CN105255847A - 用离子液体调控溶菌酶溶解度制备溶菌酶晶体的方法 - Google Patents

用离子液体调控溶菌酶溶解度制备溶菌酶晶体的方法 Download PDF

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王占忠
党乐平
张笑
陈柏如
于小婷
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Abstract

本发明公开了用离子液体调控溶菌酶溶解度制备菌溶酶晶体的方法，包括以下步骤：(1)配制含NaCl的pH值为4～6的缓冲溶液；(2)加入水溶性咪唑基离子液体；加入鸡蛋清溶菌酶，使鸡蛋清溶菌酶在20～30℃下过饱和；(3)在搅拌下,将步骤(2)获得的液体冷却，过滤，晶体干燥，得溶菌酶晶体；4℃低温保藏。本发明充分利用离子液体对生物大分子分子间作用的影响来调控溶菌酶的溶解度，从而改变溶菌酶的溶解性，使溶解度增加量RM最高可达90％，该方法容易实现，操作方便。本发明所使用的水溶性离子液体有利于促进溶菌酶分子在三维空间的组装，有利于提高溶菌酶结晶率。本发明能提高收率，降低能耗，进而降低分离纯化成本。

Description

用离子液体调控溶菌酶溶解度制备溶菌酶晶体的方法
技术领域
本发明属于医药，化工及食品领域，涉及一种用离子液体调控溶菌酶溶解度制备溶菌酶晶体的方法。
背景技术
溶菌酶是一种重要的生物大分子，具有多种药理作用，随着生物科学的发展，溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶，用以制造和提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等。同时它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，可广泛应用于食品防腐、医药制剂、日用化工等行业。在生产及纯化溶菌酶过程中，由于工艺条件或环境的变化，极易造成酶的纯度、构象发生变化，甚至变性失活，进而影响酶的生物利用度。以晶体形式存在的生物大分子结构稳定。结晶法是制备高纯度、高活性溶菌酶的理想方法。
结晶是从溶液中析出固体的过程，显而易见结晶过程与固体在溶液中溶解度有着密切相关。物质溶解与否，溶解能力的大小，一方面决定于物质的本性；另一方面也与外界条件如温度、压强、溶剂种类等有关。溶解度是溶解性的定量表示。结晶过程的产量决定于结晶固体与其溶液之间的相平衡关系，通常可用固体在溶剂中的溶解度来表示这种平衡关系。溶解度的大小标志着结晶收率的极限，同时溶解度又会受到多种因素的影响，因此结晶物质的溶解度对于掌握产品是否能够运用结晶的方法得到、产品的理想产率、产物的结晶温度、产物的过饱和度至关重要。因此，调控溶菌酶的溶解度对于获取高活性、高纯度溶菌酶晶体具有重要的意义。
离子液体具有蒸汽压低、熔点低、液程宽、易操作、可溶性好、稳定性高和可设计性等特性，已成为电化学、催化、有机合成中重要的反应介质，在化工分离中的应用也已引起广泛关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用离子液体调控溶菌酶溶解度制备溶菌酶晶体的方法。
本发明的技术方案概述如下：
用离子液体调控溶菌酶溶解度制备溶菌酶晶体的方法，包括以下步骤：
(1)配制含NaCl的pH值为4～6的缓冲溶液，所述NaCl的质量含量为2％～5％；
(2)向步骤(1)获得的缓冲溶液中加入水溶性咪唑基离子液体使质量终浓度为1％～5％；加入鸡蛋清溶菌酶，使所述鸡蛋清溶菌酶在20～30℃下过饱和比为1.5～4.5；
(3)在搅拌速度为200～350rpm的条件下,将步骤(2)获得的液体以5～10℃/min的冷却速率降温至10～15℃并维持20～40min，然后2-4h之内将温度降至3～5℃，并保持5～8h，过滤，晶体在-40～-50℃冷冻干燥，得溶菌酶晶体；4℃低温保藏。
缓冲溶液优选磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲溶液，或乙酸和乙酸钠缓冲溶液。
水溶性咪唑基离子液体优选1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸、1-丁基-3甲基咪唑氯或1，3-二甲基咪唑碘。
本发明的优点：
(1)本发明充分利用离子液体对生物大分子分子间作用的影响来调控溶菌酶的溶解度，从而改变溶菌酶的溶解性，使溶解度增加量RM最高可达90％，该方法容易实现，操作方便。
(2)本发明所使用的水溶性离子液体添加后有利于促进溶菌酶分子在三维空间的组装，有利于提高溶菌酶结晶率。
(3)本发明可与其它溶菌酶分离纯化单元相耦合，有利于通过增加或降低溶菌酶溶解度来提高结晶终端纯化产品的收率，有利于降低单位产品的能耗，进而降低分离纯化成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
溶菌酶溶解度改变量：RM＝(添加离子液体溶菌酶溶解度-未添加离子液体溶菌酶溶解度)/未添加离子液体溶菌酶溶解度)。
实施例1
用离子液体调控溶菌酶溶解度制备菌溶酶晶体的方法，包括以下步骤：
(1)配制含NaCl的pH值为4的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲溶液，所述NaCl的质量含量为2％；
(2)向步骤(1)获得的缓冲溶液中加入1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸使质量终浓度为1％；加入鸡蛋清溶菌酶(比活力4000U/mg)，使鸡蛋清溶菌酶在25℃下过饱和比为1.5；
(3)在搅拌速度为200rpm的条件下,将步骤(2)获得的液体以10℃/min的冷却速率降温至10℃并维持20min，然后2h之内将温度降至3℃，并保持8h得结晶液，将结晶液过滤，晶体在-40℃真空冷冻干燥，得溶菌酶晶体；4℃低温保藏。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率90.2％。
当按步骤(1)操作，并使缓冲溶液分别为5℃、17℃和30℃时，按本发明的步骤(2)操作，鸡蛋清溶菌酶的溶解度增加量RM为50％、57％和61％。
当按步骤(1)操作，并使缓冲溶液分别为5℃、17℃和30℃时，步骤(2)加入1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸使终浓度为1％用3％替换，其它同本实施例步骤(2)；鸡蛋清溶菌酶的溶解度增加量RM为65％、75％和82％。添加3％1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸的结晶收率为90.7％。
当按步骤(1)操作，并使缓冲溶液分别为5℃、17℃和30℃时，步骤(2)加入1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸使终浓度为1％用5％替换，其它同本实施例步骤(2)；鸡蛋清溶菌酶的溶解度增加量RM为72％、79％和90％。添加5％1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸的结晶收率为91.5％。
用pH值为4的乙酸和乙酸钠缓冲溶液替代本实施例的pH值为4的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲溶液，其它同本实施例，溶解度增加量RM与本实施例相似。
实施例2
用离子液体调控溶菌酶溶解度制备菌酶晶体的方法，包括以下步骤：
(1)配制含NaCl的pH值为5.01的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲溶液，所述NaCl的质量含量为3％；
(2)向步骤(1)获得的溶液中加入1-丁基-3甲基咪唑氯使质量终浓度为1％；加入鸡蛋清溶菌酶(比活力4000U/mg)，使鸡蛋清溶菌酶在20℃下过饱和比为2.5；
(3)在搅拌速度为250rpm的条件下,将步骤(2)获得的液体以8℃/min的冷却速率冷却至12℃，维持该温度25min，3h之内降温至4℃并在4℃保持7小时得结晶液，将结晶液过滤，晶体在-45℃真空冷冻条件下干燥，得溶菌酶晶体。晶体主粒度达到100μm以上，质量收率90％。
当按步骤(1)操作，并使缓冲溶液分别为5℃、17℃和30℃时，按本发明的步骤(2)操作，鸡蛋清溶菌酶的溶解度增加量RM为52％、60％和71％。
当按步骤(1)操作，并使缓冲溶液分别为5℃、17℃和30℃时，步骤(2)加入1-丁基-3甲基咪唑氯使终浓度为1％用3％替换，其它同本实施例步骤(2)；鸡蛋清溶菌酶的溶解度增加量RM为61％、70％和81％添加3％1-丁基-3甲基咪唑氯的结晶收率为90.3％。
当按步骤(1)操作，并使缓冲溶液分别为5℃、17℃和30℃时，步骤(2)加入1-丁基-3甲基咪唑氯使终浓度为1％用5％替换，其它同本实施例步骤(2)；鸡蛋清溶菌酶的溶解度增加量RM为70％、78％和86％。添加5％1-丁基-3甲基咪唑氯的结晶收率为90.8％。
用pH值为5.01的乙酸和乙酸钠缓冲溶液替代本实施例的pH值为5.01的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲溶液，其它同本实施例，溶解度增加量RM与本实施例相似。
实施例3
用离子液体调控溶菌酶溶解度制备菌酶晶体的方法，包括以下步骤：
(1)配制含NaCl的pH值为6的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲溶液，所述NaCl的质量含量为5％；
(2)向步骤(1)获得的缓冲溶液中加入1，3-二甲基咪唑碘使质量终浓度为1％；加入鸡蛋清溶菌酶(比活力4000U/mg)，使所述鸡蛋清溶菌酶在30℃下过饱和比为4.5；
(3)在搅拌速度为350rpm的条件下,将步骤(2)获得的液体以5℃/min的冷却速率降温至15℃并维持40min，然后4h之内将温度降至5℃，并保持5h得结晶液，将结晶液过滤，晶体在-50℃真空冷冻干燥，得溶菌酶晶体；4℃低温保藏。所得晶体主粒度达到100μm以上，质量收率90％。
当按步骤(1)操作，并使缓冲溶液分别为5℃、17℃和30℃时，按本发明的步骤(2)操作，鸡蛋清溶菌酶的溶解度增加量RM为-19％、-25％和-31％。
当按步骤(1)操作，并使缓冲溶液分别为5℃、17℃和30℃时，步骤(2)加入1-丁基-3甲基咪唑碘使终浓度为1％用3％替换，其它同本实施例步骤(2)；鸡蛋清溶菌酶的溶解度增加量RM为-26％、-31％和-37％，添加3％1-丁基-3甲基咪唑碘的结晶收率为90.3％。
当按步骤(1)操作，并使缓冲溶液分别为5℃、17℃和30℃时，步骤(2)加入1-丁基-3甲基咪唑碘使终浓度为1％用5％替换，其它同本实施例步骤(2)；鸡蛋清溶菌酶的溶解度增加量RM为-43％、-48％和-53％。添加5％1-丁基-3甲基咪唑碘的结晶收率为90.8％。
用pH值为6的乙酸和乙酸钠缓冲溶液替代本实施例的pH值为6的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲溶液，其它同本实施例，溶解度增加量RM与本实施例相似。
表1本发明使用的离子液体
通过添加离子液体的方式调节溶菌酶的溶解度，从而为控制溶菌酶结晶分离过程，提高结晶的可操作性提供新思路。也用于改善溶菌酶催化的生物反应体系的反应进程，加快或降低催化反应速率。

Claims (3)

1.用离子液体调控溶菌酶溶解度制备菌溶酶晶体的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)配制含NaCl的pH值为4～6的缓冲溶液，所述NaCl的质量含量为2％～5％；
(2)向步骤(1)获得的缓冲溶液中加入水溶性咪唑基离子液体使质量终浓度为1％～5％；加入鸡蛋清溶菌酶，使所述鸡蛋清溶菌酶在20～30℃下过饱和比为1.5～4.5；
(3)在搅拌速度为200～350rpm的条件下,将步骤(2)获得的液体以5～10℃/min的冷却速率降温至10～15℃并维持20～40min，然后2-4h之内将温度降至3～5℃，并保持5～8h，过滤，晶体在-40～-50℃冷冻干燥，得溶菌酶晶体；4℃低温保藏。
2.根据权利要求1所述的用离子液体调控溶菌酶溶解度制备溶菌酶晶体的方法，其特征是所述缓冲溶液为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲溶液，或乙酸和乙酸钠缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的用离子液体调控溶菌酶溶解度制备溶菌酶晶体的方法，其特征是所述水溶性咪唑基离子液体为1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸、1-丁基-3甲基咪唑氯或1，3-二甲基咪唑碘。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113249358A (zh) * 2021-05-14 2021-08-13 天津大学 一种利用离子液体调控溶菌酶晶型的方法
CN113980093A (zh) * 2021-10-25 2022-01-28 河北工业大学 聚合物促进蛋白质类药物结晶的方法及应用

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