CN109957001B - 甘赖脯胰岛素结晶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开甘赖脯胰岛素结晶的制备方法，所述方法包括向含甘赖脯胰岛素的结晶液中以两步或更多步的方式添加Zn离子进行两步或更多步结晶，其中，以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，第一步结晶时所添加的Zn离子的量为0.1％‑0.8％，其它步结晶时所添加的Zn离子的量为0.1％以上，且各步所添加的Zn离子总量为0.4％以上。该制备方法能够制备高质量和高收率的甘赖脯胰岛素结晶，易于甘赖脯胰岛素的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及人胰岛素类似物结晶的制备方法，具体地讲，涉及甘赖脯胰岛素(GlyA21-LysB28-ProB29-人胰岛素)结晶的制备方法。
背景技术
糖尿病是胰岛素分泌缺陷或作用不足导致的以高血糖为特征的代谢紊乱。据2012年11月统计，中国已经跃居成为世界上糖尿病患者人数最多的国家，我国糖尿病患病人数每小时增加400人次，每天增加1万人次，患病总数已达到9420万，患病率高达9.7％，它的危害性仅次于心脑血管疾病和肿瘤。此外，我国约有3/4的糖尿病患者患有并发症，患者的慢性高血糖状态与长期并发症显著相关，容易导致肾脏、眼、神经、心脏和血管等众多器官损害、功能障碍和功能衰竭，危害性极大。
胰岛素治疗一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。近年来，随着胰岛素技术的不断发展，人们开发出了具有不同作用时间的新一代胰岛素，即胰岛素类似物。其中一种新开发的长效胰岛素类似物—甘精胰岛素，正在越来越多被医生和患者所接受和使用。但是，甘精胰岛素在临床应用时也存在一些问题：1.起效慢(起效时间约为1.5小时)，对餐时血糖过高的患者，或偶尔进餐较多的患者无法有效降低其餐后血糖；2.不能与其他胰岛素混合使用，这是由于各种胰岛素的等电点不同，甘精胰岛素在酸性条件下稳定，而天然胰岛素及现有速效胰岛素类似物在中性条件下稳定，如果将甘精胰岛素与其他胰岛素直接混合，会导致甘精胰岛素在注射前发生沉淀而不能施用，而其他胰岛素在混合后也由于受混合物酸碱度变化的影响，稳定性降低，安全性也随即降低。因此，在甘精胰岛素的包装说明书上，生产商特别注明不要将甘精胰岛素与其他任何类型的胰岛素混合。
然而，甘赖脯胰岛素的出现解决了上述问题，甘赖脯胰岛素是一种快速起效且在酸性条件下稳定的胰岛素类似物。该胰岛素类似物的A链A21位的天冬酰胺(Asn)突变为甘氨酸(Gly)、B链B28位的脯氨酸(Pro)突变为赖氨酸(Lys)、B29位的赖氨酸(Lys)突变为脯氨酸(Pro)，其可以与长效胰岛素类似物如甘精胰岛素混合，制成同时具有速效降糖和平稳长效降糖两种功能的预混制剂，解决现有天然胰岛素(猪、牛、人)和速效胰岛素类似物在酸性环境下不稳定，以及现有胰岛素预混制剂不澄清，需引入外源蛋白(例如鱼精蛋白)作缓释剂而易产生免疫反应，每日需早、晚注射两次的问题，使制剂安全性更高。
结晶形式的甘赖脯胰岛素由于具有均一稳定的固体分子形式，并且沉降体积小，易与上清分离，离心时间及冻干时间短，生产效率高，是更好的甘赖脯胰岛素的应用形式。因此亟需将甘赖脯胰岛素制备成结晶，再应用到胰岛素制剂中。
在现有技术中有很多胰岛素的结晶方法，例如在Abel J.J,PNAS,12:132(1926)、美国专利US2920104、中国专利CN95106555.6等中所描述的那些方法。但是，甘赖脯胰岛素因其等电点为约5.3，与其他胰岛素差异较大，应用现有的胰岛素结晶方法，并不能使甘赖脯胰岛素形成结晶，只能形成无定形沉淀。，因此，亟需开发一种甘赖脯胰岛素结晶的制备方法。
发明内容
本发明的目的是解决现有上述问题，提供一种甘赖脯胰岛素结晶的制备方法，该方法可大规模地制备高质量和高收率的甘赖脯胰岛素-锌结晶。该结晶具有稳定的固体分子形式，易于大批量生产操作，沉降体积小，易与上清分离，离心时间及冻干时间短，生产效率高，与沉淀同批量的甘赖脯胰岛素沉淀相比，离心处理时间将会缩短5-6倍。
胰岛素结晶主要是通过胰岛素与锌离子结合成的六聚体按照正负离子之间的静电引力相互堆积而成。常规胰岛素在酸性条件下存在下述平衡：
即，胰岛素单体通过分子间的聚合形成二聚体，二聚体再与锌离子络合进一步形成六聚体。
其中，上述平衡随着pH值的升高而向六聚体方向变化，而在碱性条件下时，几乎全部以六聚体的形式存在，易于形成晶体。
然而，在研究制剂过程中发现，甘赖脯胰岛素在酸性条件下几乎全部是单体，二聚体很少，因此很难在酸性条件下结合锌离子。随着pH升高至碱性条件时，才开始出现甘赖脯胰岛素的二聚体，因此与常规其它胰岛素不同的是，甘赖脯胰岛素是在碱性pH值下存在下述平衡：
此外，由于甘赖脯胰岛素自身结构的特殊性，形成的甘赖脯胰岛素六聚体极不稳定，容易解聚为单体，因此按照常规胰岛素结晶方法无法得到晶体，甚至甘赖脯胰岛素结晶溶液根本无法形成沉淀。
然而，本发明的发明人意外地发现通过以两步或更多步加入锌离子的方式来分两步或更多步结晶，能够以高收率和高质量获得符合要求的甘赖脯胰岛素结晶，从而提供了一种甘赖脯胰岛素结晶的制备方法，所述方法包括向含甘赖脯胰岛素的结晶液中以两步或更多步的方式添加Zn离子进行两步或更多步结晶，其中，以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，第一步结晶时所添加的Zn离子的量为0.1％-0.8％，其它步结晶时所添加的Zn离子的量为0.1％以上，且各步所添加的Zn离子总量为0.4％以上。
本发明中所涉及的锌的百分含量，均是指锌与甘赖脯胰岛素的质量比。
具体地，本发明中通过以两步或更多步的方式添加Zn离子进行两步或更多步结晶，能够以较低的锌离子添加量获得高质量和90％以上收率的符合要求的甘赖脯胰岛素结晶。而当第一步结晶时所添加的Zn离子的量超过0.8％时，发现会产生氢氧化锌胶体，氢氧化锌胶体吸附形成的六聚体，进而形成簇状晶体析出，且得到的结晶产品中锌离子含量严重超过所允许的限度(即，1.0％的锌含量)，不符合后续用于生产甘赖脯胰岛素制剂的标准。因为后续甘赖脯胰岛素制剂中的锌含量规定为0.75-1.0％，所以需要确保用于制备甘赖脯胰岛素制剂的甘赖脯胰岛素结晶产品中的Zn含量不超过1.0％。而以锌与甘赖脯胰岛素的质量比计，当第一步结晶时所添加的Zn离子的量小于0.1％时，则无法形成结晶。类似地，以锌与甘赖脯胰岛素的质量比计，当其它步结晶时所添加的Zn离子的量在0.1％以上时，能够较好地形成甘赖脯胰岛素结晶。若其它步结晶时加入的锌离子量更少，则不能进一步形成甘赖脯胰岛素结晶，无法进一步减少上清液中甘赖脯胰岛素的含量。且当第一步及其它步所添加的Zn离子总量为0.4％以上时，能够使上清液中甘赖脯胰岛素的含量低至小于0.4mg/ml，使得结晶收率为90％以上。
优选地，所述第一步结晶时所添加的Zn离子的量为0.2％-0.5％，从而确保在第一步结晶中充分形成晶体的同时，又尽可能少地形成氢氧化锌胶体
优选地，所述其它步结晶时所添加的Zn离子的量分别为0.3％-2.0％，从而确保有效地减少上清液中甘赖脯胰岛素的含量。
优选地，结晶时的温度为10-24℃，更优选地，结晶时的温度为14-22℃。本发明中，结晶的温度也是甘赖脯胰岛素形成结晶的关键因素之一。发明人惊奇地发现，甘赖脯胰岛素在10-24℃时能够较容易地进行结晶。本发明中，配制结晶液时的温度不受特别限制，只要该温度能保证结晶液为溶液状态即可，例如可以在4-30℃配制结晶液，优选地，可以在25-30℃配制结晶液，因为稍高的温度能够增加甘赖脯胰岛素结晶前的溶解度，待结晶液完全澄清后，再调温至10-24℃进行结晶。由于甘赖脯胰岛素结构的特殊性，更高的温度，或更低的温度都无法获得甘赖脯胰岛素结晶。当结晶温度大于24℃时，结晶液始终澄清而无晶体出现；而当温度小于10℃时，结晶液迅速浑浊，析出的沉淀经过显微镜检测大部分为絮状物只有少量晶体。发明人分析原因可能是:由于甘赖脯胰岛素本身的结构特征，在较高温度下，如温度大于24℃时，六聚体极不稳定易解聚为单体而无法结晶；此外，蛋白质在高温条件下不稳定，容易造成三级结构的变化，疏水性增加，溶解度降低，活性降低或直接失活。而温度较低，甘赖脯胰岛素溶解度降低、析出较快，而晶体的生长是一个比较缓慢的过程，胰岛素的快速析出最终导致得到的大部分是絮状物沉淀，晶体很少。
优选地，本发明中可以分两步加入Zn离子来分两步进行结晶。具体地，在分两步进行结晶时，包括下述步骤：1)配制所述含甘赖脯胰岛素的结晶液，所述结晶液包含甘赖脯胰岛素、有机溶剂、有机酸、盐、和酚类物质；2)以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，向所述结晶液中添加0.1％-0.8％的Zn离子，并将pH值调节至8.1-9.0，使所述结晶液完全澄清；3)将所述步骤2)的结晶液pH调至7.2-8.0，搅拌，并将温度调节至10-24℃，进行析晶；和4)在所述步骤3)析晶结束之后，以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，再次添加0.1％以上的、且与所述步骤2)中所添加的锌离子量的总量为0.4％以上的Zn离子，搅拌，调节pH至6.0-6.7，在10-24℃完成结晶。
以上述步骤2)和4)两步加入锌离子的方式、以及步骤2)和4)各步加入锌离子的量来分步进行结晶，能够获得高质量和高收率的符合要求的甘赖脯胰岛素结晶，同时相比于更多步的结晶，进一步简化了操作步骤。优选地，以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，上述步骤2)中Zn离子的量为0.2％-0.5％，步骤4)中再次添加的Zn离子量为0.3％-2％。
令人惊奇的是，本发明步骤4)第二次添加的Zn离子的量即便超过了0.8％，也不会产生簇状晶体，且不会使得最终获得的甘赖脯胰岛素结晶产品中锌含量超标。发明人推测，可能是由于此时大部分的甘赖脯胰岛素单体已在步骤3)中与Zn离子形成了结晶或晶核，结晶液中所剩单体形式的甘赖脯胰岛素分子已经很少，只会与锌离子形成很少量的新六聚体，且此时结晶液中存在大量的甘赖脯胰岛素晶核，这些晶核会优先吸附新形成的六聚体而生长成晶体，因此即使此时形成氢氧化锌胶体，其也无法再大量吸附胰岛素六聚体而长成簇状晶体，并且由于此时产生的氢氧化锌胶体并没有被甘赖脯胰岛素六聚体包覆，仍旧以稳定的胶体形式存在，可以被之后的水洗工艺所去除。
本发明中，这种分步加入锌离子的方式有下述优点：1)提高了锌离子与胰岛素的结合几率；2)在整个结晶过程中引入的锌离子不需要过多，减少了锌离子的加入量；3)有效地降低或避免了结晶液中氢氧化锌胶体的形成、降低了最终获得的甘赖脯胰岛素干粉中锌离子的含量、以及保证了最终获得的甘赖脯胰岛素的晶型和结晶质量；4)减少了甘赖脯胰岛素在上清液中的损失，从而可获得更高收率的甘赖脯胰岛素结晶，极大地节约了生产成本。
本发明中，pH的调节也是甘赖脯胰岛素形成结晶的关键因素之一。发明人惊奇地发现，通过使结晶在pH 6.0-9.0进行，能够更容易地形成结晶。优选地，第一步结晶在中性或碱性pH下进行，例如pH 7.2-8.0，且其它步结晶在中性或弱酸性pH下进行结晶，例如pH为6.0-6.7，这样形成的结晶的粒径更大、结构更规则且更为均一。具体地，在进行两步结晶时，优选地，通过先将所述配好的为酸性的结晶液的pH值调节至8.1-9.0，使所述结晶液完全澄清，然后再将结晶液pH调节至7.2-8.0进行析晶，再在析晶完全后第二次加入锌离子进行结晶时，将pH调节至6.0-6.7，能够更容易地形成结晶，且形成结晶的粒径更大、结构更规则且更为均一，这可能是由于甘赖脯胰岛素六聚体在接近中性的弱酸性环境下溶解度更低，更容易析出。更优选地，将所述配好的为酸性的结晶液的pH值调节至8.3-8.5，使所述结晶液完全澄清，然后再将结晶液pH调节至7.4-7.7进行析晶，再在析晶完全后第二次加入锌离子进行结晶时，将pH调节至6.3-6.5。本发明结晶液的pH值可通过使用本领域技术人员所公知的酸碱进行调节，优选使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵(浓氨水)、Tris、盐酸、乙酸或丙酸进行调节。
优选地，在所述其它步结晶时或步骤4)结晶时，还包括在添加Zn离子之后再添加盐至终浓度为1mol/L以上，优选地，添加盐至终浓度为2-4mol/L，更优选地，所述盐为醋酸铵。发明人惊奇地发现，在结晶过程中加入盐类，能够容易地形成更高收率的晶体，减少上清液中胰岛素的损失，节省生产成本。在结晶过程中所加入的盐可以为例如醋酸铵、硫酸铵、氯化钠、氯化铵、乙酸钠或柠檬酸钠，优选地，所述盐可以为醋酸铵。
本发明中，结晶过程中进行搅拌以及搅拌速度也是甘赖脯胰岛素形成结晶的重要因素之一。发明人惊奇地发现，在结晶过程中必须进行搅拌才能形成结晶，优选地，进行高速搅拌，例如以300转/分以上、优选以500转/分以上的速度进行搅拌，更优选以500-1500转/分的速度进行搅拌，这样能够使甘赖脯胰岛素晶体迅速、容易地生成。而缓慢搅拌，例如低于300转/分则形成结晶较慢。而现有的其他胰岛素结晶过程中均未提及需要高速搅拌。在结晶过程中进行高速搅拌，可以增加分子碰撞的概率，易于二聚体和六聚体的形成，从而促使甘赖脯晶体迅速生成，有效地降低了结晶时间。
本发明中，优选地，所述锌离子是以锌盐的形式加入的，具有代表性的锌盐的实例包括但不限于氯化锌、氧化锌、乙酸锌、溴化锌、硫酸锌等。本领域技术人员知晓，还有许多其他的可以在低浓度有机溶剂的水溶液中提供出锌离子的物质也可以用于本发明的方法。
本发明中，甘赖脯胰岛素的溶解是通过添加有机溶剂来实现的。有机溶剂的种类及其浓度没有特别限定，只要能够较好地使甘赖脯胰岛素溶解且不影响甘赖脯胰岛素的活性即可。一定浓度的甘赖脯胰岛素在没有有机溶剂的条件下，无法溶解澄清，而有机溶剂浓度过高，又会使甘赖脯胰岛素溶解度增加，以致无法达到利于结晶析出的过饱和状态，发明人惊奇地发现，当结晶液中存在有浓度为10-30％(体积/体积)、优选为15-20％(体积/体积)的有机溶剂时，甘赖脯胰岛素能容易地形成结晶。在本发明中，所述有机溶剂可以为乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等任何本领域技术人员所公知的水溶性极性有机溶剂。其中优选的有机溶剂为乙醇，其体积分数优选为15％-20％。
本发明中，所述结晶液中甘赖脯胰岛素的浓度可以为3-50g/L，当甘赖脯胰岛素的浓度更高时，则容易凝胶化使蛋白质难于溶解，浓度过低则会造成设备和试剂的浪费，增加生产成本。此外，发明人发现，对于上述浓度范围的甘赖脯胰岛素，采用本发明的方法进行结晶时，最终均使得上清中残余的甘赖脯胰岛素含量小于0.4mg/L，而在上述甘赖脯胰岛素浓度范围内，采用较低浓度(如3g/L)时，相对于更高浓度(如50g/L)，并没有显著减少最终上清中残余的甘赖脯胰岛素含量，因此，为了进一步减少生产过程中甘赖脯胰岛素的损失，减少生产成本，更优选地，结晶液中甘赖脯胰岛素的浓度可以为15-40g/L，进一步优选可以为25-30g/L。
本发明中，所述结晶液中的酚类物质选自苯酚、间甲苯酚、对羟基苯甲酸甲脂、或它们的混合物；结晶液中酚类物质的浓度为0.05％-0.5％，优选为0.1％-0.2％。优选的酚类物质为苯酚，浓度为0.1％-0.2％。
本发明的结晶液中的盐可以为无机盐也可以为有机盐，优选地，所述盐选自氯化钠、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、乙酸钠或柠檬酸钠；结晶液中盐的浓度可以为0.1-0.4M，优选为0.2-0.3M；更优选的盐为氯化钠，浓度为0.2-0.3M。
本发明中，结晶液中的有机酸可以选自例如乙酸、柠檬酸或甘氨酸；结晶过程中有机酸浓度过高易造成结晶过程中放热过多而影响产品的稳定性，浓度过低会使甘赖脯胰岛素溶解效果不好，因此结晶液中有机酸的浓度优选为0.1-2.0M。更优选的有机酸为乙酸，浓度优选为0.5-1.0M。
优选地，本发明采用以下步骤对甘赖脯胰岛素进行结晶：
1)在25-30℃制备含甘赖脯胰岛素的结晶液，所述结晶液包含15-30g/L甘赖脯胰岛素、15-20％(体积/体积)乙醇、0.5-1.0M乙酸、0.2-0.3M氯化钠、0.1-0.2％(质量/体积)的苯酚；2)以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，向所述结晶液中添加0.2％-0.5％的Zn离子，并将pH值调节至8.3-8.5，使所述结晶液完全澄清；3)将所述步骤2)的结晶液pH调至7.4-7.7，以500-1500转/分的搅拌速度进行搅拌，并调温至14-22℃，进行析晶；和4)在所述步骤3)析晶结束之后，以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，再次添加Zn离子0.3％-2.0％，以500-1500转/分的搅拌速度进行搅拌，并加入醋酸铵至终浓度2-4mol/L，调节pH至6.3-6.5，在14-22℃完成结晶。
甘赖脯胰岛素溶于结晶液中的方式，以及配制结晶液时各组分加入的顺序对本发明来说不是关键性的。例如，可以分别将有机溶剂、酚类物质、有机酸以及盐加入到甘赖脯胰岛素溶液中，也可以先将酚类物质、有机酸和盐配制成溶液，再加入到包含甘赖脯岛素和有机溶剂的溶液中。
本发明的甘赖脯胰岛素可以通过商购获得，也可以采用任何一种公认的肽合成技术制备，例如溶液法、固相合成法、半合成法、基因工程法、DNA重组法等。
本发明甘赖脯胰岛素结晶的制备方法具有以下优点：能够以较少量的Zn、以高收率结晶出均一稳定的甘赖脯岛素六面体结晶，晶体的透明度高，沉降体积小，离心干燥时间短，生产效率高。
附图说明
图1：实施例1重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图2：实施例2重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图3：实施例3重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图4：实施例4重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图5：实施例5重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图6：比较例1重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图7：比较例2重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图8：比较例4重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图9：比较例5重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图10：实施例6重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图11：实施例7重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图12：比较例7重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图13：实施例8重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图14：实施例9重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图15：实施例10重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图16：实施例11重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图17：实施例12重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图18：实施例13重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
图19：实施例14重组甘赖脯胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明。需要注意的是，这些实施例不构成对本发明保护范围的限制。
材料
甘赖脯胰岛素：甘李药业股份有限公司提供，批号(GLP019)。
氯化锌购自sigma；苯酚购自天津科密欧；乙酸购自上海国药；氯化钠购自上海国药；浓氨水；乙醇购自迪马科技；醋酸铵购于上海国药；甲醇购自上海国药。
实施例中所涉及的锌的百分含量，均是指锌与甘赖脯胰岛素的质量比。
实施例1
采用下述四个主要步骤进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备：
1)在25℃制备重组甘赖脯胰岛素结晶液，该结晶液中所包含的组分和浓度为：重组甘赖脯胰岛素：15g/L；乙醇：15％；乙酸：1.0M；氯化钠：0.3M；苯酚：0.1％(质量体积比)。
制备过程如下：称取重组甘赖脯胰岛素干粉1.5g，量取乙醇15ml、乙酸5.7ml、10％苯酚1ml，加入氯化钠1.75g，加水混合最终定溶至100ml，制成结晶液。
2)向步骤1)的结晶液中加入氯化锌15.69mg(0.5％的Zn离子)，用氢氧化铵调节pH至8.3，使结晶液完全澄清。
3)之后再用乙酸调节pH至7.4，以1500转/分的速度进行搅拌，并调温至22℃进行析晶至晶体完全析出。
4)待析晶结束之后，再次添加氯化锌62.7mg(2％的Zn离子与甘赖脯胰岛素的质量比)，以1500转/分的速度进行搅拌、调节pH6.5，约2小时，结晶结束。
取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.25mg/ml。搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图1)。最终得到的结晶产品的锌含量为0.66％，符合要求。结晶的收率为98.33％。
实施例2
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，步骤2)中添加的Zn离子的量为0.1％。结晶结束后，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.27mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图2)；最终得到的结晶产品的锌含量为0.53％；结晶的收率为98.2％。
实施例3
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，步骤2)中添加的Zn离子的量为0.8％。结晶结束后，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.26mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图3)；最终得到的结晶产品的锌含量为0.81％；结晶的收率为98.27％。
实施例4
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，步骤4)中添加的Zn离子的量为0.1％。结晶结束后，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.37mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图4)；最终得到的结晶产品的锌含量为0.56％；结晶的收率为97.53％。
实施例5
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，步骤4)中添加的Zn离子的量为0.3％。结晶结束后，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.33mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图5)；最终得到的结晶产品的锌含量为0.57％，结晶的收率为97.8％。
比较例1
采用实施例1的步骤1)-3)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，没有进行步骤4)，且步骤2)中添加的Zn离子的量为0.8％。取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为2.4mg/ml，上清残留较高；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图6)；最终得到的结晶产品的锌含量为0.83％，结晶的收率仅为84.0％。
比较例2
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，步骤2)中添加的Zn离子的量为1.0％。结晶结束后，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.28mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的簇状晶体(见图7)，该结晶吸附在胶状沉淀上。最终得到的结晶产品的锌含量1.2％，不符合制剂要求。
比较例3
采用实施例1的步骤1)-3)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，步骤2)中添加的Zn离子的量为0.05％。本实施例中，在步骤3)中，结晶液始终澄清无晶体出现。
比较例4
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，步骤4)中添加的Zn离子的量为0.05％。结晶结束后，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为2.6mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图8)。最终得到的结晶产品的锌含量0.65％，结晶的收率仅为82.67％。
比较例5
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，步骤2)中添加的Zn离子的量为0.1％，步骤4)中添加的Zn离子的量为0.2％。结晶结束后，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为
3.5mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图9)。最终得到的结晶产品的锌含量0.36％，结晶的收率仅为76.67％。
实施例6
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，在步骤3)中调温至24℃。结晶结束后，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.38mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图10)；最终得到的结晶产品的锌含量0.72％，符合制剂要求。结晶的收率为97.47％。
实施例7
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，在步骤3)中调温至10℃。结晶结束后，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.35mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高，但伴有少量絮状沉淀(见图11)；最终得到的结晶产品的锌含量0.68％，符合制剂要求。结晶的收率为97.67％。
比较例6
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，在步骤3)中在28℃进行结晶。本实施例中，在步骤3)中始终澄清无晶体出现。在步骤4)中再次添加Zn离子后，仍然澄清无晶体出现。
比较例7
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，在步骤3)中降温至8℃。本实施例中，在步骤3)中，溶液迅速变浑浊，产生大量絮状沉淀，搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍几乎看不见六面体结晶。同样，在步骤4)中也产生大量絮状沉淀，搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍看不见六面体结晶(见图12)。
实施例8
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，在步骤4)中，在添加锌离子之后，又加入醋酸铵至终浓度4mol/L。在本实施例步骤4)中，约1.5小时完成结晶，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.09mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图13)；最终得到的结晶产品的锌含量0.60％，符合制剂要求。结晶的收率为99.4％。
实施例9
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，结晶液中甘赖脯胰岛素的浓度为25g/L，以及在步骤4)中，在添加锌离子之后，又加入醋酸铵至终浓度1mol/L。在本实施例步骤4)中，约2小时完成结晶，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.18mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图14)；最终得到的结晶产品的锌含量0.60％，符合制剂要求。结晶的收率为99.28％。
实施例10
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，在步骤3)和4)的结晶过程中，以300转/分钟缓慢进行搅拌，本实施例中在步骤3)和4)中晶体析出较慢，搅拌约5小时晶体才完全析出。结晶结束后，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.30mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图15)；最终得到的结晶产品的锌含量0.68％，符合制剂要求。结晶的收率为98.0％。
实施例11
采用实施例1的步骤1)-4)进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是，将步骤4)的pH调节为7.2。在本实施例步骤4)中，约3小时完成结晶，取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.32mg/ml；搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图16)；最终得到的结晶产品的锌含量0.71％，符合制剂要求。结晶的收率为97.86％。
实施例12
采用下述五个主要步骤进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备：
1)在30℃制备重组甘赖脯胰岛素结晶液，该结晶液中所包含的组分和浓度为：重组甘赖脯胰岛素：3g/L；乙醇：10％；乙酸：0.1M；氯化钠：0.1M；苯酚：0.05％(质量体积比)。
制备过程如下：称取重组甘赖脯胰岛素干粉0.3g，量取乙醇10ml、乙酸0.57ml、10％苯酚0.5ml，加入氯化钠0.58g，加水混合最终定溶100ml，制成结晶液。
2)向步骤1)的结晶液中加入氯化锌1.25mg(0.2％的Zn离子)，用氢氧化铵调节pH至9.0，使结晶液完全澄清。
3)之后再用乙酸调节pH至8.0，以500转/分速度进行搅拌，并降温至14℃进行析晶至晶体完全析出。
4)待析晶结束之后，再次添加氯化锌1.88mg(0.3％的Zn离子)，以500转/分的速度进行搅拌、调节pH6.7，约2小时，结晶结束。
5)待析晶结束之后，再次添加氯化锌5mg(0.8％的Zn离子)，以500转/分速度进行搅拌，在pH6.0结晶约3小时。
取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.14mg/ml。搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图17)；最终得到的结晶产品的锌含量0.41％，符合制剂要求。结晶的收率为95.33％。
实施例13
采用实施例12的五个步骤进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是：
步骤1)是在4℃制备重组甘赖脯胰岛素结晶液，且该结晶液中所包含的组分和浓度为：重组甘赖脯胰岛素：50g/L；乙醇：30％；乙酸：2M；氯化钠：0.4M；苯酚：0.5％(质量体积比)；
步骤2)中的pH为8.1；
步骤3)中的pH为7.2；
步骤4)中添加的Zn离子为0.1％(Zn与胰岛素的质量比)，且pH为6.0；
步骤5)中添加的Zn离子为0.1％(Zn与胰岛素的质量比)，且pH为6.7。
取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.38mg/ml，符合要求。搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图18)；最终得到的结晶产品的锌含量0.39％，符合制剂要求。结晶的收率为99.24％。
实施例14
采用实施例12的五个步骤进行重组甘赖脯胰岛素结晶的制备，不同的是：
步骤1)是在25℃制备重组甘赖脯胰岛素结晶液，且该结晶液中所包含的组分和浓度为：重组甘赖脯胰岛素：30g/L；甲醇：20％；乙酸：1.0M；氯化钠：0.4M；苯酚：0.2％(质量体积比)；
步骤2)中的pH为8.5；
步骤3)中的pH为7.7；
步骤4)中添加的Zn离子为1％，且pH为6.5；
步骤5)中添加的Zn离子为2％，且pH为6.7。
取上清液进行HPLC检测，上清液中重组甘赖脯胰岛素的含量为0.18mg/ml。搅起结晶混悬液后镜检，放大160倍可见明显的六面体结晶，透明度较高(见图19)；最终得到的结晶产品的锌含量0.56％，符合制剂要求。结晶的收率为99.4％。
本发明已经通过上述实施例进行了说明，但应当理解的是，上述实施例只是用于举例和说明的目的，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明并不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围以内。本发明的保护范围由附属的权利要求书及其等效范围所界定。
Claims (15)
1.甘赖脯胰岛素结晶的制备方法，所述方法包括向含甘赖脯胰岛素的结晶液中以两步的方式添加Zn离子进行两步结晶，其中，以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，第一步结晶时所添加的Zn离子的量为0.1％-0.8％，第二步结晶时所添加的Zn离子的量为0.3％-2.0％，且第一步结晶和第二步结晶时所添加的Zn离子总量为0.4％以上；
所述制备方法包括下述步骤：
1)配制所述含甘赖脯胰岛素的结晶液，所述结晶液由甘赖脯胰岛素、有机溶剂、有机酸、盐和酚类物质组成；
2)以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，向所述结晶液中添加0.1％-0.8％的Zn离子，并将pH值调节至8.1-9.0，使所述结晶液完全澄清；
3)将所述步骤2)的结晶液pH值调至7.2-8.0,搅拌，并将温度调节至10-24℃，进行析晶；和
4)在所述步骤3)析晶结束之后，以Zn与甘赖脯胰岛素的质量比计，再次添加0.3％-2.0％、且与所述步骤2)中所添加的锌离子量的总量为0.4％以上的Zn离子，搅拌，调节pH值至6.0-6.7, 在10-24℃，完成结晶；
其中，所述搅拌的速度为300转/分以上，且在所述步骤1）的所述结晶液中甘赖脯胰岛素的浓度为3-50g/L；
所述结晶液中有机溶剂选自甲醇或乙醇，以体积/体积计，含量为10-30%；
所述结晶液中有机酸为乙酸，含量为0.1-2.0M；
所述结晶液中盐为氯化钠，含量为0.1-0.4M；
所述结晶液中酚类物质为苯酚，以质量/体积计，含量为0.05-0.5％；
以及所述锌离子以锌盐的形式加入，所述锌盐选自氯化锌、氧化锌、乙酸锌、溴化锌或硫酸锌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述第一步结晶时所添加的Zn离子的量为0.2％-0.5％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，结晶时的温度为14-22℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在4-30℃配制结晶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在25-30℃配制结晶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤2）中调节pH值至8.3-8.5，使所述结晶液完全澄清。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤3）中调节pH值至7.4-7.7，搅拌，并将温度调节至10-24℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤4）中调节pH值至6.3-6.5，在10-24℃完成结晶。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤4)结晶时，还包括在添加Zn离子之后再添加醋酸铵至终浓度为1mol/L以上。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，步骤4）中在添加Zn离子之后再添加醋酸铵至终浓度为2-4mol/L。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其中，搅拌的速度为500转/分以上。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其中，搅拌的速度为500-1500转/分。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在所述步骤1)的结晶液中，甘赖脯胰岛素的浓度为15-40g/L。
14.根据权利要求1所述的制备方法，其中，甘赖脯胰岛素的浓度为25-30g/L。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述结晶液中含有组分及配比的方案选自下述方案中的任一种：
a)甘赖脯胰岛素的浓度为15g/L；
所述有机溶剂为乙醇，以体积/体积计，含量为15%；
所述有机酸为乙酸，含量为1.0M；
所述盐为氯化钠，含量为0.3M；和
所述酚类物质为苯酚，以质量/体积计，含量为0.1%；
b）甘赖脯胰岛素的浓度为3g/L；
所述有机溶剂为乙醇，以体积/体积计，含量为10%；
所述有机酸为乙酸，含量为0.1M；
所述盐为氯化钠，含量为0.1M；和
所述酚类物质为苯酚，以质量/体积计，含量为0.05％；
c)甘赖脯胰岛素的浓度为50g/L；
所述有机溶剂为乙醇，以体积/体积计，含量为30%；
所述有机酸为乙酸，含量为2.0M；
所述盐为氯化钠，含量为0.4M；和
所述酚类物质为苯酚，以质量/体积计，含量为0.5%；
或者，
d)甘赖脯胰岛素的浓度为30g/L；
所述有机溶剂为甲醇，以体积/体积计，含量为20%；
所述有机酸为乙酸，含量为1.0M；
所述盐为氯化钠，含量为0.4M；和
所述酚类物质为苯酚，以质量/体积计，含量为0.2%。
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