CN114933647B - 一种胰岛素结晶的制备方法及产品 - Google Patents
一种胰岛素结晶的制备方法及产品 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114933647B CN114933647B CN202210627553.4A CN202210627553A CN114933647B CN 114933647 B CN114933647 B CN 114933647B CN 202210627553 A CN202210627553 A CN 202210627553A CN 114933647 B CN114933647 B CN 114933647B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- insulin
- liquid
- crystallization
- crystal
- organic solvent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 317
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 159
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 159
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 158
- 239000013078 crystal Substances 0.000 title claims abstract description 124
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 114
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 42
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 26
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 98
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 97
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 36
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 28
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 claims description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 claims description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000007785 strong electrolyte Substances 0.000 claims description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 108700002369 insulin icodec Proteins 0.000 abstract description 28
- 229940067574 insulin icodec Drugs 0.000 abstract description 28
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000011549 crystallization solution Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002560 Polyethylene Glycol 3000 Polymers 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101000852815 Homo sapiens Insulin receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010073961 Insulin Aspart Proteins 0.000 description 1
- 108010057186 Insulin Glargine Proteins 0.000 description 1
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Insulin glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 description 1
- 229940100066 Long-acting insulin Drugs 0.000 description 1
- NDOKLORZSUQYOY-UHFFFAOYSA-K [Na+].[Na+].[Na+].CC#N.[O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].CC#N.[O-]P([O-])([O-])=O NDOKLORZSUQYOY-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- XIYCTZQLUYWRCP-UHFFFAOYSA-N acetic acid;propan-2-ol;hydrate Chemical compound O.CC(C)O.CC(O)=O XIYCTZQLUYWRCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000667 effect on insulin Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000047882 human INSR Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126904 hypoglycaemic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 229960002869 insulin glargine Drugs 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N novorapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- YGSFNCRAZOCNDJ-UHFFFAOYSA-N propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CC(C)=O YGSFNCRAZOCNDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种胰岛素结晶生成液，所述胰岛素结晶生成液至少包括：胰岛素，聚半乳糖醛酸，精氨酸，有机溶剂，锌离子，酚类，盐类，水；所述有机溶剂包括有机溶剂1和有机溶剂2。本发明将胰岛素制备成形态规则的晶体，制备工艺简单，回收率高，易于产业化放大。本发明制备的胰岛素晶体形态规则、颗粒均匀，与无定形态相比，具有较高的理化稳定性以及生物活性，在稳定性上优于不定形粉末状同种胰岛素。本发明尤其适用于Insulin Icodec。
Description
技术领域
本发明涉及于生物医药技术领域，特别是涉及一种胰岛素结晶的制备方法及产品。
背景技术
糖尿病是一种慢性代谢类疾病，主要由先天遗传因素或环境因素引起，其发病机制多为人体胰岛β细胞功能缺陷导致胰岛素分泌不足，或机体出现胰岛素抵抗等。据2021年IDF《糖尿病地图集第十版》数据，糖尿病已经成为重大的全球挑战。2021年全球约5.37亿成年人患糖尿病，约占成年人(20-79周岁)人数的十分之一。
糖尿病分为I型和II型，前者是由于胰岛β细胞受损，导致胰岛素绝对缺乏，主要治疗手段是使用胰岛素泵或注射胰岛素，尚无其他方案，后者表现为不同程度的胰岛素分泌不足，或胰岛素抵抗，主要采用口服各类降糖药或者注射降糖肽，如胰岛素类似物、胰高血糖素样肽类似物等等。
胰岛素属于生物大分子，其具有特定的高级结构以维持生理活性，一直以来，如何维持胰岛素的体外活性是胰岛素类产品开发的难点，而晶体结构的存在对胰岛素类分子的稳定性是有益的。与其它小分子物质一样，胰岛素晶体是按分子单元特定的排列顺序堆积形成一个独特的空间，主要在外观上表现为具有规则的几何形状的固体物质，与无定形态相比，蛋白质晶体具有较高的理化稳定性以及生物活性(Insulin structure andstability.Pharm Biotechnol.1993；5:315-50.)。
目前市面上除了少部分长效的GLP-1激动剂为周制剂，如杜拉鲁肽、司美格鲁肽，其余大部分的降糖肽特别是胰岛素类，几乎都需要每天注射一次或多次，因此需要一种长效的、安全的、一周甚至一月给药一次的胰岛素。
例如，超长效胰岛素Insulin Icodec(也可称为Icodec)。其临床Ⅱ期数据显示，经皮下注射一次可控制患者一周内的血糖。Insulin Icodec由诺和诺德公司开发，目前已经进入临床Ⅲ期，主要用于治疗Ⅱ型糖尿病。Insulin Icodec从两个方向设计延长其半衰期：其一通过超长的脂肪酸链修饰增强与白蛋白的结合力，其二突变非保守区氨基酸降低与人胰岛素受体亲和力。同时侧链引进的亲水基团使其水溶性增加，因此可以制备为高浓度(700单位每毫升)的胰岛素注射液，注射一次就能满足一周的胰岛素需求。
目前关于胰岛素结晶的报道较多：CN105753966A公开了一种人胰岛素结晶方法，CN103342746B报道了一种门冬胰岛素晶体的制备方法，CN106117345B报道了一种甘精胰岛素晶体的制备方法，CN104761632A公开了一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用，CN104892749B报道了一种德谷胰岛素的结晶方法。但是，高溶解性和较长的脂肪酸侧链的胰岛素(大于C16)结晶难度更大，目前尚未存在Insulin Icodec的胰岛素结晶的制备方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种胰岛素结晶的制备方法及产品。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种胰岛素结晶生成液，其特征在于，所述胰岛素结晶生成液至少包括：胰岛素，聚半乳糖醛酸，精氨酸，有机溶剂，锌离子，酚类，盐类，水；所述有机溶剂包括有机溶剂1和有机溶剂2，所述胰岛素为InsulinIcodec。
本发明第二方面提供一种胰岛素结晶的制备方法，所述方法至少包括如下步骤：
将前述的胰岛素结晶生成液进行干燥，析出晶体，获得胰岛素结晶。
本发明第三方面提供一种胰岛素晶体，采用前述的胰岛素结晶的制备方法获得。
如上所述，本发明的一种胰岛素结晶的制备方法及产品，具有以下有益效果：
(1)本发明将胰岛素制备成形态规则的晶体，制备工艺简单，回收率高，易于产业化放大。(2)本发明制备的胰岛素晶体形态规则、颗粒均匀，与无定形态相比，具有较高的理化稳定性以及生物活性，在稳定性上优于不定形粉末状同种胰岛素。
(3)本发明尤其适用于高溶解性和较长的脂肪酸侧链的胰岛素的结晶。例如Insulin Icodec。
附图说明
图1：Insulin Icodec结构示意图。
图2：实施例1结晶显微观察，400倍放大。
图3：实施例2胰岛素结晶生成液A、胰岛素结晶生成液B、胰岛素结晶生成液C显微观察，400倍放大。
图4：实施例3胰岛素结晶生成液D、胰岛素结晶生成液E、胰岛素结晶生成液F显微观察，400倍放大。
图5：实施例4胰岛素结晶生成液G、胰岛素结晶生成液H显微观察，200倍放大。
图6：实施例5胰岛素结晶生成液显微观察，200倍放大。
图7：实施例6胰岛素结晶生成液显微观察200倍放大。
图8：实施例7胰岛素结晶生成液显微观察400倍放大。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域的常规技术。
本发明人经过大量创造性实验发现一种新的胰岛素的结晶方法。该方法制备的胰岛素晶体形态规则、颗粒均匀，与无定形态相比，具有较高的理化稳定性以及生物活性，且结晶回收率高，具有工业化放大生产的潜力。适用于Insulin Icodec这类溶解性高、脂肪酸侧链长的胰岛素的结晶。
本发明一实施例的胰岛素结晶生成液，至少包括：胰岛素，聚半乳糖醛酸，精氨酸，有机溶剂，锌离子，酚类，盐类，水；所述有机溶剂包括有机溶剂1和有机溶剂2，所述胰岛素为Insulin Icodec，所述胰岛素为Insulin Icodec。
在一种实施方式中，以所述胰岛素结晶生成液的总量为基准计，所述胰岛素结晶生成液各组分含量为：
聚半乳糖醛酸为长链多糖，对于所述结晶是必需的。聚半乳糖醛酸不仅可以促进晶体产生，还能够显著提高晶体的均一性。本发明通过实验对比了聚半乳糖醛酸、乳糖等多糖及PEG3000对于Insulin Icodec结晶的作用。结果表明，聚半乳糖醛酸促进结晶效果最优。进一步的聚半乳糖醛酸浓度实验表明，浓度过高会导致体系黏度增加，过低则无促进作用，因此优选0.01～0.5％(w/v)。
(w/v)是指质量体积比。使用单位为g和mL之比。M为mol/L。
所述的精氨酸对结晶是比较重要的，可明显提升结晶成功率。由于精氨酸的浓度过高会导致体系浑浊，因此精氨酸浓度选择0.05-0.2M。
所述的有机溶剂，对于胰岛素结晶具有促进作用。显然有机溶剂的助溶效果是在一定的浓度实现，考虑到目标胰岛素具有超长的疏水碳链及亲水的PEG片段，本发明选择在11～28％总有机溶剂中结晶。有机溶剂1为有机溶剂为任何本领域技术人员所公知的易溶于水的有机溶剂，如乙腈、乙醇、正丙醇、异丙醇、2-甲基-2,4-戊二醇等，其中优选的有机溶剂为乙腈。有机溶液2为丙酮。以所述胰岛素结晶生成液的总量为基准计，所述有机溶剂1的体积分数优选为10～20％；所述有机溶剂2的体积分数为1～8％，优选为4～6％。本发明发现有机溶剂2对于降低结晶损失率有显著作用。所述的结晶损失率是指结晶上清中Icodec总量与结晶总Icodec的百分比。
在一种实施方式中，所述酚类物质选自苯酚、间苯二酚、间甲酚或对羟基苯甲酸；优选苯酚。
可选的，所述锌离子选自乙酸锌或氯化锌中的锌离子，优选乙酸锌中的锌离子。
锌离子和酚类物质对胰岛素形成不同的晶体构型具有重要作用。本发明通过实验发现锌离子在1:0.67～5，优选1:1(胰岛素与锌离子摩尔比)。酚类物质质量体积比在0.1～0.5％；优选0.2～0.3％；结晶率较高。
在一种实施方式中，所述盐类为易溶于水的强电解质盐；优选的，选自氯化钠、醋酸钠、醋酸铵、硫酸铵、硫酸钠或硝酸钠，更优选的，为氯化钠。
优选的，所述盐类的浓度为1.0～1.5M。
所述胰岛素为脂肪酸侧链长度大于C16的胰岛素。
同诺和诺德公司中国专利CN102037008B实施例33所公开的物质。其结构详见附图1，为干燥/冻干的无定型固体粉末。本发明的实施例中所使用的Insulin Icodec购自上海博唯生物科技有限公司。
在一种实施方式中，所述以所述胰岛素结晶生成液的总量为基准计，所述胰岛素的浓度为为1-6g/L；优选地为2～5g/L。
所述胰岛素结晶生成液的pH值为6.5～8.0。优选的，为7.0～7.6。所述pH不仅是形成结晶的关键工艺参数之一，而且对于晶型及晶体大小均有显著影响。基于不同结晶pH研究，本发明选择结晶pH6.5～8.0，优选pH7.0～7.6。所述的pH值控制是指用酸或碱调节，本发明优选醋酸和氨水进行pH控制。
在一种实施方式中，所述胰岛素结晶生成液中还包括缓冲液；优选的，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、硼酸缓冲液或Tris-甘氨酸缓冲液；有优选的，所述缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液。例如，20mM Tris，0.1M甘氨酸pH8～9。
本发明一实施例提供一种胰岛素结晶的制备方法，所述方法至少包括如下步骤：
将前述的胰岛素结晶生成液进行干燥，析出晶体，获得胰岛素结晶。
优选的，所述干燥方式为减压真空干燥。减压真空干燥是本发明结晶工艺中较为关键的工艺之一。减压真空是为了降低有机成分及水分，促进胰岛素晶种产生。真空干燥后，于4～8℃静置，有利于结晶生长。
室温下进行减压真空干燥1～5h。密封后于2～8℃静置结晶12-36h，获得稳定的Icodec结晶。
在一种实施方式中，可以利用真空干燥设备进行减压真空干燥。能够产生真空度的设备均可，例如旋转蒸发仪、真空干燥箱和结晶反应釜等。
在一种实施方式中，所述胰岛素结晶生成液的制备方法至少包括如下步骤：
(1)配制结晶液1：将胰岛素，盐类；酚类物质和部分有机溶液1混合溶解；
(2)配制结晶液2：将聚半乳糖醛酸、水和精氨酸混合溶解；
(3)配制结晶液3：将剩余部分有机溶剂1和有机溶剂2混合；
(4)将结晶液2加入到结晶液1中；再将结晶液3加入结晶液1中，调节pH值，加入锌离子，获得胰岛素结晶生成液。
可选的，步骤(1)中，所述胰岛素为胰岛素干粉，所述胰岛素干粉采用缓冲液进行溶解；
可选的，胰岛素结晶生成液的终体积为基准计，步骤(1)中，所述部分有机溶液1的体积分数为5～10％。
可选的，胰岛素结晶生成液的终体积为基准计，步骤(3)中，所述剩余部分有机溶液1的体积分数为5～10％。
可选的，所述结晶液1、结晶液2、结晶液3的pH值为6.5～8.0。优选的，为7.0～8.0、更优选的，为7.0-7.6。
可选的，步骤(4)所述的将结晶液2和3依次加入结晶液1，是指搅拌状态下将结晶液2缓慢加入到结晶液1中，搅拌3～5min后，再将结晶液3缓慢加入结晶液1，调pH，补入锌离子后于37℃，100rpm搅拌10min～60min。
一种胰岛素晶体，采用前述的胰岛素结晶的制备方法获得。
如未特别说明，本发明实施例中所述的浓度均以胰岛素结晶生成液的总量为基准计算。
实施例1
结晶配方：聚半乳糖醛酸0.05％，Insulin Icodec 3g/L，精氨酸0.1M、氯化钠1.0M，有机溶液1占16％，有机溶液2占4％。酚类物质质量体积比0.3％(结晶终浓度)，控制pH7.5，锌离子按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:1补入。
配制结晶液1：取胰岛素干粉1.8g，用Tris甘氨酸缓冲(20mM Tris,0.1M甘氨酸pH8.0)溶解至6g/L，补入氯化钠35.1g，补入2-甲基-2,4-戊二醇48mL，加入苯酚1.8g于室温搅拌至完全溶解。
配制结晶液2：称取精氨酸10.44g，用150mL水完全溶解，再缓慢加入聚半乳糖醛酸0.3g至完全溶解。
配制结晶液3：量取2-甲基-2,4-戊二醇48mL，量取丙酮24mL，两者混匀。
先将结晶液2缓慢加入结晶液1，搅拌混匀后，再将结晶液3缓慢加入结晶1，调pH7.5，定容至600mL。最后按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:1补入锌离子，于37℃，100rpm搅拌20min，获得胰岛素结晶生成液。用真空干燥箱室温下减压真空干燥至胰岛素结晶生成液开始混浊，将胰岛素结晶生成液置于冰箱冷藏16h。取胰岛素结晶生成液显微观察，有大小约为20μm左右的立方体晶体产生，整体较为均一，上清通过高效液相色谱检测含量，计算整体回收率约为92％。镜检结果详见附图2。
实施例2
结晶配方：多糖0.01％，Insulin Icodec 2g/L，精氨酸0.2M、氯化钠1.2M，有机溶液1占20％，有机溶液2占1％。酚类物质质量体积比0.5％(结晶终浓度)，控制pH7.0，锌离子按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:0.67最后补入。
配制结晶液1：取胰岛素干粉1.2g，用Tris甘氨酸缓冲(20mM Tris,0.1M甘氨酸pH8.0)溶解至4g/L，补入氯化钠42.1g，补入乙腈60mL，加入苯酚3g于室温搅拌至完全溶解，平分成三组，编号1A、1B及1C。
配制结晶液2：称取精氨酸20.9g，用150mL水完全溶解后，平分成三组装于250mL三角瓶，分别编号为2A、2B及2C。向2A缓慢加入聚半乳糖醛酸0.06g，向2B缓慢加入PEG30000.06g，向2C缓慢加入0.06g乳糖至完全溶解。
配制结晶液3：量取乙腈60mL，量取丙酮6mL，两者混匀后均分三份。
先将结晶液2A、2B及2C分别加入到结晶液1A、1B及1C，搅拌混匀后，再缓慢分别加入有机溶剂，调pH7.0，定容至200mL。最后按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:0.67分别补入锌离子，于37℃，100rpm搅拌10min，分别获得胰岛素结晶生成液A、胰岛素结晶生成液B、胰岛素结晶生成液C。用真空干燥箱室温下减压真空干燥至胰岛素结晶生成液变浑浊，再将胰岛素结晶生成液置于冰箱冷藏24h。结果显示聚半乳糖醛酸对结晶有显著作用，而PEG3000和乳糖效果不明显，见下表。镜检结果详见附图3。
| 胰岛素结晶生成液 | 添加物 | 结晶效果 |
| A | 聚半乳糖醛酸 | 有晶体产生 |
| B | PEG3000 | 不定型颗粒 |
| C | 乳糖 | 不定型粉末 |
实施例3
结晶配方：聚半乳糖醛酸0.1％，Insulin Icodec 2g/L，碱性氨基酸0.2M、氯化钠1.8M，有机溶液1占10％，有机溶液2占8％。酚类物质质量体积比0.2％(结晶终浓度)，控制pH7.3，锌离子按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:2最后补入。
配制结晶液1：取胰岛素干粉1.2g，用Tris甘氨酸缓冲(20mM Tris,0.1M甘氨酸pH8.0)溶解至4g/L，补入氯化钠63.1g，补入乙腈30mL，加入苯酚1.2g于室温搅拌至完全溶解，平分成三组，编号1D、1E及1F。
配制结晶液2：称取聚半乳糖醛酸0.6g，用150mL水完全溶解后，平分成三组装于250mL三角瓶，编号为2D、2E及2F。分别称取精氨酸20.9g溶于2D，赖氨酸17.54g溶于2E，组氨酸18.6g溶于2F。
配制结晶液3：量取乙腈30mL，量取丙酮48mL，两者混匀后均分三份。
先将结晶液2D、2E及2F分别加入结晶液1D、1E及1F，搅拌混匀后，再缓慢加入结晶液3至1D、1E及1F，调pH7.3，定容至200mL。最后按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:2分别补入锌离子，于37℃，100rpm搅拌15min，分别获得胰岛素结晶生成液D、胰岛素结晶生成液E、胰岛素结晶生成液F。用真空干燥箱室温下减压真空干燥1h，再将结晶液置于4℃冷藏20h。
结果表明，添加精氨酸可以促进晶体产生。
| 胰岛素结晶生成液 | 添加物 | 结晶效果 |
| D | 精氨酸 | 晶体较大 |
| E | 赖氨酸 | 不定型粉末 |
| F | 组氨酸 | 有少量晶体产生 |
镜检结果详见附图4。
实施例4
结晶配方：聚半乳糖醛酸0.2％，Insulin Icodec 2g/L，精氨酸0.05M、硫酸钠0.8M，有机溶液1占16％，有机溶剂2占8％。酚类物质质量体积比0.3％(结晶终浓度)，控制pH7.6，锌离子按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:5最后补入。
配制结晶液1：取胰岛素干粉1g，用Tris甘氨酸缓冲(20mM Tris,0.1M甘氨酸pH8.0)溶解至5g/L，补入硫酸钠45.45g，补入异丙醇64mL，加入苯酚1.2g于室温搅拌至完全溶解。配制结晶液2：称取精氨酸3.48g用100mL水完全溶解后，补入聚半乳糖醛酸0.8g至完全溶解。
先将结晶液2加入至结晶液1中，搅拌混匀后，调pH7.6，再平分成两组，分别补入丙酮32mL，纯化水32mL，分别定容至200mL。最后按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:5分别补入锌离子，于室温搅拌15min，获得胰岛素结晶生成液G、胰岛素结晶生成液H。用真空干燥箱减压真空干燥1h，再将胰岛素结晶生成液置于4℃冷藏16h。显微观察结晶情况，取上清计算损失率。
结果表明，添加丙酮可以降低上清胰岛素含量，G组损失率为5％，而H组损失率36％。
镜检结果显示，胰岛素结晶生成液G和胰岛素结晶生成液H均有晶体产生，详见附图5。
| 胰岛素结晶生成液 | 丙酮 | 结晶效果 | 损失率 |
| G | 8％ | 有晶体产生 | 5％ |
| H | 0 | 有晶体产生 | 36％ |
实施例5
结晶配方：聚半乳糖醛酸0.5％，Insulin Icodec 2g/L，精氨酸0.05M、氯化钠2.2M，有机溶液1占16％，有机溶剂2占6％。酚类物质质量体积比0.2％(结晶终浓度)，控制pH7.4，锌离子按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:3最后补入。
配制结晶液1：取胰岛素干粉1g，用Tris甘氨酸缓冲(20mM Tris,0.1M甘氨酸pH8.0)溶解至5g/L，补入氯化钠51.43g(终浓度2.2M)，补入乙腈32mL，加入苯酚0.8g于室温搅拌至完全溶解。配制结晶液2：称取精氨酸3.48g用100mL水完全溶解后，补入聚半乳糖醛酸2g完全溶解。
配制结晶液3：量取乙腈32mL，量取丙酮24mL，两者混匀后均分两份。
先将结晶液2加入至结晶液1中，搅拌混匀后，调pH7.4，再平分成两组。两组加入等量有机溶剂，再分别定容至200mL。最后按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:3分别补入锌离子。分别获得胰岛素结晶生成液I、胰岛素结晶生成液J。其中胰岛素结晶生成液I于室温搅拌至混浊，再置于4℃冷藏16h。胰岛素结晶生成液J于室温搅拌10分钟后，用真空干燥箱减压真空干燥至溶液混浊，再将胰岛素结晶生成液J置于4℃冷藏16h。
结果表明，真空减压干燥可以缩短结晶时间，且晶体颗粒较大。胰岛素结晶生成液I在室温搅拌8h左右，出现混浊有晶体产生。镜检结果详见附图6。
| 胰岛素结晶生成液 | 变浑浊时间 | 结晶效果 |
| I | 8h | 有晶体产生 |
| J | 小于1h | 有晶体产生 |
实施例6
分别采用以下结晶配方，利用实施例1所述的方法，配置胰岛素结晶生成液，室温下减压真空干燥至胰岛素结晶生成液开始混浊，将胰岛素结晶生成液置于冰箱冷藏16h。取胰岛素结晶生成液显微观察，有大小约为10μm左右的立方体晶体产生，上清通过高效液相色谱检测含量，整体回收率较高。
结晶配方1：聚半乳糖醛酸0.4％，Insulin Icodec 1g/L，精氨酸0.1M、氯化钠1.0M，有机溶液1占10％，有机溶液2占1％。酚类物质质量体积比0.1％(结晶终浓度)，控制pH6.5，锌离子按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:1补入。结晶结果详见附图7K。
结晶配方2：聚半乳糖醛酸0.5％，Insulin Icodec 6g/L，精氨酸0.2M、氯化钠2.2M，有机溶液1占20％，有机溶液2占8％。酚类物质质量体积比0.5％(结晶终浓度)，控制pH8.0，锌离子按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:1补入。结晶结果详见附图7L。
实施例7
结晶配方：聚半乳糖醛酸0.4％，Insulin Icodec 2g/L，精氨酸0.1M、氯化钠1.0M，有机溶液1占14％，有机溶液2占6％。酚类物质质量体积比0.3％(结晶终浓度)，控制pH7.4，锌离子按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:1最后补入。
配制结晶液1：取胰岛素干粉400g，用Tris甘氨酸缓冲(20mM Tris,0.1M甘氨酸pH8.0)溶解至4g/L，补入氯化钠11690g，补入乙醇14LmL，加入苯酚600g于室温搅拌至完全溶解。
配制结晶液2：称取精氨酸3480g，用50LmL水完全溶解，再缓慢加入聚半乳糖醛酸800g至完全溶解。
配制结晶液3：量取乙醇14LmL，量取丙酮12LmL，两者混匀。
将结晶液1倒入结晶罐中，再将结晶液2缓慢加入结晶液1，100rpm室温搅拌混匀后，再将结晶液3缓慢加入结晶1，调pH7.5，定容至200L。最后按Insulin Icodec与锌离子摩尔比1:1补入锌离子，于室温，100rpm搅拌20min。室温下抽真空至0.5Bar直至胰岛素结晶生成液开始混浊，停止搅拌并将温度控制在8-10℃冷藏24h。取胰岛素结晶生成液显微观察，有大小约为15μm左右的立方体晶体产生，上清通过高效液相检测含量,计算整体回收率为84％。镜检结果详见附图8。
实施例8
将实施例7制备的晶体Icodec和不定形Icodec分别避光置于稳定性培养箱，37℃孵化12周，使用高效液相色谱法(HPLC)分别测定0周、4周、8周和12周的总杂和高分子蛋白(HMWP)。
总杂检测方法：色谱柱Kromasil C8柱或其他等效柱，流动相A:磷酸钠乙腈缓冲液，pH5.7，流动相B是50％乙腈水溶液，检测波长215nm。
HMWP的检测方法：色谱柱Waters Insulin HWMP凝胶柱或其他等效柱，流动相为冰醋酸-异丙醇-水溶液，检测波长276nm。
检测结果见下表。总杂上，晶体Icodec每周增加约0.04％，不定形Icodec每周增加0.22％。高分子蛋白上，晶体Icodec每周增加约0.04％，不定形Icodec每周增加0.14％。在稳定性上，晶体Icodec优于不定形Icodec。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (14)
1.一种胰岛素结晶生成液，其特征在于，所述胰岛素结晶生成液至少包括：胰岛素，聚半乳糖醛酸，精氨酸，有机溶剂，锌离子，酚类，盐类，水；所述有机溶剂包括有机溶剂1和有机溶剂2，所述胰岛素为Insulin Icodec，以所述胰岛素结晶生成液的总量为基准计，所述胰岛素结晶生成液中各组分含量为：聚半乳糖醛酸的质量体积比为0.01％-0.5％，精氨酸0.05-0.2M，有机溶剂体积分数为11～28％，胰岛素与锌离子的摩尔比为1:0.67～5，酚类物质的质量体积比为0.1～0.5％，所述有机溶剂1选自与水能够混溶的有机溶剂；所述有机溶剂2选自丙酮。
2.如权利要求1所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，以所述胰岛素结晶生成液的总量为基准计，所述胰岛素结晶生成液各组分含量为：
盐类0.8～2.2M；
余量为水。
3.如权利要求1所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
a.以所述胰岛素结晶生成液的总量为基准计，所述有机溶剂1的体积分数为10～20％；所述有机溶剂2的体积分数为1～8％；
b.所述有机溶剂1选自乙腈、乙醇、正丙醇、异丙醇或2-甲基-2,4-戊二醇。
4.如权利要求1所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
a.以所述胰岛素结晶生成液的总量为基准计，所述有机溶剂2的体积分数为4～6％；
b.所述有机溶剂1为乙腈。
5.如权利要求1所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述酚类物质选自苯酚、间苯二酚、间甲酚或对羟基苯甲酸；
b.所述盐类为强电解质盐；
c.所述锌离子选自乙酸锌或氯化锌中的锌离子；
d.所述胰岛素结晶生成液的pH值为6.5～8.0。
6.如权利要求1所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述酚类物质选自苯酚；
b.所述盐类选自氯化钠、醋酸钠、醋酸铵、硫酸铵、硫酸钠或硝酸钠；
c.所述锌离子选自乙酸锌中的锌离子；
d.所述胰岛素结晶生成液的pH值为7.0～7.6。
7.如权利要求2所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：以所述胰岛素结晶生成液的总量为基准计，
a.所述胰岛素的浓度为1-6g/L；
b.所述盐类的浓度为1.0～1.5M。
8.如权利要求2所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，以所述胰岛素结晶生成液的总量为基准计，所述胰岛素的浓度为2～5g/L。
9.如权利要求1所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，所述胰岛素结晶生成液中还包括缓冲液。
10.如权利要求9所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、硼酸缓冲液或Tris-甘氨酸缓冲液。
11.如权利要求9所述的所述胰岛素结晶生成液，其特征在于，所述缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液。
12.一种胰岛素结晶的制备方法，所述方法至少包括如下步骤：
将权利要求1-11任一所述的胰岛素结晶生成液进行干燥，析出晶体，获得胰岛素结晶。
13.如权利要求12所述的胰岛素结晶的制备方法，其特征在于，所述干燥方式为减压真空干燥。
14.如权利要求12所述的胰岛素结晶的制备方法，其特征在于，所述胰岛素结晶生成液的制备方法至少包括如下步骤：
(1)配制结晶液1：将胰岛素，盐类；酚类物质和部分有机溶液1混合溶解；
(2)配制结晶液2：将聚半乳糖醛酸、水和精氨酸混合溶解；
(3)配制结晶液3：将剩余部分有机溶剂1和有机溶剂2混合；
(4)将结晶液2加入到结晶液1中；再将结晶液3加入结晶液1中，加入锌离子，获得胰岛素结晶生成液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210627553.4A CN114933647B (zh) | 2022-06-01 | 2022-06-01 | 一种胰岛素结晶的制备方法及产品 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210627553.4A CN114933647B (zh) | 2022-06-01 | 2022-06-01 | 一种胰岛素结晶的制备方法及产品 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114933647A CN114933647A (zh) | 2022-08-23 |
| CN114933647B true CN114933647B (zh) | 2023-06-06 |
Family
ID=82866492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210627553.4A Active CN114933647B (zh) | 2022-06-01 | 2022-06-01 | 一种胰岛素结晶的制备方法及产品 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114933647B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003290412A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-21 | Council Of Scientific And Industrial Research | Arginine hydrochloride enhances chaperone-like activity of alpha crystallin |
| WO2008065138A1 (en) * | 2006-11-29 | 2008-06-05 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin crystal and method for preparing the crystal |
| CN104193819A (zh) * | 2014-09-03 | 2014-12-10 | 韩飞 | 胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法 |
| CN104892749A (zh) * | 2015-06-16 | 2015-09-09 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种德谷胰岛素结晶的制备方法及应用 |
| CN105753966A (zh) * | 2016-05-05 | 2016-07-13 | 通化东宝药业股份有限公司 | 一种重组人胰岛素结晶的制备方法 |
| CN113896784A (zh) * | 2021-10-18 | 2022-01-07 | 合肥天麦生物科技发展有限公司 | 一种胰岛素结晶的制备方法及其产品 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102219851B (zh) * | 2011-05-09 | 2012-05-30 | 甘李药业有限公司 | 甘精胰岛素结晶的制备方法 |
| CN103342746B (zh) * | 2013-07-26 | 2014-07-30 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法 |
| CN104761632A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-07-08 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用 |
| CN106117345B (zh) * | 2015-05-05 | 2020-11-24 | 宜昌东阳光长江药业股份有限公司 | 一种制备甘精胰岛素结晶的方法 |
| CN114354815A (zh) * | 2022-01-18 | 2022-04-15 | 重庆宸安生物制药有限公司 | 一种重组胰岛素原料药中乙醇、乙腈残留量的测定方法 |
-
2022
- 2022-06-01 CN CN202210627553.4A patent/CN114933647B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003290412A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-21 | Council Of Scientific And Industrial Research | Arginine hydrochloride enhances chaperone-like activity of alpha crystallin |
| WO2008065138A1 (en) * | 2006-11-29 | 2008-06-05 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin crystal and method for preparing the crystal |
| CN104193819A (zh) * | 2014-09-03 | 2014-12-10 | 韩飞 | 胰岛素二聚体晶体的合成和保存方法 |
| CN104892749A (zh) * | 2015-06-16 | 2015-09-09 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种德谷胰岛素结晶的制备方法及应用 |
| CN105753966A (zh) * | 2016-05-05 | 2016-07-13 | 通化东宝药业股份有限公司 | 一种重组人胰岛素结晶的制备方法 |
| CN113896784A (zh) * | 2021-10-18 | 2022-01-07 | 合肥天麦生物科技发展有限公司 | 一种胰岛素结晶的制备方法及其产品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114933647A (zh) | 2022-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102219851B (zh) | 甘精胰岛素结晶的制备方法 | |
| RU2108341C1 (ru) | Способ получения кристаллов гр или производных гр, кристаллы человеческих гр или производных человеческих гр и фармацевтический препарат | |
| CN103342746B (zh) | 一种制备稳定的门冬胰岛素结晶的方法 | |
| RU2005124280A (ru) | Кристаллы человеческого гормона роста и способы их получения | |
| CN104892749B (zh) | 一种德谷胰岛素结晶的制备方法及应用 | |
| EP4206220B1 (en) | Novel proinsulin glargine and method for preparing insulin glargine therefrom | |
| CN104761632A (zh) | 一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用 | |
| CN114933647B (zh) | 一种胰岛素结晶的制备方法及产品 | |
| CN104688678B (zh) | 一种甘精胰岛素注射液的制备方法及其制备的甘精胰岛素注射液 | |
| US5453417A (en) | Process for the phosphorylation of insulin and product produced thereby | |
| US5780599A (en) | Growth hormone crystals and a process for production of growth hormone crystals | |
| CN117624335A (zh) | 一种门冬胰岛素晶体的制备方法 | |
| CN108187060B (zh) | 药物载体、药物制剂及制备方法 | |
| CN105585628A (zh) | 一种甘精胰岛素的制备方法及其制备的甘精胰岛素 | |
| CN113637708B (zh) | 一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用 | |
| CN106749616B (zh) | B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法 | |
| CN113896784A (zh) | 一种胰岛素结晶的制备方法及其产品 | |
| US20220064213A1 (en) | Preparative crystallization of recombinant human insulin | |
| CN105753962B (zh) | 一种胸腺法新晶体及其药物组合物 | |
| CN105597087B (zh) | 一种甘精胰岛素注射液及其制备方法 | |
| CN104189007B (zh) | 天然复合氨基酸原料的制备方法 | |
| CN113384529B (zh) | 一种门冬胰岛素注射液及其制备方法 | |
| CN1732980A (zh) | 微量元素冻干制剂及其制备方法 | |
| WO2020009595A1 (en) | A crystalline form of insulin glargine with a stoichiometric content of zinc and the method of its preparation | |
| CN115505035A (zh) | 一种司美格鲁肽中间体多肽的纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |