JP5668206B2 - クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料からクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法に関する。

これまでフコキサンチン等のキサントフィルの分離精製は、従来は、担体として合成吸着樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー（特許文献１）、再結晶（特許文献２）等の多段階の精製方法により単離されていた。

しかしながら、特許文献１に記載の精製方法では、キサントフィルの合成吸着樹脂への不可逆的吸着により収率が低下するという問題があった。また、特許文献２に記載の精製方法では、再結晶という方法の原理上、収率の向上には限界があり、更に冷却や濃縮等の操作に時間がかかるという問題があった。

一方、天然に多く存在するクロロフィルｃは、クロロフィルｃ１、クロロフィルｃ２、クロロフィルｃ３の三種類が知られている。これらについては藻類を原料とする以下の精製方法が知られている（非特許文献１）。

これらのクロロフィルｃの精製方法はいずれも薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、ＨＰＴＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を必要とするものであり、これらは分析用の手法であるため、ミリグラムスケールの分離しかできず、スケールアップが困難な方法であった。また、クロロフィルｃは、有機酸であるため、一般的なカラムによる分離は困難であるだけでなく、カラム担体に不可逆的吸着が起こるため、収率が低下するという問題もあった。更に、クロロフィルｃは一般的な抽出・精製の有機溶媒に対する溶解度が極めて低く、精製各段階における回収効率が極めて低いという問題点があった。

また、特にクロロフィルｃとキサントフィルを共に含有する試料からキサントフィルを精製する場合、キサントフィルがクロロフィル類と混在しているとクロロフィル類が異性化を促進するため抽出混合物におけるクロロフィル類との一刻も早い分離が望ましい。また、クロロフィルａの分解物もクロロフィルｃと同様の物理化学的性質を示すため、キサントフィルをクロロフィルｃと分離できればクロロフィルａの分解物からも分離できる。

更に、クロロフィルｃとキサントフィルは極性が高い等の物理的性質が類似しているため、通常は脂溶性のほかの光合成色素、クロロフィルａやβカロテンとの分離をまず行なってから更にクロロフィルｃとキサントフィルを分離するという二段階の精製法になる。この精製法においてキサントフィルとクロロフィルｃ（およびクロロフィルａの分解物）は精製段階に行くまでは混在することとなり、キサントフィルの耐久性および収量が低下するという問題があった。

特開２００１−５２３９６６号公報 特開２００９−１２０４９４号公報

S. W. Jeffrey, "Preparation of chlorophyll standards", In: "Phytoplankton Pigments in Oceanography", Jeffrey,S. W., Mantoura, R. F. C., Wright, S. W. (Eds.), UNESCO 1997, Spain, pp.207-238.

従って、本発明の課題は、従来の方法では困難であった、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料からクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルの分離精製を高収率で、迅速に行う方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料に、特殊な固定相および移動相を用いた高速向流クロマトグラフィー（ＨＳＣＣＣ）を行うことにより、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを高収率で、迅速に分離精製できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明はクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料に、メタノールまたはエタノール、アセトンまたは酢酸エチル、ヘキサンおよび水を混和して得られる２相系溶媒の上層を固定相および下層を移動相に用いた高速向流クロマトグラフィーを行うことを特徴とするクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法である。

本発明のクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法によれば、褐藻類等に含まれるクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを高収率で、迅速に分離精製することができる。特にこの方法に用いられる高速向流クロマトグラフィーは、固定相が溶媒であるため、原理上担体（固定相）への不可逆的吸着が起こりえず、原則１００％の回収率である。また、後述するが、分離に際して濃縮や乾燥の操作をほとんど経ずに抽出溶媒のまま分離を行うことができるため、操作も簡便である。

また、特に上記高速向流クロマトグラフィーを行うときの移動相に、イオン対試薬を添加することにより、分離能が高まるので、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを高純度で分離精製することができる。

更に、本発明のクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法では、これまでの方法では試料とすることが困難であった大型藻類を試料とすることもできる。また、クロロフィルｃを濃縮や乾燥の操作をほとんど経ずに抽出溶媒のまま精製することが可能であるため、低溶解度による回収率の低下も回避できる。

実施例１で得られたＨＳＣＣＣの溶出曲線である。 実施例１で得られたＨＳＣＣＣの溶出曲線に認められたピークに該当する各フラクションのＨＰＬＣチャートである。 実施例２で得られたＨＳＣＣＣの溶出曲線である。 実施例２で得られたＨＳＣＣＣの溶出曲線に認められたピーク２に該当するフラクション９の吸収スペクトルである。 実施例３で得られたＨＳＣＣＣの溶出曲線である。

本発明のクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法（以下、単に「本発明精製方法」という）に用いるクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料としては、前記成分を含有していれば特に限定されず、例えば、クロロフィルｃ２のみを含むアンフィジニウム・カーテラエ（Amphidinium carterae）、クロオモナス・サリーナ（Chroomonas salina）等の微細藻類、クロロフィルｃ１、ｃ２等のクロロフィルｃ、フコキサンチン、ビオラキサンチン、アンテラキサンチン、ゼアキサンチン等のキサントフィルを含むオキナワモズク等のモズク、コンブ、ワカメ等の褐藻類等が挙げられる。これらの中でもクロロフィルｃおよびキサントフィルを含むオキナワモズクが好ましく、特にその盤状体が好ましい。なお、オキナワモズクの盤状体は、例えば、特開２００４−３５５２８号公報に記載の方法により容易に得ることができる。

なお、試料は、後記する高速向流クロマトグラフィーを行う前に、抽出等し、粗精製物としてもよい。粗精製物の調製は、常法に従って行えばよく、例えば、試料をメタノール、アセトン、クロロホルム等の有機溶媒を用いて抽出を行い、得られた抽出物を、更に、乾燥物を高速向流クロマトグラフィーに用いる２相系溶媒の上層、下層または上層：下層＝１：１（ｖ／ｖ）等の２相系溶媒を維持できる溶液、特に移動相に用いる下層に溶解しておくことが収率の点から好ましい。

本発明精製方法は、上記試料について、メタノールまたはエタノール、アセトンまたは酢酸エチル、ヘキサンおよび水を混和して得られる２相系溶媒、好ましくはエタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）、メタノール：酢酸エチル：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）の２相溶媒系、より好ましくはエタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）の２相溶媒系の上層を固定相および下層を移動相に用いた高速向流クロマトグラフィーを行う。

本発明精製方法において、高速向流クロマトグラフィーは、上記固定相と移動相とを用いる以外には特に限定されず、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルが分離精製できる条件を適宜採用して行えばよい。

具体的に、高速向流クロマトグラフィーをＥＡＳＹ ＰＲＥＰ ３２０（カラム：コイルプラネット型、カラム容量：３２０ｍｌ：クツワ産業製）を用いて行う場合には、次のような条件で行うことができる。
カラム回転数：８００〜１０００ｒｐｍ、好ましくは９５０ｒｐｍ
固定相：上記２相溶媒系の上層
移動相：上記２相溶媒系の下層
流速：３〜６ｍｌ／分、好ましくは３ｍＬ／分

上記した本発明精製方法により、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィル、好ましくはフコキサンチン、ビオラキサンチン、アンテラキサンチン、ゼアキサンチン等を分離精製することができる。なお、ここで分離精製されたクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルの純度はＨＰＬＣおよび吸収スペクトルで測定することができる。

また、本発明精製方法において、特に、移動相となる２相系溶媒の下層にイオン対試薬を添加することにより高速向流クロマトグラフィーにおけるクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルのピークのテーリングを軽減し、ピーク分解能が高まるため好ましい。

上記で用いるイオン対試薬としては、酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸、蟻酸、酢酸等が挙げられ、これらの中でも酢酸アンモニウムが好ましい。２相系溶媒の下層へのイオン対試薬の添加量は、例えば、０.５Ｍ〜２０ｍＭ、好ましくは０.３Ｍ〜５０ｍＭである。

本発明精製方法で得られたクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルは、更に、カラム精製や再結晶を行い、純度を高めることができる。例えば、クロロフィルｃにクロロフィルｃ１とｃ２の両方が含まれていて、それを分離する場合はＨＰＬＣあるいはカラムクロマトグラフィーを行えばよく、クロロフィルｃにクロロフィルｃ２しか含まれない場合には再結晶だけでもよい。

上記した本発明精製方法により得られたクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルは、従来、クロロフィルｃやキサントフィルが配合されていた各種医薬品、化粧品、飲食品等に利用することができる。

また、クロロフィルｃについては、特に、色素増感太陽電池への応用、研究試薬等にも利用することができる

更に、キサントフィルについては、特に、脂肪組織における脂肪の燃焼を助けるので、脂肪燃焼用の飲食品、医薬品に利用することができる。

以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明は何らこれらの実施例に限定されるものではない。

参 考 例 １
試料の調製：
１００ｍｌの蓋付き瓶に、オキナワモズク盤状体９.８７ｇと、メタノールとアセトンの混液（アセトン：メタノール＝７：２（容量比））１００ｍｌを加え、氷で冷却しながら、１.５時間、９００ｒｐｍで撹拌した。次にこれを１０,０００ｒｐｍで５分間遠心するのを１セットとして、これを４セット行った。遠心後に得られた上清を採取し、エバポレーターで乾燥させたところ、乾燥物と、乾燥しなかった粘性の高い黄色い溶液５ｍｌが得られた。

上記で得られた乾燥物に、エタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）を１０ｍｌ添加し、完全に溶解させたところ、２層に分離した。この溶液を抽出液１とした。

また、上記で得られた黄色い溶液に、エタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）を１０ｍｌ添加し、完全に溶解させたところ、２層に分離した。この溶液を抽出液２とした。

実 施 例 １
ＨＳＣＣＣによるクロロフィルｃおよびキサントフィルの分離精製（１）：
参考例１で得られた抽出液１の下層の８ｍｌを試料とした。この試料について以下の条件でＨＳＣＣＣを行った。なお、ＨＳＣＣＣの固定相および移動相としては、ヘキサン：エタノール：アセトン：水＝５：５：５：２（容量比）を混合後、２相に分かれた、上層を固定相および下層を移動相とした。また、各フラクションは手動で捕集した。このＨＳＣＣＣの溶出曲線を図１に示した。
＜ＨＳＣＣＣ条件＞
ＨＳＣＣＣ装置：ＥＡＳＹ ＰＲＥＰ３２０（クツワ産業製）
カラム：セミプレップ３２０ｍｌ
カラム容量：３２０ｍｌ
流速：３.０ｍｌ／ｍｉｎ
回転速度：９６０ｒｐｍ
回転様式：縦型(コイルプラネット型)
送液ポンプ：Ｊａｓｃｏ ＰＵ−１５８０（日本分光製）
検出器：ＰＤＡ（２５０−８００ｎｍ）ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所製）

ＨＳＣＣＣの溶出曲線（図１）には、ピークが３つ認められた。次に、各ピークに該当するフラクションについて以下の条件でＨＰＬＣを行い、各ピークが何に由来するかを確認した（フラクション１〜６）。各フラクションのＨＰＬＣチャートを図２に示した。
＜ＨＰＬＣ条件＞
展開溶媒Ａ：メタノール（０.１Ｍ酢酸アンモニウム）：アセトニトリル：水＝９／７／ ４（ｖ／ｖ）
展開溶媒Ｂ：酢酸エチル：アセトニトリル＝７：３（ｖ／ｖ）
流速０.８ｍｌ／分
０−５分：展開溶媒Ａ１００％
５−２５分：展開溶媒Ａを１００％から展開溶媒Ｂを１００％へのリニアグラジエント
２５分以降：展開溶媒Ｂ１００％

フラクション１および２にはクロロフィルｃ１（Ｃｈｌ ｃ１）およびｃ２（Ｃｈｌ ｃ２）が認められ、フラクション３にはクロロフィルｃ１、ｃ２およびフコキサンチン（Ｆｘ）が認められ、フラクション４および５にはフコキサンチンが認められ、フラクション６にはフコキサンチンおよびビオラキサンチン（Ｖｘ）が認められた。以上の結果から、ピーク１がクロロフィルｃに基づくもの、ピーク２がフコキサンチンに基づくもの、ピーク３がビオラキサンチンに基づくものであることがわかった。そしてフラクション１および２を採取することによりクロロフィルｃが分離でき、フラクション４および５を採取すればフコキサンチンが分離できることがわかった。

実 施 例 ２
ＨＳＣＣＣによるクロロフィルｃおよびキサントフィルの分離精製（２）：
参考例１で得られた抽出液１の下層の１ｍｌと、抽出液２の下層の９ｍｌを混合したものを試料とした。この試料について、移動相としてエタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）を混合後、２層に分かれた下層に、更に、酢酸アンモニウムを１００ｍＭとなるように添加したものを用いる以外は実施例１と同様の条件でＨＳＣＣＣを行った。このＨＳＣＣＣの溶出曲線を図３に示した。

ＨＳＣＣＣの溶出曲線にはクロロフィルｃに基づくピーク１、フコキサンチンに基づくピーク２およびビオラキサンチンに基づくピーク３が認められた。特に実施例１と比べて、下層にイオン対試薬である酢酸アンモニウムを用いることにより、各ピークの分離が進んだ。また、回収したフコキサンチンに基づくピーク２を含むフラクション９を回収し、その吸収スペクトルを測定した（図４）。このスペクトルにはフコキサンチンの吸収スペクトルに基づく６６５ｎｍにシャープな吸収帯が認められた。

実 施 例 ３
ＨＳＣＣＣによるクロロフィルｃおよびキサントフィルの分離精製（３）：
参考例１の抽出液２と同様にして調製した抽出液の下層の１０ｍｌを試料とした。この試料について以下の条件でＨＳＣＣＣを行った。なお、ＨＳＣＣＣの固定相および移動相としては、酢酸エチル：ヘキサン：メタノール：水＝５：５：５：２（容量比）を混合後、２相に分かれた、上層を固定相および下層を移動相とした。また、移動相には酢酸アンモニウムを１００ｍＭとなるように添加した。更に、各フラクションは手動で捕集した。このＨＳＣＣＣの溶出曲線を図５に示した。
＜ＨＳＣＣＣ条件＞
ＨＳＣＣＣ装置：ＥＡＳＹ ＰＲＥＰ３２０（クツワ産業製）
カラム：セミプレップ３２０ｍｌ
カラム容量：３２０ｍｌ
流速：３.０ｍｌ／ｍｉｎ
回転速度：１０００ｒｐｍ
回転様式：縦型(コイルプラネット型)
送液ポンプ：Ｊａｓｃｏ ＰＵ−１５８０（日本分光製）
検出器：ＰＤＡ（２５０−８００ｎｍ）ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所製）

ＨＳＣＣＣの溶出曲線（図５）には、ピークが３つ認められた。各ピークに該当するフラクションの吸収スペクトルを測定したところ、ピーク１はクロロフィルｃ１、ピーク２はクロロフィルｃ２、ピーク３はフコキサンチンであった。この結果から、ＨＳＣＣＣの溶媒として酢酸エチル：ヘキサン：メタノール：水＝５：５：５：２（容量比）を用いてもクロロフィルｃおよびキサントフィルを分離精製できることがわかった。

本発明のクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法は、各種医薬品、化粧品、飲食品等に利用することができる純度の高いクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを容易に得ることができる。

Claims (5)

1. クロロフィルｃおよびキサントフィルを含有する褐藻類に、エタノール、アセトン、ヘキサン、水を５：５：５：２（容量比）またはメタノール、酢酸エチル、ヘキサン、水を５：５：５：２（容量比）を混和して得られる２相系溶媒の上層を固定相および下層を移動相に用いた高速向流クロマトグラフィーを行うことを特徴とするクロロフィルｃおよびキサントフィルを分離精製する方法。
2. キサントフィルが、フコキサンチンである請求項１記載のクロロフィルｃおよびキサントフィルを分離精製する方法。
3. 更に、２相系溶媒の下層にイオン対試薬を添加する請求項１または２記載のクロロフィルｃおよびキサントフィルを分離精製する方法。
4. イオン対試薬が、酢酸アンモニウムである請求項３記載のクロロフィルｃおよびキサントフィルを分離精製する方法。
5. クロロフィルｃおよびキサントフィルを含有する褐藻類が、オキナワモズク盤状体である請求項１〜４の何れかに記載のクロロフィルｃおよびキサントフィルを分離精製する方法。