ES2260832T3 - Cristales de insulina desprovistos de zinc utilizados en composiciones pulmonares. - Google Patents

Cristales de insulina desprovistos de zinc utilizados en composiciones pulmonares.

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ES2260832T3 ES98907916T ES98907916T ES2260832T3 ES 2260832 T3 ES2260832 T3 ES 2260832T3 ES 98907916 T ES98907916 T ES 98907916T ES 98907916 T ES98907916 T ES 98907916T ES 2260832 T3 ES2260832 T3 ES 2260832T3
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Abstract

Método para la preparación de cristales de insulina desprovistos de zinc, comprendiendo las etapas de: a) proveer una solución de insulina teniendo un pH entre 7, 0 y 9, 5; b) mezclar dicha solución con una solución de una sal de un metal alcalino o de una sal de amonio, donde la solución de insulina y/o la solución de una sal de un metal alcalino o de una sal de amonio comprende un solvente orgánico miscible en agua seleccionado del grupo consistente en etanol, metanol, acetona y 2propanol en una cantidad correspondiente a un 5 a 25% (v/v) en la solución obtenida después de la mezcla, donde las dos soluciones son mezcladas durante un periodo inferior a 15 minutos; y c) recuperar los cristales formados.

Description

Cristales de insulina desprovistos de zinc utilizados en composiciones pulmonares.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método de producción de cristales de insulina desprovistos de zinc teniendo un diámetro inferior a 10 \mum.
Antecedentes de la invención
La diabetes es un término general para trastornos en humanos que presentan una excreción excesiva de orina como en la diabetes mellitus y diabetes insípida. La diabetes mellitus es un trastorno metabólico que se traduce en la perdida casi total de la capacidad de utilización de la glucosa. Aproximadamente el 2% de toda la población sufre de
diabetes.
Desde la introducción de la insulina en 1920, se han realizado progresos continuos para mejorar el tratamiento de la diabetes mellitus. Para tratar de evitar los niveles glicémicos extremos, los diabéticos utilizan a menudo una terapia de inyección múltiple, con la que se administran la insulina en cada comida.
La insulina es administrada habitualmente a través de inyecciones s.c. o i.m.. No obstante, debido a las molestias inherentes a las inyecciones, se han investigado extensamente vías alternativas de administración tales como nasal y pulmonar. Como reseña de las vías alternativas de administración de insulina, véase Danielsen et al. New routes and means of insulin delivery, en: Childhood and Adolescent Diabetes (Ed. Kelnar), Chapman & Hall Medical, London 1994, pp. 571-584.
Con el fin de evitar las inyecciones, la administración de insulina por la vía pulmonar puede ser una forma alternativa de proveer perfiles de absorción que imiten la insulina endógena sin necesidad de inyectar la insulina.
Descripción del estado de la técnica
La administración de insulina por vía pulmonar puede ser obtenida a través de una solución acuosa o bien una preparación en polvo. Se puede encontrar una descripción de los detalles en varias referencias, una de las últimas realizada por Niven, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys, 12(2&3):151-231 (1995). Un aspecto tratado en dicha reseña es la estabilidad obtenida con las formulaciones proteínicas, ya que las soluciones acuosas son menos estables que una formulación en polvo. Hasta ahora, todas las formulaciones en polvo han sido descritas en forma principalmente amorfas.
Se encuentra un estudio sobre los potenciadores de permeación útiles para la promoción de absorción transmucosal en Sayani et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys, 13(1&2): 85-184 (1996).
Patton et al., Inhale Therapeutic Systems, PCT WO 95/24183, reivindican un método para la aerosolisación de una dosis de insulina que consiste en proveer la insulina en forma de polvo seco dispersando una cantidad de polvo seco en un chorro de gas para formar un aerosol capturando el aerosol en una cámara para su inhalación posterior.
Se ha descubierto que cuando se combina la insulina con un potenciador de absorción apropiado y se introduce en el tracto respiratorio inferior en forma de polvo con un tamaño de partícula apropiado, ésta entra fácilmente en la circulación sistémica por absorción a través de la capa de las células epiteliales en el tracto respiratorio inferior tal como está descrito en la patente estadounidense Nº. 5.506.203. El proceso de fabricación descrito en dicha patente, comprendiendo una disolución de insulina de pH ácido seguido de un ajuste del pH a un pH 7,4 y la adición de taurocolato de sodio antes de secar la solución mediante concentración al vacío, secado por aire exterior, secado por pulverización, o secado por congelación, produce un polvo compuesto de insulina humana y potenciador de absorción. El polvo está caracterizado como principalmente amorfo determinado con un microscopio de luz polarizada. La distribución del tamaño de partículas deseado es obtenida por micronización en un triturador adecuado, tal como un molino de chorro, y los componentes pueden ser mezclados antes o después de la micronización. El efecto biológico del polvo obtenido según los métodos descritos en esta patente es visible sólo en presencia de una cantidad sustancial de
potenciador.
Platz et al., Inhale Therapeutic Systems, PCT WO 96/32149, describe un secado por pulverización de insulina con zinc de una solución que contiene manitol y un tampón de citrato, pH 6,7. La temperatura de entrada es de 120 a 122ºC, la temperatura de salida de 80-81ºC. El diámetro medio aerodinámico de masa, MMAd, de las partículas de insulina obtenidas fue determinado en 1,3 a 1,5 \mum.
En su tesis, "Insulin Crystals", Munksgaard Publisher 1958, p. 54-55, Schlichtkrull describe la cristalización de insulina porcina recristalizada desprovista de zinc de una solución comprendiendo 0,01 M de acetato de sodio y 0.7% \sim 0.12 M de cloruro sódico y 0,1% de metil-parahidroxi-benzoato y el uso de un pH de 7,0. Los cristales obtenidos eran cristales dodecaédricos rómbicos de 10-50 \mum que no manifestaban ninguna birrefringencia.
Jackson, patente estadounidense Nº 3.719.655 describe un método de purificación por cristalización de insulina porcina y bovina cruda. Los cristales de insulina desprovistos de zinc son obtenidos por cristalización con un pH 8,2 (intervalo de 7,2-10) en presencia de 0,5 M (intervalo de 0.2 M - 1 M) de una sal de sodio, de potasio, de litio o de amonio. La cristalización se realiza mediante la adición de hidróxido de metal alcalino 1 N o de amonio 1 N a una solución de insulina cruda en ácido acético 0,5 N con un pH de 8,2. De manera alternativa, se realiza la cristalización en una solución acuosa de insulina impura con un pH 8,2 mediante la adición de cloruro sódico sólido a una concentración de iones de sodio de 0,45 M. Los cristales aparecen en formas octadecaédricas o dodecaédricas, es decir cristales que pertenecen al sistema cristalino cúbico.
Baker et al., Lilly, EP 0 709 395 A2 (solicitada el 31 de octubre de1994) describen un proceso de cristalización sin zinc para una insulina humana Lys^{B28}-Pro^{B29} caracterizado por un ajuste del pH de una solución ácida fuertemente tamponada comprendiendo cationes de metal o iones de amonio y un conservante con hidróxido de metal o de amonio en una cantidad entre 8,5 y 9,5.
Los métodos conocidos para la producción de partículas de insulina del tamaño deseado para una administración por vía pulmonar son incómodos, generan problemas con el polvo de insulina y las inversiones en equipamiento son importantes. Además, la insulina está expuesta a condiciones en las que puede ocurrir alguna desnaturalización. De esta manera WO 96/32149 revela un secado por pulverización en un intervalo de temperatura de 50ºC a 100ºC, seguido de una pulverización de las partículas para conseguir el tamaño de partícula deseado.
Además, las formulaciones de polvo conocidas para una administración por vía pulmonar que han sido descritas como principalmente amorfas tienden a asociarse en agregados en el polvo seco.
Descripción de la invención Definiciones
La expresión "potenciador" como se utiliza en este caso se refiere a una sustancia que aumenta la absorción de insulina, un análogo de insulina o derivado de insulina a través de la capa de las células epiteliales que revisten los alvéolos pulmonares en la vasculatura pulmonar adyacente, es decir que la cantidad de insulina absorbida en el sistema sistémico es superior a la cantidad absorbida en ausencia de potenciador.
En el presente contexto la expresión "polvo" se refiere a una colección de partículas esencialmente secas, es decir que el contenido de humedad es inferior a aproximadamente 10% en peso, preferiblemente inferior a 6% en peso, y más preferiblemente inferior a 4% en peso.
El diámetro de los cristales está definido como el diámetro de Martin. Este es medido como la longitud de la línea, paralela a la escala ocular, que divide los cristales orientados de forma aleatoria en dos áreas previstas iguales.
Breve descripción de la invención
Un objeto de la presente invención es proveer un polvo de insulina adecuado para el suministro por vía pulmonar que presente una tendencia reducida a asociarse en agregados en el polvo seco en comparación con las partículas de insulina para vía pulmonar descritas en la técnica precedente.
Según la presente invención se ha conseguido este objetivo mediante la provisión de cristales de insulina desprovistos de zinc teniendo un diámetro inferior a 10 \mum.
Tales cristales son obtenidos mediante el método de la presente invención, que incluye las etapas de:
a.
suministrar una solución de insulina teniendo un pH situado entre 7,0 y 9,5;
b.
mezclar dicha solución con una solución de una sal de un metal alcalino o de una sal de amonio, donde la solución de insulina y/o la solución de una sal de un metal alcalino o de una sal de amonio comprende un solvente orgánico miscible en agua seleccionado del grupo consistente en etanol, metanol, acetona y 2-propanol en una cantidad que corresponde a del 5 al 25% (v/v) en la solución obtenida después de la mezcla (para suprimir la solubilidad de los cristales formados), donde las dos soluciones son mezcladas durante un periodo inferior a 15 minutos (para obtener una distribución muy uniforme de los tamaños de cristal y cristales con la misma forma cristalográfica); y
c.
recuperar los cristales formados.
El proceso de cristalización mediante el cual se obtienen directamente cristales pequeños, de tamaño uniforme y desprovistos de zinc, sin el uso de trituración, micronización, tamizado y otras fases de generación de polvo, es el preferido del estado de la técnica actual en la producción de polvos de insulina para inhalación.
Los cristales exhiben además un mejor perfil de estabilidad que los polvos de esencialmente la misma composición preparados mediante secado por pulverización, liofilización, secado al vacío y secado por aire exterior. Esto se debe probablemente al estado amorfo de los polvos preparados con los otros métodos descritos. De este modo se pueden almacenar a temperatura ambiente las formulaciones en polvo basadas en los cristales de la presente invención a diferencia de las preparaciones de insulina humana para inyecciones y algunos polvos de insulina amorfos sin agente estabilizante que deben ser mantenidos entre 2ºC a 8ºC.
Además, las formulaciones de polvo terapéutico comprendiendo los cristales de insulina de la invención dilucidan mejores propiedades de fluidez que las formulaciones de polvo amorfas correspondientes.
Formas de realización preferidas
La sal de un metal alcalino o de amonio es preferiblemente seleccionada del grupo consistente en hidrocloruro o acetato de sodio, de potasio, de litio o de amonio, o sus mezclas, más preferiblemente acetato de sodio.
Las dos soluciones son preferiblemente mezcladas durante un periodo inferior a 5 minutos.
La concentración de insulina después de la mezcla se sitúa preferiblemente entre el 0,5% y el 10%, más preferiblemente entre el 0,5% y el 5%, y más preferiblemente todavía entre el 0,5% y el 2%.
La concentración de sal después de la mezcla se sitúa preferiblemente entre 0,2 M y 2 M, más preferiblemente alrededor de 1 M.
El método según la presente invención puede comprender también una etapa de lavado, en la que los cristales obtenidos son lavados con una solución que comprende sustancias auxiliares que deben ser incluidas en el polvo seco final, preferiblemente un potenciador y/o un carbohidrato, y opcionalmente comprende un 5-25% de un alcohol, preferiblemente etanol, 5-50 mM de un fenol preferiblemente conservante, y 0,1-2 M de una sal tal como acetato de sodio.
Los cristales de insulina desprovistos de zinc provistos por la invención son de manera ventajosa provistos en una estructura cristalina perteneciente al sistema cristalino cúbico, preferiblemente en las formas cristalinas octadecaédricas o dodecaédricas, puesto que estas formas cristalinas producen un producto fácilmente soluble que presenta unas excelentes propiedades de fluidez.
El diámetro de los cristales de insulina es mantenido de manera ventajosa en el intervalo de 0,2 a 5 \mum, preferiblemente en el intervalo de 0,2 a 2 \mum, más preferiblemente en el intervalo de 0,5 y 1 \mum, para asegurar una alta biodisponibilidad y un perfil de acción apropiado, véase la solicitud PCT Nº WO 95/24183 y la solicitud PCT Nº WO 96/32149.
En una forma de realización preferida la insulina utilizada es seleccionada del grupo consistente en insulina humana, insulina bovina o insulina porcina, preferiblemente insulina humana.
En otra forma de realización preferida la insulina utilizada es seleccionada del grupo consistente en insulinas de acción rápida, preferiblemente insulina humana des(B30), insulina humana Asp^{B28} o insulina humana Lys^{B28}Pro^{B29}.
En otra forma de realización preferida la insulina utilizada es un derivado de insulina, preferiblemente seleccionado del grupo consistente en insulina humana B29-N^{\varepsilon}-miristoil-des(B30), insulina humana B29-N^{\varepsilon}-palmitoil-des(B30), insulina humana B29-N^{\varepsilon}-miristoil, insulina humana B29-N^{\varepsilon}-palmitoil, insulina humana B28-N^{\varepsilon}-miristoil lys^{B28} Pro^{B29}, insulina humana B28-N^{\varepsilon}-palmitoil Lys^{B28} Pro^{B29}, insulina humana B30-N^{\varepsilon}-miristoil-Thr^{B29}Lys^{B30}, insulina humana B30-N^{\varepsilon}-palmitoil-Thr^{B29}Lys^{B30}, insulina humana B29-N^{\varepsilon}-(N-palmitoil-\gamma-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N^{\varepsilon}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N^{\varepsilon}-(\omega-carboxiheptadecanoil)-des(B30)
e insulina humana B29-N^{\varepsilon}-(\omega-carboxiheptadecanoil), más preferiblemente insulina humana Lys^{B29}(N-\varepsilonacilada)
des(B30).
Los derivados de insulina tienen un inicio prolongado de acción y pueden por lo tanto compensar el aumento muy rápido de insulina en plasma asociado normalmente a un suministro por vía pulmonar. Mediante una selección cuidadosa del tipo de insulina, la presente invención permite ajustar la cadencia y obtener la respuesta biológica deseada dentro de un intervalo temporal definido.
Para evitar la irritación de los pulmones y eliminar reacciones inmunológicas, la insulina empleada es preferiblemente insulina purificada por cromatografía, tal como la insulina MC (Novo), insulina Single Peak (E. Lilly) e insulina RI (Nordisk).
En una forma de realización preferida, los cristales de insulina desprovistos de zinc provistos por la invención comprenden también una cantidad estabilizadora de un compuesto fenólico, preferiblemente m-cresol o un fenol, o una mezcla de estos compuestos.
Los cristales desprovistos de zinc descritos anteriormente provistos por la presente invención pueden ser utilizados en una formulación en polvo terapéutica apropiada para una administración por vía pulmonar.
En una forma de realización preferida esta formulación en polvo terapéutico comprende también un potenciador que mejora la absorción de insulina en el tracto respiratorio inferior.
El potenciador es ventajosamente un agente surfactivo, preferiblemente seleccionado del grupo consistente en sales de ácidos grasos, sales biliares o fosfolípidos, más preferiblemente una sal biliar.
Las sales de ácidos grasos preferidas son sales de ácidos grasos C_{10-14}, tales como caprato de sodio, laurato de sodio y miristato de sodio.
La lisofosfatidilcolina es un fosfolípido preferido.
Las sales biliares preferidas son sales de ursodeoxicolato, taurocolato, glicocolato y taurodihidrofusidato. Se prefieren todavía más las formulaciones de polvo según la invención donde el potenciador es una sal de taurocolato, preferiblemente taurocolato de sodio.
La proporción molar de insulina para el potenciador en la formulación en polvo de la presente invención se sitúa preferiblemente de 9:1 a 1:9, más preferiblemente entre 5:1 a 1:5, y aún más preferiblemente entre 3:1 a 1:3.
Las formulaciones en polvo pueden ser combinadas opcionalmente con un soporte o excipiente generalmente considerado adecuado para la administración por vía pulmonar. El propósito de añadir un soporte o excipiente puede ser como agente diluyente, agente estabilizante o agente de mejora de las propiedades de fluidez.
Los agentes de soporte adecuados incluyen 1) carbohidratos, por ejemplo monosacáridos tales como la fructosa, galactosa, glucosa, sorbosa, y similares; 2) disacáridos, tales como la lactosa, trehalosa y similares; 3) polisacáridos, tales como la rafinosa, maltodextrinas, dextranos y similares; 4) alditoles, tales como manitol, xilitol y similares; 5) sales inorgánicas, tales como cloruro de sodio y similares; 6) sales orgánicas, tales como citrato de sodio, ascorbato de sodio y similares. Un grupo preferido de soportes incluye trehalosa, rafinosa, manitol, sorbitol, xilitol, inositol, sacarosa, cloruro de sodio y citrato de sodio.
Esta invención es ilustrada además por los ejemplos siguientes, los cuales, no obstante, no deben ser considerados limitadores.
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Ejemplo 1 Cristalización en 1 M de acetato de sodio
2 g de insulina humana altamente purificada son disueltos en 100 ml de tampón 10 mM tris, pH 8,0 en 20% de etanol (v/v) en agua. A esta solución se añaden 100 ml de acetato de sodio 2 M bajo agitación. Se forma inmediatamente un precipitado. Después de 2 días a temperatura ambiente sepuede observar al microscopio unos pequeños cristales que poseen un diámetro entre 0,5 y 1 \mum. Los cristales son recogidos por centrifugado a -10ºC, lavados una vez en 20 ml de hielo con 10% de etanol (v/v) en agua, aislados por centrifugado y secados por liofilización. Los cristales obtenidos son mostrados en la Fig. 1.
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Ejemplo 2 Cristalización en presencia de una sal de sodio de ácido taurocólico
10 mg de insulina humana y 5 mg de sal de sodio de ácido taurocólico son disueltos en 500 \mul de tampón 10 mM tris, pH 8,0 en 20% de etanol (v/v) en agua. A esta solución se añaden 500 \mul de acetato de sodio 2 M. Después de 1 hora y de 24 horas se puede observar al microscopio un aspecto idéntico de los cristales, es decir unos cristales de tamaño uniforme que presentan unos diámetros entre 0,5 y 1 \mum. Los cristales fueron lavados tres veces con 100 \mul 10% de etanol (v/v) en agua a -10ºC y secados al vacío. La HPLC de los cristales mostraba que los lavados habían eliminado la sal de sodio del ácido taurocólico de los cristales de insulina.
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Ejemplo 3 Cristalización en presencia de Tween 80, sal de sodio sulfosuccinato bis(2-etilhexil), quitosano, L-\alpha-Lisofosfatidilcolina miristoilo y monolaurato de sorbitán polioxietileno
La cristalización se realizó tal como se describe en el Ejemplo 2 excepto la sal de sodio de ácido taurocólico que fue sustituida por 0,6% (p/v) Tween 80. 0,56% (p/v) sal de sodio sulfosuccinato bis(2-etilhexil), 0,32% (p/v) quitosano, 0,52% (p/v) L-\alpha-lisofosftidilcolina miristoilo, y 1% (p/v) monolaurato de sorbitán polioxietileno, respectivamente. Los cinco ejemplos exhiben cristales de tamaño uniforme con diámetros entre 0,5 y 1 \mum.
Ejemplo 4 Cristalización en 10% (v/v) de etanol
La cristalización se realizó en 10% de etanol (v/v) tal como se describe en el Ejemplo 1, mediante el uso de 4 combinaciones de pH y una concentración de acetato de sodio:
4.1: pH 7,5 y acetato de sodio 1 M
4.2: pH 7,5 y acetato de sodio 1,5 M
4.3: pH 9,0 y acetato de sodio 1 M
4.4: pH 9,0 y acetato de sodio 1,5 M
Las 4 combinaciones produjeron cristales de tamaño uniforme con diámetros entre 0,5 y 1 \mum.
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Ejemplo 5 Cristalización en 15% (v/v) de etanol
La cristalización se realizó en 15% (v/v) de etanol, con el uso de 6 combinaciones de pH y una concentración de acetato de sodio:
5.1: pH 7,5 y acetato de sodio 1 M
5.2: pH 7,5 y acetato de sodio 1,5 M
5.3: pH 7,5 y acetato de sodio 2 M
5.4: pH 9,0 y acetato de sodio 1 M
5.5: pH 9,0 y acetato de sodio 1,5 M
5.6: pH 9,0 y acetato de sodio 2 M
Las 6 combinaciones produjeron cristales de tamaño uniforme con diámetros entre 0,5 y 1 \mum.
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Ejemplo 6 Cristalización en 20% (v/v) de etanol
La cristalización se realizó en 20% (v/v) de etanol mediante el uso de 4 combinaciones de pH y una concentración de acetato de sodio:
6.1: pH 7,5 y acetato de sodio 1 M
6.2: pH 7,5 y acetato de sodio 1,5 M
6.3: pH 7,5 y acetato de sodio 2 M
6.4: pH 9,0 y acetato de sodio 1 M
Las 4 combinaciones produjeron cristales de tamaño uniforme con diámetros entre 0,5 y 1 \mum.
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Ejemplo 7 Cristalización con pH 7,5, 8,0, 8,5 y 9,0 en 20% (v/v) de etanol usando adición lenta de acetato de sodio
La cristalización se realizó usando soluciones tales como las que se describen en el Ejemplo 1, excepto el acetato de sodio 2 M que está disuelto en 20% (v/v) de etanol en agua. El pH de las soluciones de insulina fueron ajustadas a 7,5; 8,0; 8,5 y 9,0, respectivamente. La solución de acetato de sodio fue añadida en 12 partes alícuotas durante un periodo de 2 horas, con intervalos de 10 minutos entre las adiciones. En los 4 valores de pH se obtuvieron cristales de tamaño uniforme con diámetros entre 0,5 y 1 \mum.
Ejemplo 8 Cristalización de insulina humana Iys^{B29}(\varepsilon-miristoil) des(B30) en presencia de una sal de sodio de ácido taurocólico.
10 mg de insulina humana Iys^{B29}(\varepsilon-miristoil) des(B30) y 5 mg de sal de sodio de ácido taurocólico son disueltos en 500 \mul de tampón 10 mM tris, pH 8,0 en 20% (v/v) de etanol en agua. A esta solución se añaden 500 \mul de acetato de sodio 2 M. Después de 1 hora y de 24 horas se observa al microscopio un aspecto idéntico de los cristales, es decir unos cristales de tamaño uniforme que tienen diámetros entre 0,5 y 1 \mum. Los cristales fueron lavados una vez con 300 \mul 10% (v/v) de etanol en agua a -10ºC y secados al vacío. La HPLC de los cristales mostró que los lavados habían extraído la sal de sodio de ácido taurocólico de los cristales de insulina humana Lys^{B29} (\varepsilon-miristoil) des(B30).

Claims (6)

1. Método para la preparación de cristales de insulina desprovistos de zinc, comprendiendo las etapas de:
a)
proveer una solución de insulina teniendo un pH entre 7,0 y 9,5;
b)
mezclar dicha solución con una solución de una sal de un metal alcalino o de una sal de amonio, donde la solución de insulina y/o la solución de una sal de un metal alcalino o de una sal de amonio comprende un solvente orgánico miscible en agua seleccionado del grupo consistente en etanol, metanol, acetona y 2-propanol en una cantidad correspondiente a un 5 a 25% (v/v) en la solución obtenida después de la mezcla, donde las dos soluciones son mezcladas durante un periodo inferior a 15 minutos; y
c)
recuperar los cristales formados.
2. Método según la reivindicación 1, donde la sal de un metal alcalino o de amonio es seleccionada del grupo consistente en hidrocloruro o acetato de sodio, de potasio, de litio o de amonio, o sus mezclas, preferiblemente acetato de sodio.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde las dos soluciones son mezcladas durante un periodo inferior a 5 minutos.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la concentración de insulina después de la mezcla se sitúa entre el 0,5% y el 10%, preferiblemente entre el 0,5% y el 5%, más preferiblemente entre el 0,5% y el 2%.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la concentración de sal después de la mezcla se sitúa entre 0,2 M y 2 M, preferiblemente 1 M.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo también una etapa de lavado, durante la cual los cristales obtenidos son lavados con una solución que comprende sustancias auxiliares que deben ser incluidas en el polvo seco final, preferiblemente un potenciador y/o un carbohidrato, y comprendiendo opcionalmente 5-25% de un alcohol, preferiblemente etanol, 5-50 mM de un conservante preferiblemente un fenol, y 0,1-2 M de una sal tal como acetato de sodio.
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