TW201307565A - 由樹汁製造異麥芽酮糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明關於用於將含蔗糖之樹汁異構化以製造異麥芽酮糖(isomaltulose)的方法。

Description

由樹汁製造異麥芽酮糖的方法
本發明關於用於將含蔗糖之樹汁異構化以製造異麥芽酮糖的方法。
藉由異麥芽酮糖合成酶(蔗糖葡糖基變位酶,EC 5.4.99.11)之協助將水溶液中之蔗糖進行酶性異構化來產生異麥芽酮糖為一種已知的方法。例如,DE1049800描述藉由菌株紅色精蛋白桿菌(Protaminobacter rubrum)從含蔗糖之樹汁發酵產生異麥芽酮糖的方法。或者,酶性轉化亦可以死亡的有機體來進行。在反應結束時藉由離心將細胞團分批分離出,再將該產物進一步加工。此方法可在文獻H.Schiweck,alimenta 19,5-16,1980年中找到。
EP0001099描述以,尤其是濃汁或稀汁作為受質,將紅色精蛋白桿菌(CBS574.77)及普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)(ATCC 15928)菌種連續發酵使蔗糖同時異構化成異麥芽酮糖的方法,其中該受質溶液本身為用於長成細胞之營養介質。在反應後藉由離心將這些細胞從產物溶液分離出。從受質介質以外之介質中行的實際異構化中分離出生物催化上有效的有機體培養已被明確證明是不方便的。
DE3241788描述藉由來自如下群體之菌種的游離細胞從蔗糖水溶液製造1-O-α-D-吡喃葡萄糖苷基-D-果糖的方 法:紅色精蛋白桿菌(CBD574.77)、普城沙雷氏菌(ATCC 15928)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)(NCIB 8285)、腸繫膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(NRRL-B-512 F)及大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)(NCPPB 1578)。在描述之方法中可以使用濃汁,且其可同樣作為用於細胞生長過程之碳源。在固定化細胞的情況下需使用純蔗糖溶液作為來源。
在上述兩篇專利說明書中所揭露之發酵製造異麥芽酮糖的情況中,可選擇在無菌條件下使用經濟及能量上有利的濃汁。然而,此處有需要提及該方法之缺點--有些蔗糖係用於形成細胞團,且需要複雜的無菌設備以及費工地從產物流分離出細胞懸浮液。
EP0983374描述以來自如下群體之固定化菌株同時製造異麥芽酮糖及甜菜鹼的方法:紅色精蛋白桿菌(CBD574.77)、普城沙雷氏菌(ATCC 15928)及大黃歐文氏菌(NCPPB 1578)。此製造方法係從糖蜜(其為糖製造過程結束時製造的組成物)開始。在此方法中不可能使用濃汁作為受質,且需經由,例如結晶化來確實消耗蔗糖。
WO97/44478描述以來自如下群體之活的、固定化菌株製造異麥芽酮糖的方法:紅色精蛋白桿菌(CBD574.77)、普城沙雷氏菌(ATCC 15928)及大黃歐文氏菌(ATCC 29284)。此製造方法係從糖蜜或純蔗糖溶液開始。
EP0028900描述以大黃歐文氏菌株(NCPPB 1578)之固定化細胞製造異麥芽酮糖的方法。此製造方法係從純蔗 糖溶液與最多15%體積/體積之糖蜜的混合物開始。
DE2217628、EP49472、EP3038219及EP91063描述以固定化細菌細胞將純蔗糖酶性轉化成異麥芽酮糖的方法。為此,EP0625578使用來自如下群體之菌株:紅色精蛋白桿菌(CBS574.77)、普城沙雷氏菌(ATCC 15928)、黏質沙雷氏菌(NCIB 8285)、腸繫膜明串珠菌(NRRL-B512F(ATCC 1083a))及大黃歐文氏菌(NCPPB 1578)。EP0392556及EP1257638描述使用來自如下群體之菌株:土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)JCM 1687、克雷伯氏菌屬88號(FERM BP-2838)及新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)LX3和LX21。
使用固定化細胞之異構化方法描述於DE3133123及EP0915986中且用於藻酸鈣之酶催化劑或離子交換劑的固定化方法之領域中。
以固定化細胞將蔗糖異構化成異麥芽酮糖的所有已知方法的一個共同特點為僅使用製糖過程中的終端產品,即純蔗糖或糖蜜。
因此,連接這些方法之結晶化的方法控制並無高要求,因為該異構化混合物並不非常複雜且具有被完善定義之組成物,異麥芽酮糖可很容易地從此組成物分離出。迄今所知之結晶方法並不適合用於從更嚴重污染的溶液中分離出令人滿意之等級的異麥芽酮糖。
因此,本發明之目標係提供可能從現成之蔗糖來源取得純化之異麥芽酮糖的方法。
本發明的說明
令人驚訝的是,現已發現使用含蔗糖之樹汁,採用固定化酶複合物來製造異麥芽酮糖可達到這個目的。
因此,本發明提供製造異麥芽酮糖的方法,其包含下列方法步驟:A)將能夠催化蔗糖異構化成異麥芽酮糖之反應的酶複合物(較佳為經固定者)與含蔗糖之溶液接觸;B)將至少一些蔗糖異構化成異麥芽酮糖;C)將該酶複合物分離出以產生進料溶液,D)藉由蒸發將水從該進料溶液部分移除,以產生異麥芽酮糖晶體之懸浮液,E)將該懸浮液分成含有異麥芽酮糖之固體及母液,以及可選擇地F)清洗該含有異麥芽酮糖之固體,此方法之特徵在於所使用之含有蔗糖的溶液係選自濃汁或稀汁至少一者,較佳為濃汁。
在這方面,本發明有利地提供含蔗糖之樹汁於作為異構化反應之受質的用途。
令人驚訝地,憑藉本發明,儘管所使用之含蔗糖溶液為未經純化的且因此為非常複雜的受質混合物,但可在異構化反應中得到與藉由高純度蔗糖所取得者相同之產量及甚至較高之選擇性。
本發明的優點之一為增加固定化細胞與作為受質之天然樹汁結合的停留時間,由於節省產生高純度蔗糖之純化步驟,因而可取得實質上較高之資源利用率。
本發明之進一步的優點為由於直接使用濃汁因而節省能源及操作工具。
本發明之另一優點為由於使用濃汁,因而不需要任何種類之緩衝溶液或其他用於穩定酶活性的添加劑,而是自然穩定所使用酶。
本發明之進一步的優點為相對於使用純蔗糖水溶液,經由使用含蔗糖的樹汁可防止床滲流。
本發明之另一優點為與使用純化之蔗糖溶液相比較,在異構化期間使用濃汁可以降低致齲之單醣類果糖及葡萄糖之含量。
術語“異麥芽酮糖”意指6-O-α-D-吡喃葡萄糖苷基-D-果糖。
術語“酶複合物”意指具有至少一種活性酶之組成物或混合物組成物,其本質上亦可為複合物,諸如,例如活細胞。酶複合物之進一步實例為其中該至少一種活性酶與至少一種其他多肽相連的融合蛋白,但純化之酶本身亦可為用於本發明目的之酶複合物。
在本發明方面,術語“固定化酶複合物”意指與基質結合或被基質包封之酶複合物,從而使該酶複合物受到限制,例如減緩其在水溶液中的自由擴散或自由流動。
在本發明方面,術語“稀汁”意指在從甜菜或甘蔗 製造糖的方法中將汁液純化後呈現之產品。稀汁通常包含10-20重量%之蔗糖(以全部汁液計)。
在本發明方面,術語“濃汁”一意指增濃之“稀汁”,其包含超過20重量%之蔗糖(以全部汁液計)。
除非另有說明,所給予之百分比(%)均為重量百分比。
在根據本發明之方法中,較有利地,所使用之含蔗糖的溶液為濃汁;若需要時,可以水將此以1:5之體積比稀釋(根據濃汁對水之比例),從而取得更佳之可控制的異構化。尤其是,以水稀釋濃汁係經過選擇,如此,在方法步驟A)開始時,存在於濃汁中之蔗糖濃度為20-80重量%,尤其是30-50重量%(以全部汁液計)。
尤其是,較有利地,使用來自甜菜之稀汁或濃汁,以來自甜菜之濃汁特佳。
較佳地,存在於酶複合物中之酶為至少一種屬於酶類別EC 5.4.99.11之蔗糖葡糖基變位酶。特佳地,在根據本發明之方法中使用來自下列群組之蔗糖葡糖基變位酶:紅色精蛋白桿菌(Protaminobacter rubrum),尤其是菌株紅色精蛋白桿菌CBS574.77以及具有Seq ID No.5及6者;紅色精蛋白桿菌Z12;普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica),尤其是菌株普城沙雷氏菌ATCC 15928;氣味沙雷氏菌(Serratia odorifera),尤其是菌株氣味沙雷氏菌4Rx13(Seq ID No.7);黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens),尤其是菌株黏質沙雷氏菌NCIB 8285;腸 繫膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),尤其是菌株腸繫膜明串珠菌ATCC 1083a;大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici),尤其是菌株大黃歐文氏菌ATCC29283(SEq ID No:1)、NCPPB 1578、DSM 4484(Seq ID No.8)、NX-5(Seq ID No.9)及WAC2928(Seq ID No.10);歐文氏菌屬(Erwinia sp.),尤其是菌株歐文氏菌D12;放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter),尤其是菌株放射形土壤桿菌MX-232;土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena),尤其是菌株土生克雷伯氏菌JCM 1687;克雷伯氏菌屬,尤其是菌株克雷伯氏菌FERM BP-2838、LX3(Seq ID No.11)及NK33-98-8(Seq ID No.12);肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),尤其是菌株肺炎克雷伯氏菌342(Seq ID No.4);新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis),尤其是菌株新加坡克雷伯氏菌LX21;嗜中酸假單胞菌(Pseudomonas mesoacidophila),尤其是菌株嗜中酸假單胞菌MX-45(Seq ID No.2);分散泛菌(Pantoea dispersa),尤其是菌株分散泛菌UQ68J(Seq ID No.3);植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola),尤其是菌株植生克雷伯氏菌CCRC 19112、MX10及UQ14S(Seq ID No.13);腸桿菌屬(Enterobacter sp.),尤其是菌株腸桿菌FMB-1(Seq ID No.16)、SZ62及Ejp617(Seq ID No.14);凡蘭廸固氮菌DJ(Azotobacter vinelandii DJ)(Seq ID No.15),特別佳的為紅色精蛋白桿菌CBS574.77及紅色精蛋白桿菌 Z12。
該酶可以如多肽之純化形式使用。為了容易純化,這些可為融合蛋白之形式,其中係將,例如可使純化容易之標籤(諸如His標籤、Strep標籤、GST標籤或MBP標籤)與酶融合。
在根據本發明之方法中,較佳地,該酶複合物為完整細胞,該細胞宜選自如下群組:紅色精蛋白桿菌,尤其是菌株紅色精蛋白桿菌CBS574.77;紅色精蛋白桿菌Z12;普城沙雷氏菌,尤其是菌株普城沙雷氏菌ATCC 15928;氣味沙雷氏菌,尤其是菌株氣味沙雷氏菌4Rx13;黏質沙雷氏菌,尤其是菌株黏質沙雷氏菌NCIB 8285;腸繫膜明串珠菌,尤其是菌株腸繫膜明串珠菌ATCC 1083a;大黃歐文氏菌,尤其是菌株大黃歐文氏菌ATCC29283、NCPPB 1578、DSM 4484、NX-5及WAC2928;歐文氏菌屬,尤其是菌株歐文氏菌D12;放射形土壤桿菌,尤其是菌株放射形土壤桿菌MX-232;土生克雷伯氏菌,尤其是菌株土生克雷伯氏菌JCM 1687;克雷伯氏菌屬,尤其是菌株克雷伯氏菌FERM BP-2838、LX3及NK33-98-8;肺炎克雷伯氏菌,尤其是菌株肺炎克雷伯氏菌342;新加坡克雷伯氏菌,尤其是菌株新加坡克雷伯氏菌LX21;嗜中酸假單胞菌,尤其是菌株嗜中酸假單胞菌MX-45;分散泛菌,尤其是菌株分散泛菌UQ68J;植生克雷伯氏菌,尤其是菌株植生克雷伯氏菌CCRC 19112、MX10及UQ14S;腸桿菌屬,尤其是菌株腸桿菌FMB-1、SZ62及Ejp617;凡蘭廸固 氮菌DJ,特別佳的為紅色精蛋白桿菌CBS574.77及紅色精蛋白桿菌Z12。
固定酶複合物可採取,例如CLEAs(不溶性交聯酶聚集物)之形式(Cao,L.et al.,2000,Cross-linked enzyme aggregates:a simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase,Org.Lett.,2:1361-1264)或固定在天然或合成來源之固態支撐材料上。天然材料為,例如多醣類,諸如藻酸鹽、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、纖維素及其衍生物(如DEAE-或CM-纖維素)。亦可能使用經改質之瓊脂糖凝膠,諸如,例如經環氧樹脂活化、經溴化氰活化、經NHS活化、經巰醇活化之瓊脂糖凝膠。這些瓊脂糖凝膠可從,例如GE醫療公司、BioRad、Sigma及Pierce公司購得。
可使用之合成的有機聚合物為聚苯乙烯衍生物、聚丙烯酸酯,尤其是經環氧化物活化之丙烯酸樹脂小珠(Eupergit)、聚甲基丙烯酸樹脂、聚丙烯醯胺、乙烯與丙烯之聚合物、聚酯或聚醯胺。
可能之無機載體為以氧化矽或鋁氧化物或其混合物為底質之物質。
固定酶複合物亦可經由包封在聚合性多孔凝膠內進行,例如RSi(OCH3)3或RSi(OCH3)3與Si(OCH3)4之混合物的疏水性溶膠-凝膠物質(Reetz,M.T.;Zonta,A.;Simpelkamp,J.;Rufinska,A.;Tesche,B.J.Sol-Gel Sci.Technol.1996,7,p.35-43)或多孔聚合性矽膠之疏 水性溶膠-凝膠物質(Elgren,T.M.;Zadvorny,O.A.;Brecht,E.;Douglas,T.;Zorin,N.A.;Maroney,M.J.& Peters,J.W.)。
此外,除了固定化外,可以構想該酶在酶膜反應器中的多種用途。
較佳地,根據本發明之方法中所使用的酶複合物(尤其是細胞)係固定在多醣,諸如藻酸鹽、果膠、卡拉膠、殼聚醣或聚乙烯醇(諸如,例如lentikats)或彼等之混合物中,尤其是固定在藻酸鹽中;在這方面可比照,例如Shimizu,H.,et al.(1997)Screening of novel microbial enzymes for the production of biologically and chemically useful compounds,in:Advances in biochemical engineering biotechnology,Vo158:New Enzymes for Organic Synthesis(Scheper,T.,ed.)pp.45-88,Springer,New York。
欲用於根據本發明方法所使用之任何形式的酶複合物中的特佳固定方法為EP2011865中所描述的方法,其中該固定在惰性支撐物上的酶複合物係由經由矽氫化作用所取得之矽酮塗層提供。
根據本發明,在方法步驟B)中之pH值宜為4至9.5。此pH值可藉由酸(尤其是無機酸,較佳為選自硫酸、鹽酸或醋酸)協助之利而建立。
根據本發明,在方法步驟B)中亦宜使溫度在20至40℃,較佳為25至35℃之溫度(在含蔗糖的溶液中測量 )。
方法步驟C)中係將該酶複合物從異麥芽酮糖分離出;此步驟係藉由,例如過濾、沉澱或離心進行。與未固定之酶相比較,由於酶複合物之固定特性可加速此分離步驟。
為了方法經濟的原因,根據本發明,若使用為固體床形式之固定化酶複合物(含有蔗糖之溶液通過此床流動)則為較佳之情況(H.Schiweck,Zuckerind.(1990),115(7),555-565)。對應之固體床方法描述於A.Liese,et.al.Processes in A.Liese,K.Seelbach,C.Wandrey(Eds.),Industrial Biotransformations 2nd Edition(2006),Wiley-VCH,Weinheim中。於這類方法中,持續進行方法步驟A)至C),從而彼此合併,同時進行。
根據本發明之較佳方法的特徵在於步驟D)中添加異麥芽酮糖晶種,尤其是添加0.01至10重量%之量,特佳為添加0.1至1重量%(根據晶體量之理論計算值)。
現已證明在根據本發明之方法中,若該麥芽酮糖晶種係在當進料溶液中之音速在1800米/秒至2000米/秒之範圍內(尤其是1850米/秒至1950米/秒,尤其是1870米/秒至1920米/秒)時添加則是較有利的。音速係使用用於測定音速之標準商業探測器測量。音速探測器之典型製造商為Sensotech公司(德國馬格德堡)或Anton Paar(奧地利格拉茨)公司。
根據本發明之較佳方法的特點為方法步驟D)係在50 ℃至70℃之溫度範圍內(較佳為55℃至65℃,特佳為58℃至62℃)及70毫巴至200毫巴之壓力範圍內(較佳為100毫巴至180毫巴,特佳為110毫巴至140毫巴)進行。尤其是,在這方面,較佳地,根據本發明的方法中,方法步驟D)係在58℃至62℃之溫度範圍內及110毫巴至140毫巴之壓力範圍內進行。
藉由變化蒸發的程度可取得不同之固體含量和/或產量;此可經由,例如方法步驟D)之停留時間來控制。若在方法步驟D)中移除足夠的水從而使該懸浮液含有20重量%至70重量%(以所取得之懸浮液計),較佳地,30重量%至65重量%,特佳地,40重量%至60重量%)之固體異麥芽酮糖是較有利且較佳的。
在方法步驟E)中可使用所有熟習本技藝之人士所已知之從液體中分離固體的方法,諸如,例如離心、沉澱、傾析、在重力場中分離及過濾。根據本發明之較佳方法的特徵在於方法步驟E)中係藉由離心進行分離。
較佳地,根據本發明之方法步驟F)中係以水進行清洗,尤其是以溫度在20℃至90℃(較佳地,30℃至80℃,特佳地,50℃至70℃)的水進行清洗。
為了提高異麥芽酮糖之產量及避免產物損失,較佳地,根據本發明之方法步驟F)中所使用之用於清洗的液體,尤其是用於清洗的水係被送料進入方法步驟C)之進料溶液中。
因此,根據本發明之較佳方法的特徵在於該方法步驟 C)之包含異麥芽酮糖及水的進料溶液包含方法步驟F)中所使用之清洗用液體;特佳地,該進料溶液包含在方法步驟F)中所使用之清洗用液體及含蔗糖樹汁之直接異構化產物。
為了取得相同之技術效果,較佳地,根據本發明之方法的特徵在於其額外包含下列方法步驟G)冷卻來自方法步驟E)之母液以產生異麥芽酮糖晶體之第二懸浮液,H)將該懸浮液分成第二含有異麥芽酮糖之固體和第二母液,以及可選擇地I)將該第二含有異麥芽酮糖之固體溶解在方法步驟C)之進料溶液中。
為了能以最積極有利的可能方式進行此較佳方法,較佳地,方法步驟D)以及方法步驟F)係在50℃至70℃之溫度範圍內(較佳為55℃至65℃,特佳為58℃至62℃)及70毫巴至200毫巴之壓力範圍內(較佳為100毫巴至180毫巴,特佳為110毫巴至140毫巴)進行。尤其是,在這方面,較佳地,方法步驟D)以及方法步驟F)係在58℃至62℃之溫度範圍內及110毫巴至140毫巴之壓力範圍內進行。
尤其是,根據本發明之較佳方法的特徵在於方法步驟G)中,來自方法步驟E)之母液被冷卻至10℃至30℃,較佳為15℃至25℃,特佳為18℃至22℃,該壓力宜對應於0.9至1.1巴之大氣壓力。
在根據本發明之較佳方法的方法步驟H)中,可使用根據本發明方法之方法步驟E)中的相同方法將固體從液體中分離出以取得第二含有異麥芽酮糖之固體和第二母液;較佳地,方法步驟H)係在10℃至30℃,較佳為15℃至25℃,特佳為18℃至22℃進行。
該第二含有異麥芽酮糖之固體可經進一步處理以產生最終產物或者-如所建議者-在方法步驟I)中加入方法步驟C)之進料溶液中,較佳地,該第二含有異麥芽酮糖之固體在加入方法步驟C)之進料溶液後係以溶解形式存在於溶液中。
根據本發明,較佳地,本發明之方法中進行了方法步驟I)。因此,根據本發明之較佳方法的特徵在於方法步驟C)之進料溶液中包含異麥芽酮糖及水,特佳地,該進料溶液包括含來自方法步驟H)之溶解形式的第二含有異麥芽酮糖之固體及用於方法步驟F)中之清洗用液體。
下列實例藉由舉例的方式描述本發明,而無任何將本發明、由全部描述產生之範圍及申請專利範圍限制於實例中具體指明之實施例的意圖。
實例1:濃汁之異構化
以1-5毫升由下列者組成之無菌營養介質洗淨來自菌株紅色精蛋白桿菌(CBS574.77)之分殖細胞:50克/公斤之蔗糖、15克/公斤之玉米水膨體、7克/公斤之硫酸銨、 0.5克/公斤之酵母萃取物、1克/公斤之硫酸二氫鉀、0.41克/公斤之氯化鎂七水合物、0.004克/公斤之氯化錳四水合物、0.047克/公斤之檸檬酸鐵一水合物及926克/公斤之水,若需要時將pH值調整為7.2。以此懸浮液作為預培養之接種物,該預培養係在1升搖瓶中包含200毫升之上述營養液。
在30℃培養20個小時後,將該預培養以初始光密度值(OD600)為1之方式接種在具有1升無菌生產介質的2升發酵罐中,該無菌生產介質係由下列群體所組成:50克/公斤之蔗糖,15克/公斤之玉米水膨體,3克/公斤之硫酸銨,4克/公斤之磷酸氫銨、0.5克/公斤之酵母萃取物、1克/公斤之硫酸二氫鉀、0.41克/公斤之氯化鎂七水合物、0.004克/公斤之氯化錳四水合物、0.047克/公斤之檸檬酸鐵一水合物及926克/公斤之水,若需要時將pH值調整為7.2。
在30℃,pH7(經調節的)及30% pO2下進行發酵(級聯攪拌器,氣流)。在發酵期間餵入蔗糖。15-20小時後,完成發酵過程並可收穫該生物物質以進行固定。
為此,將所產生之懸浮液與水及4%強度之藻酸鹽溶液以1:1(體積比)混合。然後,經由浸泡在2%強度之氯化鈣溶液中來固定此懸浮液。以聚乙烯亞胺及戊二醛將所產生之小珠二次硬化。所產生之生物催化劑可在4-10℃儲存數週。
將所取得之固定化細胞引入可加熱之柱式反應器並加 熱至20-35℃,將來自甜菜之蔗糖含量為41重量%(以全部濃汁計)的經稀釋之濃汁在連續流中通過該反應器。
表1中可以找到異構化後之組成物。
實例2:異構化濃汁之結晶化 第1階段
來自實例1之異構化濃汁可用來作為起始物質。
藉由3升之加套攪拌容器之協助從異構化之濃汁將異麥芽酮糖結晶而出。
在20-25℃之溫度下,將2999克之進料溶液引入3升之結晶器中並加熱至60℃。在60℃之溫度下,小心地降低壓力,直至觀察到沸騰過程。將溫控器的溫度提高以補償藉由蒸發冷卻所帶來之溫度降低並小心地調節真空。沸騰溫度應保持固定在60℃。在固定壓力下,只要溫度一升高即調節真空,從而使溫度保持在60℃。藉由安裝的真空適配器及蒸餾液接收器之協助在該期間內持續測定餾出率。在蒸餾速率為41.5%或音速為1900米/秒時,中斷真空並經由安裝之漏斗將10克晶種(顆粒大小<20微米)接 種在濃縮液中。將容器之內含物保持在60℃約30分鐘,並一邊攪拌。將溶劑蒸發,然後小心地持續進行實際蒸發結晶化直到蒸發速率為48%或音速達到2130米/秒。在此時,中斷130毫巴之極限真空,停止蒸發。將懸浮液再留在結晶器中30分鐘,並一邊攪拌以使固液態分離。
從結晶器移出1553.5克之懸浮液。在固液態分離及晶體清洗方面可使用來自Cepa,籃直徑為200毫米之濾籃式離心機。在500rpm之轉速下,將1514.6克之懸浮液引入濾籃式離心機。在移出及裝填離心機之間計算出38.9克或2.5%之質量差。為了確實分離固、液體,將離心機之轉速增加至4000rpm。經由固液體分離可取得632.6克之母液。理論上,在濾布上之固體質量的計算值為88.2克。在預設量為10%之沖洗水方面,這產生之清洗水量的理論值為88.2克。然後,在該離心機上以90克超純水,在500 rpm之轉速下清洗固體。在接下去之乾法旋轉方面,將離心機之轉速設為4000 rpm。可去除225.3克之裝載清洗水量。從濾布可取得574克之清洗好的固體。該固體之殘留水分為3%。此固液態分離造成153.7克之質量差或10.1%之相對質量損失。
分離出之固體具有以下組成,所陳述之水為該異麥芽酮糖結晶之水:
從第1階段分離出之母液具以下組成:
使用所產生之質量計算以異麥芽酮糖為根據之未校正的產量:
該產量可藉由實驗程序之誤差校正:K1=裝填固液態分離之校正=1.025
K2=固液態分離期間之校正=1.101
Y 校正的= Y 未校正的k 1k 2=52.8%.1.025.1.101=59.6%
第2階段
為了提高產量,再於進一步的階段中處理母液。經由所謂的蒸發結晶(從60℃至約20℃)進行此處理。在此處之實驗中,使包含母液,質量為857.9克之水溶液返回結晶器並在60℃加熱。藉由線性冷卻斜率之協助,使溫度以每步驟0.2 K/分鐘慢慢冷卻。在57℃之溫度下加入1.8克顆粒大小<20微米之晶種。晶種之量約相當於預期晶體量之0.5-1%。添加晶種可經由,例如在異丙醇中之晶種的懸浮液進行。達到終點溫度後,將懸浮液在20℃進一步加熱約30分鐘並一邊攪拌。從結晶器移出575.8克之懸浮液並置入轉速為500rpm之離心機中。此相當於56.8克開始結晶時的質量差或8.9%之相對誤差。在離心機中進行固液態分離方面,將離心機之轉速增加至4000rpm。在第2階段不提供晶體清因為在第1階段之稍後過程中所取得之固體將被重新溶解及再結晶。將固液態分離後,取得334.8克之母液及180.8克之固體。該固體具有6%之殘餘水分。在固液態分離期間,測得47.9克之質量差。這相當於8.3%之誤差。第2階段亦是根據第1階段所使用之異麥芽酮糖來計算產量:
第2階段亦可能同樣計算經校正之產量。除了第1階 段之校正因素外,必須考慮第2階段之額外校正因素:K3=裝填/排空之校正=1.09
K2=固液態分離期間之校正=1.083
Y 校正的= Y 未校正的k 1k 2k 3k 4=17.5%.1.025.1.101.1.09.1.083=23.3%
在整個過程中,計算出之未經校正的總產量為70.3%,或者藉由質量平衡誤差所校正出之總產量為82.3%。
在第2階段中分離出之固體的組成列於下表中,所陳述之水為該異麥芽酮糖結晶之水:
從第2階段分離出之母液具以下組成(以乾燥物質計):
實例3:結晶化之技術方法控制的實例
根據本發明之較佳方法的一種可能的技術方法控制顯示於第1圖中:在方法開始時使用進料溶液(1)以重新溶解來自結晶階段S2(H)/固液態分離(I)之非經清洗的固體(14),該清洗水(10)係來自晶體清洗(E/F)。然後,將混合物(3)用於蒸發結晶化S1(D)中。此處,由於在60℃及對應含水率之130至150毫巴之壓力(5)下蒸發,異麥芽酮糖的溶解度超標,這意味著異麥芽酮糖結晶而出,並可以懸浮液形式(4)從蒸發結晶化(D)轉移至固液態分離/晶體清洗(E/F)中。在固液態分離/晶體清洗(E/F)中,將異麥芽酮糖晶體與母液(11)分開。以超純水(7)清洗被母液污染之固體。將清洗水(10)再次通過進料流以準備進入實驗程序。將經清洗之晶體(6)轉移至產品調製(J)。此處之產品調製可以配置為乾燥或超純水溶解站(9)。為了提高產量,將母液(11)通過冷卻結晶化(G)。此處,將溶液溫度從60℃冷卻至20℃ 。當如此做時,異麥芽酮糖之溶解度限制超標,因此,異麥芽酮糖結晶而出並形成懸浮液(12)。將懸浮液(12)從冷卻結晶化(G)通到固液態分離(H)。在此,將所產生之晶體(14)從母液(13)分離。該晶體未經清洗。母液(13)離開此流程。將固體(14)再次溶解在異麥芽酮糖的進料流(1)中以進行再結晶。
在方法流程圖中未列出用於結晶階段可能之分批操作的緩衝容器,等。
D‧‧‧蒸發結晶化
E/F‧‧‧固液態分離/晶體清洗
G‧‧‧冷卻結晶化
H‧‧‧固液態分離
I‧‧‧溶解
J‧‧‧產品調製(乾燥/溶解)
下列圖形形成實例之一部分:第1圖:結晶化之示範性技術方法控制
<110> Evonik工業
<120> 由樹汁製造異麥芽酮糖的方法
<130> 201100345
<160> 16
<170> Patent In第3.5版
<210> 1
<211> 600
<212> PRT
<213> 大黃歐文氏菌
<400> 1
<210> 2
<211> 584
<212> PRT
<213> 嗜中酸假單胞菌
<400> 2
<210> 3
<211> 598
<212> PRT
<213> 分散泛菌
<400> 3
<210> 4
<211> 598
<212> PRT
<213> 肺炎克雷伯氏菌
<400> 4
<210> 5
<211> 558
<212> PRT
<213> 紅色精蛋白桿菌
<400> 5
<210> 6
<211> 629
<212> PRT
<213> 紅色精蛋白桿菌
<400> 6
<210> 7
<211> 600
<212> PRT
<213> 氣味沙雷氏菌
<440> 7
<210> 8
<211> 600
<212> PRT
<213> 大黃歐文氏菌
<400> 8
<210> 9
<211> 550
<212> PRT
<213> 大黃歐文氏菌
<400> 9
<210> 10
<211> 632
<212> PRT
<213> 大黃歐文氏菌
<220>
<221> misc_特性
<222> (236)..(236)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_特性
<222> (449)..(449)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 10
<210> 11
<211> 598
<212> PRT
<213> 克雷伯氏菌屬
<400> 11
<210> 12
<211> 598
<212> PRT
<213> 克雷伯氏菌屬NK33-98-8
<400> 12
<210> 13
<211> 598
<212> PRT
<213> 植生克雷伯氏菌
<400> 13
<210> 14
<211> 599
<212> PRT
<213> 歐文氏菌Ejp617
<400> 14
<210> 15
<211> 600
<212> PRT
<213> 凡蘭廸固氮菌
<400> 15
<210> 16
<211> 599
<212> PRT
<213> 腸桿菌屬
<400> 16
1‧‧‧進料溶液
3‧‧‧混合物
4‧‧‧懸浮液形式
5‧‧‧壓力
6‧‧‧晶體
7‧‧‧超純水
9‧‧‧超純水溶解站
10‧‧‧清洗水
11‧‧‧母液
12‧‧‧懸浮液
13‧‧‧母液
14‧‧‧固體
D‧‧‧蒸發結晶化
E/F‧‧‧固液態分離/晶體清洗
G‧‧‧冷卻結晶化
H‧‧‧固液態分離
I‧‧‧溶解
J‧‧‧產品調製(乾燥/溶解)

Claims (15)

  1. 一種用於製造異麥芽酮糖之方法,其包含下列方法步驟:A)將能夠催化蔗糖異構化成異麥芽酮糖之反應的酶複合物與含蔗糖之溶液接觸;B)將至少一些蔗糖異構化成異麥芽酮糖;C)將該酶複合物分離出以產生進料溶液,D)藉由蒸發將水從該進料溶液部分移除,以產生異麥芽酮糖晶體之懸浮液,E)將該懸浮液分成含有異麥芽酮糖之固體及母液,以及可選擇地,F)清洗該含有異麥芽酮糖之固體,此方法之特徵在於所使用之含有蔗糖的溶液為選自濃汁或稀汁之至少一者,較佳為濃汁。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法,其中所使用之含有蔗糖的溶液為以水稀釋之濃汁且其蔗糖濃度為20-80重量%,尤其是30-50重量%(以全部汁液為基礎)。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法,其中存在於酶複合物中之酶為至少一種屬於酶類別EC 5.4.99.11之蔗糖葡糖基變位酶,尤其是來自下列群組之酶:紅色精蛋白桿菌(Protaminobacter rubrum),尤其是菌株紅色精蛋白桿菌CBS574.77以及具有Seq ID No.5及 6者;紅色精蛋白桿菌Z12;普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica),尤其是菌株普城沙雷氏菌ATCC 15928;氣味沙雷氏菌(Serratia odorifera),尤其是菌株氣味沙雷氏菌4Rx13(Seq ID No.7);黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens),尤其是菌株黏質沙雷氏菌NCIB 8285;腸繫膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),尤其是菌株腸繫膜明串珠菌ATCC 1083a;大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici),尤其是菌株大黃歐文氏菌ATCC29283(Seq ID No:1)、NCPPB 1578、DSM 4484(Seq ID No.8)、NX-5(Seq ID No.9)及WAC2928(Seq ID No.10);歐文氏菌屬(Erwinia sp.),尤其是菌株歐文氏菌D12;放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter),尤其是菌株放射形土壤桿菌MX-232;土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena),尤其是菌株土生克雷伯氏菌JCM 1687;克雷伯氏菌屬,尤其是菌株克雷伯氏菌FERM BP-2838、LX3(Seq ID No.11)及NK33-98-8(Seq ID No.12);肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),尤其是菌株肺炎克雷伯氏菌342(Seq ID No.4);新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis),尤其是菌株新加坡克雷伯氏菌LX21;嗜中酸假單胞菌(Pseudomonas mesoacidophila),尤其是菌株嗜中酸假單胞菌MX-45(Seq ID No.2);分散泛菌(Pantoea dispersa),尤其是菌株分散泛菌UQ68J(Seq ID No.3);植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola),尤其是菌株植生克雷伯氏菌CCRC 19112、 MX10及UQ14S(Seq ID No.13);腸桿菌屬(Enterobacter sp.),尤其是菌株腸桿菌FMB-1(Seq ID No.16)、SZ62及Ejp617(Seq ID No.14);凡蘭廸固氮菌DJ(Azotobacter vinelandii DJ)(Seq ID No.15)。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之方法,其中該酶複合物為細胞,尤其是選自下列群組之細胞:紅色精蛋白桿菌,尤其是菌株紅色精蛋白桿菌CBS574.77;紅色精蛋白桿菌Z12;普城沙雷氏菌,尤其是菌株普城沙雷氏菌ATCC 15928;氣味沙雷氏菌,尤其是菌株氣味沙雷氏菌4Rx13;黏質沙雷氏菌,尤其是菌株黏質沙雷氏菌NCIB 8285;腸繫膜明串珠菌,尤其是菌株腸繫膜明串珠菌ATCC 1083a;大黃歐文氏菌,尤其是菌株大黃歐文氏菌ATCC29283、NCPPB 1578、DSM 4484、NX-5及WAC2928;歐文氏菌屬,尤其是菌株歐文氏菌D12;放射形土壤桿菌,尤其是菌株放射形土壤桿菌MX-232;土生克雷伯氏菌,尤其是菌株土生克雷伯氏菌JCM 1687;克雷伯氏菌屬,尤其是菌株克雷伯氏菌FERM BP-2838、LX3及NK33-98-8;肺炎克雷伯氏菌,尤其是菌株肺炎克雷伯氏菌342;新加坡克雷伯氏菌,尤其是菌株新加坡克雷伯氏菌LX21;嗜中酸假單胞菌,尤其是菌株嗜中酸假單胞菌MX-45;分散泛菌,尤其是菌株分散泛菌UQ68J;植生克雷伯氏菌,尤其是菌株植生克雷伯氏菌CCRC 19112、MX10及UQ14S;腸桿菌FMB-1、SZ62及Ejp617;凡蘭廸固氮菌DJ。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法,其中該細胞係固定在多醣中,諸如藻酸鹽、果膠、卡拉膠、殼聚醣或聚乙烯醇,諸如,例如lentikats或彼等之混合物,尤其是藻酸鹽。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之方法,其中在方法步驟B)中之pH值為4至9.5。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之方法,其中在方法步驟B)中之溫度為20至40℃。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之方法,其中所使用之經固定的酶複合物為固體床形式,該含有蔗糖之溶液係通過此固體床流動。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之方法,其中方法步驟D)係在50℃至70℃之溫度範圍內(較佳為55℃至65℃,特佳為58℃至62℃)及70毫巴至200毫巴之壓力範圍內(較佳為100毫巴至180毫巴,特佳為110毫巴至140毫巴)進行。
  10. 如申請專利範圍第1或2項之方法,其中在方法步驟D)中係添加異麥芽酮糖晶種,尤其是當進料溶液中之音速係在1800米/秒至2000米/秒之範圍內(尤其是1850米/秒至1950米/秒,尤其是1870米/秒至1920米/秒)時。
  11. 如申請專利範圍第1或2項之方法,其中方法步驟F)中之清洗係以水進行。
  12. 如申請專利範圍第1或2項之方法,其中 方法步驟F)中所使用之用於清洗的液體係送入方法步驟D)之進料溶液中。
  13. 如申請專利範圍第1項之方法,其中其額外包含下列方法步驟:G)冷卻來自方法步驟E)之母液以產生異麥芽酮糖晶體之第二懸浮液,H)將該懸浮液分成第二含有異麥芽酮糖之固體和第二母液,以及可選擇地,I)將該第二含有異麥芽酮糖之固體加入方法步驟C)之進料溶液中。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法,其中在方法步驟G)中,將來自方法步驟E)之母液被冷卻至10℃至30℃,較佳為15℃至25℃,特佳為18℃至22℃。
  15. 如申請專利範圍第13或14項之方法,其中該方法步驟C)之進料溶液包含為溶解形式之來自方法步驟H)的第二含有異麥芽酮糖之固體及方法步驟F)中所使用之用於清洗的液體。
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