CN1247992C - 使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用高速逆流色谱(HSCCC)制订中药指纹图谱的方法。该方法包括制备各批次中药材的粗提物；通过TLC确定主要化合物类型；选取HSCCC使用的溶剂体系；使用高速逆流色谱仪纯化中药材的粗提物；使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；通过HPLC和UV-Vis确定粗提物中各组份的对应性；判断共有指纹峰；综合中药指纹图谱方法学考察资料的数据即构成指纹图谱。该法首次将HSCCC应用于中药指纹图谱的制订，是对现有方法的重要补充，其精密度和重现性明显优于TLC，又解决了HPLC难以分析/分离高粘度和易填料吸附的样品以及仪器耗材昂贵的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药质量分析方法，具体地是涉及一种使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法。
技术背景
中药材原料来自天然，多为人工分散采收、加工，受天气、地域差别及人为影响因素很大，原料和半成品及最终产品质量的规范化、标准化管理差距较大，为保证产品质量的均一和稳定，需要建立严格的质量监控标准和良好的监控方法。一般的分析技术只能表征部分化学信息，例如包括已知的活性成分、已知的非活性成分、一部分未知成分。现已知道，中药的药效不是来自任何单一的活性成分，而是由多种活性成分，甚至与“非活性成分”的协同作用或“生克作用”相关，所以中药的化学信息具有一定的模糊性。中药指纹图谱就是通过采用一种或多种检测技术，对中药的化学信息以图形的方式进行表征并加以描述，即绘制中药指纹图谱。中药指纹图谱不仅具备个体的绝对的唯一性，也具备物种特征的唯一性与同种个体之间的相似性，使中药的质量控制指标从原有的对某几个成份含量的测定上升为对整个中药内在品质的检测，可以最大限度地展示中药的内在品质，尽管对于中药的某一具体成分是什么我们可能仍不清楚，但却可以以此作为控制及衡量中药质量标准的重要内容，并使中药研究更符合中医的整体观念，提高了对中药真伪优劣鉴别的标准。
目前常用的分析技术包括光谱、波谱、色谱、核磁共振、X射线衍射及各种技术的联用等。其中色谱是制订指纹图谱的最常用的方法。最为常用的色谱技术包括：(1)薄层层析(TLC)：该法操作简便，无论中药化合物有无紫外吸收或挥发性，均可以用TLC进行定性，但此法精密度较差；(2)高效液相色谱(HPLC)：该法根据所包括的检测器不同，可以适用于不同性质的中药化合物，例如使用紫外检测器可以适用于有紫外吸收的中药化合物；使用蒸发激光散射或示差检测器可以适用于紫外吸收弱或没有紫外吸收的中药化合物；该法适用于分析/分离生物碱、甙类、蒽醌、有机酸、酚类、内酯等化合物，且精密度高，重现性好；但是该方法无法分析粘度较高的样品，分析黄酮类这种易被填料吸附的组分有一定难度，并且仪器及耗材昂贵，不利于推广；(3)气相色谱(GC)：该法的适用范围也是有限的，其应用范围与HPLC互补，适用于挥发性成分及衍生化后的生物碱、脂肪、内酯、酚、糖、动物类药物。
高速逆流色谱(HSCCC)是近来发展的一种色谱技术。其原理如文献：孙雪飞.逆流色谱的进展。国外医学药学分册。1990，18(1)，40-43所述，高速逆流色谱用聚四氟乙烯螺旋管作分离柱，没有任何固态支撑体或填料；根据被分离混合物的理化特征，选择一种有机/水两相溶剂体系或双水相溶剂体系，此体系可以是二元或多元的；用此体系的上相或下相作为色谱过程的固定相，首先将其注满管内，然后使管柱作行星式旋转运动，包括2种运动：一种是沿着自身轴的旋转——自转，它使分配的二相充分混匀；另一种是沿着离心中央轴的旋转——公转，它使固定相保留；这时如果用溶剂体系中的另一相作为流动相，带着混合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液相对流的整个管柱空间，各组分在两相微粒的表面上分配，经过成千上万次地、高效地、连续地萃取，每个组分按其在两相中的分配系数(即某一组分在流动相中的溶解度同它在固定相中的溶解度的比值)分离开来。此技术已被成功应用于生物化学、药学、农业、环境、材料、化工、海洋生物等领域，并已制备出包括黄酮类、蒽醌类、皂甙类、大环内酯了类、多酚类、儿茶素类、多糖类、糖蛋白类在内的数百种单体成分。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术在制订中药指纹图谱时，TLC精密度和重现性较差，HPLC难以分析/分离高粘度及和易被填料吸附的样品以及仪器耗材昂贵的缺陷，从而提供一种设备和耗材价格经济、易于推广的、使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法。
本发明的目的是由如下的技术方案实现的：
本发明提供一种使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法，包括如下步骤：
1)制备各批次中药材的粗提物：采用常规技术提取中药材，得到粗提物；
2)确定主要化合物类型：通过薄层色谱法(TLC)检测步骤1)得到的粗提物，确定中药材粗提物所包含的主要化合物类型；
3)选取溶剂体系：根据步骤2)确定的主要化合物类型，从以下4类溶剂体系选取适用于HSCCC的有机相/有机相或有机相/水相溶剂体系：
所述4类溶剂体系为：第一类为亲水性溶剂体系，由低极性(极性小)的非水相与水相组成，两相极性相差很大；
第二类为亲脂性溶剂体系，由高极性的非水相与水相组成，两相极性相差不大；
第三类为有机相溶剂体系，完全由有机溶剂构成，包括体系1——正构烷烃/卤代烃/脂肪醇或脂肪酮、体系2——正构烷烃/醚类/脂肪醇或脂肪酮和体系3——正构烷烃/脂肪酯类/乙腈/脂肪醇或脂肪酮；
第四类为双水相溶剂体系，包括有机相/水相系统：正己烷/乙醇/水、正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水、氯仿/甲醇/水、氯仿/甲醇/磷酸盐等；采用不同的溶剂比例，可以适用于分离不同种类的化合物，如：氯仿∶甲醇∶水系统，当按常规比例为13∶7∶8可分离黄酮类；6∶3∶2适用于分离蒽醌类；5∶4∶3可分离生物碱；13∶23∶16适用于分离香豆素类；
4)使用高速逆流色谱仪纯化中药材的粗提物：将步骤3)选定的溶剂在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出作为固定相的那一层溶剂，将其泵入高速逆流色谱仪的管柱；剩余的一相作为流动相；在10～30℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转或反转，主机转速为750～900rpm，并以1.5～2mL/min的流速将流动相泵入分离柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入步骤1)制得的某一批次中药材粗提物，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；
5)使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；
6)在洗脱过程中，同时分别收集各组份，再通过其在HPLC上的保留时间和在UV-Vis光谱图上的峰值及形状确定各批次中药材粗提物的各组份的对应性；
7)判断共有指纹峰，测量HSCCC中各共有指纹峰的保留时间，计算对应指纹峰的相对标准方差RSD，应满足RSD≤3％，非共有峰总面积不得大于总峰面积的10％；
8)根据国家标准关于指纹图谱的方法学考察资料的要求，需对10个批次以上的样品进行检测；同一供试品连续进样5次以上，以考察仪器的精密度；同一批号的供试品5份以上，以考察实验方法的重现性；同一供试品在不同时间经HSCCC分离纯化，所得图谱的共有指纹峰的RSD应≤3％；最后这些数据即构成中药指纹图谱及其方法学考察资料。
所述的中药材包括蒽醌类化合物、生物碱类化合物、黄酮类化合物、萜类化合物和皂甙类化合物。
本发明的优点在于：
本发明提供的使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法，首次将HSCCC应用于中药指纹图谱的制订，是对现有方法的重要补充，与已有技术相比优益之处在于：高速逆流色谱没有固相支持物，避免了对样品组分的吸附、变性、失活等不良影响；其精密度和重现性明显优于TLC；解决了HPLC难以分析/分离高粘度及和易被填料吸附的样品，在分离纯化黄酮等易被填料吸附的物质有明显的优势；可以分离纯化高粘度的物质；分析型HSCCC的效率、灵敏度及仪器重复性与HPLC接近；制备型HSCCC可以在制订指纹图谱的同时，可以获得足量的高纯度的组分，以备进一步的结构鉴定和活性检测；因其独特的分离原理，HSCCC在分离不同种类物质时只需更换溶剂系统，而非色谱柱，避免了柱效率下降等问题，使仪器和耗材价格经济，易于推广。
附图说明
图1为实施例1中3个产地丹参的HSCCC图谱；
其中图1-1是产自河北的丹参；
图1-2是产自山东的丹参；
图1-3是产自江苏的丹参。
具体实施方式
实施例1、使用HSCCC制订含有蒽醌类化合物(丹参)的中药的指纹图谱
1)制备各批次中药材的粗提物：将10个批次丹参均采用如下方法粗分离：将丹参根或根茎粉碎成粉；20g丹参粉溶于50mL溶剂(正己烷∶乙醇＝1∶1，V/V)，充分搅拌45min，沉降后取上清；沉淀再溶于25mL溶剂(正己烷∶乙醇＝1∶1，V/V)，充分搅拌45min，沉降后取上清；合并两次的上清液，离心10000g×10min，弃沉淀，留上清，定容；加入2倍体积的水，在分液漏斗中摇匀，静置过夜；
分出上相(有机相)，定容，用2倍于有机相体积的30wt％乙醇洗涤下相(水相)，直至下相(水相)近乎无色，浓缩上相，在真空干燥器内充分干燥，得到丹参的粗提物干粉，粗提收率为2wt％；
2)确定主要化合物类型：通过薄层色谱法(TLC)检测步骤1)得到的粗提物，确定中药材粗提物所包含的主要化合物类型为蒽醌类化合物；
3)选取溶剂体系：根据步骤2)确定的主要化合物类型，配制高速逆流色谱流动相溶剂体系A为正己烷∶乙醇∶水＝10∶5.5∶4.5(V/V)，溶剂体系B为正己烷∶乙醇∶水＝10∶7∶3(V/V)；
4)使用高速逆流色谱仪纯化丹参的粗提物：将步骤3)配制的溶剂体系A在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出上相作为固定相的那一层溶剂，将其加入高速逆流色谱仪的分离柱；下相作为流动相；在10～30℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转，主机转速为900rpm，并以2mL/min的流速将流动相泵入管柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入步骤1)制得的某一批次中药材粗提物，0-470min以体系A的下相为流动相，470min后更换为体系B的下相为流动相，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；
5)使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；每个批次丹参样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱峰12个；
6)在洗脱过程中，同时分别收集各组份，再通过其在HPLC上的保留时间和在UV-Vis光谱图上的峰值及形状确定各批次中药材粗提物的各组份的对应性；
图1所示为3个产地的丹参的HSCCC图谱。由图可见，经HSCCC纯化，3个产地的丹参各得到12个洗脱峰，峰的数目一致。对各洗脱峰进行分析：测定各洗脱峰在反相高效液相色谱(HPLC)上的保留时间，列于表1；在紫外-可见分光光度计900-200nm范围对各洗脱峰进行全波长扫描，得到吸收光谱，列于表2。
表1 HSCCC洗脱组分在HPLC反相层析检测中的保留时间
| 洗脱峰 | 河北丹参保留时间(min) | 山东丹参保留时间(min) | 江苏丹参保留时间(min) |
| 123456789101112 | 24.88724.75028.91728.29228.99229.12930.70230.81728.40232.29434.88625.170 | 24.93924.89328.82428.25028.99829.46031.24630.81728.44432.28734.78125.191 | 24.92024.98728.91128.00029.99329.12930.80030.94428.39932.35434.93625.202 |
表2 HSCCC洗脱组分的紫外吸收峰
| 洗脱峰 | 紫外吸收峰个数 | 河北丹参波长(nm) | 山东丹参波长(nm) | 江苏丹参波长(nm) |
| 1234567891011 | 11121234121231234121234123123 | 276.5275.9233269.5240.5291332.5417.5223.5279.5221.5253.5270219.5264.5363452246.5425247326326365.5227293.5512224253270.5 | 277.4276.2233.2269.5240.2292335.4417224.6276.6220.4252.8271219264.4363.2457246425247.2325.4325.4365.2226.8292.4512223.8252.6269.6 | 278276.7233.6269.1240.6292.6336416.8223.6278.6220.8253.8269.8219264.2361.6454246.2424.4246.8325.8325.8367.4226.6293.4512.4223.8252.6269.6 |
| 12 | 451 | 356468275 | 356.8468276.8 | 357.2468.6274.2 |
由表1和2可见，3条HSCCC洗脱曲线中的洗脱峰1和2的保留时间及吸收光谱的峰值分别一致，初步认为洗脱峰1和2为同一物质；从HPLC保留时间和紫外吸收光谱还可判定，3个产地丹参洗脱曲线中的第n(n为3-12)个洗脱峰为同一组分。也就是说，3个产地丹参的HSCCC洗脱图谱，不但洗脱峰个数一致，而且对应洗脱峰为同一组分。
7)判断共有指纹峰：10张洗脱图谱中的12个洗脱峰所包含的11个组分分别对应，没有非共有指纹峰，满足非共有峰总面积不得大于总峰面积10％的要求，测量HSCCC中各共有指纹峰的保留时间，经计算对应指纹峰的相对标准方差RSD≤3％，；
8)根据国家标准关于指纹图谱的方法学考察资料的要求，对10个批次以上的样品进行检测；同一供试品连续进样5次以上，以考察仪器的精密度；同一批号的供试品5份以上，以考察实验方法的重现性；同一供试品在不同时间经HSCCC分离纯化，所得图谱的共有指纹峰的RSD应≤3％。
最后这些数据即构成丹参的指纹图谱及其方法学考察资料；
实施例2、使用HSCCC制订含有生物碱类化合物(地龙毒素)的中药的指纹图谱
1)制备各批次中药材的粗提物：将10个批次红地龙的体表清洗干净，放蒸馏水中2h使其清空消化腔，中间更换蒸馏水1次，控干，加等量蔗糖，使地龙分泌粘液；
2)确定主要化合物类型：通过薄层色谱法(TLC)检测步骤1)得到的粗提物，确定中药材粗提物所包含的主要化合物类型为生物碱类化合物；
3)选取溶剂体系：根据步骤2)确定的主要化合物类型，配制高速逆流色谱流动相溶剂体系氯仿∶甲醇∶水＝5∶5∶3(V/V)；
4)使用高速逆流色谱仪纯化地龙粘液的粗提物：将步骤3)配制的溶剂体系A在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出上相作为固定相的那一层溶剂，将其加入高速逆流色谱仪的分离柱；下相作为流动相；在10～30℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转，主机转速为800rpm，并以1.7mL/min的流速将流动相泵入管柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入步骤1)制得的某一批次中药材粗提物，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；
5)使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；每个批次地龙粘液样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱峰5个；
6)在洗脱过程中，同时分别收集各组份，再通过其在HPLC上的保留时间和在UV-Vis光谱图上的峰值及形状确定各批次中药材粗提物的各组份的对应性；
7)判断共有指纹峰：10张洗脱图谱中的5个洗脱峰分别对应，没有非共有指纹峰，满足非共有峰总面积不得大于总峰面积10％的要求，测量HSCCC中各共有指纹峰的保留时间，经计算对应指纹峰的相对标准方差RSD≤3％，；
8)根据国家标准关于指纹图谱的方法学考察资料的要求，对10个批次以上的样品进行检测；同一供试品连续进样5次以上，以考察仪器的精密度；同一批号的供试品5份以上，以考察实验方法的重现性；同一供试品在不同时间经HSCCC分离纯化，所得图谱的共有指纹峰的RSD应≤3％。
最后这些数据即构成丹参的指纹图谱及其方法学考察资料；
实施例3、使用HSCCC制订含有黄酮类化合物(雪莲黄酮)的中药的指纹图谱
1)制备各批次中药材的粗提物：10个批次雪莲用石油醚冷浸6天，弃去石油醚浸取液，并将雪莲挥干，用60％乙醇冷浸7天，过滤乙醇浸取液，旋转蒸发仪适当浓缩，去除叶绿素，浓缩成棕黄色浸膏；
2)确定主要化合物类型：通过薄层色谱法(TLC)检测步骤1)得到的粗提物，确定中药材粗提物所包含的主要化合物类型为黄酮类化合物；
3)选取溶剂体系：根据步骤2)确定的主要化合物类型，配制高速逆流色谱流动相溶剂体系氯仿∶甲醇∶水＝4∶3∶2(V/V)；
4)使用高速逆流色谱仪纯化雪莲黄酮类化合物的粗提物：将步骤3)配制的溶剂体系A在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出上相作为固定相的那一层溶剂，将其加入高速逆流色谱仪的分离柱；下相作为流动相；在10～30℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转，主机转速为850rpm，并以2mL/min的流速将流动相泵入管柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入步骤1)制得的某一批次中药材粗提物，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；
5)使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；每个批次雪莲黄酮类化合物样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱峰6个；
6)在洗脱过程中，同时分别收集各组份，再通过其在HPLC上的保留时间和在UV-Vis光谱图上的峰值及形状确定各批次中药材粗提物的各组份的对应性；
7)判断共有指纹峰：10张洗脱图谱中的6个洗脱峰分别对应，没有非共有指纹峰，满足非共有峰总面积不得大于总峰面积10％的要求，测量HSCCC中各共有指纹峰的保留时间，经计算对应指纹峰的相对标准方差RSD≤3％，；
8)根据国家标准关于指纹图谱的方法学考察资料的要求，对10个批次以上的样品进行检测；同一供试品连续进样5次以上，以考察仪器的精密度；同一批号的供试品5份以上，以考察实验方法的重现性；同一供试品在不同时间经HSCCC分离纯化，所得图谱的共有指纹峰的RSD应≤3％。
最后这些数据即构成丹参的指纹图谱及其方法学考察资料；
实施例4、使用HSCCC制订含有萜类化合物(黄酮萜类)的中药的指纹图谱
1)制备各批次中药材的粗提物：10个批次雪莲用石油醚冷浸6天，弃去石油醚浸取液，并将雪莲挥干，用95％乙醇冷浸7天，过滤乙醇浸取液，旋转蒸发仪适当浓缩，去除叶绿素，浓缩成棕黄色浸膏；
2)确定主要化合物类型：通过薄层色谱法(TLC)检测步骤1)得到的粗提物，确定中药材粗提物所包含的主要化合物类型为萜类化合物；
3)选取溶剂体系：根据步骤2)确定的主要化合物类型，配制高速逆流色谱流动相溶剂体系氯仿∶甲醇∶水＝9∶12∶8(V/V)；
4)使用高速逆流色谱仪纯化雪莲萜类化合物的粗提物：将步骤3)配制的溶剂体系A在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出上相作为固定相的那一层溶剂，将其加入高速逆流色谱仪的分离柱；下相作为流动相；在10～30℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转，主机转速为850rpm，并以1.5mL/min的流速将流动相泵入管柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入步骤1)制得的某一批次中药材粗提物，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；
5)使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；每个批次雪莲萜类化合物样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱峰14个；
6)在洗脱过程中，同时分别收集各组份，再通过其在HPLC上的保留时间和在UV-Vis光谱图上的峰值及形状确定各批次中药材粗提物的各组份的对应性；
7)判断共有指纹峰：10张洗脱图谱中的14个洗脱峰分别对应，没有非共有指纹峰，满足非共有峰总面积不得大于总峰面积10％的要求，测量HSCCC中各共有指纹峰的保留时间，经计算对应指纹峰的相对标准方差RSD≤3％，；
8)根据国家标准关于指纹图谱的方法学考察资料的要求，对10个批次以上的样品进行检测；同一供试品连续进样5次以上，以考察仪器的精密度；同一批号的供试品5份以上，以考察实验方法的重现性；同一供试品在不同时间经HSCCC分离纯化，所得图谱的共有指纹峰的RSD应≤3％。
最后这些数据即构成丹参的指纹图谱及其方法学考察资料；
实施例5、使用HSCCC制订含有皂甙类化合物(苦瓜皂甙)的中药的指纹图谱
1)制备各批次中药材的粗提物：10个批次鲜苦瓜的pH3.5乙醇提取液，浓缩；
2)确定主要化合物类型：通过薄层色谱法(TLC)检测步骤1)得到的粗提物，确定中药材粗提物所包含的主要化合物类型为皂甙类化合物；
3)选取溶剂体系：根据步骤2)确定的主要化合物类型，配制高速逆流色谱流动相溶剂体系氯仿∶甲醇∶乙醇∶水＝5∶3∶1∶3(V/V)；
4)使用高速逆流色谱仪纯化苦瓜皂甙类化合物的粗提物：将步骤3)配制的溶剂体系A在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出上相作为固定相的那一层溶剂，将其加入高速逆流色谱仪的分离杜；下相作为流动相；在10～30℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转，主机转速为900rpm，并以1.8mL/min的流速将流动相泵入管柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入步骤1)制得的某一批次中药材粗提物，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；
5)使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；每个批次苦瓜皂甙类化合物样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱峰5个；
6)在洗脱过程中，同时分别收集各组份，再通过其在HPLC上的保留时间和在UV-Vis光谱图上的峰值及形状确定各批次中药材粗提物的各组份的对应性；
7)判断共有指纹峰：10张洗脱图谱中的5个洗脱峰分别对应，没有非共有指纹峰，满足非共有峰总面积不得大于总峰面积10％的要求，测量HSCCC中各共有指纹峰的保留时间，经计算对应指纹峰的相对标准方差RSD≤3％，；
8)根据国家标准关于指纹图谱的方法学考察资料的要求，对10个批次以上的样品进行检测；同一供试品连续进样5次以上，以考察仪器的精密度；同一批号的供试品5份以上，以考察实验方法的重现性；同一供试品在不同时间经HSCCC分离纯化，所得图谱的共有指纹峰的RSD应≤3％。
最后这些数据即构成丹参的指纹图谱及其方法学考察资料；
Claims (7)
1、一种使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法，包括如下步骤：
1)制备各批次中药材的粗提物：采用常规技术提取中药材，得到粗提物；
2)确定主要化合物类型：通过薄层色谱法检测步骤1)得到的粗提物，确定中药材粗提物所包含的主要化合物类型；
3)选取溶剂体系：根据步骤2)确定的主要化合物类型，从以下4类溶剂体系选取适用于高速逆流色谱的有机相/有机相或有机相/水相溶剂体系：
所述4类溶剂体系为：
第一类为亲水性溶剂体系，由极性小的非水相与水相组成，两相极性相差很大；
第二类为亲酯性溶剂体系，由高极性的非水相与水相组成，两相极性相差不大；
第三类为有机相溶剂体系，完全由有机溶剂构成，包括体系1——正构烷烃/卤代烃/脂肪醇或脂肪酮、体系2——正构烷烃/醚类/脂肪醇或脂肪酮和体系3——正构烷烃/脂肪酯类/乙腈/脂肪醇或脂肪酮；
第四类为双水相溶剂体系，包括：正己烷/乙醇/水，正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水，氯仿/甲醇/水，氯仿/甲醇/磷酸盐；
4)使用高速逆流色谱仪纯化中药材的粗提物：将步骤3)选定的溶剂在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出作为固定相的那一层溶剂，将其加入高速逆流色谱仪的分离柱；剩余的一相作为流动相；在10～30℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转或反转，主机转速为750～900rpm，并以1.5～2mL/min的流速将流动相泵入分离柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入步骤1)制得的某一批次中药材粗提物，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；
5)使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；
6)在洗脱过程中，同时分别收集各组份，再通过其在高效液相色谱上的保留时间和在紫外-可见光谱图上的峰值及形状确定各批次中药材粗提物的各组份的对应性；
7)判断共有指纹峰，测量高速逆流色谱中各共有指纹峰的保留时间，计算对应指纹峰的相对标准方差，应满足相对标准方差≤3％，非共有峰总面积不得大于总峰面积的10％；
8)对10个批次以上的样品进行检测；同一供试品连续进样5次以上，以考察仪器的精密度；同一批号的供试品5份以上，以考察实验方法的重现性；同一供试品在不同时间经高速逆流色谱分离纯化，所得图谱的共有指纹峰的相对标准方差应≤3％；最后这些数据即构成中药的指纹图谱及其方法学考察资料。
2、如权利要求1所述的使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法，其特征在于：所述的中药材包括蒽醌类化合物、生物碱类化合物、黄酮类化合物、萜类化合物和皂甙类化合物。
3、如权利要求2所述的使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法，其特征在于：所述蒽醌类化合物为丹参。
4、如权利要求2所述的使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法，其特征在于：所述生物碱类化合物为地龙毒素。
5、如权利要求2所述的使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法，其特征在于：所述黄酮类化合物为雪莲黄酮。
6、如权利要求2所述的使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法，其特征在于：所述萜类化合物为黄酮萜类。
7、如权利要求2所述的使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的方法，其特征在于：所述皂甙类化合物为苦瓜皂甙。
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