CN104155395B - 一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，包括如下步骤：1)将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比0.7-1.1:0.7-1.1：0.8-1.1：0.8-1.1进行混合，剧烈振荡、静置后将溶液分为两层，上层作为固定相，下层作为流动相；2)采用流动相分散树苔浸膏，得到待分离的样品溶液；3)采用高速逆流色谱对样品溶液进行分离，根据紫外吸收图收集相应的馏分，馏分经溶剂脱除工艺后，得到相对含量在90％以上的萜烯类组分。该方法条件温和，分离效率高，稳定性好，工艺流程简单，易于实现推广使用和工业化生产。

Description

一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法

技术领域

本发明涉及天然香料组分分离方法技术领域，更具体的涉及一种应用高速逆流色谱从树苔浸膏中分离萜烯类组分的方法。

背景技术

树苔浸膏(treemossconcrete)为棕绿色膏状物，由采用属于松萝科扁枝衣属的一种茶渍目地衣植物作为原料，经石油醚或苯浸提等一定的加工工艺而制得。树苔浸膏由于具有独特的苔类物质的自然青香和浓郁的树脂气息等香气特征，常用作烟草添加剂及日用化妆品自然清香的香原料，在天然香料国际市场，是重要的地衣香料。

浸膏类香料的成分复杂，其质量、成分不但与植物种类有关，同时也随着土壤成分、气候条件、生长季节、生成年龄、收割时间、储运情况而异。以橡苔浸膏为例，产于不同国家的橡苔制备的浸膏的香气风格有较大差异，如中国产橡苔浸膏的柔扁枝衣酸乙酯的含量远高于国外的橡苔浸膏。事实上，即使是同一地区的橡苔原料，发酵、加工等工艺的细微变化也会引起主要成分含量的变化。有学者认为正是由于这些化合物含量的不同，形成了上百种不同品种、不同产地和不同厂家的橡苔、树苔制品。因此，如何准确地对树苔浸膏的化学组分进行定性定量分析一直是研究热点。

浸膏类物质一般需要经过一系列的前处理后才能进行色谱分析，目前常用的前处理方法主要有固相微萃取、同时蒸馏萃取以及水蒸汽蒸馏等，但是，不同的前处理方式均存在一定的局限性。

萜烯，简称萜，是一系列萜类化合物的总称，是分子式为异戊二烯的整数倍的烯烃类化合物。萜烯是一类广泛存在于植物体内的天然来源碳氢化合物，可从许多植物，特别是针叶树得到。很多萜类化合物具有重要的生理活性，是研究天然产物和开发新药的重要来源。有文献报道，树苔浸膏中也含有多种异松油烯、柠檬烯、杜松烯、丁子香烯等挥发性萜类成分，这些物质为缩酚羧酸、缩酚酸环醚等次生代谢产物的降解产物，这些组分所占的比例尽管较小，但是大多有一定的甜香、木香、青香等特征，因此对树苔浸膏的香气具有一定的贡献。

采用不同的前处理方式对树苔浸膏进行分析，鉴定出来的萜类物质的种类并不相同，如采用分子蒸馏法鉴定出δ-杜松萜烯，同时蒸馏萃取法则鉴定出γ-杜松萜烯、β-杜松萜烯，而石竹烯、α-白菖考烯、别香树烯等几种萜类则仅在同时蒸馏萃取法中鉴定出来。一方面是由于两种处理方法之间的根本差异所造成，如同时蒸馏萃取方法的处理条件较分子蒸馏剧烈的多，在处理过程中导致缩酚羧酸类物质水解。另一方面，也可能是因为这些挥发性萜类物质存在多种同分异构体，理化性质极为相近，在有限柱效及一定色谱条件下，各种萜类成分之间分离度不佳，最终导致色谱峰难以定性或者定性不准确。

高速逆流色谱(high-speedcountercurrentchromatography,HSCCC)是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术。主要是将两溶剂的分配体系置于高速旋转的螺旋管内，螺旋管的运动形式，是在自身自转的基础上，同时绕一公转轴旋转，形成行星运动。由此加在分配体系上的离心力场不断发生变化，使两相溶剂充分的混合和分配，从而达到洗脱分离目的。因为样品中各组分在两相中分配系数不同，导致组分在螺旋柱中的移动速度不同，因而能使样品组分按分配系数的大小次序被依次洗脱下来。该技术由于具有仪器设备简单、价廉、操作方便、分离效率高等优点，在提取分离天然产物中的黄酮、生物碱、香豆素、等有效成分方面已获得满意结果。然而，截至目前，尚未见到有应用高速逆流色谱分离浸膏中萜烯类组分的专利和文献报道。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，该方法能实现树苔浸膏中萜烯类组分与其他组分的有效分离。

为解决上述第一个技术问题，本发明采用下述技术方案：

一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，其特征在于，包含如下步骤：

1)溶剂配制：将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水混合、振荡、静置，静置后混合液分为两层，分层后的上层作为固定相，下层作为流动相；

2)样品分散：称取树苔浸膏样品，加入步骤1)得到的流动相，搅拌后超声分散，得到待分离的样品溶液；

3)将步骤1)所得固定相充满高速逆流色谱的分离柱，随后泵入流动相，待所述流动相从出口流出后，两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡；

4)将步骤2)得到的样品溶液推入进样圈，树苔浸膏样品中的各组分在固定相与流动相之间分配分离，采用紫外检测器检测馏分，根据紫外吸收图收集馏分，得到树苔浸膏中的萜烯类组分。

优选地，所述步骤1)中正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比0.7-1.1:0.7-1.1：0.8-1.1：0.8-1.1进行混合，所述振荡时间为15-20min，所述静置时间为2-3h；优选地，正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比0.9:0.9:1:1混合。

优选地，步骤2)所述流动相的质量为样品质量的20-30倍，所述超声时间为5-10min。

优选地，所述步骤3)中所述固定相以10-30ml/min的流速充满高速逆流色谱的分离柱，当主机转速达到750-900rpm时，以3-7ml/min的流速泵入流动相；优选地，当主机转速达到820-860rpm时，以4-6ml/min的流速泵入流动相。

优选地，所述步骤4)中紫外检测波长为254nm或365nm。

优选地，步骤4)得到的萜烯类馏分可经萃取、蒸发、干燥等除去其中的溶剂。

优选地，步骤4)得到的树苔浸膏中的萜烯类组分经GC/MS检测，相对含量达90％以上。

进一步地，该方法包含如下步骤：

1)将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比0.9:0.9:1:1配制于分液漏斗中，振荡15min后静置分层。待平衡2小时后，将上相和下相分开，取上相作为固定相，下相作为流动相；

2)样品分散：称取树苔浸膏样品，加入浸膏质量20倍的步骤1)得到的流动相，搅拌后超声10min进行分散，得到待分离的样品溶液；

3)用固定相以20mL/min流速充满整个柱子；调整主机转速850rpm，以4ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡；

4)将步骤2)得到的样品溶液推入进样圈，树苔浸膏样品中的各组分在固定相与流动相之间分配分离，采用紫外检测器检测馏分，根据紫外吸收图收集馏分，得到树苔浸膏中的萜烯类组分。

本发明的有益效果如下：

首次将高速逆流色谱方法引入树苔浸膏的成分分离，采用了组成和配比合理的混合溶剂，仅通过主机转速和流动相等工艺条件的控制即可获得树苔浸膏中的萜烯类组分，有利于进一步准确定性、定量树苔浸膏中的萜烯类组分；分离过程中，条件温和，没有引入酸碱，也不需要使用固相载体，因此整个过程中不会产生不可逆吸附，减少了化合物性质的变化，样品无损失、无污染；本发明的方法操作简便，工艺流程简单，得到的萜烯类组分的相对含量可达90％以上，提供了一种获取萜烯类组分的新方法，且易于推广使用，亦可以用于其他天然香料中萜烯类组分的分离和制备。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为实施例1从树苔浸膏中分离萜烯类组分的高速逆流色谱图；

图2为实施例1中用高速逆流色谱分离出的萜烯类组分的GC/MS总离子流图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比0.9:0.9:1:1进行混合，剧烈振荡15min，静置2h后混合溶液分为两层，分层后的上层作为固定相，下层作为流动相；称取1g的树苔浸膏样品，加入20ml流动相，搅拌后超声10min进行分散，得到待分离的样品溶液。

采用TBE-300型半制备高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)，该仪器配有泵、10-30ml进样阀、紫外检测器和记录仪，其多层缠绕聚四氟乙烯管的柱容量为约300ml。先用固定相以10mL/min流速充满高速逆流色谱的分离柱，然后开启速度控制器，使高速逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机速度达到850rpm时，以3ml/min的流速泵入流动相；待所述流动相从出口流出后，两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡；将待分离的样品溶液推入进样圈，根据紫外吸收图收集馏分，馏分经溶剂脱除工艺后采用GC/MS检测，萜烯类组分的相对含量为93％左右。如图1为本实施例的树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱图，图中色谱峰1、2、3为目标馏分；图2为本实施例的GC/MS总离子流图，以C10-C40正构烷烃作为标准，以各正构烷烃的保留时间计算样品中化合物的保留指数，结合数据库检索(Nist08、Wily7.0)，质谱图解析技术的结果，并与文献数据相比较，对图2中的各色谱峰进行了化学成分定性，各色谱峰的定性结果如表1所示。表1的结果可以看出，图2的色谱图共鉴定出了14种萜烯类化合物。

表1质谱图的解析结果

序号	化合物名称
		1	α-芹子烯
2	别香橙烯
		3	γ-芹子烯
4	α-衣兰烯
		5	α-姜黄烯
6	菖蒲烯
		7	α-石竹烯
8	香树烯
		9	喇叭烯
10	花侧柏烯
		11	Β-红没药烯
12	δ-愈创木烯
		13	δ-杜松萜烯
14	α-白菖考烯

实施例2

将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比0.7:0.7:0.8:1.1进行混合，剧烈振荡20min，静置3h后将溶液分为两层，分层后的上层作为固定相，下层作为流动相；称取1g的树苔浸膏样品，加入30ml流动相，搅拌后超声5min进行分散，得到待分离的样品溶液。

采用TBE-300型半制备高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)，该仪器配有泵、10-30ml进样阀、紫外检测器和记录仪，其多层缠绕聚四氟乙烯管的柱容量为约300ml。先用固定相以30mL/min流速充满高速逆流色谱的分离柱，然后开启速度控制器，使高速逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机速度达到900rpm时，以3ml/min的流速泵入流动相；待所述流动相从出口流出后，两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡；将待分离的样品溶液推入进样圈，根据紫外吸收图收集馏分。馏分经溶剂脱除工艺后采用GC/MS检测，萜烯类组分的相对含量为90％左右。

实施例3

将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比1.1:1.1:0.8:1.1进行混合，剧烈振荡20min，静置2.5h后将溶液分为两层，分层后的上层作为固定相，下层作为流动相；称取1g的树苔浸膏样品，加入25ml流动相，搅拌后超声8min进行分散，得到待分离的样品溶液。

采用TBE-300型半制备高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)，该仪器配有泵、10-30ml进样阀、紫外检测器和记录仪，其多层缠绕聚四氟乙烯管的柱容量为约300ml。先用固定相以20mL/min流速充满高速逆流色谱的分离柱，然后开启速度控制器，使高速逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机速度达到750rpm时，以7ml/min的流速泵入流动相；待所述流动相从出口流出后，两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡；将待分离的样品溶液推入进样圈，根据紫外吸收图收集馏分。馏分经溶剂脱除工艺后采用GC/MS检测，主要致香成分的相对含量为91％左右。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，其特征在于，包含如下步骤：

1)溶剂配制：将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水混合、振荡、静置，静置后混合液分为两层，分层后的上层作为固定相，下层作为流动相；

2)样品分散：称取树苔浸膏样品，加入步骤1)得到的流动相，搅拌后超声分散，得到待分离的样品溶液；

3)将步骤1)所得固定相充满高速逆流色谱的分离柱，随后泵入流动相，待所述流动相从出口流出后，两相溶剂体系在色谱分离柱中达到平衡；

4)将步骤2)得到的样品溶液推入进样圈，树苔浸膏样品中的各组分在固定相与流动相之间分配分离，采用紫外检测器检测馏分，根据紫外吸收图收集馏分，得到树苔浸膏中的萜烯类组分；

所述步骤1)中正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比0.7-1.1：0.7-1.1：0.8-1.1：0.8-1.1进行混合，所述振荡时间为15-20min，所述静置时间为2-3h；

所述步骤3)中所述固定相以10-30ml/min的流速充满高速逆流色谱的分离柱，当主机转速达到750-900rpm时，以3-7ml/min的流速泵入流动相；

所述步骤4)中紫外检测波长为254nm或365nm。

2.根据权利要求1所述的一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，其特征在于：所述步骤1)中正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比0.9:0.9:1:1混合。

3.根据权利要求1所述的一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，其特征在于：步骤2)所述流动相的质量为样品质量的20-30倍，所述超声时间为5-10min。

4.根据权利要求1所述的一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，其特征在于：所述步骤3)中所述固定相以10-30ml/min的流速充满高速逆流色谱的分离柱，当主机转速达到820-860rpm时，以4-6ml/min的流速泵入流动相。

5.根据权利要求1所述的一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，其特征在于：步骤4)得到的萜烯类馏分经萃取、蒸发、干燥除去其中的溶剂。

6.根据权利要求1所述的一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，其特征在于：步骤4)得到的树苔浸膏中的萜烯类组分经GC/MS检测，相对含量达90％以上。

7.根据权利要求1所述的一种用于分离树苔浸膏中萜烯类组分的高速逆流色谱方法，其特征在于，包含如下步骤：

1)将正己烷、乙酸乙酯、乙醇、水按照体积比0.9:0.9:1:1配制于分液漏斗中，振荡15min后静置分层，待平衡2小时后，将上相和下相分开，取上相作为固定相，下相作为流动相；

2)样品分散：称取树苔浸膏样品，加入浸膏质量20倍的步骤1)得到的流动相，搅拌后超声10min进行分散，得到待分离的样品溶液；

3)用固定相以20mL/min流速充满整个柱子；调整主机转速850rpm，以4ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡；

4)将步骤2)得到的样品溶液推入进样圈，树苔浸膏样品中的各组分在固定相与流动相之间分配分离，采用紫外检测器检测馏分，根据紫外吸收图收集馏分，得到树苔浸膏中的萜烯类组分。