CN106866340B - 六氢番茄红素和八氢番茄红素的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种采用高速逆流色谱法分离高纯度六氢番茄红素和八氢番茄红素的方法。所述方法仅需一次操作即可由工业产品或副产品提取高纯度的天然六氢番茄红素和八氢番茄红素。本发明的方法工艺简单、操作方便、样品损耗少、高效快速、所得产品纯度高，是一种适合制备高纯度六氢番茄红素和/或八氢番茄红素的良好方法。
Description
技术领域
本发明属于食品加工领域，涉及从番茄加工工业粗产品中一次性高纯度分离六氢番茄红素和八氢番茄红素的方法。
背景技术
番茄红素是一种类胡萝卜素，具有明亮的红色。天然存在的番茄红素及其前体物质以全反式结构为主，经加热或者其它处理手段后全反式结构会发生顺反异构变化。番茄红素的分子式为C40H56(式a)，其为由11个共轭双键和2个非共轭双键构成的直链型多不饱和烯烃。研究发现，番茄红素具有抗氧化活性、抗衰老活性、吸收可见光及紫外线从而减少日光性损伤的活性。不论是作为有益健康的保健品还是作为色素，均受到人们广泛的关注。
六氢番茄红素和八氢番茄红素是类胡萝卜素和番茄红素天然合成途径的中间产物，分子式分别为C40H62和C40H64(式b和式c)。六氢番茄红素具有彼此共轭的五个双键，而八氢番茄红素具有彼此共轭的三个双键。虽然早在上世纪五十年代就有科研人员注意到这两种番茄红素前体的存在，但是对这两种无色物质类胡萝卜素的研究相对较少。
式a：全反式番茄红素
式b：全反式六氢番茄红素
式c：全反式八氢番茄红素
近年来，科研人员逐渐开始关注六氢番茄红素和八氢番茄红素，发现它们作为类胡萝卜素的前体也具有重要的作用。Britton等人通过对各种食品进行对比发现，六氢番茄红素和八氢番茄红素在杏、胡萝卜、番茄及其制品、西瓜等水果中均有较高含量(G.Britton,F.Khachik,Carotenoids in food，G.Britton，S.Liaaen-Jensen，H.Pfander(著)，Carotenoids第5卷：Nutrition and Health，Birkhauser.Basel，Boston，Berlin，2009：45-66)。特别是在番茄酱中，八氢番茄红素的含量高达4.94mg/L，而六氢番茄红素达2.85mg/L。2014年A.Martinez等人进行了番茄红素、六氢番茄红素及八氢番茄红素的ABTS自由基阳离子脱色试验，发现六氢番茄红素和八氢番茄红素的存在可以使所测组合物拥有更好的ABTS阳离子捕捉能力(A.Martinez，C.M.Stinco，A.J.Melendez-Martinez，J.Phys.Chem.，2014(118)：9819-9825)。Basu等人研究发现，番茄产品对人的健康有益，其中的番茄红素和存在于番茄中的其它物质(如六氢番茄红素和八氢番茄红素)具备协同效应(A.Basu，V.Imrhan，Eur.J.Clin.Nutr.，2007(61)：295-303)。Mathews-Roth的研究发现，在UV-B引发的肿瘤试验中，八氢番茄红素可以使得所测试小鼠的皮肤癌肿瘤的出现推迟并减少肿瘤数量(M.M.Mathews-Roth，Oncology，1982(39)：33-37)。发明专利申请WO03/041678也提到六氢番茄红素可保护皮肤免受氧或者UV辐射引起的损害。此外，发明专利申请CN1533269A建议将包含番茄红素(3-15％)、八氢番茄红素(0.3-1％)、六氢番茄红素(0.3-1％)的类胡萝卜素混合物与其它常规抗高血压药联合进行给药。发明专利CN100391433C报导了采用含有天然来源的番茄红素、八氢番茄红素、六氢番茄红素及其它类胡萝卜素和VE的组合物制备用于防护皮肤免遭由日光中紫外线辐射引起的损伤。该文献提到天然番茄红素组合物在防护皮肤免遭紫外线损伤时比合成的番茄红素更为有效，且在天然番茄红素组合物中加入八氢番茄红素和/或六氢番茄红素能有效提高该组合物防护皮肤免遭紫外线损伤的效果。由此可以看出，针对动物体和人体的多种研究均表明，六氢番茄红素和八氢番茄红素这两种无色类胡萝卜素能够单独或者与其它功能组分协同，参与生物代谢过程并提供有益功能。
本领域公开了多种制备六氢番茄红素和/或八氢番茄红素的方法。然而，由于六氢番茄红素和八氢番茄红素在天然产物中的含量很低，而且性质又不稳定，对碱、光及氧等都非常敏感，因此无论是分离耗时过长或者步骤过多，均会导致产物损耗，收率低下。例如，发明专利申请CN101035748A介绍了采用化学合成方法制备全反式六氢番茄红素的方法，此方法需要使用鏻盐，且反应需要在强酸和强碱中进行，产物为顺反异构体的混合物。该反应流程长、工艺步骤多、对环境不友好。
另一方面，上世纪80年代由美国国立卫生院的Yoichiro Ito博士提出的高速逆流色谱(High-Speed CounterCurrent Chromatography，HSCCC)已被应用于多种天然产物的分离纯化过程。高速逆流色谱基于液液分配的基本原理，不采用任何固态的支撑物(如柱填料、吸附剂、亲和剂、板床、筛膜等)，其固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附。该方法具有无样品的损失和污染、高效、快速和大制备量分离等优点。特别地，对于天然产物复杂混合物中特定成分的高纯度分离纯化，高速逆流色谱技术具有以下优势：
(1)分离效率高：分配分离在旋转运动中进行，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场甩成微小的颗粒，待分离的样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并能在这些颗粒震荡与对流的环境中有效传递，实现上万次高效连续的溶剂萃取过程，达到充分分离与纯化。这样的一步分离就能够将复杂体系中的特定成分分离到98％以上。
(2)使用成本低：分离过程不是吸附与淋洗，而是对流穿透的过程，因此不使用填料，与使用填料的制备柱色谱相比可以节省昂贵的填料费用。并且，在大规模生产中可实现溶剂的回收再利用，运行使用的后续投入很低。
(3)制备量大：由于不使用固相填料，没有填料在柱内的占空体积，柱内空间全部是有效空间，从而负载能力强、制备量大。
(4)回收率高：由于无不可逆吸附，避免了污染、变性和填料失活造成的样品损失，样品的回收率高。
(5)洁净环保：整个实验生产过程可以封闭进行，避免溶剂挥发造成的环境污染及对操作人员的身体伤害。
(6)工艺放大好：在小型仪器上摸索的工艺条件易于在大型仪器和生产过程中实现。
就HSCCC在分离番茄红素及其前体化合物中的用途而言，Yun Wei等讨论了采用制备级高速逆流从番茄酱中提取番茄红素的方法，得到最佳分离体系为正己烷：二氯甲烷：乙腈＝10：3.5：6.5(Yun Wei，Tianyou Zhang，Guoqing Xu，Yoichiro Ito，Journal ofChromatography A,2001(929)：169-173)。Susanne Baldermann等讨论了采用高速逆流方法分离全反式番茄红素的方法并考察了温度对分离效果的影响(Susanne Baldermann，Katharina Ropeter，Nils
Peter Fleischmann，J.Chromatogr.A，2008(1192)：191-193)。中国专利CN1120862C也介绍了一种用高速逆流色谱从番茄红素粗品中分离制备出高纯度单体番茄红素的方法，可得到纯度在95％以上的番茄红素单体。但是，这些研究中只讨论了番茄红素的分离方法，并没有涉及六氢番茄红素和八氢番茄红素分离。
发明内容
为了解决现有技术由于物料体系组分复杂、工艺和步骤多、实验流程长、溶剂和能量消耗大(即生产效率低)的缺陷，本发明提供了一种六氢番茄红素和八氢番茄红素的分离方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将一种或多种非极性溶剂与一种或多种极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；
(2)将番茄红素油树脂溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；
(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，一次得到六氢番茄红素馏分与流动相的混合液以及八氢番茄红素馏分与流动相的混合液；
(4)分别去除所述步骤(3)获得的六氢番茄红素馏分和八氢番茄红素馏分中的流动相溶剂，获得六氢番茄红素产品和八氢番茄红素产品。
具体而言，本发明是通过如下技术方案实现的：
1.一种六氢番茄红素和八氢番茄红素的分离方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将一种或多种非极性溶剂与一种或多种极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；
(2)将番茄红素油树脂溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；
(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，一次得到六氢番茄红素馏分与流动相的混合液以及八氢番茄红素馏分与流动相的混合液；
(4)分别去除所述步骤(3)获得的六氢番茄红素馏分和八氢番茄红素馏分中的流动相溶剂，获得六氢番茄红素产品和八氢番茄红素产品。
2.如段落1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为介电常数小于2.8的一种或多种溶剂。
3.如段落1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为介电常数大于3.6的一种或多种溶剂。
4.如段落1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为由碳数5-7的正烷烃、石油醚和二氯甲烷组成的组中的一种或多种。
5.如段落4所述的方法，其特征在于，所述非极性溶剂为碳数5-7的正烷烃与二氯甲烷的混合溶剂。
6.如段落1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为选自于由乙腈、乙酸、乙酸乙酯和丙酮组成的组的一种或多种。
7.如段落1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正戊烷与二氯甲烷的混合溶剂、正己烷与二氯甲烷的混合溶剂或正庚烷与二氯甲烷的混合溶剂，且所述极性溶剂为乙腈。
8.如段落7所述的方法，其特征在于，所述碳数5-7的正烷烃、二氯甲烷和乙腈的比例为(5-30):(1-20):(5-30)(v/v/v)。
9.如段落8所述的方法，其特征在于，所述碳数5-7的正烷烃、二氯甲烷和乙腈的比例为(5-25):(2-10):(5-20)(v/v/v)。
10.如段落1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述充分混合后静置分相为：
将所述一种或多种非极性溶剂以及所述一种或多种极性溶剂加入至分液漏斗，经振摇充分混合后静置分相，获得两相混合液。
11.如段落1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在所述静置分相后，分别收集所述两相混合液的上相溶剂和下相溶剂，分别对所述上相溶剂和下相溶剂进行脱气处理。
12.如段落11所述的方法，其特征在于，所述脱气处理在超声振荡器中进行，脱气完成后静置，使得溶剂恢复至室温。
13.如段落1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述番茄红素油树脂为番茄加工工业产品或副产品。
14.如段落13所述的方法，其特征在于，所述番茄红素油树脂为番茄酱、番茄皮渣或番茄纤维产品提取所得。
15.如段落1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的设定转速为700-900rpm。
16.如段落15所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱仪的设定转速为800-900rpm。
17.如段落1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的柱温为5-25℃。
18.如段落1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述流动相的流速为2-10ml/min。
19.如段落1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的检测器的波长分别为286nm和348nm。
20.如段落1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，借助氮吹仪或旋转蒸发仪实施所述溶剂的去除。
本发明所述的“室温”是指环境温度在16-26℃的温度范围。
有益效果
本发明针对在对复杂体系进行高效提纯时传统方法效能低的问题，采用高速逆流色谱法，仅需一次操作即可由工业产品或副产品提取高纯度的天然六氢番茄红素和八氢番茄红素。本发明的方法工艺简单、操作方便、样品损耗少、高效快速、所得产品纯度高，是一种适合制备高纯度番茄红素前体的良好方法。
附图说明
图1是根据本发明实施例4，利用高速逆流色谱分离番茄红素及其前体混合物的色谱图。色谱图中的各峰为：峰1和峰2为杂质混合物，峰3是番茄红素，峰4是六氢番茄红素，而峰5为八氢番茄红素。其中，出现峰4的色谱图(黑色)是在348nm的检测波长下得到的，出现峰5的色谱图(灰色)是在286nm的检测波长下得到的。
图2为根据本发明实施例4，利用高速逆流色谱分离过程中在不同时间获得的产品。从左至右分别是：起始物(番茄红素油树脂)；①10-20min(对应于峰1，淡黄色)；②35-39min(对应于峰2，浅黄色)；③55-65min(对应于番茄红素，琥珀色)；④110-130min(对应于六氢番茄红素，无色)；⑤130-160min(对应于八氢番茄红素，无色)。
具体实施方式
下文将详细阐述本发明。
根据一些实施方式，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为介电常数小于2.8的一种或多种溶剂。优选地，所述非极性溶剂选自于由碳数5-7的正烷烃、石油醚和二氯甲烷组成的组中的一种或多种。其中，所述碳数5-7的正烷烃分别为正戊烷、正己烷和正庚烷。优选地，所述非极性溶剂为正戊烷与二氯甲烷的混合溶剂、正己烷与二氯甲烷的混合溶剂或正庚烷与二氯甲烷的混合溶剂。
根据一些实施方式，其特征在于，所述步骤(1)中，所述极性溶剂为介电常数大于3.6的一种或多种溶剂。所述极性溶剂为选自于由乙腈、乙酸、乙酸乙酯和丙酮组成的组的一种或多种。优选地，所述极性溶剂为乙腈。
在一个优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正戊烷与二氯甲烷，所述极性溶剂为乙腈。优选地，所述正戊烷、二氯甲烷和乙腈的比例为正戊烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-30):(1-20):(5-30)(v/v/v)；更优选地，所述正戊烷、二氯甲烷和乙腈的比例为正戊烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-25):(2-10):(5-20)(v/v/v)。
在一个优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正己烷与二氯甲烷，所述极性溶剂为乙腈。优选地，所述正己烷、二氯甲烷和乙腈的比例为正己烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-30):(1-20):(5-30)(v/v/v)；更优选地，所述正己烷、二氯甲烷和乙腈的比例为正己烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-25):(2-10):(5-20)(v/v/v)。
在一个优选的实施方式中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正庚烷与二氯甲烷，所述极性溶剂为乙腈。优选地，所述正庚烷、二氯甲烷和乙腈的比例为正庚烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-30):(1-20):(5-30)(v/v/v)；更优选地，所述正庚烷、二氯甲烷和乙腈的比例为正庚烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-25):(2-10):(5-20)(v/v/v)。
根据一些实施方式，所述步骤(1)中，所述充分混合后静置分相为：将所述一种或多种极性溶剂以及所述一种或多种非极性溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液。
根据一些实施方式，所述步骤(1)中，在所述静置分相后，分别收集所述两相混合液的上相溶剂和下相溶剂，分别对所述上相溶剂和下相溶剂进行脱气处理。
根据一些实施方式，所述脱气处理在超声振荡器中进行，脱气完成后静置，使得溶剂恢复至室温。
根据一些实施方式，所述步骤(2)中，所述番茄红素油树脂为番茄加工工业产品或副产品提取所得，特别地为番茄酱、番茄皮渣或番茄纤维产品。
本发明使用的高效逆流色谱技术的一般操作过程为本领域所公知。具体而言，以非极性-极性两相溶剂的一个相作为固定相，另一相作为流动相，将待分离样品溶解于其中一相中。首先，将固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速、柱温和检测波长，待系统稳定后，以一定的流速泵入流动相进行平衡；待平衡后，加入待分离样品；根据检测器图谱的出峰情况，收集各馏分与流动相的混合液。
就本发明而言，以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，将番茄红素油树脂溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品。
根据一些实施方式，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的设定转速为700-900rpm；优选地，高速逆流色谱仪的设定转速为800-900rpm。
根据一些实施方式，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的柱温为5-25℃。
根据一些实施方式，所述步骤(3)中，所述流动相的流速为2-10ml/min。
根据一些实施方式，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的检测器的波长为286nm和348nm。
根据一些实施方式，所述步骤(4)中，借助氮吹仪或旋转蒸发仪实施所述溶剂的去除。
实施例
借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。
本发明的实施例所使用的正戊烷、正己烷、正庚烷、二氯甲烷和乙腈均为北京化学试剂公司生产的分析纯试剂，水为去离子水，番茄红素油树脂购自中粮屯河。番茄红素油树脂中番茄红素含量为6.24wt％；因无法获得标准品，该番茄红素油树脂中的六氢番茄红素和八氢番茄红素含量未知。
本发明的实施例所使用的高速逆流色谱仪为同田公司生产的TBE300C型高速逆流色谱，高效液相色谱仪为安捷伦1260型高效液相色谱。
在本发明中，对分离后的番茄红素及其前体物质进行测试的方法参考吴增宝等(吴增宝、薛琳、田珊珊、朱启军、田洁、彭代萍，安徽农业科学，2014，42(14)：4436—4437)的分析方法。采用安捷伦1260型高效液相色谱，配备DAD检测器。系统耐受正相溶剂。采用甲醇-甲基叔丁基醚为流动相，均为色谱纯。根据吴增宝等，以波长286nm产生的色谱图作为八氢番茄红素(phytoene)的色谱信号；以波长348nm产生的色谱图作为六氢番茄红素(phytofluene)和番茄红素的色谱信号。同时，DAD检测器可实时在线记录每个色谱峰的紫外-可见吸收光谱。
实施例1
采用如下步骤实施六氢番茄红素和八氢番茄红素的纯化。
(1)按照正己烷:二氯甲烷:乙腈＝5:2:5(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。
(2)取1.0g番茄红素油树脂，将其溶解于20ml步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；
(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为800rpm、柱温为10℃，待系统稳定后，以2ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入，在286nm和348nm的检测波长下，根据色谱图的出峰位置收集各样品馏分。将收集到的馏分放入旋转蒸发仪，去除溶剂，进行HPLC分析，得到六氢番茄红素和八氢番茄红素，根据峰面积归一法测得纯度分别为95％和96％。
实施例2
采用如下步骤实施六氢番茄红素和八氢番茄红素的纯化。
(1)按照正戊烷:二氯甲烷:乙腈＝25:8:25(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。
(2)取1.0g番茄红素油树脂，将其溶解于20ml步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；
(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为800rpm、柱温为5℃，待系统稳定后，以10ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入，在286nm和348nm波长下，根据色谱图的出峰位置收集各样品馏分。将收集到的馏分放入旋转蒸发仪，去除溶剂，进行HPLC分析，得到六氢番茄红素和八氢番茄红素，根据峰面积归一法测得纯度分别为84％和82％。
实施例3
采用如下步骤实施六氢番茄红素和八氢番茄红素的纯化。
(1)按照正庚烷:二氯甲烷:乙腈＝20:15:13(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。
(2)取1.0g番茄红素油树脂，将其溶解于20ml步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；
(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为900rpm、柱温为25℃，待系统稳定后，以5ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入，在286nm和348nm波长下，据检测器图谱出峰位置收集各样品馏分。将收集到的馏分放入旋转蒸发仪，去除溶剂，进行HPLC分析，得到六氢番茄红素和八氢番茄红素，根据峰面积归一法测得纯度分别为80％和85％。
实施例4
采用如下步骤实施六氢番茄红素和八氢番茄红素的纯化。
(1)按照正己烷:二氯甲烷:乙腈＝20:7:13(v/v/v)的比例，将上述三种溶剂加入至分液漏斗，振摇2-3次充分混合后静置分相，获得两相混合液；用干净的试剂瓶分别收集该两相混合液中的上相溶剂和下相溶剂，分别放入超声振荡器进行脱气处理，脱气处理15min后静置，等待溶剂恢复至室温。
(2)取1.0g番茄红素油树脂，将其溶解于20ml步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；
(3)以步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，将其泵入高速逆流色谱仪的色谱柱内，待液体充满后启动主机，设定转速为800rpm、柱温为10℃，待系统稳定后，以10ml/min流速泵入下相溶剂作为流动相进行平衡；待平衡后，通过进样阀将步骤(2)的待分离样品加入，在286nm和348nm波长下，据检测器图谱出峰位置收集各样品馏分。将收集到的馏分放入旋转蒸发仪，去除溶剂，进行HPLC分析，得到六氢番茄红素和八氢番茄红素，根据峰面积归一法测得纯度分别为96％和97％。
Claims (12)
1.一种六氢番茄红素和八氢番茄红素的分离方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将一种或多种非极性溶剂与一种或多种极性溶剂充分混合后静置分相，获得上相溶剂和下相溶剂；
(2)将番茄红素油树脂溶解于所述步骤(1)获得的上相溶剂，作为待分离样品；
(3)以所述步骤(1)获得的上相溶剂作为固定相，以所述步骤(1)获得的下相溶剂作为流动相，通过高速逆流色谱对步骤(2)的待分离样品进行分离，一次得到六氢番茄红素馏分与流动相的混合液以及八氢番茄红素馏分与流动相的混合液；
(4)分别去除所述步骤(3)获得的六氢番茄红素馏分和八氢番茄红素馏分中的流动相溶剂，获得六氢番茄红素产品和八氢番茄红素产品，
其中，所述步骤(1)中，所述非极性溶剂为正戊烷与二氯甲烷的混合溶剂、正己烷与二氯甲烷的混合溶剂或正庚烷与二氯甲烷的混合溶剂，且所述极性溶剂为乙腈，并且，所述非极性溶剂和所述极性溶剂的种类和配比选自如下中的一种：正己烷:二氯甲烷:乙腈＝5:2:5(v/v/v)、正戊烷:二氯甲烷:乙腈＝25:8:25(v/v/v)、正庚烷:二氯甲烷:乙腈＝20:15:13(v/v/v)或正己烷:二氯甲烷:乙腈＝20:7:13(v/v/v)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述充分混合后静置分相为：
将所述一种或多种非极性溶剂以及所述一种或多种极性溶剂加入至分液漏斗，经振摇充分混合后静置分相，获得两相混合液。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在所述静置分相后，分别收集所述两相混合液的上相溶剂和下相溶剂，分别对所述上相溶剂和下相溶剂进行脱气处理。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脱气处理在超声振荡器中进行，脱气完成后静置，使得溶剂恢复至室温。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述番茄红素油树脂为番茄加工工业产品或副产品。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述番茄红素油树脂为番茄酱、番茄皮渣或番茄纤维产品提取所得。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的设定转速为700-900rpm。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱仪的设定转速为800-900rpm。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的柱温为5-25℃。
10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述流动相的流速为2-10ml/min。
11.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述高速逆流色谱仪的检测器的波长分别为286nm和348nm。
12.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，借助氮吹仪或旋转蒸发仪实施所述溶剂的去除。
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