CN105585628A - 一种甘精胰岛素的制备方法及其制备的甘精胰岛素 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种甘精胰岛素的制备方法及其制备的甘精胰岛素。所述方法以甘精胰岛素溶液为原料，包括先将甘精胰岛素溶液、有机酸、酚衍生物、锌盐和水混合，配制得到结晶液，调pH至3～4，25～35℃下保温1～8小时，然后调pH至7.0～8.0，降低温度至2～8℃，静置3～5小时，离心，分离固体和上清液。与现有技术比较，本发明所述的制备方法生产效率和产品质量更高，从而可以更好地保证患者长期用药的安全。

Description

一种甘精胰岛素的制备方法及其制备的甘精胰岛素

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人胰岛素类似物——甘精胰岛素的制备方法及其制备的甘精胰岛素。

背景技术

甘精胰岛素是将人胰岛素A链上天然排列在第21位的天门冬酞胺(Asn)置换为甘氨酸(Gly)，在B链30位的苏氮酸(Thr)上添加2个精氨酸(Arg)而合成的人胰岛索类似物，用于成人和儿童I型糖尿病以及成人II型糖尿病。其经皮下注射后,分子会立即聚合,并在皮下形成稳定的六聚体，增加分子间的结合力，延缓溶解和吸收的时间，持续释放少量甘精胰岛素，从而具有可预见的、有长效作用的、平稳、无峰值的血药浓度/时间特性。甘精胰岛素因其长效特性，患者仅需要每天一次在固定的时间皮下注射给药，因此用药方便，患者依从性好。

甘精胰岛素都是以固体形式进行商品流通和用于制剂生产。而甘精胰岛素的生产通常以基因工程大肠杆菌为表达载体，通过大规模发酵及后续一系列纯化处理和超滤浓缩，获得高纯度甘精胰岛素溶液。由于溶液体积大，直接冷冻干燥耗时长、耗能高。如果用适当的方法使甘精胰岛素以固态形式从溶液中沉降出来，分离后的固态甘精胰岛素就可以方便地进行冷冻干燥，从而解决大体积溶液冷冻干燥带来的耗时长、耗能高、对设备要求高、操作不便等问题；同时，上述过程还可以进一步提高甘精胰岛素的纯度。因此，现有技术中出现了如何从甘精胰岛素溶液中获得甘精胰岛素的研究。甘精胰岛素在其B链末端多两个碱性氨基酸(ArgB31-ArgB32)，导致其等电点较天然人胰岛素及其它的人胰岛素类似物(如赖脯胰岛素)高。针对甘精胰岛素上述特点，公开号CN102219851A(公开日2011年10月19日)、名称为“甘精胰岛素结晶的制备方法”的中国发明专利申请，披露了一种制备甘精胰岛素结晶的方法，包括，从含有重组甘精胰岛素、有机溶剂、锌、酚衍生物、盐以及有机酸的结晶液中，在pH7.0-9.0的条件下使重组甘精胰岛素结晶，其中所述有机溶剂的浓度为10-30％(体积/体积)，选自乙醇、乙腈、正丙醇或异丙醇。该发明专利申请的实施例1记载的制备重组甘精胰岛素结晶液中所包含的组分和浓度为：重组甘精胰岛素：3.5g/L，乙腈：20％，乙酸：0.7M，苯酚：0.4％，氯化锌：120mg/L，乙酸钠：0.5M。结晶完成后的上清液中重组甘精胰岛素的含量为0.05mg/ml。上述现有技术使用了大量乙腈、乙醇等有机溶剂，可能引起残留溶剂超标，增加后期晶体洗涤时的操作步骤。另外，对于规模达到吨级的工业化生产，进一步降低结晶上清液中甘精胰岛素的含量，以提高产率和降低成本，具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种甘精胰岛素的制备方法。该方法不使用有机溶剂，析晶后上清液中甘精胰岛素的含量降低至0.01～0.03mg/ml，从而提高了甘精胰岛素产率，获得的产品中杂质和溶剂残留少。另外，本发明的制备方法得到的甘精胰岛素沉降体积小易于与上清液分离，洗涤次数少。因此，本发明的制备方法更适合工业化生产。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种甘精胰岛素的制备方法，所述方法以甘精胰岛素溶液为原料，包括如下操作：先将甘精胰岛素溶液、有机酸、酚衍生物、锌盐和水混合，配制得到结晶液，调pH至3～4，25～35℃下保温1～8小时，然后调pH至7.0～8.0，降低温度至2～8℃，静置3～5小时，分离固体和上清液。

优选的，所述结晶液在25～35℃下保温1～6小时，更优选1～3小时，最优选1小时。

优选的，所述结晶液中，甘精胰岛素的浓度为1～4g/L，更优选为1.5～3.5g/L。

优选的，所述甘精胰岛素为重组甘精胰岛素，所述甘精胰岛素溶液为工程菌发酵产物经过一系列分离纯化得到的甘精胰岛素浓缩液，甘精胰岛素含量＞5g/L，纯度≥98％。

优选的，所述结晶液中，所述有机酸的浓度为0.4～0.8mol/L。

优选的，所述有机酸选自乙酸、柠檬酸或甘氨酸，更优选为乙酸。

更优选的，所述结晶液中，所述有机酸为乙酸，浓度为0.5～0.7mol/L。

优选的，所述结晶液中，所述酚衍生物的浓度为1～5g/L。

优选的，所述酚衍生物选自苯酚和间甲酚中的一种或两种；更优选为苯酚。

更优选的，所述结晶液中，所述酚衍生物是苯酚，浓度为1.5～3g/L。

优选的，所述结晶液中，所述锌盐的浓度为20～200mg/L，更优选为70～100mg/L。

优选的，所述锌盐选自氯化锌或氧化锌，更优选为氯化锌。

更优选的，所述结晶液中，所述锌盐为氯化锌，浓度为70～100mg/L。

优选的，上述制备方法，还包括用水洗涤得到的固体，冷冻干燥。

作为一个优选的实施方式，本发明提供一种重组甘精胰岛素的制备方法，包括如下步骤：

1)在室温下将计算量的重组甘精胰岛素溶液、乙酸、苯酚和氯化锌加入水中，使重组甘精胰岛素的浓度为1～4g/L，乙酸的浓度为0.4～0.8mol/L，苯酚的浓度为1～5g/L，氯化锌的浓度为20～200mg/L，得到结晶液；其中，所述重组甘精胰岛素溶液中重组甘精胰岛素的含量＞5g/L，纯度≥98％；

2)调节步骤1得到的所述结晶液pH值至3～4，置于25～35℃，保温搅拌1～3小时；

3)调节步骤2得到的结晶液pH值至7.0～8.0，将所述结晶液置于温度为2～8℃环境，静置3～5小时；

4)离心，分离固体和上清液，用水洗涤固体2次，每次洗涤用水为每克固体50ml～100ml；将固体冷冻干燥。

作为一个更优选的实施方式，本发明提供一种重组甘精胰岛素结晶的方法，包括如下步骤：

1)在室温下将计算量的重组甘精胰岛素溶液、乙酸、苯酚和氯化锌加入水中，使重组甘精胰岛素的浓度为1.5～3.5g/L，乙酸的浓度为0.5～0.7mol/L，苯酚的浓度为1.5～3g/L，氯化锌的浓度为70～100mg/L，得到结晶液；其中，所述重组甘精胰岛素溶液中重组甘精胰岛素的含量＞5g/L，纯度≥98％；

2)调节步骤1得到的结晶液pH值至3～4，置于25～35℃，保温搅拌1小时；

3)调节步骤2得到的结晶液pH值至7.0～8.0，将所述结晶液置于2～8℃环境，静置3～4小时；

4)离心，分离固体和上清液，用水洗涤固体2次，每次洗涤用水为每克固体50ml～100ml；将固体冷冻干燥。

本发明还有一个目的在于提供一种甘精胰岛素，所述甘精胰岛素通过上述制备方法制备得到。

本发明中，结晶液pH调节可以采用本领域常规的酸或碱的水溶液，如盐酸、氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。

本发明中，如无特殊说明，所述的水为纯化水、注射用水或去离子水等经过纯化处理的水。

本发明所述的甘精胰岛素结晶液中各组分的加入方式不影响发明效果，只要保证各组分在最终的结晶液中均完全溶解、混合均匀即可。

本发明所述制备方法，甘精胰岛素沉析完全后，离心、固体洗涤和冷冻干燥采用本领域常规方法即可。

公开号CN102219851A(公开日2011年10月19日)、名称为“甘精胰岛素结晶的制备方法”的中国发明专利申请披露的是如何对已经是固态的甘精胰岛素进行重结晶的方法。其具体公开了只有在甘精胰岛素结晶液中添加10～30％(体积/体积)的有机溶剂并使结晶液的pH始终保持在7.0以上(初始时pH＝8.0～9.0，结晶过程中pH＝7.0～8.0)，才能获得显微镜下呈六面体的甘精胰岛素结晶。不可避免的，该方法制备得到的甘精胰岛素结晶会带有残留的有机溶剂。

而本发明则需要解决如何将高纯度的甘精胰岛素溶液中的甘精胰岛素尽可能完全地沉降出来，得到高纯度、少杂质和残留的甘精胰岛素。显然，上述现有技术并不适于解决本发明的技术问题。

为此，发明人进行了大量试验摸索，发现如果结晶液中不添加有机溶剂，以温度(在CN102219851A的说明书中明确记载了温度是非关键性因素。)配合结晶液pH值的阶段性变化对实现本发明至关重要。具体的，需先将不含有机溶剂的结晶液pH调节到3～4，温度调节到25～35℃，保温1小时以上(1～8小时)；然后升高结晶液pH至7.0～8.0(甘精胰岛素的等电点以上)，将温度降低到2～8℃，静置3～5小时。采用此方法，令人意想不到的是上清液中甘精胰岛素的浓度低至0.01mg/ml。而公开号CN102219851A的现有技术中记载的结晶上清液中重组甘精胰岛素的浓度都未低于0.02mg/ml(实施例1为0.05mg/ml，实施例2为0.02mg/ml)。说明本发明所述的方法能够使甘精胰岛素沉析地更完全，从而提高生产率，降低成本。另外，通过本发明制备得到的甘精胰岛素沉降体积小，便于固液分离，操作便利，适合工业化生产。

与公开号CN102219851A的现有技术比较，本发明所述的方法，甘精胰岛素结晶液的组分不仅没有有机溶剂，也没有氯化钠等盐；因此，结晶液的组分更简单，带入固体中的杂质也更少。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和原料的来源情况如下：

重组甘精胰岛素溶液：自制，其中重组甘精胰岛素浓度为8g/L，纯度≥98％；

氯化锌：斯百全化学试剂有限公司，

苯酚：斯百全化学试剂有限公司，

乙酸：国药集团化学试剂有限公司

乙腈：国药集团化学试剂有限公司

氯化钠：国药集团化学试剂有限公司。

在以下实施例、对比例和试验例中，溶液中的重组甘精胰岛素的含量通过如下HPLC法测定：

1.色谱条件：Waters高效液相色谱仪，KromasilC18柱(柱长150mm，直径4.6mm；100A-3.5μm)，流动相为磷酸盐缓冲液-乙腈体系，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为214nm。

2.流动相具体配制方法为：

磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠20.7g，加水800ml溶解，再用85％磷酸调节pH至2.5，加水至1L，过滤。

流动相A：取氯化钠18.4g，加磷酸盐缓冲液250ml溶解，加乙腈250ml，混匀后用水稀释至1000ml，0.45μm滤膜过滤。

流动相B：取氯化钠3.2g，加上述磷酸盐缓冲液250ml溶解，加乙腈650ml，混匀后用水稀释至1000ml，0.45μm滤膜过滤。

按照下表的梯度进行洗脱

3.测定方法：取供试品20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积积分，采用归一化法计算，即得。

本领域技术人员应该了解，上述供试品可以是未稀释的待测溶液，或者经过适当稀释的待测溶液。待测溶液是否稀释及稀释的倍数取决于方法的线性范围和重组甘精胰岛素的含量。

实施例1一种重组甘精胰岛素结晶的制备方法

1)制备1L重组甘精胰岛素结晶液，该结晶液中各组分及浓度为：重组甘精胰岛素：2g/L；乙酸：0.5mol/L；氯化锌：70mg/L；苯酚：3g/L；具体操作过程：

量取浓度为8g/L的重组甘精胰岛素溶液250ml；量取28.6ml乙酸，加水稀释至250ml；称取3g苯酚，用尽量少的水溶解；称取70mg氯化锌，用尽量少的水溶解；

向重组甘精胰岛素溶液中加入预配的乙酸溶液、苯酚溶液和氯化锌溶液，加水定容至1L，即得所述重组甘精胰岛素结晶液。

2)将步骤1得到的所述重组甘精胰岛素结晶液搅拌均匀，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH至3.5，置于30℃恒温培养箱中，搅拌1小时。

3)将步骤2中得到的结晶液从恒温培养箱中取出，用氨水调节pH至7.5；将上述结晶液置于4℃冰箱中，静置3小时。

取上清液，HPLC检测，重组甘精胰岛素含量为0.01mg/ml。

4)离心，分离固体和上清液，用水洗涤固体，用注射水洗涤固体2次，每次洗涤用水为每克固体使用80ml；将固体冷冻干燥，得到重组甘精胰岛素。

实施例2一种重组甘精胰岛素的制备方法

1)制备1L重组甘精胰岛素结晶液，该结晶液中各组分及浓度为：重组甘精胰岛素：4g/L；乙酸：0.8mol/L；氯化锌：100mg/L；苯酚：5g/L；具体操作过程：

量取浓度为8g/L的重组甘精胰岛素溶液500ml；量取45.7ml乙酸，加水稀释至300ml；称取5g苯酚，用尽量少的水溶解；称取100mg氯化锌，用尽量少的水溶解；

向预配的苯酚溶液加入重组甘精胰岛素溶液、乙酸溶液和氯化锌溶液，加水定容至1L，即得所述重组甘精胰岛素结晶液。

2)将步骤1得到的所述重组甘精胰岛素结晶液搅拌均匀，用0.1mol/L氢氧化钾调节pH至4，置于25℃恒温培养箱中，搅拌8小时。

3)将步骤2中得到的结晶液从恒温培养箱中取出，用1mol/L氢氧化钾调节pH至8.0；将上述结晶液置于4℃环境中，静置3小时。

取结晶液上清，HPLC检测重组甘精胰岛素含量为0.02mg/ml。

4)离心，分离固体和上清液，用水洗涤固体，用注射水洗涤晶体2次，每次洗涤用水为每克固体使用80ml；将固体冷冻干燥，得到重组甘精胰岛素。

实施例3一种重组甘精胰岛素结晶的制备方法

1)制备1L重组甘精胰岛素结晶液，该结晶液中各组分及浓度为：重组甘精胰岛素：1g/L；乙酸：0.4mol/L；氧化锌：40mg/L；苯酚：2g/L；具体操作过程：

量取浓度为8g/L的重组甘精胰岛素溶液125ml；量取22.8ml乙酸，加水稀释至150ml；称取2g苯酚，用尽量少的水溶解；称取40mg氧化锌，用尽量少0.1mol/L的盐酸溶解；

向预配的锌盐溶液中加入所述重组甘精胰岛素溶液、乙酸溶液和苯酚溶液，加水定容至1L，即得所述重组甘精胰岛素结晶液。

2)将步骤1得到的所述重组甘精胰岛素结晶液搅拌均匀，用0.1mol/L氢氧化钾调节pH至4，置于25℃恒温培养箱中，搅拌3小时。

3)将步骤2中得到的结晶液从恒温培养箱中取出，用1mol/L氢氧化钾调节pH至7.0；将上述结晶液置于2℃环境中，静置3小时。

取结晶液上清，HPLC检测重组甘精胰岛素含量为0.02mg/ml。

4)离心，分离固体和上清液，用水洗涤固体2次，每次洗涤用水为每克固体使用80ml；将固体冷冻干燥，得到重组甘精胰岛素。

实施例4一种重组甘精胰岛素结晶的制备方法

1)制备1L重组甘精胰岛素结晶液，该结晶液中各组分及浓度为：重组甘精胰岛素：2g/L；乙酸：0.7mol/L；氯化锌：200mg/L；苯酚：1.5g/L；具体操作过程：

量取浓度为8g/L的重组甘精胰岛素溶液250ml；量取40ml乙酸，加水稀释至350ml；称取1.5g苯酚，用尽量少的水溶解；称取200mg氯化锌，用尽量少的水溶解；

向预配的氯化锌溶液中加入所述重组甘精胰岛素溶液、乙酸溶液和苯酚溶液，加水定容至1L，即得所述重组甘精胰岛素结晶液。

2)将步骤1得到的所述重组甘精胰岛素结晶液搅拌均匀，用0.1mol/L氢氧化钾调节pH至3.5，置于35℃恒温培养箱中，搅拌6小时。

3)将步骤2中得到的结晶液从恒温培养箱中取出，用1mol/L氢氧化钾调节pH至7.0；将上述结晶液置于4℃环境中，静置3小时。

取结晶液上清，HPLC检测重组甘精胰岛素含量为0.02mg/ml。

4)离心，分离固体和上清液，用注射水洗涤固体2次，每次洗涤用水为每克固体使用50ml；将固体冷冻干燥，得到重组甘精胰岛素。

试验例1重组甘精胰岛素结晶的制备方法比较

称取12.6g重组甘精胰岛素溶于2L水中制成混悬液。将该溶液分为两份，分别按照公开号CN102219851A实施例1记载的甘精胰岛素结晶的制备方法(以下简称“现有技术”)和本发明的方法制备重组甘精胰岛素晶体：

1.现有技术：

将乙腈360ml，乙酸72.09ml，10％的苯酚溶液72ml，5.08％(质量/体积)的氯化锌溶液4.25ml，4mol/L的乙酸钠溶液225ml，混合后加水至终体积0.6L。将上述0.6L溶液加入到上述1L重组甘精胰岛素混悬液中，并补水至终体积1.8L，制成结晶液。该结晶液中的组分和浓度为：重组甘精胰岛素：3.5g/L，乙腈：20％，乙酸：0.7mol/L，苯酚：0.4％，氯化锌：120mg/L，乙酸钠：0.5mol/L。

将上述结晶液初始温度调到23℃，用氢氧化铵调节pH8.0，搅拌10分钟至溶液微混，放入4℃冰箱静置结晶约3小时。取结晶液上清，HPLC检测重组甘精胰岛素含量为0.06mg/ml。

2.本发明类似方法

向第二份混悬液中加入乙酸、苯酚、氯化锌，加水定容至1.8L，使甘精胰岛素浓度为3.5g/L，乙酸的浓度为0.6mol/L，苯酚含量为2g/L，氯化锌的浓度为100mg/L；用氢氧化钠调节pH至3.5，置于30℃恒温培养箱中，搅拌1小时；从恒温培养箱中取出溶液后，用1mol/L氢氧化钠调节pH至8.0；将上述结晶液置于4℃冰箱中，静置3小时。取结晶液上清，HPLC检测重组甘精胰岛素含量为0.02mg/ml。

两份溶液结晶沉析完成后,采用2500r/min速度离心15min，用注射用水洗涤2次，每次100ml；晶体冷冻干燥24h后得到冻干粉末。检测两种冻干粉的质量、纯度、有关物质、残留乙腈含量，结果见表1。

表1两种方法制备的重组甘精胰岛素相关测定结果

结论：

与现有技术比较，在重组甘精胰岛素投料量相同的情况下，本发明的方法的产率更高，固体中的杂质和残留更少，因此生产效率更高。

本试验例的结果液提示以重组甘精胰岛素的混悬液为原料，采用本发明所述的制备方法，也可以进行重结晶，从而提高产品的纯度，减少有机溶剂残留。

通过如下试验例考察了温度和pH值对重组甘精胰岛素结晶的影响：

试验例2温度和pH值对结晶的影响(I)

按照实施例1的方法配制结晶液5份，分别编号，直接调节pH至6、6.5、7、7.5、8，然后将结晶液放置在4℃冰箱中，结晶24小时。5份结晶液均仅形成了絮状沉淀。

结论：具有本发明所述组成的结晶液直接调pH至甘精胰岛素等电点附近，即使延长结晶时间至24小时，也无法获得沉降体积小的固体。

试验例3温度和pH值对结晶的影响(II)

按照实施例1的方法配制结晶液12份，分别编号，按照表2列出的条件先调节结晶液的温度和pH值至初始pH和初始温度，保持1小时(搅拌)，然后调pH至表2所示的终点值，将结晶液置于4℃冰箱中，3小时和24小时分别肉眼观察固体析出情况，并同时按照实施例1所述的方法取样在显微镜下观察结晶情况。结果见表2。

表2结晶条件及结晶情况

结论：具有本发明所述组成的结晶液，即使采用了分步调节pH和温度的操作，如果初始温度和终点pH没有在特定的范围内，都无法形成沉降体积小的甘精胰岛素。只有将初始温度控制在25～35℃、初始pH值控制在3～4，终点pH值控制在pH＝7～8，才能实现本发明的目的。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种甘精胰岛素的制备方法，所述方法以甘精胰岛素溶液为原料，包括如下操作：先将甘精胰岛素溶液、有机酸、酚衍生物、锌盐和水混合，配制得到结晶液，调pH至3～4，25～35℃下保温1～8小时，然后调pH至7.0～8.0，降低温度至2～8℃，静置3～5小时，分离固体和上清液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述结晶液在25～35℃下保温1～6小时，更优选1～3小时，最优选1小时。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述结晶液中，甘精胰岛素的浓度为1～4g/L，更优选为1.5～3.5g/L；

优选的，所述甘精胰岛素为重组甘精胰岛素，所述甘精胰岛素溶液为工程菌发酵产物经过一系列分离纯化得到的甘精胰岛素浓缩液，甘精胰岛素含量＞5g/L，纯度≥98％。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述结晶液中，所述有机酸的浓度为0.4～0.8mol/L；

优选的，所述有机酸选自乙酸、柠檬酸或甘氨酸，更优选为乙酸；

更优选的，所述结晶液中，所述有机酸为乙酸，浓度为0.5～0.7mol/L。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述结晶液中，所述酚衍生物的浓度为1～5g/L；

优选的，所述酚衍生物选自苯酚和间甲酚中的一种或两种；更优选为苯酚；

更优选的，所述结晶液中，所述酚衍生物是苯酚，浓度为1.5～3g/L。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述结晶液中，所述锌盐的浓度为20～200mg/L，更优选为70～100mg/L；

优选的，所述锌盐选自氯化锌或氧化锌，更优选为氯化锌；

更优选的，所述结晶液中，所述锌盐为氯化锌，浓度为70～100mg/L。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括用水洗涤得到的固体，冷冻干燥。

8.一种重组甘精胰岛素结晶的方法，包括如下步骤：

1)在室温下将计算量的重组甘精胰岛素溶液加入水中，使重组甘精胰岛素的浓度为1～4g/L，乙酸的浓度为0.4～0.8mol/L，苯酚的浓度为1～5g/L，氯化锌的浓度为20～200mg/L，得到结晶液；其中，所述重组甘精胰岛素溶液中重组甘精胰岛素的含量＞5g/L，纯度≥98％；

2)调节步骤1得到的所述结晶液pH值至3～4，置于25～35℃，保温搅拌1～3小时；

3)调节步骤2得到的结晶液pH值至7.0～8.0，将所述结晶液置于温度为2～8℃环境，静置3～5小时；

4)离心，分离固体和上清液，用水洗涤固体2次，每次洗涤用水为每克固体50ml～100ml；将固体冷冻干燥。

9.一种重组甘精胰岛素结晶的方法，包括如下步骤：

1)在室温下将计算量的重组甘精胰岛素溶液、乙酸、苯酚和氯化锌加入水中，使重组甘精胰岛素的浓度为1.5～3.5g/L，乙酸的浓度为0.5～0.7mol/L，苯酚的浓度为1.5～3g/L，氯化锌的浓度为70～100mg/L，得到结晶液；其中，所述重组甘精胰岛素溶液中重组甘精胰岛素的含量＞5g/L，纯度≥98％；

2)调节步骤1得到的结晶液pH值至3～4，置于25～35℃，保温搅拌1小时；

3)调节步骤2得到的结晶液pH值至7.0～8.0，将所述结晶液置于2～8℃环境，静置3～4小时；

4)离心，分离固体和上清液，用水洗涤固体2次，每次洗涤用水为每克固体50ml～100ml；将固体冷冻干燥。

10.一种甘精胰岛素，所述甘精胰岛素通过权利要求1至9中的任一项所述的制备方法制备得到。