CN103387967B - 基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法，包括以下步骤：（1）将水溶性咪唑基离子液体加入到溶液A中，A溶液为pH值为4-6.5的、质量浓度为3-6%的NaCl的乙酸钠缓冲溶液；（2）将鸡蛋清溶菌酶加入到步骤（1）获得的液体中，使所述溶菌酶在20-30℃下过饱和比为1-3；（3）在搅拌下,将步骤（2）获得的液体冷却至析晶浑浊养晶，降温得结晶液，过滤，晶体干燥，得溶菌酶晶体产品，4℃低温保藏。本发明过程控制容易实现，操作方便。制备的溶菌酶晶体产品粒度均一，变异系数小，主粒度达到100μm以上，质量收率90%以上，晶体外观形貌完整，溶菌酶晶体相对活性明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法，适用于医药，化工及食品领域溶菌酶的生产领域。
背景技术
溶菌酶是一种重要的生物大分子，具有多种药理作用，随着生物科学的发展，溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶，用以制造和提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等。同时它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，可广泛应用于食品防腐、医药制剂、日用化工等行业。在生产及纯化溶菌酶过程中，由于工艺条件或环境的变化，极易造成酶的纯度、构象发生变化，甚至变性失活，进而影响酶的生物利用度。以晶体形式存在的生物大分子结构稳定。结晶法是制备高纯度、高活性溶菌酶的理想方法。但是，生物大分子结晶是一个复杂的理化过程，结晶过程受诸多因素的影响，包括温度、pH值、结晶助剂的类型等，这些参数的微小变化都可能影响到结晶的进程和结果。更为重要的是溶菌酶的相对分子质量大，表面带多种电荷，因此分子间相互作用或相互结合的位点很多，而可能形成有序排列的关键结合点和几何匹配位置又少，在外界条件（如pH值、温度、不同溶剂等）的影响下，分子构象容易产生某些变化，构象与构型及超分子结构细微变化，引起溶菌酶结晶产率不高，进而影响其活性。
目前，溶菌酶生产厂家主要分布在欧、美等地。其中丹麦、加拿大占世界市场的一半以上。我国对溶菌酶的研究、应用起步较晚，加上国外对高纯度、高活性溶菌酶的生产制备技术进行了封锁，与发达国家相比，国内对溶菌酶制造和生产技术相对落后，特别是高活性、高纯度溶菌酶的生产远不能满足我国日益增长的市场需求。国内一些研究者虽开展了一些有关溶菌酶提取和应用方面的基础研究工作，例如对溶菌酶结晶过程做出了简单的改进，通过盐析结晶等方法，使结晶产品产率有一定的提高，活性增加，但其质量仍无法与国外产品相竞争。
离子液体具有蒸汽压低、熔点低、液程宽、易操作、可溶性好、稳定性高和可设计性等特性，已成为电化学、催化、有机合成中重要的反应介质，在化工分离中的应用也已引起广泛关注，目前尚未见到工业上利用添加离子液体来诱导溶菌酶结晶并调控溶菌酶生物活性的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过诱导溶菌酶结晶并改善结晶过程的控制，提高结晶率的基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法，包括以下步骤：
（1）将水溶性咪唑基离子液体加入到溶液A中，使水溶性咪唑基离子液体的质量浓度为1%-5%，所述A溶液为pH值为4-6.5的、质量浓度为3-6%的NaCl的乙酸钠缓冲溶液；
（2）将鸡蛋清溶菌酶加入到步骤（1）获得的液体中，使所述溶菌酶在20-30℃下过饱和比为1-3；
（3）在搅拌速度为250-350rpm的条件下,将步骤（2）获得的液体冷却至析晶浑浊养晶20-40min，降温至3-5℃并在3-5℃保持12-24小时得结晶液，将结晶液过滤，晶体在真空冷冻条件下干燥，得溶菌酶晶体产品，4℃低温保藏。
所述水溶性咪唑基离子液体为1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸、1-丁基-3甲基咪唑氯、1-丁基-3甲基咪唑溴或1，3-二甲基咪唑碘。
本发明的优点：
（1）本发明充分利用离子液体结构的化学可调控性和促进生物大分子组装的性质，将离子液体引入到溶菌酶分离纯化的结晶单元中来，通过冷却结晶，设备简单，过程控制容易实现，操作方便。
（2）本发明所使用的离子液体为水溶性离子液体，添加量少，可降低溶菌酶分子成核固液表面张力及成核自由能变，促进溶菌酶分子在三维空间的组装，有利于提高溶菌酶结晶率、晶体粒度及分离纯化的效果。
（3）本发明可与其它溶菌酶分离纯化单元相耦合，克服结晶过程过饱和度不易控制的缺陷，降低初级成核率，提供晶体生长较为均一推动力并减少其它结晶助剂的使用，可以通过灵活改变不同离子液体的种类来调控溶菌酶的生物活性，增加其市场竞争力。
（4）本发明可降低溶菌酶结晶的较为苛刻的条件，本发明所获得的溶菌酶晶体产品粒度均一，变异系数小，主粒度达到100μm以上，质量收率92%以上，晶体外观形貌完整，溶菌酶晶体相对活性明显提高。
利用离子液体诱导生物大分子结晶的效应，在溶菌酶结晶单元母液中添加一定比例的离子液体，通过诱导溶菌酶晶体自组装成核，改善晶体的生长过程，提高溶菌酶结晶率，调控其生物活性。
附图说明
图1使用本发明不同种类及不同添加浓度水溶性咪唑基离子液体后溶菌酶晶体的相对活性。
溶菌酶相对活性为：RU=（添加离子液体后溶菌酶比活力-未添加离子液体溶菌酶比活力/未添加离子液体溶菌酶比活力）。
图2本发明的方法获得的典型溶菌酶晶体的显微图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法，包括以下步骤：
（1）将1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸加入到溶液A中，使1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸的质量浓度为1%，所述A溶液为pH值=4的、质量浓度为3%的NaCl的乙酸钠缓冲溶液；
（2）将鸡蛋清溶菌酶(比活力4000U/mg)加入到步骤（1）获得的液体中，使所述溶菌酶在25℃下过饱和比为1；
（3）在搅拌速度为300rpm的条件下,将步骤（2）获得的液体冷却至析晶浑浊养晶20min，降温至3℃并在3℃保持12小时得结晶液，将结晶液过滤，晶体在真空冷冻条件下干燥，得溶菌酶晶体产品，4℃低温保藏。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率90%。溶菌酶晶体显微形貌如图2（a）所示。
将本实施例中的1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸的质量浓度1%用3%和5%分别替换，其它同本实施例，分别得到溶菌酶晶体产品。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率依次分别为90.5%和92%，所得晶体相对活性如图1中对应数据所示。
实施例2
一种基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法，包括以下步骤：
（1）将1-丁基-3甲基咪唑氯加入到溶液A中，使1-丁基-3甲基咪唑氯的质量浓度为1%，所述A溶液为pH值=5的、质量浓度为4%的NaCl的乙酸钠缓冲溶液；
（2）将鸡蛋清溶菌酶(比活力4000U/mg)加入到步骤（1）获得的液体中，使所述溶菌酶在20℃下过饱和比为2；
（3）在搅拌速度为250rpm的条件下,将步骤（2）获得的液体冷却至析晶浑浊养晶25min，降温至4℃并在4℃保持12小时得结晶液，将结晶液过滤，晶体在真空冷冻条件下干燥，得溶菌酶晶体产品，4℃低温保藏。所得晶体主粒度达到100μm以上。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率90.5%。溶菌酶晶体显微形貌如图2（b）所示。
将本实施例中的1-丁基-3甲基咪唑氯的质量浓度1%用3%和5%分别替换，其它同本实施例，分别得到溶菌酶晶体产品。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率分别依次为91%和91.5%，所得晶体相对活性如图1中对应数据所示。
实施例3
一种基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法，包括以下步骤：
（1）将1-丁基-3甲基咪唑溴加入到溶液A中，使1-丁基-3甲基咪唑溴的质量浓度为1%，所述A溶液为pH值=5.5的、质量浓度为5%的NaCl的乙酸钠缓冲溶液；
（2）将鸡蛋清溶菌酶(比活力4000U/mg)加入到步骤（1）获得的液体中，使所述溶菌酶在25℃下过饱和比为2.5；
（3）在搅拌速度为350rpm的条件下,将步骤（2）获得的液体冷却至析晶浑浊养晶25min，降温至4℃并在4℃保持18小时得结晶液，将结晶液过滤，晶体在真空冷冻条件下干燥，得溶菌酶晶体产品，4℃低温保藏。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率90%。溶菌酶晶体显微形貌如图2（c）所示。
将本实施例中的1-丁基-3甲基咪唑溴的质量浓度1%用3%和5%分别替换，其它同本实施例，分别得到溶菌酶晶体产品。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率分别依次为90.5%和91%，所得晶体相对活性如图1中对应数据所示。
实施例4
一种基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法，包括以下步骤：
（1）将1-丁基-3甲基咪唑碘加入到溶液A中，使1-丁基-3甲基咪唑碘的质量浓度为1%，所述A溶液为pH值=6.5的、质量浓度为6%的NaCl的乙酸钠缓冲溶液；
（2）将鸡蛋清溶菌酶(比活力4000U/mg)加入到步骤（1）获得的液体中，使所述溶菌酶在30℃下过饱和比为3；
（3）在搅拌速度为300rpm的条件下,将步骤（2）获得的液体冷却至析晶浑浊养晶40min，降温至5℃并在5℃保持24小时得结晶液，将结晶液过滤，晶体在真空冷冻条件下干燥，得溶菌酶晶体产品，4℃低温保藏。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率90%。溶菌酶晶体显微形貌如图2（d）所示。
将本实施例中的1-丁基-3甲基咪唑碘的质量浓度1%用3%和5%分别替换，其它同本实施例，分别得到溶菌酶晶体产品。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率分别依次为90%和91%，所得晶体相对活性如图1中对应数据所示。
由图2(d)所示，添加离子液体1，3-二甲基咪唑碘，晶体的形貌明显不同于添加前三种离子液体所获得溶菌酶晶体的形貌，说明该离子液体的使用改变溶菌酶分子的组装方式，获得晶体的相对活性最高。
表1本发明使用的离子液体
Claims (2)
1.一种基于离子液体的诱导结晶效应调控溶菌酶生物活性的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将水溶性咪唑基离子液体加入到溶液A中，使水溶性咪唑基离子液体的质量浓度为1%-5%，所述A溶液为pH值为4-6.5的、质量浓度为3-6%的NaCl的乙酸钠缓冲溶液；
（2）将鸡蛋清溶菌酶加入到步骤（1）获得的液体中，使所述溶菌酶在20-30℃下过饱和比为1-3；
（3）在搅拌速度为250-350rpm的条件下,将步骤（2）获得的液体冷却至析晶浑浊养晶20-40min，降温至3-5℃并在3-5℃保持12-24小时得结晶液，将结晶液过滤，晶体在真空冷冻条件下干燥，得溶菌酶晶体产品，4℃低温保藏。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述水溶性咪唑基离子液体为1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸、1-丁基-3甲基咪唑氯、1-丁基-3甲基咪唑溴或1，3-二甲基咪唑碘。
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