JP2005132774A - ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの精製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ジフルクトース・ジアンヒドリドIII（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｒａｎｏｓｅ―１，２；２，３ ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ、以下、ＤＦＡ III）を効率的に精製し、臭いもない高純度ＤＦＡ III結晶の製造も可能にする。
【解決手段】 イヌリン等フラクトースの重合体をイヌリンフラクトトランスフェラーゼ等で処理し、得られたＤＦＡ III含有液をクロマトグラフィー処理、イースト処理、清浄濾過処理の少なくともひとつの処理にて処理して精製する。本法によれば重合度が低いイヌリンを含有していても効率的精製が可能であって、直ちに結晶化できる程度にまで精製できる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ジフルクトース・ジアンヒドリドIII（以下、ＤＦＡ IIIということもある）の精製方法に関するものであって、更に詳細には、ＤＦＡ III含有液をイースト処理、清浄濾過処理、又はクロマトグラフィー処理の少なくともひとつで処理することにより、ＤＦＡ IIIを効率的に精製する方法に関するものである。本発明によれば、極めて精製されたＤＦＡ IIIを効率的に製造することができ、例えばＤＦＡ III含有液から高純度のＤＦＡ III結晶を、特に、再結晶処理を多数くり返すことなく臭いまでも除去されて高度に精製されたＤＦＡ III結晶をきわめて効率よく得ることのできる工業的方法に関するものである。

ジフルクトース・ジアンヒドリドIII（ｄｉｆｒｕｃｔｏｓｅ ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ III：ＤＦＡ III）は、フラクトース２分子が１，２；２，３で結合している難消化性二糖類であって（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ―１，２；２，３ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、水への溶解性が高く、蔗糖の９０〜９５％程度を示すが、その甘味度は蔗糖の５２％程度である。

ＤＦＡ IIIは、同一出願人による特許出願により、Ｃａ等ミネラルの吸収促進作用を有することが明らかにされ（例えば、特許文献１参照）、今後、特に高齢者や乳幼児等にとって、医薬上、健康食品、特定保健用食品、その他飲食品上、有益な物質として期待されている。したがって、高純度のＤＦＡ III、特に取扱いのうえからもまた加工のし易さからも、結晶化したＤＦＡ IIIの製造、しかも研究試薬用のように小規模高コスト生産ではなく、大規模低コスト生産法の開発が待望されている。

従来、ＤＦＡ III含有液の製造に使用するイヌリンは、イヌリン含有物（例えば、キクイモ、ゴボウ、チコリ等の抽出物）や市販品イヌリン（重合度２〜６０、ポリサッカライド約７０％〜９０％）が使用されており、それに細菌又はそれが生産する酵素フラクトシルトランスフェラーゼであるイヌリンフラクトトランスフェラーゼを作用させてＤＦＡ III含有液を製造していた。この方法で製造したＤＦＡ III含有液のＤＦＡ III純度は低く、これから精製度の高いＤＦＡ III含有液を製造することは、実験室的には行われていたが、工業的規模では行われていなかった。

例えば、ＤＦＡ III含有液を活性炭カラムに通液してＤＦＡ IIIを吸着させた後、エタノールで溶離してＤＦＡ III含量の多い画分を回収し、蒸発乾固する方法が提案されているが（例えば、特許文献２、３参照）、この方法は実験室的な回収方法であって、工業的大量生産方法とはいい難いものである。また、上記酵素反応によって得た液をイオン交換樹脂によって精製し、これを濃縮乾固する方法も提案されているが（例えば、特許文献４参照）、ＤＦＡ IIIの純度が低く、高純度のＤＦＡ III結晶を得る方法とはいい難いものである。しかも、従来の方法で結晶化したＤＦＡ III結晶は、他の不純物は除去できても、臭いまでは除去することができず、臭いの残留という欠点は不可避であった。たしかに再結晶によれば臭いの除去も一応は可能であるが、再結晶処理を多数回くり返す必要があり、そのたび毎に収率、歩留りが低下し、再結晶法は工業的な方法ではない。

このように、臭いも除去した高純度ＤＦＡ III結晶、しかもこれを工業的に大量生産するのに成功した報告は未だなされていないのが現状である。
特開平１１−４３４３８号公報 特公昭５６−２６４００号公報 特開平３−２５９０９０号公報 特開平１−２８５１９５号公報

上記したように、近年、ＤＦＡ IIIについて有用な用途が開発されるに伴い、ＤＦＡ IIIの需要が高まってきている。そして医薬用途に使用する場合はもちろんのこと飲食品用途に使用する場合においても、高度に精製されたＤＦＡ IIIが必要であり、例えば、近年要望の強い高純度ＤＦＡ IIIの結晶化も可能な程度にまで精製されたＤＦＡ IIIが要望されている。つまり、ＤＦＡ III以外の糖及び各種不純物を除去した高純度ＤＦＡ III結晶が要望されており、特に、これらの用途においては不純物の内、色のほかに臭いが結晶中に残存しないことが要望されている。ＤＦＡ IIIの結晶化には冷却結晶法又は蒸発結晶法が考えられるが、これらの結晶化の際、結晶母液（ＤＦＡ III含有液）のＤＦＡ III純度が低い場合、結晶化効率が悪いばかりでなく、結晶化したＤＦＡ IIIに他の糖及び各種不純物（色、臭い等）が多く含有し、精製度の低いＤＦＡ III結晶しか得られない。結晶の純度を高める方法として従来から行われている再結晶法があるが、これは経済的ではなく、また、この再結晶法でも除去できない成分が含まれることが解り、高純度のＤＦＡ III結晶を得ることに苦慮していた。

本発明は、上記した要望に応える目的でなされたものであって、各方面から研究した結果、ＤＦＡ IIIを結晶化する前に結晶母液（ＤＦＡ III含有液）の精製度を上げた後にＤＦＡ IIIを結晶化した方が工業的に有利であることが判明した。特にＤＦＡIII純度が７０％未満の低純度のＤＦＡIII含有液（結晶母液）については、工業的に結晶させることは非常に難しいことが判った。このため本発明者等は、ＤＦＡ III純度が７０％未満のＤＦＡ III含有液の精製度を高めるため、ＤＦＡ III含有液を、イースト処理、清浄濾過処理又はクロマトグラフィー処理の少なくとも一つで処理することによりＤＦＡ含有液のＤＦＡ III純度を大幅に上昇させることに成功した。

以下、本発明について詳述する。

本発明は、ＤＦＡ III含有液をイースト処理、清浄濾過処理、クロマト処理の少なくともひとつから選ばれる処理によって精製する方法に関するものであり、本法を利用することにより高純度のＤＦＡ III結晶を効率的に工業生産できるものである。ＤＦＡ III含有液としては、ＤＦＡ IIIを含有し後記する条件を満たす液状物をすべて包含するものであって、フラクトースの重合体、例えばイヌリン又はイヌリン含有液にフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得たＤＦＡ III生成反応液のほか、各種ＤＦＡ III生合成液、ＤＦＡ III化学合成液や本精製工程において生成する各種精製度のＤＦＡ IIIを含有する液体、あるいは市販のＤＦＡ IIIを溶解した液体等ＤＦＡ IIIを含有する液体がすべて包含される。

例えばイヌリン（及び／又はイヌリン含有液）と酵素を用いてＤＦＡ IIIを製造する場合、イヌリンは、グルコース１つにフラクトースが多数重合したもので、主にキクイモ（あるいは、チコリ、ゴボウ等）から抽出したものが使用されるため、重合度及び純度が異なるものが市販されているだけでなく、これを酵素によって分解すると、生成した反応液には、ＤＦＡ III以外のフラクトース重合物、酵素、酵素源として使用した微生物、その培養物、色素、臭い等の不純物が含まれることは不可避であり、そのため、従来は、精製されたＤＦＡ III、ひいては、純粋なＤＦＡ III結晶又はその含有物を工業的に低コストで効率良く得るまでには至っていない。

ＤＦＡ III含有液からＤＦＡ IIIを結晶化する際、工業的、経済的に結晶可能なＤＦＡ IIIの純度は６０％が限度である（好ましくは７０％よりも高い方がよい）。換言すれば、ＤＦＡ III純度が６０〜７０％以下のＤＦＡ III含有液から工業的、経済的にＤＦＡ IIIを結晶化することができず、従来、純度７０％以下のＤＦＡ III含有液（純度６０％以下のＤＦＡ III含有液の場合はなおさらのこと）は、工業的結晶化に採算がとれないため、使用することができなかったのである。

本発明は、このような現状に鑑み、従来工業的に使用することができなかったＤＦＡ III純度が低いＤＦＡ III含有液からＤＦＡ IIIを高度に精製する方法を開発して、例えば純粋なＤＦＡ III結晶が得られる程度に高純度に精製されたＤＦＡ IIIを効率良く得るため、各方面から研究の結果、ＤＦＡ III含有液をクロマトグラフィー処理（以下、クロマト処理ということもある）、清浄濾過処理、イースト処理の少なくともひとつで処理することを骨子とする新規方法を開発したものである。

ＤＦＡ III含有液としては、上記したように、ＤＦＡ III生合成液、化学合成液、市販ＤＦＡ III溶解液その他ＤＦＡ IIIを含有するがＤＦＡ III純度の低いＤＦＡ III含有液体のいずれもが使用可能である。

本発明においては、ＤＦＡ III含有液としては、高純度ＤＦＡ含有液が使用できることはもちろんのこと、上記したように純度の低いＤＦＡ含有液も使用することができ、イースト処理、清浄濾過処理、クロマト処理の少なくともひとつの処理によって、従来経済的ないし工業的理由によって使用できなかった純度の低いＤＦＡ III含有液（純度７０％以下のもの、６０％以下のものも可能）も原料として使用可能となり、効率的にＤＦＡ IIIを精製することがはじめて可能となった。

先ず、イースト処理は、ＤＦＡ III含有液とイーストを接触させればよく、両者を混合し、必要あれば攪拌してインキュベートしてもよいし、通気しながら培養してもよい。イーストとしては、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母、ブドウ酒酵母その他各種の酵母が適宜使用可能であって、ドライイースト、圧搾酵母その他各種の市販品も充分に使用可能である。イーストによって、二糖類、単糖類が分解されたり菌体内に取り込まれるので、イースト処理は、主に二糖類及び／又は単糖類を系外に除去するのに有用である。

清浄濾過処理は、ＤＦＡ III含有液の粉末活性炭処理の清浄等を目的とする処理と、固液分離を目的とする処理が含まれる。固液分離処理は、遠心分離、濾過、珪藻土等の濾過助剤を用いる濾過、メンブランフィルターを用いる方法、セラミック膜を用いる方法、限外濾過膜を用いる方法、その他固体と液体を分離する方法をすべて包含するものである。

そして、クロマト処理は、クロマト用のイオン交換樹脂を用い、固定床、連続床（疑似移動床）、半連続等各方式によって適宜行うことができ、二糖類と他の糖類を分離するものである。したがって、クロマト処理によれば、二糖類であるＤＦＡ IIIと他の糖類を効率的に分離することができる。

このように、二糖類としてはＤＦＡ IIIのみが含まれている場合には、クロマト処理はＤＦＡ IIIの精製にきわめて有効である。しかしながら、クロマト処理では、ＤＦＡ IIIと他の二糖類を分離することは、双方共に二糖類であることから、非常に困難である。したがって、例えば、イヌリンをイヌリン分解酵素処理して得たＤＦＡ III含有液中に二糖類であるＤＦＡ IIIの他にこれまた二糖類である蔗糖も含まれる場合、クロマト処理では、ＤＦＡ IIIと蔗糖（他の二糖類）の分離が非常に難しくなる。したがって、このような場合には他の処理を組み合わせることによってＤＦＡ IIIの精製を効率的に実施することが可能であり、例えば、前処理としてイースト処理を行ってＤＦＡ III以外の二糖類を系外に除去した後、クロマト処理を行えばよい。

このように、本発明においては、ＤＦＡ III含有液に応じて、イースト処理、固液分離処理、クロマト処理の内、最適な処理を実施すればよいし、必要ある場合には、これらの処理を適宜併用したり組み合わせたり、あるいは、各処理や複数の処理を更にくり返したりすることにより、従来工業的に使用できなかった低純度ＤＦＡ III含有液も効率的に精製することがはじめて可能となった。

例えば、ＤＦＡ III生合成液については、フラクトースの重合体を原料として用い、これにフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて製造することができる。

その場合、原料として用いるフラクトースの重合体としては、上記したようにイヌリン等の天然の重合体のほか、生合成及び／又は化学合成した重合体のいずれも使用可能であるが、フラクトースの重合度は２以上、好ましくは１０以上であって、１０〜６０が好適域である。また、重合体におけるポリサッカライドの含量は７０％以上が好ましく、更に好適には１００％である。しかしながら、本発明においては、純度の低いＤＦＡ III含有液も効率的に精製できるので、このような高品位フラクトース重合体のほか、低品位のものも適宜可能である。

なお、本発明において、フラクトース重合体は、フラクトースのみが重合したホモポリマーのほか、他の糖を含むヘテロポリマーのいずれであってもよく、例えば、イヌリンはフラクトース重合体にグルコースが１分子結合した一種のヘテロポリマーである。また、フラクトース重合体にはフラクトース重合体含有物も包含される。

これらフラクトースの重合体の内、天然由来物としてはイヌリンが有利に使用されるが、生合成又は化学合成したものも使用され、例えば次のようにして生合成したものも使用可能である。

例えば、シュークロースにフラクトース合成酵素（例えば、イヌリン合成酵素）を作用させて、イヌリンを生合成することができる。イヌリン合成酵素としては、シュークロース：シュークロース １−フルクトシルトランスフェラーゼ（ＳＳＴ）及びβ−（２−１）フルクタン：β−（２−１）フルクタン １−フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＦＴ）等が使用される。また、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｙ）ＩＦＯ４２８４、ＩＦＯ７５３１やストレプトコッカス・ミュータンス等の微生物の産生する酵素がイヌリン類似物を生産するが、イヌリン類似物もフラクトースの重合体及び／又はそれの含有物であるので、本発明におけるＤＦＡ III含有液の原料として使用できる。

なお、生合成法等フラクトース重合体の製造工程において、グルコースが副生する場合には、グルコースイソメラーゼ等グルコースをフラクトースに変換する酵素を用いてグルコースをフラクトースに変換したり、あるいは、グルコースオキシダーゼ等グルコースをグルコン酸に変換するといった酵素を用いてグルコースを他の物質に変換して、グルコース量を低下せしめ、イヌリン（又はイヌリン類似物）の収率を高めることができる。また、ＤＦＡ III含有液にイーストを加え、通気攪拌培養等のイースト処理を行って、ＤＦＡ III以外の不純物をイーストに消費させてクロマト処理前のＤＦＡ III含有液の純度を高めてもよい。

以下、ＤＦＡ III含有液として、フラクトースの重合体をフラクトシルトランスフェラーゼ処理して得たものを例にとって説明するが、フラクトースの重合体としてはイヌリンを例にとって説明する。

フルクトース単位を転移触媒して、ＤＦＡ IIIの様なオリゴ糖を合成する酵素は、広義で「フラクトシルトランスフェラーゼ」である。フラクトシルトランスフェラーゼは、大きく２種類に大別される。（１）フルクトース単位（スクロースなどの２糖類を含む）を基質とし、これを加水・転移して、オリゴ糖を合成する酵素（場合として、多糖も合成する）。（２）イヌリンやレバンなどのフラクタンを基質とし、これを加水・転移して、オリゴ糖を合成する酵素である。発明者らがイヌリンからのＤＦＡ III製造に使用したのは、フラクトシルトランスフェラーゼの中でも、学名がイヌリンフルクトトランスフェラーゼであり、（２）の種類に属する。イヌリンフルクトトランスフェラーゼ（以後、単にＩＦＴとする）を生成する微生物としては、アースロバクター属、クルイベロマイセス属、ストレプトマイセス属、エンテロバクター属に属する各種細菌、酵母、放線菌等が報告されており、これらを適宜使用することが可能である。これらの微生物を培養して、精製酵素、粗製酵素、酵素含有物、微生物培養物等の形態として適宜使用される。

その非限定例を以下に示す：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．； Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ ＩＦＯ １２１４０； Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ＩＦＯ １２１３７； Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｃｅｎｓ ＩＦＯ １２１３９； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．； Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．； Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．

これら微生物由来の酵素を使用する場合、分離精製した酵素のほか、粗精製酵素、微生物培養物、同処理物（培養上清、分離菌体、菌体破砕物等）も使用可能である。なお、ＤＦＡ III結晶を食品用途に使用する場合には、酵素としてフラクトシルトランスフェラーゼ、特にＩＦＴを使用するのが好適であって、上記微生物由来の酵素のほか、今回、特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−８２９６として寄託されたＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＨＵ １７５３株は、ＩＦＴ生産能にすぐれているので、本菌株由来の酵素は好適に使用可能である。

なお、イヌリンの酵素分解によるＤＦＡ IIIの生成は、ＤＦＡ III単独のものが生成されることが最も好ましいが、実際上ではＤＦＡ III以外のフラクトースの重合物が種々生成される。それが酵素分解液の純度の低下の原因となっている。このため、クロマトグラフィー処理を行うが、所望する場合には、ＤＦＡ IIIを結晶化するための原料として、イヌリン以外の不純物の混入量の出来るだけ少ないものや、また、ＤＦＡ III以外のフラクトース重合物が生成しない酵素の選択が必要である。そして、このように精製されたＤＦＡ III含有液が得られれば、これをＤＦＡ III粗液として、直ちに本発明に係る清浄濾過、結晶化工程に入っていくことができる。

イヌリンをイヌリン分解酵素で分解したＤＦＡ III含有液のＤＦＡ III純度の一例を、後記するＡ〜Ｄ社の製品について示せば、次のとおりである：
Ａ社品 ７５％、Ｂ社品 ５９％、Ｃ社品 ５２％、Ｄ社品 ７８％
そして、Ｄ社品をイヌリン酵素分解して結晶化する際のシラップのＤＦＡ III純度の一例を示せば、次のとおりである：
粗結晶シラップ ５３％、製品結晶シラップ ９５％

上記したＩＦＴ処理等の酵素処理によって得たＤＦＡ III含有液はもちろんのこと、その他の方法で調製した各種ＤＦＡ III含有液は、クロマトグラフィー処理（以下、クロマト処理ということもある）イースト処理、清浄濾過処理の少なくともひとつで処理して、不純物を除去して精製し、各種精製度のＤＦＡ IIIを得ることができる。

その場合、精製度の高いＤＦＡ III含有液からは、精製度の高いＤＦＡ III（直ちに高純度結晶化工程に入っていける程度に精製度の高いもの）が得られ、精製度の低いＤＦＡ III含有液からは、精製度の低いＤＦＡ IIIが生成するが、クロマト処理や他の処理をくり返すだけでも精製度を高めることができる。したがって、本発明によれば、各種精製度のＤＦＡ III含有液を自由に使用し、所望する精製度のＤＦＡ IIIを得ることができる。

クロマト処理によってＤＦＡ III含有液から不純物が除去され、高度に精製される。また、精製度が低いフラクションは、再度又はそれ以上の回数クロマト処理したり、他の方法にて精製することができる。

ＤＦＡ III含有液は、そのままクロマト処理してもよいが、濃縮処理といった濃度を高める処理により、更なる効率化が図られる。濃縮処理としては、例えば濃縮缶による濃縮（例えば、５０〜８０℃、１４０ｍｍＨｇ以下）が挙げられるが、その他各種濃縮処理が適宜可能である。

本発明の好適例のひとつとして、次のような精製方法が例示される。先ず、原料として市販されている又はシュークロースから生合成したイヌリンを用い、これにＩＦＴを接触せしめて酵素処理し、得られたＤＦＡ III含有液をクロマト処理して、夾雑している不純物を除去し、ＤＦＡ IIIの精製を行うものである。そしてこの間、所望するのであればイースト処理等の各種の精製を適宜行うことができる。

本発明によれば、純度の低いＤＦＡ III含有液であってもクロマト処理、イースト処理、清浄濾過処理の少なくともひとつで処理することにより、精製されたＤＦＡ III精製液が効率よく工業生産できるので、精製されたＤＦＡ IIIは各種の用途に広く利用することができ、本発明によれば、ＤＦＡ III含有液を直ちに結晶化できる程度にまで高度に精製することができる。したがって純度が９５ｗ／ｗ％以上というきわめて高純度のＤＦＡ IIIの結晶、結晶破砕物、又は顆粒状物を製造することができ、医薬やサプリメント等として各種用途に広範に利用することができる。

以下、本発明の精製フローの一例を、結晶ＤＦＡ III製造のフローの一例をも含めて図示した図１を参照しながら、本発明を詳細に説明する。なお、図１において、本発明に係る精製フローとしては、ＤＦＡ III含有液→（濃縮）→クロマト分離のルートが例示されているが、他の処理、すなわち固液分離処理は、例えば図１における清浄濾過工程での固液分離処理によればよいし、イースト処理については、後記する実施例において詳述する。

清浄濾過は、ＤＦＡ III粗液の活性炭処理及び固液分離処理を指すものである。活性炭処理は、ＤＦＡ III粗液に粉末活性炭を少量添加して、必要あれば加熱及び／又は攪拌して、ＤＦＡ III以外の不純物を活性炭に吸着せしめる処理である。

粉末活性炭としては、平均粒径が１５〜５０ミクロン、好ましくは２５〜４５ミクロン、更に好ましくは約３５ミクロン；最大粒径が２００ミクロン以下、好ましくは１７０ミクロン以下、更に好ましくは１５０ミクロン以下、例えば１４７ミクロン以下のものが使用される。その添加量は、固形分に対して、５％以下、好ましくは０．１〜３％、更に好ましくは０．５〜１．５％とするのが良く、ＤＦＡ III粗液の組成に応じて適宜規定する。

固液分離処理としては、濾過、ハイフロスーパーセル（和光純薬製）やケイソウ土濾過等の濾過助剤を使用する濾過（例えば、セラミック濾過機による濾過：日本ポール（株）製ＰＲ−１２型が使用可能）、メンブランフィルター（ＭＦ）濾過、連続遠心分離法、分子篩法、逆浸透膜法、場合によっては限外濾過（ＵＦ）膜の少くともひとつが適宜利用される。固液分離は、常圧、加圧、又は減圧の少くともいずれかで実施される。

上記の内、例えば、限外濾過膜（ＵＦ膜）を使用する濾過、メンブランフィルター（ＭＦ）濾過、連続遠心分離処理によれば、ケイソウ土等の濾過助剤を使用することなく、直接固液分離することができる。ＭＦ膜としては、例えばセラミック膜（例えば、月島機械（株）商品名ダリア）等が使用可能であるし、連続遠心分離（５，０００〜２５，０００ｒｐｍ、好ましくは８，０００〜１５，０００ｒｐｍ；６，５００〜１０，０００Ｇ、好ましくは７，５００〜９，５００Ｇ：例えば１０，０００ｒｐｍ、８，２００Ｇ）によれば、ＤＦＡ III結晶（結晶粒径２５０〜５００μｍ）と微細結晶（結晶粒径１００μｍ以下）とを分離することができる。

固液分離して得た濾液は、これを濃縮する。濃縮は、常法によって行われ、例えば蒸発濃縮缶等が用いられる。得られた濃縮液は、粗結晶母液であって、蒸発結晶化または冷却結晶化等常法にしたがって粗結晶化処理する。粗結晶化された母液は、粗結晶と粗結晶シラップに分離するが、それには、遠心分離が利用される。この分離では、分離シラップ中に細い結晶が移行する。

結晶化された母液から分離された粗結晶シラップ及び結晶シラップの濾過には、遠心分離、例えば連続遠心分離（例えば、アルファ・ラバル社製）を用いた固液分離が行われる。シラップ中には未結晶のＤＦＡ III以外のフラクトース重合度の異なるオリゴ糖（３〜５糖類）が含有されている。フラクトース重合度が高い程、結晶化がし易く、結晶の粒径が小さいことが新たに判明した。この性質を利用してＤＦＡ IIIと他のオリゴ糖を分けることができる。これによりＤＦＡ III以外のオリゴ糖が除去されてＤＦＡ III以外のオリゴ糖（３〜５糖類）の循環蓄積が防止でき、ＤＦＡ IIIの結晶化原料の純度の低下を押さえることができる。このＤＦＡ III以外のオリゴ糖が循環蓄積されると粗結晶母液（濃縮液）の純度が低下し、効率的（工業的）に結晶化できる純度（粗結晶の場合、純度６０％以上）を確保することが難しくなる。特に、粗結晶母液（濃縮液）の純度低下を防ぐためシラップの製造系外への排出を行う方法もあるがＤＦＡIIIの損失となるので避けるほうが良い。

ＤＦＡ III含有液（粗液）の清浄濾過処理によって得た濾液は、常法によって濃縮する。例えば、砂糖等の製造で用いられるカランドリア型濃縮効用缶により濃縮し、濃縮液を得る。濃縮液は、濃度Ｒ−Ｂｘ６０〜８５、好ましくは６５〜８０、例えば７７程度に濃縮すればよい。

濃縮液は、粗結晶化するが、結晶缶を用いる蒸発結晶化、冷却結晶化等常用される結晶化処理が適宜利用される。蒸発結晶缶は、例えば砂糖製造用として用いられている結晶缶であればよい。冷却結晶缶は砂糖製造用として使用されているものと同様な形状の横型又は縦型のクリスタライザーが用いられる。このように、結晶缶に供給されるＤＦＡ IIIを含有した液体を粗結晶母液（濃縮液）という。ＤＦＡ IIIの粗結晶化の際、結晶缶内に結晶が付着しないような処置をとるとよい。例えば攪拌機をそれに付設すると結晶率の上昇の効果がある。遠心分離機は砂糖製造用に用いられているものであればよい。ＤＦＡ III粗結晶を乾燥させる場合には、常圧の場合、５０〜１００℃の温度条件下で行う。なお、減圧乾燥も可能である。

粗結晶化工程により結晶が析出した母液（濃縮液）について、固液分離を行い、粗結晶（ＤＦＡ III純度は９５〜９８％程度にまで達する）と粗結晶シラップに分離する。固液分離処理は、既述した方法で行えばよく、例えば上記のように遠心分離機（５００〜６，０００ｒｐｍ、好ましくは１，０００〜５，０００ｒｐｍ、例えば２，０００〜４，０００ｒｐｍ、５００Ｇ〜３，０００Ｇ、好ましくは８００〜２，０００Ｇ、例えば約１，２００Ｇ）で両者を分離し、粗結晶シラップは、固液分離し、又はすることなく、所望する場合、精製工程に戻してやり、粗結晶は水又は湯に再溶解して、再溶解液とし、これを製品結晶化用の結晶母液用のＤＦＡ III精製液として使用する。

再溶解液（ＤＦＡ III精製液：Ｒ−Ｂｘは１０〜６０、好ましくは２０〜５５、更に好ましくは４０〜５０、ＤＦＡ III純度は９０％以上、好ましくは９０〜９８％となり、例えば９５〜９８％程度にまで達する）は、上記粗結晶の条件と同様に、清浄濾過、濾液の濃縮、濃縮液（製品結晶母液）の製品結晶化、製品結晶及び結晶シラップの分離、製品結晶の乾燥、包装、ＤＦＡ III結晶製品（純度９８〜９９％以上、色もなければ臭いもない高度に精製された結晶）を製造する。なお、結晶から分離したシロップ（結晶シロップ、粗結晶シロップ）は、所望する場合、濾過し又は濾過することなく、ＤＦＡ III含有液からＤＦＡ III製品に至る全精製工程（図１のフロー）の少くともひとつに戻してやる。

そして本発明の１態様においては、クロマト分離法を利用してＤＦＡ III含有液を精製し、本実施例においてはこれを更に処理して、ＤＦＡ III結晶を製造するものである。ＤＦＡ III含有液は、これを格別処理することなくそのままクロマト処理原液として使用できることはもちろんのこと、濃縮したり、固液分離したり、イースト処理したりして、あるいはクロマト処理したりして予じめ不純物を除去しておき、これをクロマト処理原液として使用してもよい。そして、本発明は、クロマト分離法を利用してＤＦＡ IIIを精製するものであるが、引き続き処理を行ってＤＦＡ III結晶を製造することも可能である。例えば、ＤＦＡ III結晶化全精製工程（図１）で生成する各種生成物をクロマト処理原液（Ｒ−Ｂｘ ５５〜７５）として、これをクロマト処理し、ＤＦＡ IIIを精製して結晶化することが可能である。そのクロマト処理による精製フローの一例を図２に示す。

クロマト処理原液（Ｒ−Ｂｘ ５５〜７５）は、クロマト処理して、ＤＦＡ III画分を分離する。既述した再溶解液（ＤＦＡ III液）と同様の精製度を有するＤＦＡ IIIリッチ画分は、ＤＦＡ III精製液として、これを清浄濾過、濃縮、結晶化することにより製品結晶を製造することができ（ルートＡ）、あるいは、上記再溶解液（ＤＦＡ III液）に添加してＤＦＡ III精製液とし、これを結晶化することもできる（ルートＢ）。また、ＤＦＡ IIIリッチ画分とは異なりＤＦＡ III含量が低いＤＦＡ III非リッチ画分及びごく少量しかＤＦＡ IIIを含まない非ＤＦＡ III画分については、前者は製造フロー（図１に示すようなＤＦＡ III含有液からＤＦＡ III製品に至る全精製工程）の適宜個所に戻してやればよいし（ルートＣ）、後者について精製工程に導入するか、場合によっては廃棄する（ルートＤ）。

ＤＦＡ IIIを含む液体（純度６０％以上）をクロマト処理によって精製する場合、処理液のＤＦＡ III画分は純度８０〜９８％のものが得られるので、ＤＦＡ III純度８５％以上、好ましくは９０〜９５％、場合によっては９５〜９８％のＤＦＡ IIIリッチ画分は、ルートＡにしたがって、清浄濾過、濃縮、製品結晶化することができる。したがって、例えば、粗結晶化工程を経ることなく粗結晶用の母液（濃縮液）をクロマト処理してＤＦＡ III画分（ＤＦＡ IIIリッチ画分）を分離し、これをＤＦＡ III精製液として活性炭処理濾過後、この濃縮液を製品結晶母液として使用し、他は上記したのと同じ操作を行って、臭いもなく高度に精製されたＤＦＡ III結晶製品を得ることができる。もちろん、この画分を再溶解液に添加してＤＦＡ III精製液として使用するルート、例えばルートＢでも可能である。また、上記で分離したＤＦＡ III非リッチ画分は、ルートＣにしたがって、精製工程（ＤＦＡ III含有液〜ＤＦＡ III製品の全精製工程）例えば図１の適宜個所に戻してやり、全体として無駄やロスを生じることなく、本フローを循環させて徹底的に効率化することができる。

また、非常に不純物含量が少ないイヌリン、例えばフラクトースの重合度が１０以上、好ましくは１０〜６０であり、ポリサッカライド含量が８０％以上、好ましくは１００％のイヌリンを原料とし、そしてフラクトトランスフェラーゼとして精製酵素を用いてこれを処理し、そして得られたＤＦＡ III含有液をクロマト処理し、得られたＤＦＡ IIIリッチ画分は、活性炭清浄濾過等を行うことなく、直接、濃縮し、結晶化することができる。得られたＤＦＡ III結晶はきわめて高純度な結晶であり、高純度イヌリン及び／又は精製フラクトシルトランスフェラーゼを使用することにより、清浄濾過を行うことなく、しかも、分離、濃縮、結晶化の各処理はわずか１回で臭いのない高純度なＤＦＡ III結晶をきわめて効率的に製造することができる。

クロマト分離法としては、その分離装置は固定床方式（ワンパス方式）、連続方式（疑似移動床方式）、半連続方式（固定床方式と連続方式の組合）が適用できる。その装置の充填イオン交換樹脂としては、クロマト用のＮａ形、Ｋ形、Ｃａ形等の強酸性イオン交換樹脂が使用される。その樹脂は均一粒径のスチレンジビニルベンゼン系樹脂等が用いられている。イオン交換樹脂のメーカーから種々のクロマト用樹脂が販売されているが、糖液に適用できるものであればいずれも使用できる。クロマト処理は結晶母液のＤＦＡIII純度が低い場合、その純度を上げるのにも適宜使用される。

上記したように、高純度ＤＦＡ III含有液をクロマト処理によって精製すると、純度８０〜９０％のものが得られ、結晶化が可能となるが、本発明においては、純度７０％以下という低純度ＤＦＡ III含有液であっても、クロマト処理、イースト処理、清浄濾過処理の１種又は２種以上の処理を行うことによって、きわめて効率的にＤＦＡ IIIの精製を行うことができ、低純度ＤＦＡ III含有液（純度６０％未満）をクロマト処理することによっても、純度８５〜９５％のものが得られることが確認された。

事実、後記するところからも明らかなように、純度４９．５％のＤＦＡ III含有液をクロマト精製することにより純度９１％のＤＦＡ III画分を得ている。一方、純度８１％のＤＦＡ III含有液の場合は、純度９６％のＤＦＡ III画分が得られ、クロマト処理による精製法が非常に有効であることが実証されている。イースト処理、清浄濾過処理によっても、低純度ＤＦＡ III含有液を効率的に精製することが可能となり、従来ＤＦＡ IIIの製造には使用できなかったような純度の低いＤＦＡ III含有液も使用可能となった。これらの処理は、単独でも非常に有効であるが、同じ処理をくり返したり、又は、これらを１種又は２種以上組み合わせて用いたり、同時に併用したりすれば、更に効率よくＤＦＡ IIIの精製が可能となる。

また、既述したように、本発明によれば低純度ＤＦＡ III含有液を効率的に精製することができるので、更にこの技術を利用して、及び／又は、この技術の関連技術を利用して、例えば図１、図２に示したフローにしたがって、高純度のＤＦＡ IIIを結晶化することも可能である。

本発明は、ＤＦＡ III含有液を精製するにあたり、イースト処理、固液分離処理、クロマト処理の少なくとも１つで処理することにより、効率よくＤＦＡ IIIを精製することを可能にしただけでなく、例えばイヌリンの低分子化合物（例えば、重合度１０未満）を含有するＤＦＡ III含有液の場合も対応可能となり、精製度（純度）が低いＤＦＡ III含有液（純度７０％以下、６０％以下でも可能）であっても、効率良く且つ高度に精製することができる。

このように本発明によれば、従来工業的に使用できなかった低純度ＤＦＡ III含有液を高度に精製することが可能になったので、各種応用面での利用が可能となった。例えば本発明によって、従来効率よく工業生産することができなかった高純度のＤＦＡ III結晶の工業生産がはじめて可能となった。しかも、本発明によれば、特定の活性炭処理とＤＦＡ III含有液の純度向上との有機的結合によって、純度９９ｗ／ｗ％にも達するきわめて高純度の精製されたＤＦＡ III結晶を効率的に工業生産できるだけでなく、従来法では再結晶を多数回くり返さなければ除去することができなかった結晶中の臭いの工業的且つ効率的除去にもはじめて成功したという著効も奏される。

このように、本発明に係るＤＦＡ III結晶は、単に純度が高いだけでなく、臭いがないというきわめて顕著な効果が奏されるので、医薬用途や飲食品用途に使用するのに特に適しており、例えばカルシウム吸収剤として自由に使用できる特徴も奏される。

以下、実施例をあげて本発明を更に詳しく説明する。

イヌリンのフラクトース重合度（分子量分布）
市販イヌリンを購入しフラクトース重合度を調査した。下記の条件で液体クロマトグラフィー分析装置を使用したクロマトグラムを図３に示す。

１）イヌリンの分析サンプル
イ．Ａ社品
ロ．Ｂ社品
ハ．Ｃ社品
二．Ｄ社品

上記サンプルに係わるカタログの表示を下記表１に示す。

（表１）
────────────────────────────────
サンプル イ ロ ハ ニ
────────────────────────────────
化学構造 ＧＦｎ ＧＦｎ ＧＦｎ ＧＦｎ
重合範囲 ２〜６０ １０〜６０
平均重合度 １８ １０〜１２ ２０〜２５
生 産 砂糖から チコリ抽出 イヌリンの
酵素合成 分離
ポリサッカ 約７０％ １００％
ライド含量
────────────────────────────────

２）分析条件
カラム ： Dionex, CarboPac PA1, 4×250mm I.D.
カードカラム： Dionex, CarboPac PA1 Guard
カラム温度 ： 室温
溶離液 ： グラジエント
０分 １００分
割合（％） 割合（％）
１Ｎ ＮａＯＨ １５ １５
１Ｍ ＮａＯＡｃ ０ ４５
水 ８５ ４０
カーブＮｏ． − ２
検出器 ： Dionex, Pulsed Electrochemical Detector
検出モード ： Integrated Amperometry
パルス電圧 ： E1: +0.05V (400 m sec), E2: +0.75V (200m sec),
E3: −0.15V (400m sec)
流速 ： 1.0 ml/min
レンジ ： １μＣ
注入量 ： 各0.1％水溶液を５μｌ注入
分析サイクル： 120 min

３）結果
各クロマトグラムの流出時間によるピーク値を比較する。リテンションタイムの経過に従って各ピークは重合度（分子量）の高いものとなる。

（Ｃ社品） 流出時間約６．５ｍｉｎから約４０ｍｉｎの間に約４０個のピークが存在している。このピークの状態から流出時間６．５から１４．５ｍｉｎのものが多いため重合度の低いポリサッカライドの割合が多い。

（Ｄ社品） 流出時間約１４．５ｍｉｎから４６ｍｉｎの間に約４０個のピークが存在した。このことから比較的重合度の高いポリサッカライドが多い。

（Ｂ社品） 流出時間約７．９ｍｉｎから３０ｍｉｎの間に約３０個のピークがあった。流出時間１４．５ｍｉｎ以上の割合が多いが１４．５ｍｉｎ未満のポリサッカライドも含まれる。

（Ａ社品） 流出時間約９ｍｉｎから４１ｍｉｎの間に４０個のピークがあった。Ｄ社品と同様な傾向のピークを示したが、流出時間６．５から１４．５ｍｉｎの間にも多少ピークが散見された。
これらの結果とカタログから推察すると滞留時間６．５ｍｉｎの重合度が２で、１４．５ｍｉｎのピークが重合度１０と予想される。

（１）ＩＦＴ酵素生産量及びイヌリンからのＤＦＡ IIIの反応収率
上記市販品４種のイヌリンを使用し、後記するフラクトシルトランスフェラーゼを使用して酵素反応を行い、ＤＦＡ IIIの生成率を調査した。イヌリンを８０℃のお湯で完全に溶解した後、６０℃まで冷却する。そこにＩＦＴを５０００ｕｎｉｔ／ｋｇイヌリンを添加し、６０℃、２４時間攪拌しながら反応させる。反応液のＩＦＴ酵素生産量を下記の通り測定した。また、反応液を失活（８０℃）させ、活性炭（太閤活性炭Ｓ）及び珪藻土（ラジオライト７００）で清浄濾過し、清浄反応液を液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと記す。カラム：Shodex Sugar KS-801,300×8mm I.D.、流速１ml/min、カラム温度８０℃）を使用しＤＦＡ IIIを定量した。イヌラーゼの酵素生産量及びＤＦＡ IIIの生成収率の結果を表２に示した。

その結果から明らかなように、酵素生産量及びＤＦＡ IIIの反応収率ともＤ社品が最も良かった。図３及び表２の結果からフラクトース重合度が高い分布のものほど、即ち、Ａ社品及びＤ社品は重合度１０以上のものと予想されるが、これらがＤＦＡ III収率がよかった。尚、イヌリンは、分子量（重合度）が高くなると溶解性が悪く、ハンドリングしづらくなるため、ＤＦＡ IIIの工業生産には重合度１００程度が限界である。

（２）酵素生産量（酵素活性）の測定法
２ｍｌ容チューブに１０％イヌリン溶液０．５ｍｌと０．１Ｍクエン酸・ＮａＯＨバッファー（ｐＨ５．５）０．４５ｍｌを入れ、６０℃の湯浴で約５分間加温した。そこに、粗酵素液５０μｌを加え、６０℃で１０分間反応させた。沸とう水中に５分間保持することにより反応を停止させた。ＨＰＬＣにより生成したＤＦＡ IIIを定量した。１ｕｎｉｔは１分間に１μｍｏｌのＤＦＡ IIIを生成する酵素量とした。

（表２） ＤＦＡ IIIの酵素反応生成率
─────────────────────────
イヌリンの種類 酵素生産量 ＤＦＡ IIIの
（units/ml） 反応収率(％)
─────────────────────────
イ．Ａ社品 ９６．２ ７１．３
ロ．Ｂ社品 ８０．３ ５７．８
ハ．Ｃ社品 ６８．９ ５３．８
ニ．Ｄ社品 １０２．４ ７６．５
─────────────────────────

イヌリンからＤＦＡ IIIの製造
（１） 上記Ｄ社品２００ｋｇを８０℃のお湯１０００ｋｇで溶解し、６０℃まで冷却する。その溶液に下記酵素生産で得られたＩＦＴ ５０００ｕｎｉｔｓ／ｋｇイヌリンを添加し、６０℃で２４時間攪拌しＤＦＡ III含有液を生成させる。この反応完了液を８０℃に上げ酵素を失活させる。この失活液に固形分当たり１％の割合で太閤活性炭Ｓ（二村化学工業製：平均粒径約３５ミクロン、１４７ミクロン以下）を添加し６０℃、１０分間攪拌する。この完了液を珪藻土（昭和化学工業製ラジオライト７００）濾過を行った。すなわちセラミック製の筒（日本ポール（株）製ＰＲ−１２型セラミックチューブ）の内面に上記珪藻土をプレコートしておき、筒内に活性炭含有反応液を加圧通過させて、加圧濾過し、筒外から濾液を回収した。

（２） この濾液を濃縮缶で濃縮（６０〜７０℃ １２０ｍｍＨｇ以下）する。最終濃度Ｒ−Ｂｘ７７まで濃縮した後、その母液を結晶化工程に移した。結晶は冷却結晶化法を行った。６０℃の濃縮液を冷却缶外部に冷却外套及び攪拌機が設けられた缶で、２３時間かけて１５〜２０℃に冷却する。結晶の析出した母液を分離機（３０００ｒｐｍ、１２００Ｇ）で粗結晶とシラップに分離する。その粗結晶（ＤＦＡ III純度９７％）を再溶解し、得られた再溶解液（ＤＦＡ III精製液）を、上記条件と同様に活性炭処理、珪藻土濾過を行い濃縮、結晶化・分離し、製品結晶（ＤＦＡ III純度９９％）を得る。得られた結晶を５０℃で通風乾燥し、ＤＦＡ III７．２ｋｇ（水分０．１％）が得られた。この結晶は、着色もなく臭いも認められなかった。

（３） 上記（１）において、珪藻土濾過にかえてメンブランフィルター（ＭＦ）濾過を行った。
すなわち、酵素反応完了液（約Ｒ−Ｂｘ２０）を失活させて、それに太閤活性炭Ｓを固形分当たり１％添加し、６０℃、１０分間攪拌する。それを、０．１４μｍのメンブランフィルター（月島機械株式会社製：セラミック膜 ＴＳＫ−ＴＡＭＩダリア）を使用し、濾過を行った。濃縮率は１０倍とした。結果を図４に示す。その結果から明らかなように、透過液量の低下もみられず順調に濾過できることを確認した。透過液は透明であった。

（４） 上記（１）、（２）において、ＤＦＡ III含有液（酵素反応完了液：濃度Ｒ−Ｂｘ６０、ＤＦＡ III純度７８．６％、その他２４．１％（主に４糖類および５糖類））について、以下によってクロマト処理を行い、下記する画分を得た（表３）。このようにして、通液量０．６００〜０．７００Ｌ／Ｌ−Ｒ画分を回収して、ＤＦＡ III画分（純度９７．３％）を得た。このようにしてクロマト分画して得たＤＦＡ III画分は、ＤＦＡ IIIリッチ画分として、清浄濾過した後に濃縮して製品結晶母液として使用できるほか、粗結晶再溶解液（ＤＦＡ III精製液）としてあるいはそれに添加して使用できることも確認された。また、ＤＦＡ III純度７６．８％画分は、例えばＤＦＡ III非リッチ画分としてルートＣに利用できることも確認された。

（表３）
───────────────────────────────
画分（Ｌ／Ｌ−Ｒ） 純度（％） 回収率（％）
───────────────────────────────
０．５００〜０．５９９ ７６．８ ６１．４
０．６００〜０．７００ ９７．３ ３２．９
───────────────────────────────

（クロマト処理条件）
クロマト用樹脂： Ｎａ型強酸性樹脂（オルガノ製ＣＲ−１３１０型）
カラム： ２２×５２５ｍｍ、２００ｍｌ
クロマト処理原液：ＤＦＡ III酵素反応液を失活した後粉末活性炭で清浄濾過した液。
Ｒ−Ｂｘ ６０、ＤＦＡ III純度 ７８．６％、供給量 ２．５％ Ｌ／Ｌ−Ｒ）
通液条件：７０℃、ＳＶ＝０．６（２．０ｍｌ／ｍｉｎ）
溶離液： 水
回収フラクション： ５ｍｌ／フラクション

（５）イヌリン（Ｃ社品）２００ｋｇを８０℃のお湯１０００ｇに溶解し、ＩＦＴ５０００ｕｎｉｔｓ／ｋｇイヌリンを添加し、６０℃１２時間攪拌しＤＦＡ III含有液を生成させた。この反応完了液を８０℃に上げ失活させた後、この失活反応完了液を３０℃に冷却後にイースト（日本甜菜製糖株式会社製：ニッテンイースト）１００ｇ（水分６６％）を添加し、３０℃で１２時間通気攪拌培養した。
そのイースト反応液を濾過（セラミック膜等）し、その濾過液を濃縮して、Ｂｘ５０〜７０程度までにして、クロマト分離処理のクロマト原液とし、上記と同様にクロマト処理して、ＤＦＡ IIIの精製を行った。

フラクトシルトランスフェラーゼの製造
（１） アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＡＨＵ １７５３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９６）を下記の培養条件で培養し、酵素液を作成した。

（２）培地１：１％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．０。５００ｍｌ容の振とう坂口フラスコに、１００ｍｌを調製し、高圧蒸気殺菌をした。
培地２：１％イヌリン、０．２％硝酸ナトリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％リン酸二水素カリウム、０．０１ｇ／Ｌ硫酸第二鉄、０．５％酵母エキス、ｐＨ７．０。２００Ｌ容のジャーファーメンター（日立製作所製、モデルＦＦ−０２）に、１００Ｌを調製し、高圧蒸気殺菌をした。

（３）培養（酵素生産）
前培養；保存スラント培地より、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＡＨＵ １７５３株の一白金耳量菌体を、無菌的に（培地１）に接種した。そして、２７℃、２４時間、振とう培養をした。振とう条件は、１５センチ幅、１２０ｒｐｍ。
本培養： 前培養で調製した培養液（フラスコ１０本分、１Ｌ分）を、無菌的に（培地２）に接種した。そして、ジャーファーメンターを２７℃で、１７時間、運転した。通気量は、１ｖｖｍ（１００Ｌ／分）、攪拌数は、３００ｒｐｍ。

（４）菌体回収、およびその他
（３）で調製した培養液を、遠心分離器で菌体と上清とに分離し、上清をＤＦＡ III酵素液とした。酵素液をリン酸にて、ｐＨ５．５に調整後、マイナス２０℃で保存した。

（結果）
この操作により、ＩＦＴを、
濃度： ３００ユニット／ミリリットル（培養液）、（実験室レベルの３倍）
全量： ４．５×１０の７乗、ユニット量、（工業生産に対応できる十分量）
時間： １７時間、（実験室レベルより短時間）
に製造できた。

（培養条件）
・前培養：２７℃、２４時間、振とう培養
・本培養：前培養液を本培養液に接種（本培養液量に対して１％の前培養液量）し、２７℃、２４時間振とう培養する。

（酵素液の調整）
本培養液を遠心分離（２０００Ｇ、４℃、２０分）し、上澄みを酵素液として使用する。

クロマトグラフィー処理
ＤＦＡ III純度が８１％、４９．５％のＤＦＡ III含有液について、疑似移動床方式クロマトグラフィー処理による精製を行い（１）、（２）、それぞれ、ＤＦＡ III画分純度９６％、９１％を得た。

（１）試験例１
・原料：ＤＦＡ III含有液
Ｒ−Ｂｘ ６０
ＤＦＡ III純度 ８１％
・運転条件
運転負荷 ：０．１４０７ Ｌ／ｈｒ
溶離水使用比 ：１．３００Ｖ／Ｖ（分離剤当たり）
運転温度 ：６５℃
分離剤 ：強酸性樹脂ＵＢＫ５３０（日本錬水製）Ｎａ型
原料処理量 ：４．０ｔｏｎ／ｄａｙ（樹脂１ｍ³当たり）
溶離水 ：純水
プロセス ：４床を使用し、５サイクル連続運転
ＤＦＡ III画分とその他画分の２成分分離
・運転結果 ５サイクル平均のＤＦＡ III画分の分析結果（高速液体クロ マトグラフィーＳｈｏｄｅｘ，ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０１等 使用）
ＤＦＡ III画分純度 ：９６％
ＤＦＡ III画分回収率：９０％

（２）試験例２
・原料：ＤＦＡ III含有液
Ｒ−Ｂｘ ６０
ＤＦＡ III純度 ４９．５％
・運転条件
運転負荷 ：０．１４０７Ｌ／ｈｒ
溶離水使用比 ：１，３００Ｖ／Ｖ（分離剤当たり）
運転温度 ：６５℃
分離剤 ：強酸性樹脂ＵＢＫ５３０（日本錬水製）Ｎａ型
原料処理量 ：４．０ｔｏｎ／ｄａｙ（樹脂１ｍ³当たり）
溶離水 ：純水
プロセス ：４床を使用し、５サイクル連続運転
ＤＦＡ III画分とその他画分の２成分分離
・運転結果 ５サイクル平均のＤＦＡ III画分の分析結果（高速液体ク ロマトグラフィーＳｈｏｄｅｘ，ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０ １等使用）
ＤＦＡ III画分純度 ：９１％
ＤＦＡ III画分回収率 ：８１％

ＤＦＡ III酵素反応液のイースト処理
イヌリン（Ｃ社品）２００ｋｇを８０℃の湯１ｋｇに溶解し、ＩＦＴ５０００ ｕｎｉｔｓ／ｋｇイヌリンを添加し、６０℃で１２時間攪拌し、ＤＦＡ III含有液を生成させた。

この反応終了液を８０℃にまで加温して酵素を失活させた後、この失活反応完了液を３０℃に冷却し、しかる後にイースト（日本甜菜製糖（株）製：ニッテンイースト）１００ｇ（水分６６％）を添加し、３０℃で１２時間通気培養した。

得られたイースト反応液を濾過（セラミック膜等）し、その濾過液を濃縮して、Ｂｘ５０〜７０程度までにし、これをクロマト分離処理のクロマト原液とした。

ＤＦＡ III顆粒状物の製造
ＤＦＡ III結晶を乳鉢で微粉砕した後、ＤＦＡ III１００に対して水１０を加え、均一に混合した。これを押出し造粒機（不二パウダル（株）製、ＦＩＮＥＲＹＵＺＥＲ、型式ＥＸＲ−６０、処理能力４０〜１５０ｋｇ／ｈｒ）にて造粒し、７０℃の送風定温恒温機（ヤマト科学（株）製、型式ＤＮ９１０）で３時間乾燥し、顆粒状ＤＦＡ IIIを製造した。

熟練したパネラー２０人により、結晶ＤＦＡ IIIと微粉砕ＤＦＡ III、顆粒状ＤＦＡ IIIの官能試験を実施した。得られた結果を下記表４に示した。表４に示すように、微粉砕ＤＦＡ IIIは結晶ＤＦＡ IIIより甘味が強くなり、口溶けや甘味の切れが向上し、結果的に好ましいという結果が得られた。さらに顆粒状ＤＦＡ IIIでは微粉砕ＤＦＡ IIIに対して甘味の強さは変わらないものの、口溶けや甘味の切れが向上し、総合評価も高かった。

（表４） 各加工処理をしたＤＦＡ IIIの官能試験
────────────────────────────────
結晶ＤＦＡ IIIに対する微粉砕ＤＦＡ IIIの評価
甘み 口溶け感 甘味の切れ 総合評価
＋１．２ ＋１．４ ＋０．５ ＋１．７
微粉砕ＤＦＡ IIIの評価に対する顆粒状ＤＦＡ IIIの評価
甘み 口溶け感 甘味の切れ 総合評価
＋０．１ ＋０．５ ＋０．２ ＋０．５
────────────────────────────────

（甘み）
＋２：甘い
＋１：やや甘い
０：どちらとも言えない
―１：やや甘くない
−２：甘くない
（口溶け感）
＋２：良い
＋１：やや良い
０：どちらとも言えない
―１：やや悪い
−２：悪い
（甘みの切れ）
＋２：さっぱりしている
＋１：ややさっぱりしている
０：どちらとも言えない
−１：ややしつこい
−２：しっこい
（総合評価）
＋２：良い
＋１：やや良い
０：どちらとも言えない
−１：やや悪い
−２：悪い

以上のことから、口溶け感や甘味の切れなど、食味や食感において敬遠される面があった結晶ＤＦＡ IIIは、微粉砕後、更に顆粒化することで、これらの点を改善できることが確認された。

なお、結晶化条件は、ＤＦＡ III冷却結晶化時のＲ−Ｂｘ：６５以上であった（５０℃における溶解度より判断した）。

ＤＦＡ III結晶の製造フローの一例を示す。 クロマト処理による精製フローの例を示す。 各種イヌリン商品の液体クロマトグラムである。 ＭＦ（メンブランフィルター）濾過試験の結果を示す。

Claims (8)

1. ジフルクトース・ジアンヒドリドIII（以下ＤＦＡ IIIという）純度が７０％未満のＤＦＡ III含有液を、イースト処理、清浄濾過処理又はクロマトグラフィー処理の少なくとも１つから選ばれる方法で処理することを、特徴とするＤＦＡ IIIの精製方法。
2. ＤＦＡ III含有液が、フラクトース重合体又はフラクトース重合体含有物にフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得たものそのまま、その濃縮物、結晶化分離シラップ、これらの１種又は２種以上の混合物の少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１記載のＤＦＡ IIIの精製方法。
3. フラクトシルトランスフェラーゼとして、イヌリンフルクトトランスフェラーゼ（デポリメライジング）（inulin fructotransferase (depolymerizing)）を使用すること、を特徴とする請求項３記載のＤＦＡ IIIの精製方法。
4. イヌリンフルクトトランスフェラーゼ（デポリメライジング）（inulin fructotransferase (depolymerizing)）として、アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）ＡＨＵ１７５３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９６）由来の精製酵素、粗製酵素、酵素含有物、菌体、菌培養物、同処理物の少なくとも一つを使用すること、を特徴とする請求項３記載のＤＦＡ IIIの精製方法。
5. イースト処理が、ＤＦＡ III含有物にイーストを添加し、通気培養する処理であること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＦＡ IIIの精製方法。
6. 清浄濾過処理が粉末活性炭処理及び固液分離処理を包含するものであること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＦＡ IIIの精製方法。
7. 結晶化分離シラップの清浄濾過処理が連続遠心分離処理を包含するものであること、を特徴とする請求項１〜２のいずれか1項に記載のＤＦＡ IIIの精製方法。
8. 請求項１〜７に記載した方法によってＤＦＡ IIIを精製し、必要あれば濃縮した後、結晶化すること、を特徴とする高純度ＤＦＡ III結晶の製造方法。

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