CN106117345B

CN106117345B - 一种制备甘精胰岛素结晶的方法

Info

Publication number: CN106117345B
Application number: CN201610271979.5A
Authority: CN
Inventors: 林小鹊; 章琛; 李平珠; 江武; 陈小锋; 李文佳
Original assignee: Yichang Hec Changjiang Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: YICHANG HEC CHANGJIANG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2036-04-27
Also published as: CN106117345A

Abstract

本发明涉及一种制备甘精胰岛素结晶的方法，该方法具体包括以下步骤：1)将甘精胰岛素、酚类衍生物、含锌物质和有机酸溶于水中，制成结晶液；2)取pH调节剂将结晶液的pH值调至4.5～7.0，搅拌3～9小时，分离即得；其中结晶液中甘精胰岛素的浓度为1～3.5g/L，酚类衍生物、含锌物质和有机酸的质量/体积分数分别为：0.01～1.00％、0.005～1.5％和0.01～2.0％。该方法所配制的结晶液中不含有机溶剂，操作过程安全，工艺简单，容易控制，可有效去除上一步层析中的有毒有害物质，缩短了产品的过滤收集、洗晶及冷冻干燥时间，节约了成本，适用于甘精胰岛素的工业化生产。

Description

一种制备甘精胰岛素结晶的方法

技术领域

本发明涉及胰岛素的结晶领域。具体涉及一种制备甘精胰岛素结晶的方法。

背景技术

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现。1922年开始用于临床，使过去不治的糖尿病患者得到挽救。近年来，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增长，胰岛素的需求越来越多，单纯的从动物细胞提取已满足不了病人的需求，胰岛素及胰岛素类似物的生产迫在眉睫。其中一种新开发的长效胰岛素类似物-甘精胰岛素，正在越来越多被医生和患者所接受和使用。

甘精胰岛素(recombinant glycine-arginine insulin)是一种通过基因重组技术获得并用于治疗Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的长效胰岛素类生物制品，其持续控制血糖的原理为：皮下注射后甘精胰岛素分子立即聚合，因而溶解度降低，形成甘精胰岛素沉淀物，机体吸收延迟，其降糖作用的时间也被延长。甘精胰岛素是当前治疗Ⅰ、Ⅱ型糖尿病十分方便和有效的药物。国外由Aventis公司生产的甘精胰岛素注射液(商品名Lantus)与人胰岛素的不同之处在于其A链羧基端21位的天门冬氨酸被甘氨酸所取代，B链羧基端30位苏氨酸后的31和32位连接了两个精氨酸，改造后的活性胰岛素即甘精胰岛素，由E.coli表达生产。可在糖尿病患者体内平稳发挥药效24小时以上，并且无明显的血药高峰值和低峰值，很适合用于低基础胰岛素的替代治疗。

甘精胰岛素是一种在中性液中溶解度低的人胰岛素类似物。在本品酸性(pH＝4)注射液中，完全溶解。其主要作用是调节糖代谢。中国糖尿病防治指南认可：甘精胰岛素是唯一平稳无峰、作用时间长达24小时的胰岛素。符合人类生活作息周期，每天只需注射一次，而被患者和医生所青睐。

目前市场上大多以无定型或者粉末存在的甘精胰岛素没有均一且稳定的形态，而以结晶形式存在的甘精胰岛素，体积小，易与上清分开，大大缩短了过滤、洗晶及冻干的时间，生产效率高，是更好的重组甘精胰岛素的应用形式。因此，寻找一个稳定且简单的结晶方法势在必行。

中国专利CN102219851B中公开了一种从含有甘精胰岛素、有机溶剂、锌、酚衍生物、盐以及有机酸的结晶液中，在pH 7.0～9.0的条件下制备甘精胰岛素结晶的方法，该方法制备的结晶具有稳定的固体分子形式，易于大批生产操作，沉降体积小，易与上清分离，离心时间及冻干时间短，生产效率高等优点，但是结晶过程中有大量有机试剂存在，这些挥发性差且毒性高的有机溶剂的残留会严重影响胰岛素产品的质量。这不仅会给最终的结晶产品带来风险，也给后续操作带来很多麻烦。虽然该发明的发明人认为，甘精胰岛素在没有有机溶剂的条件下，只能是絮状的无定形沉淀，无法形成结晶，但本发明通过一系列的实验后证明，即使在无有机溶剂存在条件下，甘精胰岛素也能形成较好的六聚体晶型，且此在不含有机溶剂的溶液中结晶的方法不仅能简化结晶操作过程，降低风险，还可以降低成本，减少对环境的污染。

发明内容

本发明针对上述现有技术中存在的缺陷和不足，提供一种在不含有机溶剂的溶液中制备甘精胰岛素结晶的方法，该方法简单、方便、绿色环保且可降低成本，所制备的甘精胰岛素结晶体积小，易与上清分开，大大缩短了过滤、洗晶及冻干的时间，生产效率高，后续风险低，是较好的甘精胰岛素的应用形式。

为了实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种制备甘精胰岛素结晶的方法，包括以下步骤：

1)将甘精胰岛素、酚类衍生物、含锌物质和有机酸溶于水中，制成结晶液；

2)取pH调节剂将结晶液的pH值调至4.5～7.0，搅拌3～9小时，分离即得；

其中结晶液中甘精胰岛素的浓度为1～3.5g/L，酚类衍生物、含锌物质和有机酸的质量/体积分数分别为0.01～1.00％、0.005～1.5％和0.01～2.0％。

在本发明的一些实施方式中，酚类衍生物选自苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲脂。

在本发明的一些实施方式中，有机酸选自乙酸、柠檬酸或甘氨酸。

在本发明的一些实施方式中，含锌物质选自氯化锌、氧化锌、乙酸锌、溴化锌或硫酸锌。

在本发明的一些实施方式中，步骤1)所述结晶液的pH值为4.5～5.5，步骤2)所述pH值调至5.0～7.0。

在本发明的一些实施方式中，pH值调节剂为在pH 5.0～7.0具有缓冲能力的缓冲溶液。

在本发明的一些实施方式中，pH值调节剂选自氢氧化钾、氢氧化钠、氨水。

在本发明的一些实施方式中，pH值调节剂的浓度为0.5～4M。

在本发明的一些实施方式中，甘精胰岛素结晶的制备是在室温下进行的。

本发明的实施方式中使用的水均为去离子水。

除非明确地说明与此相反，否则，本发明引用的所有范围包括端值。例如，“将上述结晶液调pH值至5.0～7.0”表示结晶液的pH取值范围为5.0≤n≤7.0。

本发明所述的“分离”表示在重力或者其他外力作用下通过介质或不通过介质将流体与非流体分离的操作，所述介质包括但不限于滤纸、纱布、滤芯、半透膜、滤网等，理论上，含有多孔结构的材料都可以成为过滤的介质；将固体部分分离的设备包括但不限于真空或减压装置、加压装置、离心装置等。

本发明使用的术语“或”表示备选方案，如果合适的话，可以将它们组合，也就是说，术语“或”包括每个所列出的单独备选方案以及它们的组合。例如，“所述的有机酸选自乙酸、柠檬酸或甘氨酸。”表示有机酸是乙酸、柠檬酸、甘氨酸之中的一种，也可以是其一种以上的组合。

本发明中的数字均为近似值，无论有否使用“大约”或“约”等字眼。数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。

本发明所述的室温是指10～35℃。

有益效果：

本发明所述的方法能使甘精胰岛素在无有机溶剂的条件下直接结晶，绿色环保，操作简单，还可以降低成本，同时形成的晶体具有较好的晶型，且大小形状均一。

本发明制备结晶的方法工艺简单，容易控制，缩短了产品的过滤收集、洗晶及冷冻干燥时间，适用于甘精胰岛素的工业化生产。

附图说明

图1为实施案例1中甘晶胰岛素结晶在显微镜下1000倍放大图。

图2为实施案例2中甘晶胰岛素结晶在显微镜下400倍放大图。

图3为实施案例3中甘晶胰岛素结晶在显微镜下400倍放大图。

具体实施方式

以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得。

氯化锌购自成都市科龙化工试剂厂，批号20100517；苯酚购自成都市科龙化工试剂厂，批号20110216；柠檬酸购自成都市科龙化工试剂厂，批号20100723；氢氧化钠购自成都市科龙化工试剂厂，批号20120416。

实施例1

制备甘精胰岛素结晶液，结晶液中各组分的含量为：甘精胰岛素：2.53g/L，苯酚：0.1％、氯化锌：0.05％、柠檬酸：0.5％。

秤取10.11g甘精胰岛素溶于2L水中，制成甘精胰岛素溶液，另将3.99g苯酚、2.02g氯化锌、20.11g柠檬酸加入到结晶溶液中，加水定容至4L，制成结晶液。将结晶液置于室温下低速搅拌，用氢氧化钠调pH值到5.0，搅拌4小时，在室温下静置，然后取上清检测，上清液中甘精胰岛素的含量为0.04mg/ml。

取结晶混悬液镜检，放大1000倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(图1)。

实施例2

制备甘精胰岛素结晶液，结晶液中各组分的含量为：甘精胰岛素：2.07g/L，苯酚：0.01％、氯化锌：0.007％、柠檬酸:0.05％。

秤取2.07g甘精胰岛素溶于500ml水中，制成甘精胰岛素溶液，另将2ml 5％苯酚、1.75ml 4％氯化锌、0.5g柠檬酸加入到结晶溶液中，加水定容至1L，制成结晶液。将结晶液置于室温下低速搅拌，用氢氧化钠调pH至6.8，搅拌6小时，在室温下静置，然后去上清检测，上清液中甘精胰岛素的含量为0.01mg/ml。

取结晶混悬液镜检，放大400倍可见明显结晶，透明度较高(图2)。

实施例3

制备甘精胰岛素结晶液，该结晶液中各组分的含量为：甘精胰岛素：3.17g/L，苯酚：0.7％、氯化锌：1.5％、柠檬酸：1.8％。

秤取6.34g甘精胰岛素溶于1L水中，制成甘精胰岛素溶液，另将14g苯酚、30g氯化锌、36g柠檬酸加入到结晶溶液中，加水定容至2L，制成结晶液。将结晶液置于室温下低速搅拌，用氢氧化钠调pH至7.0，搅拌9小时，在室温下静置，然后去上清检测，上清液中甘精胰岛素的含量为0.04mg/ml。

取结晶混悬液镜检，放大400倍可见明显的结晶，透明度较高(图3)。

Claims

1.一种制备甘精胰岛素结晶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将甘精胰岛素、苯酚、氯化锌和柠檬酸溶于水中，制成结晶液；

其中，结晶液中甘精胰岛素的浓度为1～3.5g/L，苯酚、氯化锌和柠檬酸的质量/体积分数分别为0.01～1.00％、0.005～1.5％和0.01～2.0％；

其中，步骤2)所述的pH调节剂为氢氧化钠。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述结晶液的pH值为4.5～5.5，步骤2)所述pH值调至5.0～7.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH值调节剂的浓度为0.5～4M。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)是在室温下完成的，所述室温为10-35℃。