CN108048421A - 利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法 - Google Patents

利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，包括：以氯化胆碱低共熔溶剂和缓冲液的混合溶液作为催化体系，以果糖基转移酶为催化剂转化底物蔗糖为低聚果糖。结果发现，相较于原缓冲液体系，低共熔溶剂体系会使果糖基转移酶酶活及转化率提高10％以上。而且，相较于原缓冲液体系，低共熔溶剂体系会使果糖基转移酶储存稳定性提高40％以上。

Description

利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性 的方法
技术领域
本发明涉及一种利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，属于酶催化转化技术领域。
背景技术
低聚果糖(Fructooligosaccharides，简称FOS)，又称蔗果低聚糖，寡果糖或者蔗果三糖族低聚糖，是一种果糖聚合物，是蔗糖(GF)和1-3个果糖基(F)通过β(2→1)糖苷键连接形成的蔗果三糖(1-Ketose，GF2)、蔗果四糖(Nistose，GF3)、蔗果五糖(1-β-fructofuranosylnystose，GF4)及其混合物的总称。它的分子式为G-F-Fn(n＝1～3，G为葡萄糖，F为蔗糖)。
低聚果糖是一种益生元，能够改善肠道环境，抑制肠道病源和腐败微生物的生长，调节体内菌群的平衡，是国际公认的超强双歧因子。又因为低聚果糖热量低，能促进矿物吸收，不引起龋齿，促进人体对营养物质的吸收，提高免疫力，改善脂类代谢，润肠通便，所以它已经作为功能性食品添加剂被广泛应用。
目前，工业上生产的低聚果糖主要通过酶转化法获得，即以蔗糖为底物，利用果糖基转移酶的催化作用，使蔗糖发生分子间果糖基转移反应得到多种低聚果糖产物。根据K.H.Jung总结的酶促反应方程式为：GFn+GFn→GFn+1+GFn-1。
如今，工业上普遍采用低浓度的柠檬酸盐，磷酸盐等缓冲液作为溶剂，使用游离的果糖基转移酶对含有蔗糖的底物进行生物催化反应。中国专利CN201010548887.X公布了一种用果糖基转移酶生产低聚果糖的方法，包括以含高活性果糖基转移酶的点青霉菌丝体作为生物催化剂用分批法转化蔗糖为低聚果糖。中国专利CN200910026901.7和CN201510000076.9也分别公布了使用大孔阴离子树脂和复合工艺进行果糖基转移酶的固定化，这种方法降低了生产成本，利于获得多批次的产物，提高酶的使用效率和酶活稳定性，便于连续化操作。但上述酶催化体系中酶的催化效率和产物转化率仍待提高。
发明内容
本发明目的是在果糖基转移酶催化体系中加入一定比例的胆碱类低共熔溶剂(DES)，进一步提高了酶的利用率、低聚果糖的转化率以及果糖基转移酶的稳定性，从而降低了低聚果糖的生产成本。而且，低共熔溶剂具有低挥发性，高热稳定性，室温下呈液体，是一种造价低，毒性低，溶解性好的新型离子液体，在酶催化领域具有巨大的应用潜力。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，包括：(1)以氯化胆碱低共熔溶剂和缓冲液的混合溶液作为催化体系，(2)以果糖基转移酶为催化剂转化底物蔗糖为低聚果糖。
所述果糖基转移酶可以由能够产果聚糖转移酶的菌株发酵生产。
所述催化剂可以是包括游离酶或固定化酶等形式。
优选的，所述胆碱类低共熔溶剂以体积比0.1-100％与缓冲液进行混合。
优选的，所述缓冲液为磷酸钠盐，磷酸钾盐，柠檬酸盐，乙酸盐缓冲液中的至少一种。
优选的，所述胆碱类低共熔溶剂的制备：低共熔溶剂氢受体氯化胆碱和氢供体(例如尿素)以摩尔比1：0.25～4进行结合，或者以摩尔比1:1:1(例如蔗糖-氯化胆碱-水)结合；之后将混合物置于油浴锅中80～150℃，2～6h制备而成。
优选的，所述氯化胆碱低共熔溶剂为氯化胆碱-尿素，氯化胆碱-乙二醇，氯化胆碱-丙三醇，氯化胆碱-谷氨酸，氯化胆碱-甲脲，氯化胆碱-硫脲，氯化胆碱-乙酰胺，氯化胆碱-柠檬酸，氯化胆碱-苯甲酸，氯化胆碱-丙二酸，氯化胆碱-果糖，氯化胆碱-苹果酸，蔗糖-氯化胆碱-水中至少一种。
无论催化剂的形式为液体酶或菌丝体或固定化酶，底物与催化剂的比例都以酶活表示为1g底物添加0.5-50U酶，低共熔溶剂的含量与缓冲液的含量相关。
所述方法中酶的催化转化条件为：20-70℃，pH 3-8,转化时间10分钟-5小时。
本发明还可采用上述缓冲液添加氯化胆碱低共熔溶剂组成的混合体系对果糖基转移酶进行保存，优选为缓冲液添加体积比10-30％氯化胆碱低共熔溶剂，保存三周以上酶活稳定性有显著提高。
本发明的有益效果如下：
一般情况下，游离酶在磷酸钠缓冲液与低共熔溶剂以体积比4:1相溶的20mL体系中，向其中加入质量比50％的蔗糖，加入0.5mL酶液(酶活为20-60U/mL)，在50℃下水浴振荡1h，最终利用高效液相检测得出低聚果糖含量，分别计算固定化酶酶活及低聚果糖产率。最终检测到对于游离酶，氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂体系相较于原体系产物产率与酶活能提高10％以上；对于固定化酶颗粒，加入0.5g固定化酶(酶活60-160U/g)，低共熔溶剂体系相较于原体系，最大可提高产物转化率与酶活10％以上，与游离酶的效果相当，但比游离酶反应时间明显缩短。
另外，采用缓冲液与氯化胆碱低共熔溶剂组成的混合体系对果糖基转移酶进行保存，保存第3周之后，缓冲液加入10％～30％低共熔溶剂的样品酶活比对照组缓冲液中原酶液明显提高。实验显示在储存3-8周之后，缓冲液添加10％～30％的低共熔溶剂能够显著提高果糖基转移酶稳定性，比不加低共熔溶剂时提高40％以上。所以也可以考虑将氯化胆碱类的低共熔物用作果糖基转移酶的稳定剂。
附图说明
图1：A，B分别表示原磷酸钠缓冲液体系和10％(v/v)氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂中，游离糖基转移酶酶活检测的HPLC-ELSD图谱，图中5个峰按出峰时间依次是果糖，葡萄糖，蔗糖，蔗果三糖和蔗果四糖。
图2：原磷酸钠缓冲液体系和10％，20％，30％(v/v)氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂中，游离糖基转移酶的酶活随时间(周)改变的趋势图(设定初始酶活为100％)。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：
一种利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)首先将产果聚糖转移酶的菌株接种于发酵培养基中，先通过摇瓶发酵一级、二级种子液，再运用5～20L发酵罐进行高密度培养，培养条件为：温度28～30℃，pH＝4.9～5.0，通气量500～1500mL/min，搅拌速度200～600r/min，培养时间5-7天，制得发酵粗酶液；
(2)将步骤(1)制得的粗酶液，经过8000～10000rpm超高速离心去除菌泥，然后在0～4℃的低温下经过微滤、超滤处理，最终制得纯度较高的酶液；
(3)为检测胆碱类低共熔溶剂对果糖基转移酶催化效率的影响，以蔗糖为底物，将步骤(2)制得的果糖基转移酶液(或者处理过的固定化酶)作为催化剂，催化体系为缓冲液与低共熔溶剂的混合溶液，水浴振荡反应，转化结束后取样，使用高效液相色谱/蒸发光检测器(HPLC-ELSD)计算产物转化率；
(4)为检测胆碱类低共熔溶剂对果糖基转移酶稳定性的影响，首先将步骤(1)制得的粗酶液进行冻干成粉，再添加缓冲液与低共熔溶剂的混合溶液溶解酶粉，4℃低温储存，每一周取样使用高效液相色谱/蒸发光检测器(HPLC-ELSD)检测酶活，根据获得的酶活数据，计算低共熔溶剂对果糖基转移酶稳定性的影响。
根据本发明所优选的，所述胆碱类低共熔溶剂的制备如下：低共熔溶剂氢受体氯化胆碱和氢供体(例如柠檬酸)以摩尔比1：0.25～4进行结合，或者以摩尔比1:1:1(例如蔗糖-氯化胆碱-水)结合；之后将混合物置于油浴锅中80～150℃，2～6h制备而成。
根据本发明所优选的，所述胆碱类低共熔溶剂为氯化胆碱-尿素，氯化胆碱-乙二醇，氯化胆碱-丙三醇，氯化胆碱-谷氨酸，氯化胆碱-甲脲，氯化胆碱-硫脲，氯化胆碱-乙酰胺，氯化胆碱-柠檬酸，氯化胆碱-苯甲酸，氯化胆碱-丙二酸，氯化胆碱-果糖，氯化胆碱-苹果酸，蔗糖-氯化胆碱-水中至少一种。
根据本发明所优选的，所述缓冲液为磷酸钠盐，磷酸钾盐，柠檬酸盐，乙酸盐缓冲液中的至少一种。
根据本发明所优选的，所述步骤(1)中的产酶菌株为毕赤酵母(PichiaPastoris)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus Oryzae)或出芽短梗霉(Aureobasidium pulluans)中的一种。
根据本发明所优选的，所述步骤(2)中所使用的微滤仪器为滤径0.1μm的中空纤维膜组件，所使用的超滤设备为Labscale TFF系统和截留分子量10kDa的Pellicon XL装置。
根据本发明所优选的，所述步骤(3)中，游离酶酶活测定方法为：用50mM，pH＝5.0的盐离子缓冲液和0.1～100％低共熔溶剂形成20mL的催化体系，向体系中加入10～80％的蔗糖为底物，再加入0.1～1mL酶液，在20～70℃下水浴振荡1h，取样0.1mL用去离子水稀释100～1000倍，将最终样品通过高效液相色谱/蒸发光检测器(HPLC-ELSD)检测酶活，计算产物生成率。
本发明果糖基转移酶酶活定义为，每分钟产生1μmol蔗果三糖所需酶量为一个酶活力单位(U)，注意控制酶用量，使反应60min后，体系中的蔗果三糖不超过总糖含量的10％为宜。
酶活力测定公式如下：其中先通过液相图谱，根据峰面归一法，计算出蔗果三糖，蔗果四糖占总峰面积的百分比得出GF2，t为时间(min)，此处为60，m对于游离酶为酶液体积(mL)，对于固定化酶为固定化树脂质量(g)。
产率的计算：根据液相检测图谱中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖总的含量占总糖含量的百分比即最终低聚果糖产物转化率。
实施例2：
一种利用胆碱类低共熔溶剂提高游离果糖基转移酶催化效率的方法，步骤如下：
(1)将一种产酶菌株毕赤酵母置于培养皿中活化，然后接种到10L发酵罐中进行扩大培养，培养条件为温度30℃，pH＝5.0，通气量800mL/min，搅拌速度600r/min，接种量10％。通过甘油补料，甲醇诱导，培养7天后得到酶活高达400U/mL的粗酶液大约4L，发酵培养基成分为：85％磷酸26.7mL/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，硫酸镁7.27g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40mL/L，硫酸铵40g/L；
(2)将步骤(1)发酵制得的粗酶液，经过8000rpm超高速离心去除菌泥，然后在4℃的低温下经过滤径0.1μm的中空纤维膜进行微滤处理，制得透明，澄清的高活性酶液，将获得的酶液分装置于4℃冰箱中备用；
(3)配制50mM，pH＝5.0的磷酸钠缓冲液；
(4)胆碱类低共熔溶剂的制备：将摩尔比例1:2的干燥的氯化胆碱固体与乙二醇混合在一起，装入圆颈烧瓶中，用100℃油浴锅加热2h，直到形成透明均匀的液体即可；
(5)将步骤(3)所得的磷酸钠缓冲液与步骤(4)所得的低共熔溶剂以体积比4:1相溶为液体，取液体20mL，向其中加入体积比10％的蔗糖，再加入游离酶酶液0.1mL，在30～60℃下水浴振荡1h，取样0.1mL用去离子水稀释100倍，将最终样品通过高效液相色谱/蒸发光检测器(HPLC-ELSD)检测酶活，计算产物转化率。
对照组仅以磷酸钠缓冲液作为催化体系转化率为58.43％，酶活为77.29U/mL，在添加氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂的催化体系中，游离酶转化率为64.04％，酶活为84.71U/mL。由此可见，低聚果糖的酶活与转化率相比没有加低共熔溶剂时提高了10％。
实施例3：
一种利用胆碱类低共熔溶剂提高固定化果糖基转移酶催化效率的方法，步骤如下：
(1)将一种产酶菌株米曲霉置于培养皿中活化，进行摇瓶培养，培养条件为温度28℃，pH＝6.5，培养72h后，离心取菌体，破壁后离心制得粗酶液。
(2)将步骤(1)制得的粗酶液，在4℃的低温下经过滤径0.1μm的中空纤维膜进行微滤处理，再添加2倍体积的去离子水，使用设备Labscale TFF系统和截留分子量10kDa的Pellicon XL装置进行超滤，将浓缩后的酶液分装置于4℃冰箱中备用；
(3)根据本发明所优选的固定化树脂制备方法为，先将树脂进行预处理，然后将制得的酶液与树脂混合到一定体积的1～2M磷酸盐缓冲液(pH＝3.0～7.0)中，保证树脂对酶的固定量在60～350U/g；固定条件为10～30℃，100～300rpm水浴振荡1～3天，最后将固定化树脂进行抽滤收集；
(4)配制50mM，pH＝5.0的磷酸钠缓冲液；
(5)胆碱类低共熔溶剂的制备：将摩尔比例1:2的干燥氯化胆碱固体与丙三醇混合在一起，装入圆颈烧瓶中，用100℃油浴锅加热2h，直到形成透明均匀的液体即可；
(6)将步骤(4)所得的磷酸钠缓冲液与步骤(5)所得的低共熔溶剂以体积比3:1相溶配成液体，将所制得的固定化树脂0.2g与体积比10％的蔗糖加入到20mL上述液体中，在30～60℃下水浴振荡1h，取样0.1mL用去离子水稀释100倍，将最终样品通过高效液相色谱/蒸发光检测器(HPLC-ELSD)检测酶活，计算产物转化率。
根据本发明所优选的，固定化树脂预处理方法为：称取足量的树脂，用0.1M的磷酸钾缓冲液(pH＝6～8)振荡浸泡2h，重复此操作2次，然后用2倍体积的去离子水浸泡2h，抽滤除去溶剂，放置于4℃备用。
根据本发明所优选的，固定化酶酶活测定方法为：用50mM，pH＝5.0的盐离子缓冲液和0.1～100％低共熔溶剂形成20mL的催化体系，向体系中加入10～80％的蔗糖为底物，再加入0.1～2g固定化处理过后的树脂，在30～60℃下水浴振荡1h，取样0.1mL用去离子水稀释100～1000倍，将最终样品通过高效液相色谱/蒸发光检测器(HPLC-ELSD)检测酶活，计算产物转化率。
最终结果显示，低聚果糖的转化率比没有加低共熔溶剂时提高了10％。
实施例4：
一种利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶稳定性的方法，步骤如下：
(1)将一种产果糖基转移酶菌株接种到10L发酵罐中进行扩大培养，得到酶活高达400U/mL的粗酶液大约4L；优选的产酶菌株为毕赤酵母(Pichia Pastoris)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(AspergillusOryzae)或出芽短梗霉(Aureobasidium pulluans)中的一种；
(2)将步骤(1)制得的粗酶液，经过8000rpm超高速离心去除菌泥，然后在4℃的低温下经过滤径0.1μm的中空纤维膜进行微滤处理，制得透明，澄清的高活性酶液，将获得的酶液分装置于4℃冰箱中备用；
(3)配制50mM，pH＝5.0的磷酸钾缓冲液；
(4)胆碱类低共熔溶剂的制备：将摩尔比例1:2的干燥氯化胆碱固体与乙二醇混合在一起，装入圆颈烧瓶中，用100℃油浴锅加热2h，直到形成透明均匀的液体即可；
(5)取步骤(2)所制得的酶液冻干成酶粉，再将步骤(4)所配制的胆碱类低共熔溶剂分别以体积比10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％与步骤(3)配制的缓冲液梯度混合溶解酶粉，以不加低共熔溶剂的缓冲液溶解酶粉作为对照，置于4℃储存；
(6)对步骤(5)制成的溶液每一周取样一次，一次0.1mL，检测酶活，比较不同比例胆碱类低共熔溶剂对于酶活稳定性的影响；
(7)步骤(6)酶活检测方法为：用步骤(3)制得的50mM，pH＝5.0的磷酸钾缓冲液20mL，向其中加入体积比10％的蔗糖，0.1mL步骤(6)制得的酶液，在30～60℃下水浴振荡1h，取样用去离子水稀释100倍，将最终样品通过高效液相色谱/蒸发光检测器(HPLC-ELSD)检测酶活，计算产物转化率。
最终结果显示，在前3周，不加低共熔溶剂样品的酶活与加入低共熔溶剂样品的酶活相差不大，第3周之后，加入10％～30％氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂的样品酶活明显高于对照组。实验显示在储存3周之后，添加10％～30％低共熔溶剂能够显著提高果糖基转移酶稳定性。储存8周后，添加10％-30％低共熔溶剂的体系中仍保留酶活80％左右，而对照组酶活已降至55％以下，利用胆碱类低共熔溶剂可提高酶活稳定性40％以上。

Claims (9)

1.利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，包括：(1)以氯化胆碱低共熔溶剂和缓冲液的混合溶液作为催化体系，(2)以果糖基转移酶为催化剂转化底物蔗糖为低聚果糖。
2.如权利要求1所述的利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，所述催化剂包括游离酶或固定化酶。
3.如权利要求1所述的利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，所述氯化胆碱低共熔溶剂为氯化胆碱-尿素，氯化胆碱-乙二醇，氯化胆碱-丙三醇，氯化胆碱-谷氨酸，氯化胆碱-甲脲，氯化胆碱-硫脲，氯化胆碱-乙酰胺，氯化胆碱-柠檬酸，氯化胆碱-苯甲酸，氯化胆碱-丙二酸，氯化胆碱-果糖，氯化胆碱-苹果酸，蔗糖-氯化胆碱-水中至少一种。
4.如权利要求3所述的利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，所述氯化胆碱低共熔溶剂的制备：低共熔溶剂氢受体氯化胆碱和氢供体以摩尔比1：0.25～4进行结合，或者以摩尔比1:1:1结合；之后将混合物置于油浴锅中80～150℃，2～6h制备而成。
5.如权利要求1所述的利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸钠盐，磷酸钾盐，柠檬酸盐，乙酸盐缓冲液中的至少一种。
6.如权利要求1所述的利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，所述胆碱类低共熔溶剂以体积比0.1-100％与缓冲液进行混合。
7.如权利要求1所述的利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，所述底物与催化剂的比例以酶活表示为1g底物添加0.5-50U酶。
8.如权利要求1所述的利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，酶的催化转化条件为：20-70℃，pH 3-8,转化时间10分钟-5小时。
9.如权利要求1所述的利用胆碱类低共熔溶剂提高果糖基转移酶催化效率和稳定性的方法，其特征在于，采用缓冲液添加体积比10-30％氯化胆碱低共熔溶剂组成的混合体系对所述果糖基转移酶进行保存；
所述缓冲液为磷酸钠盐，磷酸钾盐，柠檬酸盐，乙酸盐缓冲液中的至少一种；
所述氯化胆碱低共熔溶剂为氯化胆碱-尿素，氯化胆碱-乙二醇，氯化胆碱-丙三醇，氯化胆碱-谷氨酸，氯化胆碱-甲脲，氯化胆碱-硫脲，氯化胆碱-乙酰胺，氯化胆碱-柠檬酸，氯化胆碱-苯甲酸，氯化胆碱-丙二酸，氯化胆碱-果糖，氯化胆碱-苹果酸，蔗糖-氯化胆碱-水中至少一种。
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