CN103342746A

CN103342746A - 一种制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法

Info

Publication number: CN103342746A
Application number: CN2013103212286A
Authority: CN
Inventors: 马瑞; 肖拥军; 蒋振东; 曹春来; 潘太健; 周翠; 杨晓森
Original assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: CN103342746B

Abstract

本发明公开了一种制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，属于人工胰岛素的纯化和制备领域。本发明在10～30℃条件下，配制含0.2～1.5M甘氨酸，3.0～10.0g/L重组门冬胰岛素，体积分数含量为10～30％的有机溶剂，体积分数含量为0.2～0.4%的酚类物质、0.2～0.5M盐的结晶液，并调节结晶液pH值至6.0～6.5，加入锌离子，结晶3～6小时，然后降温至2～8℃静置12～18小时，可获得稳定的门冬胰岛素结晶。本发明的结晶方法的实施缩短了产品的冷冻干燥时间及提高了产品稳定性，适合于重组门冬胰岛素的工业化生产。

Description

一种制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法

技术领域

本发明属于人工胰岛素的纯化和制备领域，具体涉及一种制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法。

背景技术

糖尿病是胰岛素分泌缺陷或作用不足导致的以高血糖为特征的代谢紊乱。据2012年11月统计，中国已经跃居成为世界上糖尿病患者人数最多的国家，我国糖尿病患病人数以每小时增加400人次，每天增加1万人次，患病总数已达到9420万，患病率高达9.7%，它的危害性仅次于心脑血管疾病和肿瘤。我国约有3/4的糖尿病患者患有并发症，其慢性高血糖状态与长期并发症显著相关，容易导致肾脏、眼、神经、心脏和血管等众多器官损害、功能障碍和功能衰竭，危害性极大。

由于饭后葡萄糖的峰值和注射胰岛素的峰值二者之间的偏离带来的问题，从而推动了单体胰岛素类似物的产生。20世纪八九十年代，随着分子生物学技术及基因工程的不断发展，人们开发出了速效胰岛素——重组门冬胰岛素（重组Asp^B28-人胰岛素）。重组门冬胰岛素是通过将人胰岛素B链B28位的脯氨酸（Pro）突变为天门冬氨酸（Asp）。这一个氨基酸的改变破坏了两个胰岛素单体分子在形成二聚体时重要的范德华力（一个胰岛素分子的B28与另外一个胰岛素分子的B23所形成），从而使其不易形成二聚体。重组门冬胰岛素制剂注射后，其药代动力学接近正常胰岛素的生理分泌曲线。与常规人胰岛素对比，其药代动力学特性是常规人胰岛素的一半左右，其起效时间是10～20分钟，达峰时间为40分钟，作用持续时间是3～5小时，使患者在获得良好的血糖控制的同时不会发生夜间严重低血糖事件。

固态胰岛素中的晶体形式无论从贮藏性能还是后续制剂配方设计等方面都较液态形式方便。此结晶制备方法得到的晶体具有均一稳定的固体分子形式，冻干时间短，样品稳定性高，因此它更适合与工业化生产。

中国专利CN95106555.6描述了一种速效胰岛素——重组赖脯胰岛素(Lys^B28-Pro^B29-人工胰岛素)的结晶方法：在1M乙酸体系下，含有1.8～2.5g/L重组赖脯胰岛素、100～300mg锌、0.15％～0.25％苯酚、pH5.9～6.2使其形成晶体。赖脯胰岛素和门冬胰岛素都是单体胰岛素类似物，结构和作用方式有一定的相似性，但将赖脯胰岛素的结晶方法应用于门冬胰岛素，不能形成晶体，而为无定形沉淀。

发明内容

为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种制备稳定的门冬胰岛素（重组Asp^B28-人胰岛素）结晶的方法。该方法可从干燥/冻干固体粉末样品或纯化收集的液体样品中直接制备门冬胰岛素晶体。样品来源形式灵活（固体粉末或液体形式均可应用于此发明），更好地与上游工艺衔接。该晶体具有沉降体积小，均一稳定，冻干时间短，生产效率高等优点，易于工业化生产。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，在含0.2～1.5M甘氨酸体系下，从含有重组门冬胰岛素、锌离子、酚类物质、盐及有机溶剂的结晶液中，在pH6.0～6.5的条件下使重组门冬胰岛素结晶。

具体由以下步骤实现：

在10～30℃条件下，配制含0.2～1.5M甘氨酸，3.0～10.0g/L重组门冬胰岛素，体积分数含量为10～30％的有机溶剂，体积分数含量为0.2～0.4%的酚类物质、0.2～0.5M盐的结晶液，并调节结晶液pH值至6.0～6.5，加入锌离子，结晶3～6小时，然后降温至2～8℃静置12～18小时，获得稳定的门冬胰岛素结晶。

本发明中的有机酸甘氨酸是至关重要的，在乙酸体系下是无法形成甘氨酸体系下均一稳定的固体分子；所述结晶液中有机酸为甘氨酸，其浓度为0.2～1.5M；较优选的浓度为0.5～1.0M。

所述的重组门冬胰岛素可以用各种认可的肽合成技术中的任意方法进行制备，优选为溶液法（经典方法）、固相方法、半合成法或DNA重组法（CN86106574A）中的一种方法进行制备；所述的重组门冬胰岛素为干燥/冻干固体粉末样品或纯化收集的液体样品中的一种；所述结晶液中重组门冬胰岛素的浓度为3.0～10.0g/L，较优选的浓度为3.0～5.0g/L。

重组门冬胰岛素因其B28的突变（相对于人胰岛素一级结构），导致其结晶条件较为苛刻，以下为结晶过程中重要的参数和条件：酚类物质的加入和浓度、有机溶剂的加入和浓度以及pH值的调节方式等。

本发明中所述的酚类物质的加入和浓度是重组门冬胰岛素形成结晶的重要参数之一。胰岛素六聚体是变构蛋白，有3种构象：T6、T3R3和R6，其物理及化学稳定性：R6>>T3R3>>T6（Rahuel-Clermont et al.1997）。在R6构象中有6个疏水口袋可结合6个酚类物质，T3R3构象中也有3个疏水口袋可结合3个酚类物质，而T6构象中没有酚类物质结合口袋。随着脊椎动物的不断进化，胰岛素六聚体在小囊泡的可能储藏形式为R6或T3R3（Michael F.Dunn.2005）。从此发明结晶体系中加入的物质（锌离子、酚类物质、卤化盐等）来推测，此门冬胰岛素晶体中的单元六聚体为R6构象。所述结晶液中酚类物质为苯酚、间甲苯酚、邻甲苯酚、对甲苯酚、间苯二酚或对羟基苯甲酸甲脂中的至少一种；结晶液中酚物质的体积分数为0.2～0.4%。较优选的酚类物质为苯酚；体积分数优选为0.2～0.3％。

本发明中所述的有机溶剂的加入和浓度是重组门冬胰岛素形成结晶的重要参数之一。一定浓度的重组门冬胰岛素在没有有机溶剂的条件下，在pH3.5～6.5无法溶解澄清，使其结晶结果为无定形沉淀。发明人经实验研究发现，只有当结晶液中存在浓度为体积分数10～30％的有机溶剂时，重组门冬胰岛素才能较好地形成结晶。在本发明中，所述有机溶剂为乙腈、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种；其中优选的有机溶剂为乙腈；所占的体积分数优选为12～18％。

由于在甘氨酸体系下，提供锌离子的锌盐（乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌或硫酸锌中的一种）的加入都会降低pH，发明人经过大量的实验得知pH的调节最好是在加入锌离子之前进行，一般认为锌离子的加入使结晶开始，如果这时再去调节pH会影响晶体的形态，从而影响其均一性。因此，除了锌离子以外的各物质加完混匀后，再调节pH为6.0～6.5，加完提供锌离子的锌盐之后结晶开始，pH会降到5.5～6.1之间。这一操作减少了结晶过程中的动力干扰，从而使形成的晶体更均一。本发明结晶液的pH值可通过使用本领域技术人员所公知酸碱进行调节，优选使用氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸或乙酸中的一种进行调节。更优选的酸碱为盐酸和氢氧化铵；

结晶的初始温度范围为10～30℃。优选的结晶液初始温度为18～26℃，该温度能够增加重组门冬胰岛素结晶前的溶解度，使样品较好的溶解，前期结晶3～6小时使形成的晶核稳定后，再降温至2～8℃继续结晶。

所述结晶液中盐为氯化钠、氯化钙、氯化铵、氯化钾、氯化镁、溴化钾、碘化钾或硫氰酸钾中的一种；结晶液中盐的浓度为0.2～0.5M；较优选的盐为氯化钠；优选浓度为0.3～0.4M。

所述结晶液中锌离子是以锌盐的形式加入的；所述的锌盐为乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌或硫酸锌中的一种；本发明结晶液中锌离子（Zn⁺²）的含量为锌离子与门冬胰岛素的摩尔比为2～15:1；较优选的锌盐为乙酸锌，优选的含量为锌离子与门冬胰岛素的摩尔比为2.2～8:1。

所述的结晶的过程应用搅拌或不进行搅拌使晶体生成。所述的结晶的过程应用优选为搅拌使晶体形成。为了使得到胰岛素晶体的纯度更高，可以进行重结晶。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明提供了甘氨酸结晶体系进行重组门冬胰岛素的结晶制备，克服了应用乙酸体系制备重组门冬胰岛素的缺陷和低效率。

2.本发明结晶方法的实施所得到的晶体具有沉降体积小，均一稳定，生产效率高，同时缩短了产品的冷冻干燥时间及提高了产品稳定性，适合于重组门冬胰岛素的工业化生产。

附图说明

图1为实施例1重组门冬胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。

图2为实施例2重组门冬胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。

图3为实施例3重组门冬胰岛素结晶后在显微镜下40倍放大图。

图4为实施例4重组门冬胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。

图5为实施例5重组门冬胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。

图6为实施例6重组门冬胰岛素结晶后在显微镜下160倍放大图。

图7为实施例7重组门冬胰岛素结晶后在显微镜下64倍放大图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

实验材料

重组门冬胰岛素：珠海联邦制药股份有限公司提供，批号LB0208101。

甘氨酸来源于国药集团化学试剂有限公司，批号F20111214；乙酸锌来源于广东光华化学厂有限公司，批号120813；水饱和酚来源于北京拜尔迪生物科技公司，批号20110518；乙酸来源于西陇化工股份有限公司，批号20120701；氯化钠来源于西陇化工股份有限公司，批号120610；氢氧化铵来源于广东光华化学厂有限公司，批号20100907；盐酸来源于珠海市华成达化工有限公司，批号20120826；乙腈来源于天津市康科德科技有限公司，批号20101126；其余试剂至少为分析纯。

下面的实例仅为了进一步详细叙述本发明门冬胰岛素结晶的制备方法。本发明的范围不应解释为仅下述实例构成。

实施例1

制备重组门冬胰岛素结晶液，各组分和浓度为：实验A为1.2M甘氨酸体系，实验B为1.5M甘氨酸体系，其他成分一样：重组门冬胰岛素：3.0g/L，乙腈：体积分数含量为12％，苯酚：体积分数含量为0.2％，乙酸锌：锌离子与门冬胰岛素的摩尔比为7.35:1，氯化钠：0.34M（20g/L）。

制备浓度为6.0g/L重组门冬胰岛素溶液，其中乙腈体积分数含量为24%，调节pH值为6.0待用。称取1.36g和1.69g甘氨酸分别装于50ml的三角瓶，分别加入0.3g的氯化钠，加入7.3ml的纯化水使其溶解，然后加入7.5ml含量为6.0g门冬胰岛素样品，然后加入30ul的水饱和苯酚，调节pH值为6.0，最后加入160ul浓度为0.355M的乙酸锌溶液使结晶开始，将其放在摇床上转速105转/分钟，18℃结晶3小时，然后降温至4℃静置，继续结晶15小时。取少量混悬液进行镜检，放大160倍，可见均一的单斜晶体，实验A和实验B获得晶体分别如图1a和图1b所示。

实施例2

制备重组门冬胰岛素结晶液，各组分和浓度为：实验A含有0.5M氯化钠，实验B含有0.2M氯化钠，其他成分一样：甘氨酸：1.2M，重组门冬胰岛素：6.0g/L，乙腈：体积分数含量为12％，苯酚：体积分数含量为0.4％，乙酸锌：门冬胰岛素的含量摩尔比为3:1。

制备浓度为12.0g/L重组门冬胰岛素溶液，其中乙腈体积分数含量为24%，调节pH值为6.0待用。称取0.45g和0.18g氯化钠分别装于50ml的三角瓶，分别加入1.36g的甘氨酸，加入7.3ml的纯化水使其溶解，然后加入7.5ml含量为12.0g门冬胰岛素样品，然后加入60ul的水饱和苯酚，调节pH值为6.2，最后加入130ul浓度为0.355M的乙酸锌溶液使结晶开始，将其放在摇床上转速105转/分钟，26℃结晶3小时，然后降温至2℃静置，继续结晶18小时。取少量混悬液进行镜检，放大160倍，可见相对均一的单斜晶体，其中有少量较小的单斜晶体，实验A和实验B获得晶体分别如图2a和图2b所示。

实施例3（对比实施例）

制备重组门冬胰岛素结晶液，各组分和浓度为：实验A按照中国专利CN95106555.6赖脯胰岛素结晶工艺，制备15ml结晶体系，含乙酸：1M，重组门冬胰岛素：2.5g/L，乙酸锌：200mg/L，苯酚：体积分数含量为0.2％，pH6.0；实验B在实验A的基础上加入乙腈，体积分数含量为12％；实验C在实验B的基础上加入氯化钠，浓度为0.34M（20g/L）。结果如图3所示：放大40倍，实验A和B为无定形沉淀（见图3a和图3b），实验C所形成的为门冬胰岛素单斜针状晶体，均一性相对较差，而且针状晶体易碎，不易后续处理（见图3c）。

实施例4

制备重组门冬胰岛素结晶液，各组分和浓度为：甘氨酸：0.7M，重组门冬胰岛素：10.0g/L，乙腈：体积分数含量为12.5％，苯酚：体积分数含量为0.2％，乙酸锌：门冬胰岛素的含量摩尔比为2.2:1，氯化钠：0.34M（20g/L）。

制备浓度为20.0g/L重组门冬胰岛素溶液，其中乙腈体积分数含量为25%，调节pH值为6.0待用。称取0.79g甘氨酸装于50ml的三角瓶，加入0.3g的氯化钠，加入7.3ml的纯化水使其溶解，然后加入7.5ml含量为20.0g门冬胰岛素样品，然后加入30ul的水饱和苯酚，调节pH值为6.2，最后加入160ul浓度为0.355M的乙酸锌溶液使结晶开始，将其放在摇床上转速105转/分钟，25℃结晶6小时，将其降温至8℃静置，继续结晶12小时。然后取少量混悬液进行镜检，结果如图4：放大160倍，可见均一性相对较好，单斜晶体的形状不是那么规则。

实施例5

制备重组门冬胰岛素结晶液，各组分和浓度为：甘氨酸：0.2M，重组门冬胰岛素：3.0g/L，乙腈：体积分数含量为12.5％，苯酚：体积分数含量为0.2％，乙酸锌：门冬胰岛素的含量摩尔比为7.35:1，氯化钠：0.34M。

制备浓度为6.0g/L重组门冬胰岛素溶液，其中乙腈体积分数含量为25%，调节pH值为6.0待用。称取0.23g甘氨酸装于50ml的三角瓶，加入0.3g的氯化钠，加入7.3ml的纯化水使其溶解，然后加入7.5ml含量为6.0g门冬胰岛素样品，然后加入30ul的水饱和苯酚，调节pH值为6.5，最后加入160ul浓度为0.355M的乙酸锌溶液使结晶开始，将其放在摇床上转速105转/分钟，15℃结晶4小时，将其降温至4℃静置，继续结晶16小时。然后取少量混悬液进行镜检，放大160倍，可见晶体的形状和均一性相对较差，如图5所示。

实施例6

制备重组门冬胰岛素结晶液，各组分和浓度为：甘氨酸：0.8M，重组门冬胰岛素：4.0g/L，乙腈：体积分数含量为12.5％，苯酚：体积分数含量为0.3％，乙酸锌：门冬胰岛素的含量摩尔比为8:1，氯化钠：0.3M。

制备浓度为8.0g/L重组门冬胰岛素溶液，其中乙腈体积分数含量为25%，调节pH值为6.0待用。称取0.90g甘氨酸装于50ml的三角瓶，加入0.27g的氯化钠，加入7.3ml的纯化水使其溶解，然后加入7.5ml含量为8.0g门冬胰岛素样品，然后加入45ul的水饱和苯酚，调节pH值为6.2，最后加入232ul浓度为0.355M的乙酸锌溶液使结晶开始，将其放在摇床上转速105转/分钟，25℃结晶4小时，将其降温至4℃静置，继续结晶16小时。然后取少量混悬液进行镜检，放大160倍，可见均一性非常好，晶体的形状非常规则，如图6所示。

实施例7

制备重组门冬胰岛素结晶液，各组分及浓度分别为：重组门冬胰岛素：3.5g/L，乙酸锌：门冬胰岛素的摩尔比为5:1，甘氨酸：0.5M，乙腈：体积分数含量为13％，苯酚：体积分数含量为0.2％，氯化钠：0.34M（20g/L)。

量取含量为9.35g/L的门冬胰岛素纯化收集液16.1L（门冬胰岛素总质量为150.5g），纯化收集液中乙腈体积分数含量为25%，为了达到体积分数含量为13%的终浓度再补加100％乙腈1.57L，接下来依次加入甘氨酸1.61kg，氯化钠860g，水饱和苯酚溶液86ml，加水至体积42L。将上述溶液的初始温度调到23±2℃，用浓氨水调节pH至6.20，搅拌10分钟，再加入0.355M的醋酸锌溶液364ml，加稀盐酸调节pH至5.87使最终体积为43L。然后搅拌5小时，使形成的晶核稳定后，降温至5±2℃静置18小时。取上清液进行HPLC检测，上清液中重组门冬胰岛素的含量已低至0.10mg/ml，符合要求。取少量悬浮液进行镜检，放大64倍可见大量均一、规则的单斜晶体（见图7）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，其特征在于该方法包括：在含0.2～1.5M甘氨酸体系下，从含有重组门冬胰岛素、锌离子、酚类物质、盐及有机溶剂的结晶液中，在pH6.0～6.5的条件下使重组门冬胰岛素结晶。

2.根据权利要求1所述的制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，其特征在于由以下步骤实现：在10～30℃条件下，配制含0.2～1.5M甘氨酸，3.0～10.0g/L重组门冬胰岛素，体积分数含量为10～30％的有机溶剂，体积分数含量为0.2～0.4%的酚类物质、0.2～0.5M盐的结晶液，并调节结晶液pH值至6.0～6.5，加入锌离子，结晶3～6小时，然后降温至2～8℃静置12～18小时，获得稳定的门冬胰岛素结晶；其中所述的锌离子的含量为锌离子与门冬胰岛素的摩尔比为2～15:1。

3.根据权利要求1所述的制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，其特征在于：所述的重组门冬胰岛素为干燥/冻干固体粉末样品或纯化收集的液体样品中的一种。

4.根据权利要求1所述的制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，其特征在于：所述的酚类物质为苯酚、间甲苯酚、邻甲苯酚、对甲苯酚、间苯二酚或对羟基苯甲酸甲脂中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，其特征在于：所述有机溶剂为乙腈、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种。

6.根据权利要求1所述的制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，其特征在于：所述的pH值使用氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸或乙酸中的一种进行调节。

7.根据权利要求1所述的制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，其特征在于：所述的盐为氯化钠、氯化钙、氯化铵、氯化钾、氯化镁、溴化钾、碘化钾或硫氰酸钾中的一种。

8.根据权利要求1所述的制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，其特征在于：所述的锌离子是以锌盐的形式加入的；所述的锌盐为乙酸锌、氯化锌、溴化锌、碘化锌或硫酸锌中的一种。

9.根据权利要求2所述的制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法，其特征在于：所述的结晶的过程应用搅拌或不进行搅拌使晶体生成。