CN102336825B

CN102336825B - 苦瓜蛋白、制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN102336825B
Application number: CN201110234348.3A
Authority: CN
Inventors: 彭金咏; 李英楠; 尹连红; 郑玲俐; 许丽娜; 赵艳艳
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2031-08-16
Also published as: CN102336825A

Abstract

本发明公开一种可抑制癌细胞生长的苦瓜蛋白、制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用，其苦瓜蛋白含有343个氨基酸，氨基酸序列如下：1MMRPSILRSVKSAVSRSITRRGYATEPVPERKVAILGAAGGIGQPLSLLM 51KLNPLVSTLSLYDIAGTPGVAADVSHINSRSQVTGYAGEDELGKALEGAD 101VVIIPAGVPRKPGMTRDDLFNINAGIVKSLATAISKYCPHALVNMISNPV 151NSTVPIAAEVFKKAGTYDEKRLFGVTTLDVVRAKTFYAGKANVPVAEVNV 201PVIGGHAGVTILPLFSQASPQANLDDDVIKALTARTQDGGTEVVTAKAGK 251GSATLSMAYAGAIFADACLKGLNGVPDVVECSYVQSNLIAELPFFASKVR 301IGKNGVEEILGLGSLSDFEKQGLENLKSELKSSIEKGIKFASQ。

Description

苦瓜蛋白、制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种可抑制癌细胞生长的苦瓜蛋白、制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

苦瓜（Momordica charantia L.）为葫芦科苦瓜属植物，其果实药食兼用，在我国已有十分悠久的使用历史。《本草纲目》中曾记载，苦瓜具有“去邪热，解劳之，清心明目”的作用，其性味苦寒，具有降低血糖、清热解毒、滋养强壮等功效，大量的现代研究也证明了苦瓜在降血糖、抗肿瘤、抗菌、抗爱滋病及抗生育方面的作用。苦瓜中含有糖类、维生素、生物碱、蛋白质、甾类、三萜类等多种成分，其中最具代表性的活性成分是蛋白质及多肽，如类胰岛素多肽、核糖体失活蛋白等，因此苦瓜蛋白作为具有多重生理活性的天然蛋白质，有着良好的药用开发价值。但是，迄今为止，还没有关于用高速逆流色谱（HSCCC）对苦瓜进行分离纯化，以获得对癌细胞生长有很好抑制作用的苦瓜蛋白的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可抑制癌细胞生长的苦瓜蛋白、制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的技术解决方案是：一种苦瓜蛋白（未知），其特征在于含有343个氨基酸，氨基酸序列如下：

1 MMRPSILRSV KSAVSRSITR RGYATEPVPE RKVAILGAAG GIGQPLSLLM

51 KLNPLVSTLS LYDIAGTPGV AADVSHINSR SQVTGYAGED ELGKALEGAD

101 VVIIPAGVPR KPGMTRDDLF NINAGIVKSL ATAISKYCPH ALVNMISNPV

151 NSTVPIAAEV FKKAGTYDEK RLFGVTTLDV VRAKTFYAGK ANVPVAEVNV

201 PVIGGHAGVT ILPLFSQASP QANLDDDVIK ALTARTQDGG TEVVTAKAGK

251 GSATLSMAYA GAIFADACLK GLNGVPDVVE CSYVQSNLIA ELPFFASKVR

301 IGKNGVEEIL GLGSLSDFEK QGLENLKSEL KSSIEKGIKF ASQ。

一种上述苦瓜蛋白的提取方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 苦瓜榨汁后，用5~10倍体积的Tris-HCl缓冲液于4℃搅拌2~4 h，静置过夜，于10000 rpm离心20 min，取上清液，加入硫酸铵至80%~100%饱和度，于4℃搅拌4~6 h，再于10000 rpm离心20 min，透析48 h后取沉淀冷冻干燥，得苦瓜粗蛋白；

b. 用高速逆流色谱法将所得的苦瓜粗蛋白进行分离纯化，所用两相溶剂系统为反胶团溶剂系统，其中固定相为0.05~0.10 mol/L AOT/异辛烷，流动相A是pH6.0~8.0、离子强度为0.02 ~0.06 mol/L KCl的Tris-HCl缓冲溶液，流动相B是pH9.0~11.0、离子强度为0.2 ~0.6 mol/L KCl的Tris-HCl缓冲溶液，固定相和流动相在该相中所占的体积比例分别为80%~95%和20%~5%；操作时先将固定相充满高速逆流色谱仪柱子，然后使主机转动并泵入流动相A，待两相溶剂系统平衡后，由进样阀进样，180 min后，将流动相A更换成流动相B，接收目标成分。

所述的步骤b中，高速逆流色谱的柱体积为20 ml，主机转速为830 rpm，进样量为100~200 mg，流速为1.5 ml/min，温度为4℃。

一种上述苦瓜蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是在制备抑制胃癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞或乳腺癌细胞生长药物中的应用。

本发明是采用高速逆流色谱对苦瓜蛋白粗提物进行分离纯化，不但简便、快速，而且也可避免样品的损失，具有制备量大、产物纯度高、简便易行等优点。所制备的蛋白为未见报道的新蛋白，具有抑制癌细胞生长的作用，可应用于制备抗肿瘤药物。

附图说明

图1为本发明实施例苦瓜粗蛋白的高速逆流色谱图。

图2为本发明实施例苦瓜提取物的SDS-PAEG图谱。

图3为不同浓度的本发明实施例苦瓜蛋白对人胃癌细胞作用不同时间的抑制率示意图。

图4为不同浓度的本发明实施例苦瓜蛋白对人胃癌细胞凋亡影响的显微镜下图。

具体实施方式

按照下列方法制备苦瓜蛋白：

a. 市售新鲜苦瓜用榨汁机将其全部绞碎，加入5~10倍体积的Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L, pH=7.0~8.2）于4℃搅拌2 h，静置过夜，于10000 rpm离心20 min，取上清液，加入硫酸铵至80%~100%饱和度，于4℃搅拌4~6 h，再于10000 rpm离心20 min，将沉淀透析48 h之后冷冻干燥，得到干燥粉末，即苦瓜粗蛋白；

b. 用高速逆流色谱法将所得的苦瓜粗蛋白进行分离纯化，所用两相溶剂系统为反胶团溶剂系统，其中固定相为0.05~0.10 mol/L AOT/异辛烷，流动相A是pH6.0~8.0、离子强度为0.02 ~0.06 mol/L KCl的Tris-HCl缓冲溶液，用于萃取；流动相B是pH9.0~11.0、离子强度为0.2 ~0.6 mol/L KCl的Tris-HCl缓冲溶液，用于反萃取；固定相和流动相在该相中所占的体积比例分别为80%~95%和20%~5%。

粗蛋白的干燥粉末用流动相A溶解，作为待分离样品。

操作时先将固定相充满高速逆流色谱仪柱子（20 ml），然后使主机按转速为830 rpm转动，打开温控装置，设定温度为4℃，用1.5 ml/min的流速泵入流动相A，当溶剂系统在分离柱中建立流体动力学平衡后，将制备好的待分离样品100~200 mg通过进样阀口注入高速逆流色谱仪分离管中，180 min后，将流动相A更换成流动相B。以UV检测器（280 nm）采集数据，记录色谱图（如图1所示），并根据洗脱图谱收集流份Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。

经考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定，苦瓜粗蛋白总蛋白含量为6.8%；分离产物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的蛋白含量分别为6.61%、7.55%和8.77%。

采用变性凝胶电泳对苦瓜粗蛋白及HSCCC分离产物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ进行分析：根据目标蛋白的分子量配制10~12% SDS-PAGE分离胶，5% SDS-PAGE浓缩胶，胶的厚度为1.0或1.5 mm。每孔加入含等量蛋白的样品溶液，在恒压（220V）条件下分离,直至溴酚蓝达到胶底部，关闭电源，用考马斯亮兰R250染色，结果显示电泳纯度为100%，SDS-PAEG图谱如图2所示。

将得到的蛋白条带通过MALDI-TOF/TOF-MS/MS进行分子量和氨基酸序列分析。经鉴定流份Ⅱ的分子量为36 KD且等电点为8.8，含有343个氨基酸，其序列如下：

1 MMRPSILRSV KSAVSRSITR RGYATEPVPE RKVAILGAAG GIGQPLSLLM

51 KLNPLVSTLS LYDIAGTPGV AADVSHINSR SQVTGYAGED ELGKALEGAD

101 VVIIPAGVPR KPGMTRDDLF NINAGIVKSL ATAISKYCPH ALVNMISNPV

151 NSTVPIAAEV FKKAGTYDEK RLFGVTTLDV VRAKTFYAGK ANVPVAEVNV

201 PVIGGHAGVT ILPLFSQASP QANLDDDVIK ALTARTQDGG TEVVTAKAGK

251 GSATLSMAYA GAIFADACLK GLNGVPDVVE CSYVQSNLIA ELPFFASKVR

301 IGKNGVEEIL GLGSLSDFEK QGLENLKSEL KSSIEKGIKF ASQ。

与NCBInr数据库匹配，未发现相关蛋白，在此称其为苦瓜蛋白MAP36。

苦瓜蛋白MAP36的体外抗肿瘤活性：

细胞培养：

人胃癌细胞SGC-7901、肝癌细胞BEL-7404、肺癌细胞SPCA-1、卵巢癌细胞ES-2和乳腺癌细胞MCF-7以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液于5% CO₂、37℃及饱和湿度条件下静置培养，常规消化传代并选择对数生长期细胞试验。

MTT分析：

收集对数生长期的癌细胞，1000 rpm离心10 min并计数，制成1×10⁵个/mL的单细胞悬液，于96孔板中每孔加细胞悬液100 μL，置37℃、5% CO₂培养箱孵育24 h后，分别加入不同浓度的苦瓜蛋白MAP36（0.238、0.285和0.713 mg/mL），培养12、24、48 h，并于培养结束前4 h，加入10 μL MTT (5 mg/mL)，结束反应时加入100 μL SDS三联液，于CO₂培养箱中再培养12 h，酶标仪测定吸光度A ₅₇₀。每个实验组均设5个复孔，以不加药的细胞上清液为空白对照，通过下列公式求出抑制率（IR），对其作图并得出IC₅₀。

抑制率IR（%）＝（1－空白对照平均A值）/实验组平均A值×100%

其中苦瓜蛋白MAP36对该五种癌细胞均具有生长抑制作用，IC₅₀值分别为0.285、0.325、0.296、0.280、0.279和0.345 mg/mL。且该各浓度的该蛋白对SGC-7901的抑制率见图3。

细胞AO-EB染色：

胰酶消化癌细胞，调整细胞密度0.1~1×10⁵个/mL，置于放有盖玻片的六孔板中，每孔2 mL细胞悬液，待细胞单层贴片后，给予苦瓜蛋白MAP36（0.2853 mg/mL）孵育12、24、48 h后，用PBS洗片三次，95%乙醇室温固定15 min。将等量AO和EB混合均匀，取5 μL混合液滴加在载玻片上，将盖玻片的细胞面覆盖在载玻片上，显微镜下观察，正常细胞被染成绿色荧光，凋亡细胞为橙红色荧光，拍照。结果显示，苦瓜蛋白MAP36对该五种肿瘤细胞具有促凋亡的作用，其中该蛋白对SGC-7901的抑制率见图4。

实施例2：

a. 市售新鲜苦瓜用榨汁机将其全部绞碎，加入8倍体积的Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH=7.0）于4℃搅拌2 h，静置过夜。再于10000 rpm离心20 min，取上清液，加入硫酸铵至80%饱和度，于4℃搅拌4 h，再于10000 rpm离心20 min，将沉淀透析48 h之后冷冻干燥，得到干燥粉末，即苦瓜粗蛋白；

b. 用高速逆流色谱法将所得的苦瓜粗蛋白进行分离纯化，所用两相溶剂系统为反胶团溶剂系统，其中固定相为0.06 mol/L AOT/异辛烷，AOT/异辛烷和流动相A在该相中所占的体积比例分别为80%和20%，流动相A （0.04 mol/L Tris-HCl， pH=7.0，0.05 mol/L KCl）用于萃取；流动相B（0.04 mol/L Tris-HCl，pH=10.0，0.4 mol/L KCl）用于反萃取。

具体的操作步骤同实施例1，对分离所得流份进行含量、纯度、结构鉴定及抗肿瘤活性分析方法及结果均同实施例1。

实施例3：

a.市售新鲜苦瓜用榨汁机将其全部绞碎，加入10倍体积的Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH=8.2）于4℃搅拌2 h，静置过夜。再于10000 rpm离心20 min，取上清液，加入硫酸铵至100%饱和度，于4℃搅拌6 h，再于10000 rpm离心20 min，将沉淀透析48 h之后冷冻干燥，得到干燥粉末，即苦瓜粗蛋白；

b. 用高速逆流色谱法将所得的苦瓜粗蛋白进行分离纯化，所用两相溶剂系统为反胶团溶剂系统，其中固定相为0.10 mol/L AOT/异辛烷，AOT/异辛烷和流动相A在该相中所占的体积比例分别为95%和5%，流动相A （0.04 mol/L Tris-HCl，pH=7.0，0.05 mol/L KCl）用于萃取；流动相B（0.04 mol/L Tris-HCl，pH=10.0，0.4 mol/L KCl）用于反萃取。

序列表

<110> 大连医科大学

<120>苦瓜蛋白、制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用

<160>1

<210> 1

<211> 343

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<221> 苦瓜蛋白

<222> (1)..(343)

<400>

1 MMRPSILRSV KSAVSRSITR RGYATEPVPE RKVAILGAAG GIGQPLSLLM

51 KLNPLVSTLS LYDIAGTPGV AADVSHINSR SQVTGYAGED ELGKALEGAD

101 VVIIPAGVPR KPGMTRDDLF NINAGIVKSL ATAISKYCPH ALVNMISNPV

151 NSTVPIAAEV FKKAGTYDEK RLFGVTTLDV VRAKTFYAGK ANVPVAEVNV

201 PVIGGHAGVT ILPLFSQASP QANLDDDVIK ALTARTQDGG TEVVTAKAGK

251 GSATLSMAYA GAIFADACLK GLNGVPDVVE CSYVQSNLIA ELPFFASKVR

301 IGKNGVEEIL GLGSLSDFEK QGLENLKSEL KSSIEKGIKF ASQ。

Claims

1.一种苦瓜蛋白的制备方法，所述苦瓜蛋白氨基酸序列如下：

1 MMRPSILRSV KSAVSRSITR RGYATEPVPE RKVAILGAAG GIGQPLSLLM

51 KLNPLVSTLS LYDIAGTPGV AADVSHINSR SQVTGYAGED ELGKALEGAD

101 VVIIPAGVPR KPGMTRDDLF NINAGIVKSL ATAISKYCPH ALVNMISNPV

151 NSTVPIAAEV FKKAGTYDEK RLFGVTTLDV VRAKTFYAGK ANVPVAEVNV

201 PVIGGHAGVT ILPLFSQASP QANLDDDVIK ALTARTQDGG TEVVTAKAGK

251 GSATLSMAYA GAIFADACLK GLNGVPDVVE CSYVQSNLIA ELPFFASKVR

301 IGKNGVEEIL GLGSLSDFEK QGLENLKSEL KSSIEKGIKF ASQ；

其特征在于按如下步骤进行：

2.根据权利要求1所述苦瓜蛋白的制备方法，其特征在于所述的步骤b中，高速逆流色谱的柱体积为20 ml，主机转速为830 rpm，进样量为100~200 mg，流速为1.5 ml/min，温度为4℃。