byl izolován vektorový fragment 3254 bp, který byl spojen s Ncol/Xbal PCR fragmentem. Vazebná směs byla transformována do kompetentní E. coli linie a plazmidy byly izolovány z výsledných E. coli kolonií s použitím standardních DNA minipreparačních technik, řízených vhodnými restrikčními endonukleázami, např. EcoRI, Xbal, Ncol. Selektovaný plazmid, pojmenovaný pll3A (zobrazený na obr. 3), byl štěpen EcoRI a Xbal a byl izolován fragment 535 bp.

Plazmid pAK233 byl štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Xbal a EcoRI/NcoI a byly izolovány fragmenty 9273 a 1644 bp. Tyto dva DNA fragmenty byly na sebe navázány spolu sEcoRI/Xbal fragmentem z pll3A s použitím T4 DNA ligázy a standardních podmínek. Vazebná směs byla transformována do kompetentní E. coli linie (R-, M+) a následovala selekce na ampicilinovou rezistenci. Plazmidy byly izolovány z výsledných E. coli kolonií s použitím standardních DNA minipreparačních technik, řízených vhodnými restrikčními endonukleázami, tj. EcoRI, Xbal, Ncol a HindlII. DNA sekvenční analýzou byl zjištěn u selektovaného plazmidu obsah správné sekvence pro Arg^B31 jednořetězcového prekurzoru DNA lidského inzulínu s Nkoncovým prodloužením GluGluAlaGluAlaGluAlaArg a že je vložen za DNA kódující

-23CZ 287945 B6

S. cerevisiae alfa faktor DNA. Plazmid byl pojmenován pEAl 13 a je zobrazen na obr. 2. DNA sekvence kódující alfa faktor leader/Arg®’¹ Arg⁸³¹ jednořetězcového prekurzorového komplexu lidského inzulínu s N-koncovým prodloužením (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) a jeho aminokyselinová sekvence je sekvence id. č.: 44, 45 a 46. Plazmid pEA113 byl transformován do S. cerevisiae kmenu MT663 jak je popsáno v příkladu 1 a výsledná linie byla pojmenována yEA113.

Příklad 6

Syntéza Arg®’¹ Arg^B31 jednořetězcového prekurzoru lidského inzulínu s N-koncovým prodloužením (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) z kvasinkové linie yEA136 s použitím alfa faktor leader

Byl syntetizován následující oligonukleotid:

č. 389 5'-GCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAAGAA.GCTGAAGCGAAG CTGAAAGATTCGTTAACCAACAC-3’ (id. č. sekvence: 13).

Následující PCR byla provedena s použitím reagenční soupravy Gene Amp PCR μΐ oligonukleotidu č. 220 (100 pmol) μΐ oligonukleotidu č. 389 (100 pmol) μΐ 10X PCR pufru μΐ dNTP směsi

0,5 μΐ Taq enzymu μΐ pEAl 13 plazmidu jako templátu (0,5 ug DNA) μΐ vody.

Bylo provedeno celkem 12 cyklů, přičemž každý cyklus probíhal 1 minutu při 95 °C, 1 minutu při 37 °C a 2 minuty při 72 °C.

DNA kódující alfa faktor leader/Arg®’¹ Arg⁸³¹ jednořetězcového prekurzorového komplexu lidského inzulínu s N-koncovým prodloužením (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) byl konstruován stejným způsobem jaký je popsán pro DNA kódující alfa faktor leader/Arg^8-1 Arg⁸³¹ jednořetězcového prekurzorového komplexu lidského inzulínu s N-koncovým prodloužením (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) v příkladu 5. Plazmid byl pojmenován pEA136. DNA sekvence kódující alfa faktor leader/Arg^8-1 Arg⁸³¹ jednořetězcového prekurzorového komplexu lidského inzulínu s N-koncovým prodloužením (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) a jeho aminokyselinová sekvence jsou sekvence id. č.: 47, 48 a 49. Plazmid pEA136 byl transformován do S. cerevisiae kmenu MT663 jak je popsáno v příkladu 1 a výsledná linie byla pojmenována yEA136.

Příklad 7

Syntéza (Al.Bl)-diBoc lidského inzulínu g lidského inzulínu neobsahujícího zinek se rozpustilo v 41,3 ml DMSO. K roztoku se přidalo 3,090 ml kyseliny octové. Reakční směs byla ponechána při laboratorní teplotě a reakce začala přidáním 565 mg di-terc-butylpyrouhličitanu rozpuštěného v 5,650 ml DMSO. Reakce se nechala

-24CZ 287945 B6 probíhat po dobu 51/2 hodiny a pak se zastavila přidáním 250 μΐ ethanolaminu. Produkt se vysrážel přidáním 1500 ml acetonu. Sraženina se oddělila centrifugací a vysušila za sníženého tlaku. Bylo získáno 6,85 g látky.

(Al,Bl)-diBoc inzulín se čistil HPLC na reverzní fázi následujícím způsobem: surový produkt se rozpustil ve 100 ml 25 % obj. ethanolu ve vodě, pH se pomocí HC1 upravilo na pH 3,0 a vše se aplikovalo na kolonu (5 cm průměr, 30 cm délka) naplněnou oktadecyldimethylsilyl substituovanými částicemi silikagelu (střední průměr částice 15 pm, velikost pórů 100 Á) a ekvilibrovalo se elucí pufrem. Eluce byla provedena pomocí směsí ethanolu a 1 mM vodné HC1, 0,3 M KC1 při průtoku 2 1/h. Inzulín byl eluován zvýšením obsahu ethanolu ze 30 % na 45 %. Vhodné frakce byly zředěny na 20 % ethanol a vysráženy při pH 4,8. Sražený materiál byl izolován centrifugací a vysušen za sníženého tlaku. Takto se získalo 1,701 g (Al,Bl)-diBoc lidského inzulínu při čistotě 94,5 %.

Příklad 8

Syntéza (N^eB29-benzoyl lidský inzulín) ₆, 3Zn²⁺

400 mg (Al,Bl)-diBoc lidského inzulínu se rozpustilo ve 2 ml DMSO. K roztoku se přidalo 748 μΐ směsi N-methylmorfolinu a DMSO (1:9, v/v). Reakce se prováděla při 15 °C a byla zahájena přidáním 14,6 mg N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny benzoové rozpuštěného ve 132 μΐ DMF. Reakce byla zastavena po 2 hodinách přidáním 100 ml acetonu. Sraženina se oddělila centrifugací a vysušila za sníženého tlaku. Bylo získáno 343 mg látky.

Boc chránící skupiny se odstranily přidáním 4 ml TFA. Látka se ponechala rozpuštěná po dobu 30 minut a pak se vysrážela přidáním 50 ml acetonu. Sraženina se oddělila centrifugací a vysušila za sníženého tlaku.

N^eB29-benzoyl lidský inzulín se čistil HPLC na reverzní fázi jak je popsáno v příkladu 7. Bylo získáno 230 mg látky. Rekrystalizací z 15% vodného ethanolu, který obsahoval 6 mM Zn²⁺ a 50 mM citrátu při pH 5,5 se získaly krystaly sloučeniny uvedené v titulu, které se oddělily centrifugací a vysušily za sníženého tlaku. Výtěžek byl 190 mg.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 5911, teoretická: 5911.

Příklad 9

Syntéza (N^EB29-lithocholoyl lidský inzulín) ₆, 3Zn²⁺

400 mg (Al,Bl)-diBoc lidského inzulínu se rozpustilo ve 2 ml DMSO. K roztoku se přidalo 748 μΐ směsi N-methylmorfolinu a DMSO (1:9, v/v). Reakce se prováděla při 15 °C a byla zahájena přidáním 14,6 mg N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny lithocholové rozpuštěného ve 300 μΐ DMF. Reakce byla zastavena po 2 hodinách přidáním 100 ml acetonu. Sraženina se oddělila centrifugací a vysušila za sníženého tlaku. Bylo získáno 331 mg látky.

Boc chránící skupiny se odstranily přidáním 4 ml TFA. Látka se ponechala rozpuštěná po dobu 30 minut a pak se vysrážela přidáním 50 ml acetonu. Sraženina se oddělila centrifugací a vysušila za sníženého tlaku.

B29-lithocholoyl lidský inzulín se čistil HPLC na reverzní fázi jak je popsáno v příkladu 7. Bylo získáno 67 mg látky o čistotě 94 %. Rekrystalizací z 15 % vodného ethanolu, který obsahoval

-25CZ 287945 B6 mM Zn²⁺ a 50 mM citrátu při pH 5,5 se získaly krystaly sloučeniny uvedené v titulu, které se oddělily centrifugací a vysušily za sníženého tlaku. Výtěžek byl 49 mg.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 6160, teoretická: 6166.

Příklad 10

Syntéza (N^sB29-dekanoyl lidský inzulín) 6, 3Zn²⁺

400 mg (Al,Bl)-diBoc lidského inzulínu se rozpustilo ve 2 ml DMSO. K roztoku se přidalo 748 μΐ směsi N-methylmorfolinu a DMSO (1:9, v/v). Reakce se prováděla při 15 °C a byla zahájena přidáním 14,6 mg N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny děkanové rozpuštěného ve 132 μΐ DMF. Reakce byla zastavena po 60 minutách a produkt se vysrážel přidáním 100 ml acetonu. Sraženina se oddělila centrifugací a vysušila za sníženého tlaku. Bylo získáno 420 mg meziproduktu.

Boc chránící skupiny se odstranily přidáním 4 ml TFA. Látka se ponechala rozpuštěná po dobu 30 minut a pak se produkt vysrážel přidáním 50 ml acetonu. Sraženina se oddělila centrifugací a vysušila za sníženého tlaku. Výtěžek surového produktu byl 420 mg.

Surový produkt se čistil HPLC na reverzní fázi jak je popsáno v příkladu 7. Bylo získáno 254 mg látky uvedené v titulu. Čistota byla 96,1 %. Rekrystalizací z 15 % vodného ethanolu, který obsahoval 6 mM Zn²⁺ a 50 mM citrátu při pH 5,5 se získaly krystaly sloučeniny uvedené v titulu, které se oddělily centrifugací a vysušily za sníženého tlaku. Výtěžek byl 217 mg.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 5962, teoretická: 5962.

Příklad 11

Syntéza des(B30) lidského inzulínu

Syntéza des(B30) lidského inzulínu byla provedena postupem popsaným Markussenem (Methods in diabetes research, Vol. I, Laboratory methods, část B, 404-410. Editoři: J. Lamer a S. Phol, John Wiley & Sons, 1984). 5 g lidského inzulínu se rozpustilo v 500 ml vody, zatímco se pH roztoku udržovalo přidáváním 0,5 M kyseliny sírové na 2,6. Následně se inzulín vysolil přidáním 100 g síranu amonného a sraženina se oddělila centrifugací. Peleta se rozpustila v 800 ml 0,1 M hydrogenuhličitanu amonného a hodnota pH roztoku se upravila na 8,4 pomocí 1 M amoniaku.

mg hovězí karboxypeptidázy A se suspendovalo ve 25 ml vody a tak dlouho se přidával 1 M amoniak dokud se při pH 10 nezískal čirý roztok. Roztok karboxypeptidázy se přidal k roztoku inzulínu a reakce se nechala probíhat po dobu 24 hodin. Přidalo se několik kapek toluenu, který během reakce působil jako stabilizační prostředek.

Po 24 hodinách se des(B30) lidský inzulín vykrystalizoval přidáním 80 g chloridu sodného do roztoku za míchání. Hodnota pH se pak upravila na 8,3 a krystalizace se nechala probíhat po dobu 20 hodin za mírného míchání. Krystaly byly izolovány 1,2 pm filtrem, byly promyty 250 ml ledově studeného 2-propanolu a nakonec vysušeny za sníženého tlaku.

-26CZ 287945 B6

Příklad 12

Syntéza (Al,Bl)-diBoc des(B30) lidského inzulínu

Sloučenina uvedená v titulu byla syntetizována způsobem popsaným v příkladu 7, za použití des(B30) vepřového inzulínu jako výchozí látky. Surový produkt byl srážen acetonem a vysušen za sníženého tlaku. (Al,Bl)-diBoc des(B30) lidský inzulín byl čištěn HPLC na reverzní fázi způsobem popsaným v příkladu 7.

Příklad 13

Syntéza N^sB29-dekanoyl des (B30) lidského inzulínu

400 mg (Al,Bl)-diBoc des(B30) lidského inzulínu bylo použito jako výchozí látka pro syntézu N^EB29-dekanoyl des(B30) lidského inzulínu způsobem popsaným v příkladu 10. Surový produkt byl vysrážen acetonem, vysušen za sníženého tlaku a pomocí TFA ochráněn. Výsledný produkt byl vysrážen acetonem a vysušen za sníženého tlaku. N^eB29-dekanoyl des(B30) lidský inzulín se pak čistil HPLC na reverzní fázi postupem popsaným v příkladu 10.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 5856, teoretická: 5861.

Příklad 14

Syntéza N^sB29-dodekanoyl des (B30) lidského inzulínu

a. Imobilizace A. lyticus proteázy mg A. lyticus proteázy, rozpuštěné v 5 ml vodného 0,2 M NaHCO₃ pufru, pH 9,4, se smíchalo se 4 ml usazeného gelu MiniLeak® Medium, který byl promyt tímtéž pufrem (MiniLeak je divinylsulfon aktivované Sepharosy CL 6B, získané od KemEnTec, Copenhagen). Gel se jemným mícháním udržoval po dobu 24 hodin za laboratorní teploty v suspenzi. Pak se gel oddělil filtrací, promyl vodou a suspendoval v 20 ml 1 M ethanolaminového pufru, pH 9,4, a udržoval se v suspenzi po dobu 24 hodin za laboratorní teploty. Nakonec se gel promyl vodou a 0,1 M kyselinou octovou a uchovával se při 4 °C. Aktivita enzymu ve filtrátu byla 13 % hodnoty pro původní roztok, což značí, že výtěžek imobilizace byl 87 %.

b. Imobilizace vepřového trypsinu

Vepřový trypsin byl imobilizován na MiniLeak® Low tak, že se dosáhlo stupně substituce 1 mg na ml gelu, za podmínek popsaných výše pro imobilizaci A. lyticus.

c. Syntéza Glu(GluAla)₃Arg-B(l-29), ThrArg-A(l-21) inzulínu pomocí imobilizované A. lyticus proteázy

K 200 mg Glu(GluAla)₃Arg-B(l-29)-ThrArg-A(l-21) jednořetězcového prekurzoru lidského inzulínu, rozpuštěnému ve 20 ml 0,1 M NaHCO₃ pufru, pH 9,0, se přidaly 4 ml gelu, který nesl imobilizovanou A. lyticus proteázu. Po 6 hodinách udržování gelu v suspenzi v reakční směsi za laboratorní teploty byla hydrolýza kompletní, čímž se získal Glu(GluAla)₃Arg-B(l-29), ThrArgA(l-21) lidský inzulín (reakce byla sledována HPLC na reverzní fázi). Po hydrolýze se gel odstranil filtrací. K filtrátu se přidalo 5 ml ethanolu a 15 μΐ 1 M ZnCl₂ a pH se pomocí HCI upravilo na 5,0. Srážení produktu bylo kompletní po stání přes noc při 4 °C za mírného míchání.

-27CZ 287945 B6

Produkt byl oddělen centrifugací. Po promytí 1 ml ledově chladného 20 % ethanolu a vysušení za sníženého tlaku byl výtěžek 190 mg.

d. Syntéza N“^A1,N“^B1,N^EB29-tridodekanoyl Glu(GluAla)3ArgB(l-29), ThrArg-A(l-21) lidského inzulínu pomocí N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekanové

190 mg (30 pmol) Glu(GluAla)₃Arg-B(l-29), ThrArg-A(l-21) inzulínu se rozpustilo v 1 ml DMSO a 1,05 ml 0,572 M roztoku Ν,Ν-diizopropylethylaminu v DMF. Roztok byl ochlazen na 15 °C a bylo přidáno 36 mg (120 pmol) N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekanové rozpuštěného v 0,6 ml DMSO. Reakce zcela proběhla během 24 hodin. Byla izolována lipofilní sloučenina uvedená v titulu.

e. Syntéza N^EB29-dodekanoyl des(B30) inzulínu

Produkt z předcházejícího kroku d., ve 2,65 ml DMSO/DMF/N,N-diizopropylethylamin, se naředil 10,6 ml 50 mM glycinového pufru, který obsahoval 20 % ethanolu a pH se pomocí NaOH upravilo na hodnotu 10. Po stání po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě se přidal 1 ml MiniLeak gelu, který nesl 1 mg imobilizovaného trypsinu na ml gelu. Reakční směs se mírně míchala po dobu 48 hodin za laboratorní teploty. Aby se izoloval žádaný produkt, reakční směs se aplikovala na HPLC kolonu s reverzní fází (5 cm průměr, 30 cm délka) naplněnou oktadecyldimethylsilyl substituovanými částicemi silikagelu (střední průměr částice 15 pm, velikost pórů 100 A). Eluce byla provedena pomocí 20 mM Tris/HCl pufrů, s pH upraveným na 7,7, které obsahovaly zvyšující se koncentraci ethanolu, 40 % až 44 % (v/v) při průtoku 2000 ml/h. Hlavní pík eluovaný při 43 až 44 % ethanolu obsahoval sloučeninu uvedenou v titulu. Frakce obsahující hlavní pík byly spojeny, přidala se voda, aby se koncentrace ethanolu snížila na 20 % (v/v) a pH bylo upraveno na 5,5. Roztok se ponechal stát přes noc při 20 °C, kdy se vysrážel produkt. Sraženina byla izolována centrifugací při -8 °C a vysušena za sníženého tlaku. Výtěžek sloučeniny uvedené v titulu byl 90 mg.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 5892, teoretická: 5890.

Příklad 15

Syntéza N^EB29-(N-myristoyl-a-glutamyl) lidského inzulínu

500 mg (Al,Bl)-diBoc lidského inzulínu bylo rozpuštěno ve 2,5 ml DMSO a bylo přidáno 428 μΐ ethyldiizopropylaminu ve 2,5 ml DMSO/DMF 1/1 (v/v). Teplota byla upravena na 15 °C a bylo přidáno 85 mg N-myristoyl-Glu(OBut) N-hydroxysukcinimid esteru rozpuštěného ve 2,5 ml DMSO/DMF 1/1 (v/v). Po 30 minutách se reakční směs nalila do 60 ml vody pH se upravilo na 5 a sraženina se oddělila centrifugací. Sraženina se sušila za sníženého tlaku. Usušená reakční směs byla rozpuštěna ve 25 ml TFA a roztok se nechal 30 minut stát za laboratorní teploty. TFA se odstranila odpařením za sníženého tlaku. Želatinový odparek se rozpustil v 60 ml vody a pH bylo pomocí koncentrovaného amoniaku upraveno na 11,2. Sloučenina uvedená v titulu byla krystalizována z tohoto roztoku úpravou pH na 8,5 pomocí 6 N HC1. Produkt byl izolován centrifugám, jednou promyt 10 ml vody a vysušen za sníženého tlaku. Výtěžek byl 356 mg. Čistota podle HPLC 94 %.

Produkt z tohoto příkladu je lidský inzulín, ve kterém má ε-aminoskupina Lys^B29 substituent vzorce VI:

CH3(CH₂)i2CONHCH(CH₂CH₂COOH)CO- VI.

-28CZ 287945 B6

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 6146, teoretická: 6148.

Příklad 16

Syntéza N^eB29-undekanoyl des(B30) lidského inzulínu

Sloučenina uvedená v titulu byla syntetizována analogicky jako N^eB29-dodekanoyl des(B30) lidský inzulín jak je popsáno v příkladu 14, použitím N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny undekanové místo N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekanové.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 5876, teoretická: 5876.

Příklad 17

Syntéza N^EB29-tridekanoyl des(B30) lidského inzulínu

Sloučenina uvedená v titulu byla syntetizována analogicky jako N^EB29-dodekanoyl des(B30) lidský inzulín jak je popsáno v příkladu 14, použitím N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny tridekanové místo N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekanové.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 5899, teoretická: 5904.

Příklad 18

Syntéza N^eB29-myristoyl des(B30) lidského inzulínu

Sloučenina uvedená v titulu byla syntetizována analogicky jako N^sB29-dodekanoyl des(B30) lidský inzulín jak je popsáno v příkladu 14, použitím N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny myristové místo N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekanové.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 5932, teoretická: 5918.

Příklad 19

Syntéza N^EB29-palmitoyl des(B30) lidského inzulínu

Sloučenina uvedená v titulu byla syntetizována analogicky jako N^EB29-dodekanoyl des(B30) lidský inzulín jak je popsáno v příkladu 14, použitím N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny palmitové místo N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny dodekanové.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 5944, teoretická: 5946.

-29CZ 287945 B6

Příklad 20

Syntéza N^eB29-suberoyl-D-thyroxin lidského inzulínu

a. Příprava N-(sukcinimidylsuberoyl)-D-thyroxinu

Disukcinimidylsuberát (1,0 g, Pierce) byl rozpuštěn v DMF (50 ml) a za míchání při 20 °C se přidal D-thyroxin (2,0 g, Aldrich). Thyroxin se pomalu rozpustil a po 20 hodinách se rozpouštědlo odpařilo za sníženého tlaku. Olejovitý odparek byl krystalizován z 2-propanolu na 0,6 g N(sukcinimidylsuberoyl)-D-thyroxinu o teplotě tání 128-133 °C.

b. Reakce (Al,Bl)-diBoc lidského inzulínu sN-(sukcinimidylsuberoyl)-D-thyroxinem (Al,Bl)-diBoc lidský inzulín (200 mg) byl rozpuštěn v suchém DMF (10 ml) přídavkem triethylaminu (20 μΐ) za laboratorní teploty. Pak byl přidán N-(sukcinimidylsuberoyl)-D-thyroxin (80 mg). Reakce byla sledována HPLC na reverzní fázi a když reakce proběhla z 90 %, rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. K odparku se přidala bezvodá kyselina octová (5 ml) a roztok se ponechal stát 1 h při laboratorní teplotě. Po odpaření kyseliny trifluoroctové za sníženého tlaku se odparek rozpustil ve směsi 1 M kyseliny octové (5 ml) a acetonitrilu (1,5 ml), čistil na preparativní HPLC koloně s reverzní fází a odsolil na koloně PD-10. Výtěžek Ν^εΒ29suberoyl-D-thyroxin lidského inzulínu byl 50 mg.

Produkt z tohoto příkladu je lidský inzulín, ve kterém má ε-aminoskupina Lys^B29 substituent vzorce VII:

Thyrox-CO(CH₂)₆CO- VII, kde Thyrox je thyroxin vázaný ke skupině oktandiové kyseliny amidovou vazbou přes svou aaminoskupinu.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 6724, teoretická: 6723.

Příklad 21

Syntéza N^EB29-(2-sukcinylamid)myristová kyselina lidského inzulínu

a. Příprava hydrochloridu methyl esteru kyseliny a-aminomyristové

Do methanolu (5 ml, Měrek) při -10 °C se po kapkách za prudkého míchání přidal thionylchlorid (0,2 ml, Aldrich). Pak se přidala kyselina a-aminomyristová (0,7 g, připravená z a-brom kyseliny reakcí s amoniakem). Reakční směs se míchala za laboratorní teploty přes noc a pak se odpařila do sucha. Surový produkt (0,7 g) byl použit přímo v kroku b.

b. Příprava methyl esteru kyseliny N-sukcinoyl-a-aminomyristové

Hydrochlorid methyl esteru kyseliny a-aminomyristové (0,7 g) byl rozpuštěn v chloroformu (25 ml, Měrek). Postupně byl přidán triethylamin (0,35 ml, Fluka) a sukcinanhydrid (0,3 g) Fluka. Reakční směs se míchala po dobu dvou hodin za laboratorní teploty, odpařila do sucha a odparek byl rekrystalizován ze směsi ethylacetát/petrolether (1/1). Výtěžek: 0,8 g.

-30CZ 287945 B6

c. Příprava methyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristové

Methyl ester kyseliny N-sukcinoyl-a-aminomyristové (0,8 g) byl rozpuštěn v DMF (10 ml, Měrek, vysušen nad molekulárními síty 4Á). Byl přidán suchý pyridin (80 μΐ, Měrek) a di(Nsukcinimidyl)karbonát (1,8 g, Fluka) a reakční směs se míchala za laboratorní teploty přes noc. Odparek se čistil flash chromatografii na silikagelu 60 (Měrek) a rekrystalizoval ze směsi 2propanol/petrolether (1/1). Výtěžek methyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristové: 0,13 g, teplota tání 64 - 66 °C.

d. Reakce (Al,Bl)-di Boc lidského inzulínu s methyl esterem kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristové

Reakce byla provedena způsobem popsaným v příkladu 20, s tím rozdílem, že se místo N(sukcinimidylsuberoyl)-D-thyroxinu použil methyl ester kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-aaminomyristové. Po odpaření kyseliny trifluoroctové za sníženého tlaku se k odparku přidal 0,1 M hydroxid sodný při teplotě 0 °C, aby se zhydrolyzoval methylester. Když se podle HPLC na reverzní fázi zjistilo, že hydrolýza je úplná, pH se upravilo na hodnotu 3 a roztok se lyofilizoval. Po čištění na preparativní HPLC koloně s reverzní fází a odsolení na koloně PD-10 byl výtěžek N^EB29-(2-sukcinylamido)myrystové kyseliny lidského inzulínu 39 mg.

Produkt z tohoto příkladu je lidský inzulín, ve kterém má ε-aminoskupina Lys⁸²⁹ substituent vzorce VIII:

CH₃(CH₂)! jCHfCOOHjNHCOCHjCHzCO- VIII.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 6130, teoretická: 6133.

Příklad 22

Syntéza N^EB29-oktyloxykarbonyl lidského inzulínu

Syntéza byla provedena způsobem popsaným v příkladu 20, s tím rozdílem, že se místo N(sukcinimidylsuberoyl)-D-thyroxinu použil n-oktyloxykarbonyl-N-hydroxysukcinimid (9 mg, připravený z n-oktylchloroformátu (Aldrich) a N-hydroxysukcinimidu). Výtěžek N^eB29oktyloxykarbonyl lidského inzulínu byl 86 mg.

Produkt z tohoto příkladu je lidský inzulín, ve kterém má ε-aminoskupina Lys⁸²⁹ substituent vzorce IX:

CH₃(CH₂)₇OCO- IX.

Molekulová hmotnost, nalezená MS: 5960, teoretická: 5964.

Příklad 23

Syntéza N^EB29-(2-sukcinylamid)palmitová kyselina lidského inzulínu

a. Příprava methyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminopalmitové

Tato sloučenina byla připravena postupem popsaným v příkladu 21 a. až c., s tím, že se místo kyseliny α-aminomyristové použila kyselina a-aminopalmitová.

-31 CZ 287945 B6

b. Reakce (Al,Bl)-di Boc lidského inzulínu s methyl esterem kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminopalmitové

Reakce byla provedena způsobem popsaným v příkladu 21 d., s tím rozdílem, že se místo methyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristové použil methyl ester kyseliny N(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminopalmitové čímž se získal N^eB29-(2-sukcinylamid)palmitová kyselina lidský inzulín.

Produkt z tohoto příkladu je lidský inzulín, ve kterém má ε-aminoskupina Lys^B29 substituent vzorce X:

CH₃(CH₂)₁₃CH(COOH)NHCOCH₂CH₂COX.

Příklad 24

Syntéza N^EB29-(2-sukcinylamidoethyloxy)palmitová kyselina lidského inzulínu

a. Příprava methyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-2-aminoethyloxypalmitové

Tato sloučenina byla připravena postupem popsaným v příkladu 21 a. až c., s tím, že se místo kyseliny α-aminomyristové použila kyselina 2-aminoethyloxypalmitová syntetizovaná obecným postupem popsaným v R. TenBrink, J. Org. Chem. 52 (1987) 418-422.

b. Reakce (Al,Bl)-di Boc lidského inzulínu s methyl esterem kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-2-aminoethyloxypalmitové

Reakce byla provedena způsobem popsaným v příkladu 21 d., s tím rozdílem, že se místo methyl esteru kyseliny N-(sukcinimidylsukcinoyl)-a-aminomyristové použil methyl ester kyseliny N(sukcinimidylsukcinoyl)-2-aminoethyloxypalmitové čímž se získal N^EB29-(2-sukcinylamidoethyloxy)palmitová kyselina lidský inzulín.

Produkt z tohoto příkladu je lidský inzulín, ve kterém má ε-aminoskupina Lys^B29 substituent vzorce XI:

CH₃(CH₂)₁₃CH(COOH)NHCH₂CH₂OCOCH₂CH₂COXI.

Příklad 25

Syntéza N^eB29-lithocholoyl-a-glutamyl des(B30) lidského inzulínu

Syntéza byla provedena postupem popsaným v příkladu 13, s tím, že se místo N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny děkanové použil α-N-hydroxysukcinimid ester, γ-terc-butyl ester kyseliny N-lithocholoyl-L-glutamové.

Produkt z tohoto příkladu je des(B30) lidský inzulín, ve kterém má ε-aminoskupina Lys^B29 substituent vzorce XII:

lithocholoyl-NHCH(CH₂CH₂COOH)COXII.

Molekulová hmotnost produktu, nalezená MS: 6194, teoretická: 6193.

-32CZ 287945 B6

Příklad 26

SyntézaN^EB29-3,3',5,5'-tetrajodthyroacetyl lidského inzulínu

Syntéza byla provedena postupem popsaným v příkladu 10, s tím, že se místo N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny děkanové použil N-hydroxysukcinimid ester kyseliny 3,3',5,5'-tetrajodthyrooctové.

Molekulová hmotnost produktu, nalezená MS: 6536, teoretická: 6538.

Příklad 27

Syntéza N^eB29-L-thyroxyl lidského inzulínu

Syntéza byla provedena postupem popsaným v příkladu 10, s tím, že se místo N-hydroxysukcinimid esteru kyseliny děkanové použil N-hydroxysukcinimid ester Boc-L-thyroxinu.

Molekulová hmotnost produktu, nalezená MS: 6572, teoretická: 6567.

Příklad 28

Farmaceutický prostředek, který obsahuje v roztoku 600 nmol/ml N^eB29-dekanoyl des(B30) lidský inzulín s 1/3 Zn²⁺

N^eB29-dekanoyl des(B30) lidský inzulín (1,2 pmol) byl rozpuštěn ve vodě (0,8 ml) a pH bylo upraveno na 7,5 přidáním 0,2 M hydroxidu sodného. Byl přidán 0,01 M octan zinečnatý (60 pl) a roztok, který obsahoval 0,75 % fenolu a 4 % glycerolu (0,8 ml). pH roztoku bylo upraveno na 7,5 pomocí 0,2 M hydroxidu sodného a objem roztoku byl upraven vodou na 2 ml.

Vzniklý roztok byl sterilizován filtrací a asepticky převeden do patrony nebo do nádobky.

Příklad 29

Farmaceutický prostředek, který obsahuje v roztoku 600 nmol/ml N^EB29-dekanoyl des(B30) lidský inzulín s 1/2 Zn²⁺

1,2 pmol sloučeniny uvedené v titulu bylo rozpuštěno ve vodě (0,8 ml) a pH bylo upraveno na 7,5 přidáním 0,2 M hydroxidu sodného. Byl přidán roztok, který obsahoval 0,75 % fenolu a 1,75 % chloridu sodného (0,8 ml). pH roztoku bylo upraveno na 7,5 pomocí 0,2 M hydroxidu sodného a objem roztoku byl upraven vodou na 2 ml.

Vzniklý roztok byl sterilizován filtrací a asepticky převeden do patrony nebo do nádobky.

-33CZ 287945 B6

Příklad 30

Farmaceutický prostředek, který obsahuje v roztoku 600 nmol/ml N^tB29-lithocholoyl lidský inzulín s 1/3 Zn²⁺

1,2 pmol sloučeniny uvedené v titulu bylo suspendováno ve vodě (0,8 ml) a rozpuštěno upravením hodnoty pH roztoku na 8,5 pomocí 0,2 M hydroxidu sodného. K roztoku pak bylo přidáno 0,8 ml zásobního roztoku, který obsahoval 0,75 % kresolu a 4 % glycerolu ve vodě. Nakonec bylo pH roztoku upraveno na 8,5 a objem roztoku byl upraven vodou na 2 ml.

Vzniklý roztok byl sterilizován filtrací a asepticky převeden do patrony nebo do nádobky.

-34CZ 287945 B6

Seznam sekvenci (1) Obecné informace:

i) Žadatel:

(A) Jméno: Novo Nordisk A/S

(B) Ulice: Novo Allé

(C) Město: DK-2880 Bagsvaerd

(E) Země: Dánsko

(F) Telefon: +45 44448888

(G) Fax: +45 44490555

(H) Telex: 37173

(ii) Název vynálezu: Acylovaný insulin (iii) Počet sekvenci: 49 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresát: Novo Nordisk A/S

Corporate Patents (B) Ulice: Novo Alle (C) Město: DK-2880 Bagsvaerd (E) Země: Dánsko (v) Forma určená pro počitač:

(A) Typ media: flopy disk (B) Počitač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln č. 1.0, verze 1,25 (vi) Data současné žádosti:

(A) Číslo žádosti:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(vii) Data předešlé žádosti:

(A) Čísla žádostí: DK1044/93 a US 08/190,829 (B) Data podání: 9. 9. 1993 a 2. 2. 1994

-35CZ 287945 B6 (viii) Informace o právním zástupci:

(A) Jméno: Jorgensen, Dan a kol.

(C) Číslo reference: 3985.204-WO,DJ (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: +45 44448888 (B) Fax +45 44493256 (2) Informace o sekvenci id. č.: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 1:

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
1				5		10
Leu	Tyr	Gin	Leu	Glu	Asn	Tyr Cys Xaa
		15				20
	(2)	Informace	o sekvenci id. č.: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 30 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 2:

Xaa Val Xaa Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val

10

-36CZ 287945 B6

Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe

20

Phe Tyr Thr Pro Lys Xaa

30 (2) Informace o sekvenci id. č.: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 110 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 3:

TGGCTAAGAG ATTCGTTGAC CAACACTTGT GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA 50

GCTTTGTACT TGGTTTGTGG TGAAAGAGGT TTCTTCTACA CTCCAAAGTC 100

TGACGACGCT 110 (2) Informace o sekvenci id. č.:4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 100 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 4:

CTGCGGGCTG CGTCTAAGCA CAGTAGTTTT CCAATTGGTA CAAAGAACAG 50

ATAGAAGTAC AACATTGTTC AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTGG 100 (2) Informace o sekvenci id. č.: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární

-37CZ 287945 B6 (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 5:

GTCGCCATGG CTAAGAGATT CGTTG 25 (2) Informace o sekvenci id. č.: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 6:

CTGCTCTAGA GCCTGCGGGC TGCGTCT 27 (2) Informace o sekvenci id. č.: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 110 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 7:

TGGCTAAGAG ATTCGTTACT CAACACTTGT GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA 50

GCTTTGTACT TGGTTTGTGG TGAAAGAGGT TTCTTCTACA CTCCAAAGTC 100

TGACGACGCT 110 (2) Informace o sekvenci id. č.: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 8:

-38CZ 287945 B6

GTCGCCATGG CTAAGAGATT CGTTA (2) Informace o sekvenci id. č.: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 100 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 9:

CTGCGGGCTG CGTCTAACCA CAGTAGTTTT CCAATTGGTA CAAAGAACAG 50

ATAGAAGTAC AACATTGTTC AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTGG 100 (2) Informace o sekvenci id. č.: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 10:

ACGTACGTTC TAGAGCCTGC GGGCTGC (2) Informace o sekvenci id. č.: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 78 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 11:

CACTTGGTTG AAGCTTTGTA CTTGGTTTGT GGTGAAAGAG GTTTCTTCTA 50

CACTCCAAAG ACTAGAGGTA TCGTTGAA 78 (2) Informace o sekvenci id. č.: 12:

-39CZ 287945 B6 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 63 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineárni (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 12:

GCTAACGTCG CCATGGCTAA GAGAGAAGAA GCTGAAGCTG AAGCTAGATT 50

CGTTAACCAA CAC 63 (2) Informace o sekvenci id. č.: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 65 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 13:

GCTAACGTCG CCATGGCTAA GAGAGAAGAA GCTGAAGCGA AGCTGAAAGA 50

TTCGTTAACC AACAC 65 (2) Informace o sekvenci id. č.: 14:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 80...391 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 14:

-40CZ 287945 B6

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 60

AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 112

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile

1

I

5

10

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

160

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

G1U

15

' 20

25

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

ttg

GCT

AAC

208

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

Ile

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

30

35

40

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

256

Val

Ala

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

45

50

55

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

304

Leu

Val

Glu

A1a

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

60

65

70

75

ACT

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

352

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

80

85

90

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

AAC

TAGACGCAGC

401

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Ásn

Tyr

Cys

Asn

100

CCGCAGGCTC TAGA

415 (2) Informace o sekvenci id. č.: 15:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 104 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 15:

Met

Lys

Ala

Val

Phe Leu

Val

Leu

Ser

Leu Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

1

5

10

15

Gin

Pro

Val

Thr

Gly Asp

Glu

Ser

Ser

Val Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

20

25

30

Leu

Ile

Ile

Ala

Glu Asn

Thr

Thr

Leu

AI a Asn

Val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

Arg

Phe

Val

Asn

Gin His

Leu

Cys

Gly

Ser His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

50

55

60

-41 CZ 287945 B6

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp

70 75 80

Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu

90 95

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100 (2) Informace o sekvenci id. č.: 16:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 16:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG60

TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC120

GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA180

6TA6CGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATTGGTTGT240

GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA300

GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC360

AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACATT GATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT415 (2) Informace o sekvenci id. č.: 17:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 523 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS

-42CZ 287945 B6 (B) Umístěni: 80...499

112

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC AATATAAACG ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu

1

1

5

11

3

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

TTA

GCT

GCT

CCA

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

15

20

25

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

Ile

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

30

35

40

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

GAT

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

45

50

55

AAT

AAC

GGG

TTA

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

GCT

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

60

65

70

75

160

208

256

304

AAA

GAA

GAA

GGG

GTA

TCT

TTG

GAT

AAG

AGA

GAA

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Leu

Asp

Lys

Arg

Glu

Val

Asn

Gin

His

Leu

80

85

90

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

95

100

105

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

GAA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Glu

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

110

115

120

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

125

130

135

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA

352

400

448

496

AAC Asn 140

523 (2) Informace o sekvenci id. č.: 18:

(A) (B) (D)

Délka: 140 aminokyselin

Typ: aminokyselinová

Topologie: lineární

-43CZ 287945 B6 (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: sekvence id. Č.: 18:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

Ile

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

20

25

30

Ile

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

35

40

45

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

50

55

60

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

65

70

75

80

Ser

Leu

Asp

Lys

Arg

Glu

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

85

90

95

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

100

105

110

Glu

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

115

120

125

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

130

135

140

(2) Informace o sekvenci id. č.: 19:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 523 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 19:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG ΠΤ6ΑΤΑ6Π AAAGTATGTG60

TTATATTTGC TAATTTTCTT ACTCTAAAGG AAGTTAAAAA TGACGTCAAA ATAAGCGTCG120

TAGGAGGCGT AATCGACGAG GTCAGTTGTG ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTGTTTAAGG180

CCGACTTCGA CAGTAGCCAA TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAGCTACAAC GACAAAACGG240

TAAAAGGTTG TCGTGTTTAT TGCCCAATAA CAAATATTTA TGATGATAAC GGTCGTAACG300

ACGATTTCTT CTTCCCCATA GAAACCTATT CTCTCTTCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAG360

-44CZ 287945 B6

AGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC ACCACTTTCT CCAAAGAAGA TGTGACTTTT420

CAGACTGCTG CGATTCCCAT AGCAACTTGT TACAACATGA AGATAGACAA GAAACATGGT480

TAACCTTTTG ATGACATTGA TCTGCGTCGG GCGTCCGAGA TCT523 (2) Informace o sekvenci id. č.: 20:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klič: CDS (B) Umístěni: 80...391

Popis sekvence: sekvence id. č.: 20:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC

AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile 5 10 (xi)

112

Met Lys Ala Val

GGA	TTC	; TGC	TGG GCC CAA	CCA	GTC	ACT	GGC	GAT	GAA TCA TCT GTT	GAG	160
Gly	Phe	Cys	Trp Ala Gin	Pro	Val	Thr	Gly	Asp	. Glu Ser Ser Val	Glu
	15			20			25
ATT	CCG	GAA	GAG TCT CTG	ATC	ATC	GCT	GAA	AAC	ACC ACT TTG GCT	AAC	208
Ile	Pro	Glu	Glu Ser Leu	Ile	Ile	Ala	Glu	Asn	Thr Thr Leu Ala	Asn
		30			35				40
GTC	GCC	ATG	GCT AAG AGA	TTC	GTT	GAC	CAA	CAC	TTG TGC GGT TCT	CAC	256
Val	Ala	Met	Ala Lys Arg	Phe	Val	Asp	Gin	His	Leu Cys Gly Ser	His
	45		50				55
TTG	GTT	GAA	GCT TTG TAC	TTG	GTT	TGT	GGT	GAA	AGA GGT TTC TTC	TAC	304
Leu	Val	Glu	Ala Leu Tyr	Leu	Val	Cys	Gly	Glu	Arg Gly Phe Phe	Tyr
60			65					70	75
ACT	CCA	AAG	TCT GAC GAC	GCT	AAG	GGT	ATC	GTT	GAA CAA TGT TGT	ACT	352
Thr	Pro	Lys	Ser Asp Asp	Ala	Lys	Gly	Ile	Val	Glu Gin Cys Cys	Thr
			80				85		90
TCT	ATC	TGT	TCT TTG TAC	CAA	TTG	GAA .	ŘAC	TAC	TGT GCT TAGACGCA	GC	401

Ser Ile

Gin

Leu

Ala

Glu Asn Tyr Cys

100

Cys Ser Leu Tyr

CCGCAGGCTC TAGA (2) Informace o sekvenci id

č.: 21:

415 (i) Charakteristiky sekvence:

-45CZ 287945 B6 (A) Délka: 104 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 21:

Met

Lys

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

1

5

10

15

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

20

25

30

Leu

Ile

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

Arg

Phe

Val

Asp

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

50

55

60

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

£5

70

75

80

Asp

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

85

90

95

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Ala

100 (2) Informace o sekvenci id. č.: 22:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 22:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT 50

AAA.GTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA 100

AACAGGAACT AGCCTAAGAC GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG 150

TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAA 200

ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AACTGGTTGT GAACACGCCA 250

-46CZ 287945 B6

AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA 300

GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT 350

GAAGATAGAC AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACG AATCTGCGTC 400

GGGCGTCCGA GATCT 415 (2) Informace o sekvenci id. č.: 23:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 80...391 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 23:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG 97

Met Lys Ala Val Phe Leu

5

GTT

TTG

TCC

TTG

ATC

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

139

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

10

15

20

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

181

Gly Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

Ile

25

30

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG 223

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

-47CZ 287945 B6

AGA

TTC

GTT

ACT

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

265

Arg

Phe

Val

Thr

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

50

55

60

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

307

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

65

70

75

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

349

Pro

Lys

Ser

Asp Asp

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

80

85

90

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

GCT

391

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Ala

95

100

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA

415

(2)

Informace

o sekvenci id. č

24:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 104 aminokyselin

			(B) Typ: aminokyselinová
			(D) Topologie	i: lineárni
		(ii) 1	Typ molekuly:	protein
		(xi) :	Popis sekvence: sekvence	id.	č.:	24:
Met	Lys	Ala Val	Phe	Leu Val	Leu Ser	Leu	Ile	Gly	Phe	Cys	Trp
1			5			10					15
Ala	Gin	Pro Val	Thr	Gly Asp	Glu Ser	Ser	Val	Glu	Ile	Pro	Glu
			20			25					30
Glu	Ser	Leu Ile	Ile	Ala Glu	Asn Thr	Thr	Leu	Ala	Asn	Val	Ala
			35			40					45
Met	Ala	Lys Arg	Phe	Val Thr	Gin His	Leu	Cys	Gly	Ser	His	Leu
			50			55					60
Val	Glu	Ala Leu	Tyr	Leu Val	Cys Gly	Glu	Arg	Gly	Phe	Phe	Tyr
			65			70					75

-48CZ 287945 B6

Thr Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys

85 90

Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Ala

100 (2) Informace o sekvenci id. č.: 25:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 25:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT 50

AAAGTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA 100

AACAGGAACT AGCCTAAGAC GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG 150

TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAA 200

ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATGAGTTGT GAACACGCCA 250

AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA 300

GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT 350

GAAGATAGAC AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACG AATCTGCGTC 400

GGGCGTCCGA GATCT 415 (2) Informace o sekvenci id. č.: 26:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 80...391

-49CZ 287945 B6 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 26:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG 97

Met Lys Ala Val Phe Leu

1

5

GTT

TTG

TCC

TTG

ATC

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

139

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

10

15

20

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

181

Gly Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

Ile

25

30

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

AGA

TTC

GTT

GAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

223

Arg

Phe

Val

Asp

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

G1U

50

55

60

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

265

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

G1U

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

65

70

75

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

307

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

80

85

90

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

GGT

349

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

100

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA 415 (2) Informace o sekvenci id. č.: 27:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 104 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová

-50CZ 287945 B6 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 27:

Met

Lys

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

1

5

10

15

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

Gly Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Ser

Leu

Ile

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

35

40

45

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asp

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

50

55

60

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

65

70

75

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp Asp

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

80

85

90

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

100 (2) Informace o sekvenci id. č.: 28:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 28:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT 50

AAAGTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA 100

AACAGGAACT AGCCTAAGAC GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG 150

TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAA 200

ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AACTGGTTGT GAACACGCCA 250

-51 CZ 287945 B6

AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA 300

GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT 350

GAAGATAGAC AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACC AATCTGCGTC 400 GGGCGTCCGA GATCT 415 (2) Informace o sekvenci id. č.: 29:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíČ: CDS (B) Umístění: 80...391 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 29:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG 97 Met Lys Ala Val Phe Leu 1 5

GTT

TTG

TCC

TTG

ATC

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

139

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

10

15

20

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

181

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

Ile

25

30

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

223

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

AGA

TTC

GTT

ACT

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

265

Arg

Phe

Val

Thr

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

50

55

60

52CZ 287945 B6

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

307

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

65

70

75

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

349

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

80

85

90

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

GGT

391

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

95

100

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA

415

(2)

Informace

o sekvenci id. č

30:

(i) Charakteristiky sekvence:

I (A) Délka: 104 aminokyselin

(B) Typ:

amino kys e1inová

(D) Topologie

i: lineární

(ii) '

Typ molekuly:

protein

(xi) :

Popis sekvence: sekvence

id.

č. :

30:

Met

Lys

Ala

Yal

Phe Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

1

5

10

15

Ala

Gin

Pro

Val

Thr Gly Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Ser

Leu

Ile

Ile Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

35

40

45

Met

Ala

Lys

Arg

Phe Val

Thr

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

50

55

60

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

65

70

75

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp Asp

Ala

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

80

85

90

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

100

-53CZ 287945 B6 (2) Informace o sekvenci id. č.: 31:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 415 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 31:

TAGCTTAAGG	TAAGTTCTTA	TCAAGTTTGT	TCTTCTAATG	TTTGATAGTT	50
AAAGTATGTG	TTATATTTGC	TGGTTTTCTT	ACTTCCGACA	AAAGAACCAA	100
AACAGGAACT	AGCCTAAGAC	GACCCGGGTT	GGTCAGTGAC	CGCTACTTAG	150
TAGACAACTC	TAAGGCCTTC	TCAGAGACTA	GTAGCGACTT	TTGTGGTGAA	200
ACCGATTGCA	GCGGTACCGA	TTCTCTAAGC	AATGAGTTGT	GAACACGCCA	250
AGAGTGAACC	AACTTCGAAA	CATGAACCAA	ACACCACTTT	CTCCAAAGAA	300
GATGTGAGGT	TTCAGACTGC	TGCGATTCCC	ATAGCAACTT	GTTACAACAT	350
GAAGATAGAC	AAGAAACATG	GTTAACCTTT	TGATGACACC	AATCTGCGTC	400
GGGCGTCCGA	GATCT				415

(2) Informace o sekvenci id. č.: 32:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 523 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost; jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístěni: 80...499 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 32:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

-54CZ 287945 B6

TTTCATACAC AATATAAACG ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT 97

Met Arg Phe Pro Ser Ile

5

TTT

ACT

GCA

GTT

TTA

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

TTA

GCT

GCT

139

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

10

15

20

CCA

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

181

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

Ile

Pro

25

30

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

223

Ala

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly Asp

Phe

35

40

45

GAT

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

AAT

AAC

GGG

265

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

50

55

60

TTA

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

GCT

AAA

307

Leu

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

Lys

65

70

75

GAA

GAA

GGG

GTA

TCT

TTG

GAT

AAG

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

349

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Leu

Asp

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

80

85

90

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

391

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

95

100

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

433

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

105

110

115

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

475

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

120 125 130

-55CZ 287945 B6

TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGT AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC 517

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

135 140

TAGA 523 (2) Informace o sekvenci id. č.: 33:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 140 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 33:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

Ile

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

20

25

30

Ala

Gin

Ile

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

35

40

45

Gly Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

50

55

60

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

65

70

75

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Leu

Asp

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

80

85

90

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Yal

Cys

Gly

95

100

105

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp Asp

Ala

Lys

Gly

110

115

120

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

125

130

135

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

140

-56CZ 287945 B6 (2) Informace o sekvenci id. č.: 34:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 523 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineárni

	(xi) Popis sekvence: sekvence id.	č.: 34:
TAGCTTAAGG	TAAGTTCTTA	TCAAGTTTGT	TCTTCTAATG	TTTGATAGTT	50
AAAGTATGTG	TTATATTTGC	TAATTTTCTT	ACTCTAAAGG	AAGTTAAAAA	100
TGACGTCAAA	ATAAGCGTCG	TAGGAGGCGT	AATCGACGAG	GTCAGTTGTG	150
ATGTTGTCTT	CTACTTTGCC	GTGTTTAAGG	CCGACTTCGA	CAGTAGCCAA	200
TGAGTCTAAA	TCTTCCCCTA	AAGCTACAAC	GACAAAACGG	TAAAAGGTTG	250
TCGTGTTTAT	TGCCCAATAA	CAAATATTTA	TGATGATAAC	GGTCGTAACG	300
ACGATTTCTT	CTTCCCCATA	GAAACCTATT	CTCTAAGCAA	TTGGTTGTGA	350
ACACGCCAAG	AGTGAACCAA	CTTCGAAACA	TGAACCAAAC	ACCACTTTCT	400
CCAAAGAAGA	TGTGAGGTTT	CAGACTGCTG	CGATTCCCAT	AGCAACTTGT	450
TACAACATGA	AGATAGACAA	GAAACATGGT	TAACCTTTTG	ATGACATTGA	500
TCTGCGTCGG	GCGTCCGAGA	TCT			523

(2) Informace o sekvenci id. č.: 35:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 409 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 80...385 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 35:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

-57CZ 287945 B6

TTTCATACAC AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG 97

Met Lys Ala Val Phe Leu

GTT

TTG

TCC

TTG

ATC

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

139

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

10

15

20

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

181

Gly Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

Ile

25

30

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

223

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Lys

35

40

45

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

265

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

50

55

60

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

65

70

75

CCT

AAG

GAA

AAG

AGA

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT

307

Pro

Lys

Glu

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

G1U

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

80

85

90

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

GGT

343

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

95100

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA409 (2) Informace o sekvenci id. č.: 36:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 102 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

-58CZ 287945 B6

(xi) Popis sekvence: sekvence

id.

č.:

36:

Met

Lys

Ala

Val

Phe

Leu Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

1

5

10

15

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

Gly Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Ser

Leu

Ile

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

35

40

45

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

50

55

60

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

65

70

75

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

80

85

90

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

100 (2) Informace o sekvenci id. č.: 37:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 409 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 37:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT 50

AAAGTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA 100

AACAGGAACT AGCCTAAGAC GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG 150

TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAA 200

ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATTGGTTGT GAACACGCCA 250

AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA 300

GATGTGAGGA TTCCTTTTCT CTCCATAGCA ACTTGTTACA ACATGAAGAT 350

AGACAAGAAA CATGGTTAAC CTTTTGATGA CACCAATCTG CGTCGGGCGT 400

-59CZ 287945 B6

CCGAGATCT 409 (2) Informace o sekvenci id. č.: 38:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 511 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 77...487 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 38:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT 50

CATACACAAT ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT 97

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe

5

ACT

GCA

GTT

TTA

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

TTA

GCT

GCT

CCA

139

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

10

15

20

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

181

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

Ile

Pro

Ala

25

30

35

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

GAT

223

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly Asp

Phe

Asp

40

45

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

AAT

AAC

GGG

TTA

265

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

50

55

60

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

GCT

AAA

GAA

307

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

Lys

Glu

70 75

60CZ 287945 B6

GAA

GGG

GTA

TCC

ATG

GCT

AAG

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

349

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Yal

Asn

Gin

His

Leu

80

85

90

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

391

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

95

100

105

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

CCA

AAG

ACT

AGA

GGT

ATC

GTT

433

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

Ile

Val

110

115

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

475

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

120

125

130

AAC TAC TGC AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA 511

Asn Tyr Cys Asn

135 (2) Informace o sekvenci id. č.: 39:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 137 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 39:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

Ile

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

20

25

30

Ala

Gin

Ile

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

35

40

45

Gly Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

50

55

60

-61 CZ 287945 B6

Asn Gly

Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala

Ala 75

65

70

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg Phe

Val

Asn

Gin

His

80

85

90

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu Tyr

Leu

Yal

Cys

Gly

95

100

105

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr Arg

Gly

Ile

Val

Glu

110

115

120

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr Gin

Leu

Glu

Asn Tyr

125

130

135

Cys Asn (2) Informace o sekvenci id. č.: 40:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 511 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 40:

CTTAAGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA 50

GTATGTGTTA TATTTGCTAA TTTTCTTACT CTAAAGGAAG TTAAAAATGA 100

CGTCAAAATA AGCGTCGTAG GAGGCGTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG 150

TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG ACTTCGACAG TAGCCAATGA 200

GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA AAGGTTGTCG 250

TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG 300

ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGÁTTCTC TAAGCAATTG GTTGTGAACA 350

CGCCAAGGGT GAACCAACTT CGAAACATGA ACCAAACACC ACTTTCTCCA 400

AAGAAGATGT GAGGTTTCTG ATCTCCATAG CAACTTGTTA CAACATGAAG 450

ATAGACAAGA AACATGGTTA ACCTTTTGAT GACGTTGATC TGCGTCGGGC 500

GTCCGAGATC T 511 (2) Informace o sekvenci id. č.: 41:

-62CZ 287945 B6 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 523 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 80...499 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 41:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA 50

TTTCATACAC AATATAAACG ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT 97

Met Arg Phe Pro Ser Ile

5

TTT

ACT

GCA

GTT

TTA

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

TTA

GCT

GCT

139

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

10

15

20

CCA

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

181

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

Ile

Pro

25

30

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

223

Ala

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly Asp

Phe

35

40

45

GAT

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

AAT

AAC

GGG

265

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

50

55

60

TTA

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

GCT

AAA

307

Leu

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

Lys

65

70

75

-63CZ 287945 B6

GAA

GAA

GGG

GTA

TCC

ATG

GCT

AAG

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

349

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

80

85

90

TTG

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

GTT

GAA.

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGC

391

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

95

100

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

CCT

AAG

TCT

GAC

GAT

GCT

433

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp Asp

Ala

105

110

115

AAG

GGT

ATT

GTC

GAG

CAA

TGC

TGT

ACC

TCC

ATC

TGC

TCC

TTG

475

Lys

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

120

125

130

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

TAGACGCAGC

509

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys Asn

135

140

CCGCAGGCTC TAGA

523

(2)

Informace

o sekvenci id. č

42:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 140 aminokyselin

				(B) Typ: aminokyselinová
				(D) Topologie: lineární
		(ii)	Typ molekuly: protein
		(xi)	Popis	i sekvence: sekvence	id.	č.:	42:
Met	Arg	Phe	Pro	Ser	Ile Phe Thr Ala	Val	Leu	Phe	Ala	Ala	Ser
1				5		10					15
Ser	Ala	Leu	Ala	Ala	Pro Val Asn Thr	Thr	Thr	Glu	Asp	Glu	Thr
				20		25					30
Ala	Gin	Ile	Pro	Ala	Glu Ala Val Ile	Gly	Tyr	Ser	Asp	Leu	Glu
				35		40					45
Gly Asp	Phe	Asp	Val	Ala Val Leu Pro	Phe	Ser	Asn	Ser	Thr	Asn

55 60

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala Ala

65

70

75

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin His

80

85

90

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys Gly

95

100

105

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser Asp Asp

Ala

Lys Gly

110

115

120

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin Leu

125

130

135

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

140 (2)

Informace o sekvenci id. č.: 43:

(A) (i) Charakteristiky sekvence:

Délka: 523 párů bází

Typ: nukleokyselinová (B) (C)

Vláknitost: jednoduchá (D)

Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id.

43:

TAGCTTAAGG

TAAGTTCTTA

TCAAGTTTGT

TCTTCTAATG

TTTGATAGTT

AAAGTATGTG

TTATATTTGC

TAATTTTCTT

ACTCTAAAGG

AAGTTAAAAA

100

TGACGTCAAA

ATAAGCGTCG

TAGGAGGCGT

AATCGACGAG

GTCAGTTGTG

150

ATGTTGTCTT

CTACTTTGCC

GTGTTTAAGG

CCGACTTCGA

CAGTAGCCAA

200

TGAGTCTAAA

TCTTCCCCTA

AAGCTACAAC

GACAAAACGG

TAAAAGGTTG

250

TCGTGTTTAT

TGCCCAATAA

CAAATATTTA

TGATGATAAC

GGTCGTAACG

300

ACGATTTCTT

CTTCCCCATA

GGTACCGATT

CTCTAAGCAA

TTGGTTGTGA

350

ACACGCCAAG

GGTGAACCAA

CTTCGAAACA

TGAACCAAAC

GCCACTTTCT

400

CCAAAGAAGA

TGTGAGGATT

CAGACTGCTA

CGATTCCCAT

AACAGCTCGT

450

TACGACATGG

AGGTAGACGA

GGAACATGGT

TAACCTTTTG

ATGACGTTGA

500

TCTGCGTCGG

GCGTCCGAGA

TCT

523

-65CZ 287945 B6 (2) Informace o sekvenci id. č.: 44:

(i) Charakteristiky sekvence;

(A) Délka: 535 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 77...511 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 44:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT 50

CATACACAAT ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT 99

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe

5

ACT

GCA

GTT

TTA

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

TTA

GCT

GCT

CCA

141

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

10

15

20

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

183

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

G1U

Thr

Ala

Gin

Ile

Pro

Ala

25

30

35

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

GAT

225

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly Asp

Phe

Asp

40

45

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

AAT

AAC

GGG

TTA

267

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

50

55

60

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

GCT

AAA

GAA

309

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

Lys

Glu

65

70

75

-66CZ 287945 B6

GAA

GGG

GTA

TCC

ATG

GCT

AAG

AGA

GAA

GAA

GCT

GAA

GCT

GAA

351

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Glu

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

80

85

90

GCT

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

GTT

393

Ala

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

95

100

105

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

435

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

110

115

ACT

CCA

AAG

ACT

AGA

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT

477

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

Ile

Val

G1U

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

120

125

130

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

519

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

135

140

145

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA

535 (2) Informace o sekvenci id. č.: 45:

(i) Charakteristiky sekvence: Délka: 145 aminokyselin Typ: aminokyselinová Vláknitost: jednoduchá Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (A) (B) (C) (D)

(xi) Popis

sekvence: sekvence

id.

č.:

45:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

Ile

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

20

25

30

Ala

Gin

Ile

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

35

40

45

-67CZ 287945 B6

Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn

50

55

60

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

65

70

75

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Glu

Glu

Ala

Glu

Ala

80

85

90

Glu

Ala

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

95

100

105

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

110

115

120

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

125

130

135

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

140

145

(2) Informace o sekvenci id. č.: 46:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 535 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 46:

CTTAAGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA 50

GTATGTGTTA TATTTGCTAA TTTTCTTACT CTAAAGGAAG TTAAAAATGA 100

CGTCAAAATA AGCGTCGTAG GAGGCGTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG 150

TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG ACTTCGACAG TAGCCAATGA 200

GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA AAGGTTGTCG 250

TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG 300

ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGATTCTC TCTTCTTCGA CTTCGACTTC 350

GATCTAAGCA ATTGGTTGTG AACACGCCAA GGGTGAACCA ACTTCGAAAC 400

ATGAACCAAA CACCACTTTC TCCAAAGAAG ATGTGAGGTT TCTGATCTCC 450

-68CZ 287945 B6

ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC AAGAAACATG GTTAACCTTT 500

TGATGACGTT GATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT 535 (2) Informace o sekvenci id. č.: 47:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 538 párů bází (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klič: CDS (B) Umístění: 77...514 (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 47:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT 50

CATACACAAT ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT 97 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe 1 5

ACT

GCA

GTT

TTA

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

TTA

GCT

GCT

CCA

139

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Léu

Ala

Ala

Pro

10

15

20

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

181

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

Ile

Pro

Ala

25

30

35

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

GAT

223

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly Asp

Phe

Asp

40

45

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

AAT

AAC

GGG

TTA

265

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn Asn

Gly

Leu

50

55

60

-69CZ 287945 B6

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

GCT

AAA

GAA

307

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

Lys

Glu

65

70

75

GAA

GGG

GTA

TCC

ATG

GCT

AAG

AGA

GAA

GAA

GCT

GAA

GCT

GAA

349

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Glu

G1U

Ala

Glu

Ala

Glu

80

85

90

GCT

GAA

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

391

Ala

Glu

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

95

100

105

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

433

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

110

115

TAC

ACT

CCA

AAG

ACT

AGA

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

475

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

120

125

130

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

514

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

135

140

145

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA 538 (2) Informace o sekvenci id. č.: 48:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 146 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 48:

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser 15 10 15

Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr

25 30

-70CZ 287945 B6

Ala Gin Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu

35

40

45

Gly Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

50

55

60

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

65

70

75

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Glu

Glu

Ala

Glu

Ala

80

85

90

Glu

Ala

Glu

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

95

100

105

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

110

115

120

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

Ile

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

Ile

125

130

135

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys Asn

140

145

(2) Informace o sekvenci id. č.: 49:

(i) Charakteristiky sekvence;

(A) Délka: 538 párů bázi (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: sekvence id. č.: 49:

CTTAAGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA 50

GTATGTGTTA TATTTGCTAA TTTTCTTACT CTAAAGGAAG TTAAAAATGA 100

CGTCAAAATA AGCGTCGTAG GAGGCGTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG 150

TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG ACTTCGACAG TAGCCAATGA 200

GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA AAGGTTGTCG 250

TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG 300

ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGATTCTC TCTTCTTCGA CTTCGACTTC 350

-71 CZ 287945 B6

GACTTTCTAA GCAATTGGTT GTGAACACGC CAAGGGTGAA CCAACTTCGA 400

AA.CATGAA.CC AAACACCACT TTCTCCAAAG AAGATGTGAG GTTTCTGATC 450

TCCATAGCAA CTTGTTACAA CATGAAGATA GACAAGAAAC ATGGTTAACC 500

TTTTGATGAC GTTGATCTGC GTCGGGCGTC CGAGATCT 538

Průmyslová využitelnost

Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou průmyslově využitelné při přípravě prostředků pro léčení diabetů.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Inzulínový derivát následující sekvence:

   A-řetězec S S ⁷ I

   Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12 ř

   B-řetězec S

   I

   Xaa-V al-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-V al1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

   A-řetězec - pokračování

   Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (sekvence id. č.: 1)

   13 14 15 16 17 18 19 [ 21

   I

   B-řetězec - pokračování S

   I

   Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

   B-řetězec - pokračování

   Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa-Xaa (sekvence id. č.:2)

   25 26 27 28 29 30 ve kterém Xaa v pozicích A21 a B3 jsou, nezávisle, jakékoliv aminokyselinové zbytky, které jsou kódovány genetickým kódem kromě Lys, Arg a Cys;

   -72CZ 287945 B6

   Xaa v pozici Bl je Phe neboje vypuštěno;

   Xaa v pozici B30 je a) zbytek nekódované, lipofílní aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující α-aminodekanovou kyselinu, α-aminododekanovou kyselinu, α-aminotetradekanovou kyselinu a α-aminohexadekanovou kyselinu, a v tomto případě Xaa v pozici B29 je zbytek Lys s acylovou skupinou, vybranou ze skupiny zahrnující formyl, acetyl, propionyl a n-butyryl a zbytek kyseliny jantarové, která je vázaná k jeho ε-aminoskupině a b) jakýkoliv aminokyselinový zbytek, který je kódován genetickým kódem kromě zbytku Lys, Arg a Cys, a v tomto případě Xaa v pozici B29 je zbytek Lys, který má na ε-aminoskupině lipofílní substituent, kterým je acylová skupina vybraná ze skupiny zahrnující lineární nasycenou karboxylovou kyselinu mající od 6 do 24 atomů uhlíku nebo c) je vypuštěna, a v tomto případě Xaa v pozici B29 je zbytek Lys, který má lipofílní substituent, kterým je acylová skupina vybraná ze skupiny zahrnující zbytek lineární nasycené karboxylové kyseliny mající od 6 do 24 atomů uhlíku, a jakékoliv jeho Zn2+ komplexy, za předpokladu, že Xaa v pozici B30 je zbytek Thr nebo Ala, Xaa v pozicích A21 a B3 jsou zbytek Asn a Xaa v pozici Bl je zbytek Phe, pak je inzulínový derivát Zn2+ komplex.
2. 2. Inzulínový derivát podle nároku 1, ve kterém Xaa v pozicích A21 a B3 jsou, nezávisle, jakékoliv aminokyselinové zbytky, které jsou kódovány genetickým kódem kromě Lys, Arg a Cys;

   Xaa v pozici Bl je Phe neboje vypuštěno;

   Xaa v pozici B30 je vypuštěno nebo je to jakýkoliv aminokyselinový zbytek, který je kódován genetickým kódem kromě Lys, Arg a Cys a ε-aminoskupina LysB29 má lipofílní substituent, kterým je acylová skupina zahrnující zbytek lineární nasycené karboxylové kyseliny mající od 6 do 24 atomů uhlíku.
3. 3. Inzulínový derivát podle nároku 2, ve kterém je Xaa v pozici B30 vypuštěno.
4. 4. Inzulínový derivát podle nároku 2, ve kterém Xaa v pozici B30 je zbytek Asp, Glu nebo Thr.
5. 5. Inzulínový derivát podle nároku 2, ve kterém je acylová skupina vybraná ze skupiny sestávající ze zbytku kyseliny dodekanové, kyseliny tridekanové a kyseliny tetradekanové.
6. 6. Inzulínový derivát podle nároku 1, ve kterém Xaa v pozici A21 je zbytek Ala, Gin, Gly nebo Ser.
7. 7. Inzulínový derivát podle nároku 1, ve kterém Xaa v pozici B3 je zbytek Asp, Gin nebo Thr.
8. 8. Inzulínový derivát podle nároku 1, ve kterém Xaa v pozici Bl je vypuštěno.
9. 9. Inzulínový derivát podle nároku 1, kterým je N^sB29-tetradekanoyl des(B30) lidský inzulín.
10. 10. Inzulínový derivát podle nároku 1, kterým je jakýkoliv Zn²⁺ komplex N^eB29-tetradekanoyl des(B30) lidského inzulínu.
11. 11. Inzulínový derivát podle nároku 1, kterým je Zn²⁺ komplex N^EB29-tetradekanoyl des(B30) lidského inzulínu, který obsahuje 2, 3 nebo 4 Zn²⁺ ionty na inzulínový hexamer.
12. 12. Inzulínový derivát podle nároku 1, kterým je N^eB29-lithocholoyl-a-glutamyl des(B30) lidský inzulín.

    -73CZ 287945 B6
13. 13. Inzulínový derivát podle nároku 1, kterým je jakýkoliv Zn²⁺ komplex N^eB29-lithocholoyl-aglutamyl des(B30) lidského inzulínu.
14. 14. Inzulínový derivát podle nároku 1, kterým je Zn²⁺ komplex N^EB29-lithocholoyl-a-glutamyl des(B30) lidského inzulínu, který obsahuje 2, 3 nebo 4 Zn²⁺ ionty na inzulínový hexamer .
15. 15. Farmaceutický prostředek pro léčení diabetů u pacientů, kteří takovou léčbu potřebují, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle nároku 1, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
16. 16. Farmaceutický prostředek pro léčení diabetů u pacientů, kteří takovou léčbu potřebují podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle nároku 1 ve směsi s inzulínem nebo inzulínovým analogem a spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.