CN101864191B

CN101864191B - 高纯度红曲色素组分的制备方法

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Publication number: CN101864191B
Application number: CN 201010205895
Authority: CN
Inventors: 郑允权; 郭养浩; 石贤爱
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2030-06-22
Also published as: CN101864191A

Abstract

本发明提供了一种制备高纯度红曲色素的新工艺。本发明以红曲米为原料，经粉碎后，采用萃取液提取-高速逆流色谱法分离-结晶的组合技术，分离纯化得到6种红曲色素组分，分别为红斑胺、红曲红胺、红曲素、红曲黄素、红斑素、红曲红素，各种色素纯度均大于95%，可用于食品、化妆品着色剂及保健品的制备。本发明分离用有机溶剂易回收使用且节省了分离材料消耗，克服了薄层层析法、高效液相色谱法、树脂法和硅胶柱层析法处理量小且较难实现单一组分色素有效分离纯化的问题。本发明采用萃取液提取-高速逆流色谱法分离-结晶的组合技术，制备得到了6种高纯度红曲色素晶体。具有操作步骤简单和收率高的优点。

Description

高纯度红曲色素组分的制备方法

技术领域

本发明属生化制品技术领域，具体涉及一种高纯度红曲色素的制备方法。

背景技术

高速逆流色谱（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC）是利用溶质在两种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不同，从而进行分离的色谱法。高速逆流色谱技术无需固相载体支持，避免了因发生不可逆吸附而引起的样品损失、变性等问题，分离用有机溶剂易回收使用且节省了分离材料消耗。该项技术已广泛应用于黄酮、生物碱、植物多酚、酯类、萜类、木脂素、香豆素、皂苷等各种天然植物化学成份及抗生素的分离制备。高速逆流色谱法制备6种高纯度红曲色素（纯度大于95%）未见报道。

红曲霉在固态培养（或液态培养）过程中，产生大量次级代谢产物。其中最主要的一类次级代谢产物为红曲色素，属氧杂菲酮（Azaphilone）化合物，由聚酮合成酶（Polyketide Synthases，PKS）代谢途径合成。红曲霉发酵产品中含有十多种Azaphilone类化合物，红曲色素主要为6种组分：2种红色素（Rubropunctatamine、Monascorubramine）、2种黄色素（Monascin、Ankaflavin）和2种橙色素（Rubropunctatin、Monascorubrin）。

目前国内外市场上，红曲霉发酵产品主要包括色素红曲粉、红曲红色素和红曲黄色素。现有红曲色素产品主要为多种色素的混合物且纯度不高，不同色调的色素组分比例不同，造成色价和色调都不稳定。若能分离纯化单一组成结构的红曲色素产品，不同色调色素分开使用，将开拓天然红曲色素的应用范围。将不同色调的色素分开，按需进行调配，可以大大提高产品着色的稳定性，不仅可以填补国内高档食用色素的空白，而且在国际市场极具竞争优势。另外高纯度红曲色素组分及其衍生物的制备也有利于新型药物研发和制药产业链的延伸。

上述6种色素组分在化学结构和理化性质上十分相似，分离纯化较为困难。目前市场上未见高纯度的红曲色素产品，也未见单一组分的红曲色素化合物标准品。张慧娟[1]采用二次薄层层析法分离纯化红斑红曲素，钟立人[2]采用高效液相色谱研究红曲色素组分的分离，这些方法仅能纯化得到毫克级红曲色素。连喜军[3]采用树脂法分离红曲黄色素和红色素，但各种树脂对红曲色素的吸附量均低于52 U/g。代春华[4]采用硅胶柱层析法分离红曲黄色素，处理量小且较难实现单一组分红曲色素的分离纯化。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高纯度红曲色素的制备工艺。

本发明以红曲米为原料，经粉碎后，采用萃取液提取-高速逆流色谱法分离-结晶的组合技术，分离纯化得到6种红曲色素组分，分别为红斑胺（Rubropunctamine）、红曲红胺（Monascorubramine）、红曲素（Monascin）、红曲黄素（Ankaflavin）、红斑素（Rubropunctatin）、红曲红素（Monascorubrine））晶体，各种色素纯度均大于95%，可用于食品、化妆品着色剂及保健品的制备。

本发明以红曲米为原料，经粉碎、萃取液提取得到色素粗提物，然后经过制备型高速逆流色谱仪分离，根据紫外检测器谱图分别收集6个色素组分进行结晶操作，得到6种高纯度红曲色素组分；所述6种高纯度红曲色素组分为红斑胺、红曲红胺、红曲素、红曲黄素、红斑素、红曲红素，纯度大于95%。

具体制备步骤如下：

原料采用色价为800-6000U/g（E

Figure 2010102058954100002DEST_PATH_IMAGE001

505nm， GB 4926-2008）的红曲米，粉碎至粒径100-1000 μm，然后按红曲米粉与萃取液比为1：5-20（w/v）的配比置于15-60℃条件下浸泡、搅拌或回流提取，提取液经过滤、真空浓缩，析出色素粗提物；所述萃取液采用有机溶剂与水按10：1-10配比（v/v）混合；所述有机溶剂包括甲醇、乙醇或丙酮。色素粗提物采用高速逆流色谱法分离纯化，步骤如下：将溶剂A，B，C，D组分按体积比2.5-10：0-7.5：3-8：2.5-7.5（v：v：v：v）置于漏斗中，摇匀静置分层，待平衡后，将上相和下相分开，上相作为固定相使用，下相作为流动相使用；进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速100-1000转，将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，根据紫外检测器谱图收集目标组分；所述的溶剂A选自石油醚、正已烷、环已烷或正庚烷中的一种；所述的溶剂B选自乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷或氯仿中的一种；所述的溶剂C选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或丁香酮中的一种；所述的溶剂D为水；根据紫外检测器谱图分别收集6个色素组分进行结晶操作，所述的结晶操作将收集到的6个色素组分分别真空浓缩至干，再用结晶溶液溶解，30-60℃真空浓缩至过饱和，然后缓慢降温至10-30℃即析出大量色素晶体；所述的结晶溶液为有机溶剂与水按10：1-10（v/v）配比混合而成；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿或丙酮中的一种或几种混合。

本发明的显著优点：本发明通过高速逆流色谱的方法，实现了6种红曲色素的分离纯化。分离用有机溶剂易回收使用且节省了分离材料消耗，克服了薄层层析法、高效液相色谱法、树脂法和硅胶柱层析法处理量小且较难实现单一组分色素有效分离纯化的问题。本发明采用萃取液提取-高速逆流色谱法分离-结晶的组合技术，制备得到了6种高纯度红曲色素晶体。具有操作步骤简单和收率高的优点。

附图说明

图1为纯化后6种红曲色素的HPLC谱图；

图2为纯化后6种红曲色素的光谱图；

图3为纯化后6种红曲色素的HPLC-MS图；其中R1、R2、Y1、Y2、O1和O2分别为Rubropunctatamine、Monascorubramine、Monascin、Ankaflavin、Rubropunctatin和Monascorubrin。

具体实施方式

原料采用色价为800-6000U/g（E

505nm， GB 4926-2008）的红曲米，粉碎至粒径100-1000 μm，然后按红曲米粉与萃取液比为1：5-20（w/v）的配比置于15-60℃条件下浸泡、搅拌或回流提取，提取液经过滤、真空浓缩至萃取液体积1/4-1/2即析出色素粗提物。色素粗提物经过制备型高速逆流色谱仪分离，根据紫外检测器谱图分别收集6个色素组分进行结晶操作，得到6种高纯度红曲色素组分。

其中所述萃取液采用有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮）与水按10：1-10配比（v/v）混合。

所述色素粗提物采用高速逆流色谱法分离纯化，具体步骤如下：将溶剂A，B，C，D组分按体积比2.5-10：0-7.5：3-8：2.5-7.5（v：v：v：v）置于漏斗中，摇匀静置分层。待平衡后，将上相和下相分开，上相作为固定相使用，下相作为流动相使用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速100-1000转，将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，根据紫外检测器谱图收集目标组分。

所述的溶剂A选自石油醚、正已烷、环已烷或正庚烷中的一种；所述的溶剂B选自乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷或氯仿中的一种；所述的溶剂C选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或丁香酮中的一种；所述的溶剂D为水。

所述的结晶操作将收集到的目标色素组分样品分别置于烧瓶中真空浓缩至干，以结晶溶液溶解，30-60℃真空浓缩至过饱和，然后缓慢降温至10-30℃即析出大量色素晶体；所述的结晶溶液为有机溶剂与水按10：1-10（v/v）配比混合而成；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿或丙酮中的一种或几种混合。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

红曲米色价5100 U/g，含红色素（红斑胺和红曲红胺）10.1 g/Kg，橙色素（红斑素和红曲红素）48.3 g/Kg，黄色素（红曲素和红曲黄素）41.9 g/Kg。粉碎至粒径0.1mm，采用70%（重量比，下同）乙醇溶液萃取（60℃水浴，固液比1：10）后，真空浓缩至原体积1/2即析出红曲色素粗提物，得率10.1%。

采用柱体积为300mL的高速逆流色谱系统分离。选取正已烷-甲醇-水作为溶剂体系，按10:7.5:2.5（v：v：v：v）配比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。取上层为固定相，下层为流动相。

称取200mg红曲色素粗提物，以20mL固定相溶解待用。进样前，用固定相充满整个柱体积，调整主机转速至800rpm/min，将流动相以4ml/min流速泵入柱内建立动态平衡后，采用进样阀进样；然后分别收集目标色素组分。

目标组分分离液置60℃条件下真空浓缩至干，收集色素纯化组分用90%甲醇溶液溶解，置60℃条件下真空浓缩至过饱和，缓慢降温至10℃即析出大部分色素晶体，R1、R2、Y1、Y2、O1和O2的收率分别为83.22%、84.78%、84.22%、82.96%、82.54%和81.40%。

结晶样品采用HPLC归一化法测定纯度，结果如图1所示， R1、R2、Y1、Y2、O1和O2纯度分别为99.1%、99.3%、99.5%、99.1%、99.9%和99.6%。R1、R2、Y1、Y2、O1和O2的光谱图如图2所示，可将6种色素分为三组。第一组为红色素，包括2种红色素物质（R1和R2），其光谱图在304、413和524 nm处有特征吸收峰，最大吸收峰位于304nm。第二组为黄色素，包括2种黄色素物质（Y1和Y2），其光谱图在231、291和387 nm处有特征吸收峰，最大吸收峰位于391 nm。第三组为橙色素，包括2种橙色素物质（O1和O2），其光谱图有四个特征吸收峰，分别在波长213、247、286和467 nm处，最大吸收峰位于467 nm。R1、R2、Y1、Y2、O1和O2的HPLC-MS图如图3所示，其分子量分别为353、381、358、386、354和382。根据光谱图和分子量，推断R1/R2、Y1/Y2和O1/O2分别为Rubropunctatamine、Monascorubramine、Monascin、Ankaflavin、Rubropunctatin和Monascorubrin。

实施例2

红曲米色价3000 U/g，粉碎至粒径1 mm，采用70%（重量比，下同）甲醇溶液萃取（60℃水浴，固液比1：15）后，真空浓缩至原体积1/3即析出红曲色素粗提物，得率6.7%。

采用柱体积为1000mL的高速逆流色谱系统分离。选取石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水作为溶剂体系，按2.5:7.5:5:5（v：v：v：v）配比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。取上层为固定相，下层为流动相。

称取800mg红曲色素粗提物，以50mL固定相溶解待用。进样前，用固定相充满整个柱体积，调整主机转速至900rpm/min，将流动相以10ml/min流速泵入柱内建立动态平衡后，采用进样阀进样；然后分别收集目标色素组分。

目标组分分离液置60℃条件下真空浓缩至干，收集色素纯化组分用85%丙酮溶液溶解，置48℃条件下真空浓缩至过饱和，缓慢降温至15℃即析出大部分色素晶体，R1、R2、Y1、Y2、O1和O2的得率分别为80.54%、82.24%、81.40%、82.75%、84.74%和85.52%。采用HPLC测定结果表明，其纯度分别为99.5%、99.4%、99.2%、99.5%、99.7%和99.7%。

实施例3

红曲米色价4000 U/g，粉碎至粒径1 mm，采用90%丙酮水溶液萃取（60℃水浴，固液比1：5），萃取后的提取液真空浓缩至原体积1/3即析出红曲色素组份粗提物，得率8.5%。

采用柱体积为1000mL的高速逆流色谱系统分离。选取环已烷-氯仿-异丙醇-水作为溶剂体系，按5:6:8:2.5（v：v：v：v）配比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。取上层为固定相，下层为流动相。

目标组分分离液置60℃条件下真空浓缩至干，收集色素纯化组分用70%乙醇溶液溶解，置60℃条件下真空浓缩至过饱和，缓慢降温至10℃即析出大部分色素晶体，R1、R2、Y1、Y2、O1和O2的得率分别为82.11%、83.35%、82.78%、84.63%、81.93%和83.68%。采用HPLC测定结果表明，其纯度分别为98.3%、98.7%、98.6%、99.2%、99.6%和98.7%。

Claims

1.一种红曲色素组分的制备方法，其特征在于：以红曲米为原料，经粉碎、萃取液提取得到色素粗提物，然后经过制备型高速逆流色谱仪分离，根据紫外检测器谱图分别收集6个色素组分进行结晶操作，得到6种高纯度红曲色素组分；

所述6种高纯度红曲色素组分分别为红斑胺、红曲红胺、红曲素、红曲黄素、红斑素、红曲红素，纯度大于95%；

原料采用色价为800-6000U/g的红曲米，粉碎至粒径100-1000 μm，然后按红曲米粉与萃取液w/v 1：5-20的配比置于15-60℃条件下浸泡、搅拌或回流提取，提取液经过滤、真空浓缩，析出色素粗提物；

所述萃取液采用有机溶剂与水按10：1-10体积配比混合；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇或丙酮；

色素粗提物采用高速逆流色谱法分离纯化，步骤如下：将溶剂A，B，C，D组分按体积比2.5-10：0-7.5：3-8：2.5-7.5置于漏斗中，摇匀静置分层，待平衡后，将上相和下相分开，上相作为固定相使用，下相作为流动相使用；进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速100-1000转，将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，根据紫外检测器谱图收集目标组分；

所述的溶剂A选自石油醚、正已烷、环已烷或正庚烷中的一种；所述的溶剂B选自乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷或氯仿中的一种；所述的溶剂C选自甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种；所述的溶剂D为水。

2.根据权利要求1所述的红曲色素组分的制备方法，其特征在于：所述的结晶操作是将收集到的6个色素组分分别真空浓缩至干，再用结晶溶液溶解，30-60℃真空浓缩至过饱和，然后缓慢降温至10-30℃即析出色素晶体。

3.根据权利要求2所述的红曲色素组分的制备方法，其特征在于：所述的结晶溶液为有机溶剂与水按10：1-10体积配比混合而成；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿或丙酮中的一种或几种混合。