KR102220167B1 - 단백질 상온 안정화 및 저장용 천연공융용매 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질을 용해시키고, 온도에 따른 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있는 단백질 안정화용 조성물 및 이를 이용한 단백질을 안정화하는 방법에 관한 것으로 천연 물질인 당이나 콜린클로라이드를 특정 비율로 혼합했을 때 수소 결합에 의해 고체로부터 융점이 낮은 액체가 생성이 되어, 단백질 약물을 용해시키고 온도 변화에 민감한 단백질을 안정화시킬 수 있으므로 장기간 보관이 가능할 뿐만 아니라, 단백질 약물 생산으로부터 운송에 이르기까지 고비용이 요구되는 저온 저장의 문제점을 해결할 수 있어 경제적이며, 전력 체계의 문제점으로 인하여 단백질 약물 보급이 어려운 지역으로 약품 보급도 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

단백질 상온 안정화 및 저장용 천연공융용매{Natural deep eutectic solvent for room temperature stabilization and storage of protein biologics}
본 발명은 단백질을 용해시키고, 온도에 따른 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있는 단백질 안정화용 조성물 및 이를 이용한 단백질을 안정화하는 방법에 관한 것이다.
단백질 의약품은 재조합 기술, 세포배양 기술, 정제 기술의 발전에 따라 더욱 그 생산량이 증가하고 있다. 그러나 단백질 의약품은 분자량이 크고 그 구조가 복잡한 경우가 많아 물리적 화학적 불안정성으로 인해 적절한 제형이 필요하다.
수용액 상에 용해된 단백질 약물은 탈아미드화(deamidation), 산화(oxidation), 가수분해(hydrolysis) 등과 같은 화학적 분해와 열변성(thermal denaturation), 응집(aggregation)과 같은 물리적 분해에 의해서 비활성화가 일어나며 또한, 수분 제거를 위한 동결 건조 과정에서 단백질의 변성이 일어나 독성을 유발할 수 있다. 한가지 예로서, 물리적 불안정성에 의해 발생하는 대표적인 현상인 응집(aggregation)의 요인은 단백질의 정제, 제형화, 보관 과정에서 다양하게 존재한다. 정제 시에는 최적의 조건이 아닌 pH, 염 종류, 염 농도, 온도, 공기와의 접촉, 교반 속도 등이 영향을 미치며, 제형화 시에는 단백질의 농축 조건이 영향을 미칠 수 있다. 그리고 버퍼 교환 시에는 필터 통과, 교반 등이 영향을 미치며 저장 시에는 온도변화, pH 변화, 공기와의 접촉, 교반 등이 응집 현상에 영향을 미칠 수 있다. 상기와 같은 이유로 응집된 단백질은 대체로 활성이 감소되거나 시간이 지남에 따라 활성을 잃어버린다. 또한, 단백질은 응집되는 경우 인체에 투여하게 되면 응집되지 않은 상태에서는 나타내지 않던 항원성을 갖게 되어 항체(anti-drug antibody, ADA)의 생성을 유발시킬 수 있다.
한편, 무수유기용매를 사용하는 경우 단백질의 안정성을 향상시킬 수는 있으나, 유기용매의 독성으로 인해 의학적으로 사용이 어려워 보관 용매로는 적합하지 않으며, 단백질 약물의 안정성을 위하여 생산으로부터 운송에 이르기까지 고비용의 저온 저장(Cold chain)이 필요하지만, 전력체계가 잘 갖추어 있지 않은 곳으로의 보급에는 어려움이 있는 실정이다.
따라서, 단백질 약물을 안정화시켜 장기간 보존이 가능하면서도 고비용의 저온 저장의 문제점과 전력체계의 문제점으로 인한 단백질 약물 공급의 어려움을 해결할 수 있는 연구가 요구되고 있다.
대한민국특허등록공보 10-1704378
본 발명자들은 천연 물질인 당이나 콜린클로라이드를 특정 비율로 혼합했을 때 수소 결합에 의해 고체로부터 융점이 낮은 액체가 생성이 되어, 단백질 약물을 용해시키고 이때 용해된 단백질 약물은 온도 변화에 관계없이 단백질의 안정성을 높일 수 있다는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 콜린클로라이드(choline chloride; Chl) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단백질을 포함하는 용액에 콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질을 안정화하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜린클로라이드 및 당이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 단백질을 포함하는 용액에 콜린클로라이드 및 당이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질을 안정화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 단백질은 인터페론-2 알파(interferon-2α), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G) 및 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 당은 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 글루코스(glucose), 자일로스(xylose), 및 말토스(maltose)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 당은 프럭토스 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 콜린클로라이드와 프럭토스, 수크로스, 글루코스, 자일로스, 또는 말토스의 몰비(molar ratio)는 1 : 0.5 내지 2.0일 수 있다(1:0.5~2.0).
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 콜린클로라이드와 갈락토스 또는 만노스의 몰비는 1 : 0.2 내지 1.0일 수 있다(1:0.2~1.0).
본 발명인 단백질 안정화용 조성물은 천연공융용매를 사용하여 단백질 약물을 용해시켜 안정화시킴으로써 온도 변화에 민감한 단백질을 고농도로 녹여 안정화시킬 수 있으므로 장기간 보관이 가능할 뿐만 아니라, 상온에서 보관이 용이하여 단백질 약물 생산으로부터 운송에 이르기까지 고비용이 요구되는 저온 저장 및 운송(cold-chain system)의 문제점을 해결할 수 있어 경제적이며, 인도적 측면에서 전력 체계의 문제점으로 인하여 단백질 약물 보급이 어려운 지역으로 약품 보급도 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 다양한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent; NDES) 와 PBS(phosphate buffered saline)에 용해되어 있는 인터페론-알파2(interferon-α2; IFN-α2)의 활성도를 비교한 결과이다.
도 2a 및 2b는 콜린클로라이드와 프럭토스을 포함하는 천연공융용매(Chl:Fru NDES)와 PBS에 용해된 IFN-α2의 2차구조(도 2a) 및 3차구조(도 2b)를 비교한 결과이다.
도 3은 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 온도에 따른 열변성 정도를 비교한 결과이다.
도 4a는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2에 대하여 다양한 온도에서 활성도를 비교한 결과이다.
도 4b는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 70℃에서 시간에 따른 활성도 변화를 비교한 결과이다.
도 4c 및 4d는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 70℃에서 2차구조(도 4c) 및 3차구조(도 4d)를 비교한 결과이다.
도 5a는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 37℃에서의 시간에 따른 활성도를 비교한 결과이다.
도 5b 및 5c는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN-α2의 37℃에서의 2차구조(도 5b) 및 3차구조(도 5c)를 비교한 결과이다.
도 6은 다양한 NDES와 PBS에 용해되어 있는 탄산무수화효소(Carbonic anhydrase; CA)의 활성도를 비교한 결과이다.
도 7은 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 CA의 2차 구조를 비교한 결과이다.
도 8은 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 CA의 온도에 따른 열변성 정도를 비교한 결과이다.
도 9a는 Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 CA의 다양한 온도에서의 활성도를 비교한 결과이다.
도 9b 및 9c는 Chl:Fru NDES에 용해된 CA의 70℃에서의 시간에 따른 활성도(도 9b) 및 탁도(도 9c) 변화를 비교한 결과이다.
도 10a 및 10b는 Chl:Fru NDES 에 용해된 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G)의 상온에서의 시간에 따른 2차구조(도 10a) 및 3차구조(도 10b)를 비교한 결과이다.
도 11a는 Chl:Fru NDES에 용해된 다양한 농도의 인간혈청알부민(HSA)를 나타낸 것이다.
도 11b는 Chl:Fru NDES에 용해된 다양한 농도의 인간혈청알부민(HSA)를 70℃에서 2시간 동안 가열한 후의 상태를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 천연 물질인 당이나 콜린클로라이드를 특정 비율로 혼합했을 때 수소 결합에 의해 고체로부터 융점이 낮은 액체가 생성이 되어, 단백질 약물을 용해시키고 이때 용해된 단백질 약물은 온도 변화에 관계없이 단백질의 안정성을 높일 수 있다는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, IFN-α2의 안정화 매질로서 다양한 조성의 천연공융용매로 실험한 결과 콜린클로라이드와 프럭토스가 조합된 천연공융용매에서 IFN-α2 활성이 가장 뛰어난 상태로 유지되는 것을 확인하였으며(실시예1 참조), 다양한 온도조건에서 IFN-α2 단백질의 활성도, 2차, 및 3차 구조가 유지됨을 확인하였다(실시예2 내지 실시예5 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 탄산무수화효소(carbonic anhydrase; CA)의 안정화 매질로서 다양한 조성의 천연공융용매로 실험한 결과 콜린클로라이드와 당류를 포함하는 천연공융용매의 경우 모두 CA 활성이 높게 유지되는 것을 확인하였으며(실시예6 참조), 다양한 온도에서 열적안정성이 부여되고 단백질의 2차구조도 유지됨을 확인하였다(실시예7 내지 실시예9 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G)의 안정화 매질로서 콜린클로라이드 : 프럭토스를 기반으로 한 천연공융용매를 이용한 결과 상온에서 단백질의 2차 및 3차 구조가 장기간 유지됨을 확인하였다(실시예10 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인간혈청알부민(HSA, Human serum albumin)의 안정화 매질로서 콜린클로라이드 : 프럭토스를 기반으로 한 천연공융용매를 이용한 결과 70℃에서도 인간혈청알부민(HSA, Human serum albumin)이 안정하게 유지됨을 확인하였다(실시예11 참조).
상기 실시예 결과에 비추어 본 발명의 천연공융용매는 다양한 단백질을 안정화시켜 보관이 용이하게 하는 효과를 가진다.
이에, 본 발명은 콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “당(sugar)”란 당, 당질, 설탕(雪糖), 당[류](糖[類]), 사탕(砂糖), 자당(蔗糖). 동물 및 식물 기원의 단맛이 있는 여러 종류의 탄수화물로서, 다가(多價)알코올의 알데하이드 또는 키톤 유도체이다. 당질의 주요한 2군(群)은 C12H22O11의 구조식을 가진 이당류와 C6H12O6의 단당류이며, 이들은 모두 백색의 결정성 고형이며, 물과 희석알코올에 녹는다. 이당류에는 대표적으로 수크로스(sucrose), 말토스(maltose), 락토스(lactose) 등이 있으며 단당류에는 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 만노스(mannose), 갈락토스(galactose) 등이 포함된다. 이들 이외에 많은 인공당 및 그 외의 당이 화학적으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “공융용매(deep eutectic solvent)”란 공융점을 갖는 용매로 공융점이란 두성분계의 고체상(固體相)-액체상(液體相) 곡선에서, 두 성분이 고용체(固溶體)를 만들지 않고 액체 상태에서 완전히 녹아 섞이는 점 또는 냉각시에는 일정 조성의 용액에서 성분수에 따른 종류의 결정이 동시에 정출하는 점을 의미한다.
본 발명에서 상기 단백질은 인터페론-2 알파(interferon-2α), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G) 및 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 특정 항체를 안정화 시키는 용도로 사용될 수도 있다.
본 발명에서 상기 당은 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 글루코스(glucose), 자일로스(xylose), 및 말토스(maltose) 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 당은 프럭토스 이다.
본 발명에서 상기 콜린클로라이드와 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 글루코스(glucose), 자일로스(xylose), 또는 말토스(maltose)의 몰비(molar ratio)는 1 : 0.5 내지 2.0 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 콜린클로라이드와 갈락토스(galactose) 또는 만노스(mannose)의 몰비는 1 : 0.2 내지 1.0 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 단백질을 포함하는 용액에 콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질을 안정화하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. IFN - α2 안정화 매질로서 천연공융용매의 선별
IFN-α2의 안정화 매질로서 다양한 몰비로 조성된 콜린클로라이드(choline chloride; Chl) : 당(sugar)과 콜린클로라이드(choline chloride; Chl) : 카복시산 그룹(carboxylic acid group)을 기반으로 한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent; NDES)에 PBS에 녹인 IFN-α2(최종 농도 = 40 μM)를 첨가하고, 동결 건조를 통해서 물을 제거하여, IFN-α2가 용해된 천연공융용매를 제조하였다. IFN-α2 / NDES 제제를 사용하기 전에 원하는 농도로 희석(최종 농도 = 5 nM) 시킨 후, IFN-α2의 활성도를 측정하여 용해 전과 후에 단백질 활성을 유지시키는 천연공융용매를 선별하였다 (Chl:Choline chloride, Fru:Fructose, Suc:Sucrose, Gal:Galactose, Man:Mannose, Glu:glucose, Xyl:Xylose, Mat:Maltose, Cit:Citric acid, Mal:Malic acid, Lev:levulinic acid, Tar:Tartaric acid, Oxa:Oxalic acid). IFN-α2의 활성은 인터페론-센시티브 리스폰스 엘리먼트(Interferon-sensitive response element; ISRE) 프로모터의 발현 조절을 받는 파이어플라이 루시페라아제 유전자(firefly luciferase gene)를 리포터 유전자(reporter gene)로 형질전환한 인간 자궁경부암세포(HeLa)를 이용하여 측정하였다. ISRE-루시페라아제 활성측정을 위해, HeLa 세포(200,000 cells/well)를 24 웰 플레이트에 배양하여 24시간 후, IFN-α2(최종 농도 =5 nM)를 처리하고 18시간 후 루시페라아제 활성을 측정하였다.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 콜린클로라이드와 당류를 포함하는 천연공융용매의 경우 모두 루시페라아제 활성이 뛰어난 것으로 나타났으며 특히 콜린클로라이드와 프럭토스의 몰비가 1:1인 경우 가장 활성이 높은 것으로 나타났다.
실시예2 . Chl:Fru NDES와 PBS에 용해되어 있는 IFN - α2 단백질의 2차 및 3차 구조 비교
상기 실시예 1을 통해 선별한 천연공융용매(Chl:Fru)가 IFN-α2의 구조와 활성도에 영향을 주지 않는 것을 확인하기 위해 Chl:Fru와 PBS에 용해되어 있는 IFN-α2 단백질의 2차 및 3차 구조를 비교하였다.
IFN-α2 단백질 2차 구조 변화는 PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다 (1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate).
IFN-α2 단백질 3차 구조 변화는 8-아닐리노-1-나프탈렌설포닉에시드암모늄염(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt; ANS)를 사용한 외부형광성(extrinsic fluorescence)의 측정을 통해 관찰했으며 PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM) 200 μL에 20 μL의 ANS (40 μM)을 첨가하여 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 형광 변화를 관찰하였다 (370 nm excitation / 400-600 nm emission).
그 결과 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이 NDES와 PBS에서 유사한 결과값을 가지는 것으로 나타나 천연공융용매가 단백질의 2차 및 3차구조에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
실시예 3. Chl:Fru NDES에서 IFN - α2의 열적안정성 평가
상기 실시예 1을 통해 선별한 천연공융용매(Chl:Fru)와 PBS에 용해된 IFN-α2의 용융점(Melting temperature; Tm)을 비교하기 위해 분광 광도계(Cary 100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 사용하여 단백질 샘플의 온도를 1 ℃/분의 속도로 연속적으로 증가시킴으로써 PBS 또는 Chl:Fru에 용해 된 IFN-α2의 용융 거동을 관찰 하였다. 최종 단백질 농도는 5.0 μM이었으며 용융 곡선 및 Tm은 온도에 따른 280 nm에서의 흡광도의 변화에 기초하여 결정되었다. 열 변성은 온도와 흡광증가성(hyperchromicity)의 일차 도함수(dH / dT)를 사용하여 나타내었다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, PBS의 경우 60℃ 근방부터 급격히 단백질 변성이 일어나는 것으로 관찰되는 반면 Chl:Fru는 변화가 거의 없는 것으로 나타나 Chl:Fru NDES가 단백질의 열적 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. Chl:Fru NDES에 용해된 IFN - α2의 다양한 온도 조건에서 활성도 측정 및 70℃에서 단백질의 2차 및 3차 구조비교
IFN-α2의 활성은 ISRE 프로모터의 발현 조절을 받는 파이어플라이 루시페라아제 유전자를 리포터 유전자로 형질전환한 인간 자궁경부암세포 (HeLa)를 이용하여 측정하였다. ISRE-루시페라아제 활성측정을 위해, HeLa 세포(200,000 cells/well)를 24 웰 플레이트에 배양하여 24시간 후, IFN-α2(최종 농도 = 5 nM)를 처리하고 18시간 후 루시페라아제 활성을 특정했다. IFN-α2 단백질 2차구조 변화는 PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다 (1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate)
IFN-α2 단백질 3차구조 변화는 8-아닐리노-1-나프탈렌설포닉에시드암모늄염(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt; ANS)를 사용한 외부형광성(extrinsic fluorescence)의 측정을 통해 관찰했다. PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM) 200 μL에 20 μL의 ANS (40 μM)을 첨가하여 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 형광 변화를 관찰하였다 (370 nm excitation / 400-600 nm emission)
그 결과 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이 PBS에서는 70℃에서 IFN-α2의 활성도가 급격히 저하되었으나 Chl:Fru NDES에 용해된 IFN-α2는 다양한 온도 조건에서 높은 활성도를 유지하였고 70℃에서도 장시간 활성도를 유지하고 있음을 확인하였다. 또한, 도 4c 및 4d에 나타난 바와 같이 NDES에서는 70℃에서 단백질의 2차 및 3차 구조가 안정하게 유지되는 것을 확인하였다.
실시예 5. Chl:Fru NDES와 PBS에 용해된 IFN - α2의 상온에서 시간에 따른 활성도 비교
IFN-α2의 활성은 ISRE 프로모터의 발현 조절을 받는 파이어플라이 루시페라아제 유전자를 리포터 유전자로 형질전환한 인간 자궁경부암세포(HeLa)를 이용하여 측정하였다. ISRE-루시페라아제 활성측정을 위해, HeLa 세포(200,000 cells/well)를 24 well plate에 배양하여 24시간 후, 37˚C에서 지정된 기간동안 인큐베이션 후 샘플링한 IFN-α2(최종 농도 = 5 nM)를 처리하고 18시간 후 루시페라아제 활성을 측정하였다.
IFN-α2 단백질 2차 구조 변화는 PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다(1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate).
IFN-α2 단백질 3차구조 변화는 8-아닐리노-1-나프탈렌설포닉에시드암모늄염(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt; ANS)를 사용한 외부형광성(extrinsic fluorescence)의 측정을 통해 관찰했다. PBS에 희석한 IFN-α2(최종 농도 = 1.5 μM) 200 μL에 20 μL의 ANS (40 μM)을 첨가하여 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 형광 변화를 관찰하였다 (370 nm excitation / 400-600 nm emission).
그 결과 도 5a에 나타난 바와 같이, PBS에 용해된 IFN-α2은 37˚C에서 20일경부터 급격히 활성도가 떨어진 반면에 Chl:Fru NDES에 용해된 IFN-α2는 90일 이후까지도 활성도가 유지되는 것을 확인할 수 있었고, 도 5b 및 5c에 나타난 바와 같이 Chl:Fru NDES에 용해된 IFN-α2의 2차와 3차 구조가 안정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 탄산무수화효소 (carbonic anhydrase ) 안정화 매질로서 천연공융용매의 선별
탄산무수화효소(carbonic anhydrase; CA)의 안정화 매질로서 다양한 몰비로 조성된 콜린클로라이드 : 당과 콜린클로라이드 : 카복시산 그룹을 기반으로 한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent, NDES)에 PBS에 녹인 CA(최종 농도 = 67 μM)를 첨가하고, 동결 건조를 통해서 물을 제거하여, CA가 용해된 천연공융용매를 제조하였다. CA / NDES 제제를 사용하기 전에 원하는 농도로 희석(최종 농도 = 33 nM) 시킨 후, CA의 활성도를 측정하여 용해 전과 후에 단백질 활성을 유지시키는 천연공융용매를 선별하였다 (Chl:Choline chloride, Fru:Fructose, Suc:Sucrose, Gal:Galactose, Man:Mannose, Glu:glucose, Xyl:Xylose, Mat:Maltose, Cit:Citric acid, Mal:Malic acid, Lev:levulinic acid, Tar:Tartaric acid, Oxa:Oxalic acid). CA의 활성은 CA에 의한 4-니트로페닐 아세테이트(4-nitrophenyl acetate; PNPA)의 가수 분해에 의해 생성되는 발색 물질인 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 흡광도 변화를 통하여 측정하였다. CA (최종 농도 = 33 nM) 100 μl와 PNPA (최종농도 = 5 μM) 100 μl를 96 웰 플레이트에서 혼합한 뒤에 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 5분 동안 30초 간격으로 400 nm에서의 흡광도 변화를 통해 CA의 활성도를 측정하였다.
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 콜린클로라이드와 카복시산 그룹을 포함하는 천연공융용매의 경우 CA 활성이 낮았으나 콜린클로라이드와 당류를 포함하는 천연공융용매의 경우 모두 CA 활성이 높게 유지되는 것으로 나타났다.
실시예7 . Chl:Fru와 PBS에 용해되어 있는 CA 단백질의 2차 구조 비교
실시예 6을 통해 선별한 천연공융용매(Chl:Fru)가 CA의 구조와 활성도에 영향을 주지 않는 것을 확인하기 위해 Chl:Fru와 PBS에 용해되어 있는 CA 단백질의 2차 구조를 비교하였다.
CA 단백질 2차구조 변화는 PBS에 희석한 CA (최종 농도 = 3.3 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다 (1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate).
그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 네이티브 CA와 NDES가 첨가된 CA모두 비슷한 결과값을 나타내고 있어 천연공융용매가 단백질의 구조에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
실시예 8. Chl:Fru NDES에서 CA의 열적안정성 평가
실시예 6을 통해 선별한 천연공융용매(Chl:Fru)와 PBS에 용해된 CA의 용융점(Melting temperature; Tm)를 비교하여, Chl:Fru가 단백질의 열적 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인하기 위해 분광 광도계 (Cary 100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 사용하여 단백질 샘플의 온도를 1 ℃ / 분의 속도로 연속적으로 증가시킴으로써 PBS 또는 Chl:Fru에 용해 된 CA의 용융 거동을 관찰하였다. 최종 단백질 농도는 5.0 μM이었으며 용융 곡선 및 Tm은 온도에 따른 280 nm에서의 흡광도의 변화에 기초하여 결정되었다. 열변성과 관련하여 온도와 흡광증가성(hyperchromicity)은 일차 도함수(dH / dT)를 사용하여 나타내었다.
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, PBS의 경우 60℃ 근방부터 급격히 단백질 변성이 일어나는 것으로 관찰되는 반면 Chl:Fru는 변화가 거의 없는 것으로 나타나 Chl:Fru가 단백질의 열적 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 9. Chl:Fru NDES에 용해된 CA의 다양한 온도 조건에서 활성도 및 70℃에서 CA의 활성도 및 탁도 비교
CA의 활성은 CA에 의한 4-니트로페닐아세테이트(4-nitrophenyl acetate; PNPA)의 가수 분해에 의해 생성되는 발색 물질인 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 흡광도 변화를 통하여 측정하였다. CA (최종 농도 = 33 nM) 100 μl와 PNPA (최종농도=5 μM) 100 μl를 96 웰 플레이트에서 혼합한 뒤에 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 5분 동안 30초 간격으로 400 nm에서의 흡광도 변화를 통해 CA의 활성도를 측정하였다. 70℃에서 시간에 따른 CA의 탁도 변화는 CA가 용해된 Chl:Fru NDES (최종농도 = 5.0 μM)와 PBS(최종농도 = 5.0 μM)를 415 nm 에서의 흡광도 변화를 통해서 측정하였다.
그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, PBS에서는 65℃부터 효소의 활성도가 급격히 떨어졌으나 NDES에서는 상대적으로 높은 활성도를 유지하고 있었으며 또한, 도 9b 및 9c에 나타난 바와 같이, 70℃에서 시간에 따른 CA의 활성도 및 탁도 관찰에서도 NDES가 PBS군보다 완만하게 값이 변화함을 확인하였다.
실시예 10. Chl:Fru NDES에 용해된 인간면역글로불린G ( IgG , human immunoglobulin G)의 상온에서 시간에 따른 안정성 분석
IgG 항체 단백질의 안정화 매질로서 콜린클로라이드 : 프럭토스 (molar stoichiometry = 1:1)를 기반으로 한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent, NDES)에 PBS에 녹인 IgG를 첨가하고, 동결 건조를 통해서 물을 제거하여, IgG가 용해된 천연공융용매(최종농도 = 15 μM)를 제조하였다.
IgG 항체 단백질 2차 구조 변화는 PBS에 희석한 IgG(최종 농도 = 1.5 μM)를 항온 유닛이 장착된 분광편광계(spectropolarimeter)를 사용하여 분석하였다(1.0mm quartz cell, far UV CD 190 nm - 250 nm at 50 nm/min scanning rate).
IgG 항체 단백질 3차구조 변화는 8-아닐리노-1-나프탈렌설포닉에시드암모늄염(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt; ANS)를 사용한 외부형광성(extrinsic fluorescence)의 측정을 통해 관찰했다. PBS에 희석한 IgG(최종 농도 = 1.5 μM) 200 μL에 20 μL의 ANS (40 μM)을 첨가하여 마이크로 플레이트 리더 (Infinite® 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 상온에서 형광 변화를 관찰하였다 (370 nm excitation / 400-600 nm emission).
그 결과 도 10a 및 10b에 나타난 바와 같이, Chl:Fru NDES에 용해된 IgG는 상온에서 8주 이후까지도 IgG의 2차 및 3차 구조가 안정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 11. 천연공융용매(Chl:Fru)에 다양한 농도로 용해된 인간혈청알부민 (HSA, Human serum albumin)의 열적안정성 분석
HSA의 안정화 매질로서 콜린클로라이드 : 프럭토스 (molar stoichiometry = 1:1)를 기반으로 한 천연공융용매(natural deep eutectic solvent, NDES)에 PBS에 녹인 다양한 농도의 HSA를 첨가하고, 동결 건조를 통해서 물을 제거하여, HSA가 용해된 천연공융용매(최종농도 = 15 μM ~ 2.25 mM)를 제조하였다(도 10a). 70℃에서 2시간 동안 가열한 후 가열전과 비교한 결과 도 11a 및 11b에 나타난 바와 같이 HSA의 상태변화를 육안으로 관찰할 수 없었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (12)

  1. 콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물로서,
    상기 당은 프럭토스(fructose)이고,
    상기 단백질은 인터페론-2 알파(interferon-2α), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G) 및 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는, 단백질 안정화용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 콜린클로라이드와 프럭토스의 몰비는 1 : 0.5 내지 2.0인 것을 특징으로 하는, 단백질 안정화용 조성물.
  6. 삭제
  7. 단백질을 포함하는 용액에 콜린클로라이드(choline chloride) 및 당(sugar)이 포함된 천연공융용매를 함유하는, 단백질 안정화용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질을 안정화하는 방법으로서,
    상기 당은 프럭토스(fructose)이고,
    상기 단백질은 인터페론-2 알파(interferon-2α), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 인간면역글로불린G(IgG, human immunoglobulin G) 및 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는, 단백질을 안정화하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제7항에 있어서,
    상기 콜린클로라이드와 프럭토스의 몰비는 1 : 0.5 내지 2.0인 것을 특징으로 하는, 단백질을 안정화하는 방법.
  12. 삭제
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