CN111057730A - 一种高纯果果二糖单体的制备方法 - Google Patents

一种高纯果果二糖单体的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111057730A
CN111057730A CN201911363873.8A CN201911363873A CN111057730A CN 111057730 A CN111057730 A CN 111057730A CN 201911363873 A CN201911363873 A CN 201911363873A CN 111057730 A CN111057730 A CN 111057730A
Authority
CN
China
Prior art keywords
inulin
sample
disaccharide
fructo
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911363873.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111057730B (zh
Inventor
曾宪维
吴少辉
魏远安
杨新球
吴嘉仪
叶伟娟
霍金洪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Quantum Hi Tech Guangdong Biology Co ltd
Original Assignee
Quantum Hi Tech China Biological Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Quantum Hi Tech China Biological Co Ltd filed Critical Quantum Hi Tech China Biological Co Ltd
Priority to CN201911363873.8A priority Critical patent/CN111057730B/zh
Publication of CN111057730A publication Critical patent/CN111057730A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111057730B publication Critical patent/CN111057730B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/04—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种高纯果果二糖单体的制备方法，属于分离提纯技术领域。本发明提供一种高纯果果二糖单体的制备方法，通过酶解法快速提高菊粉或菊粉来源低聚果糖中果果二糖的比例，同时降低同分异构体蔗糖的比例，利用制备高效液相色谱技术分离得到纯度98％以上的符合标准样品要求的果果二糖单体。本发明的制备方法分离时间短，制备量大，可以放大生产，回收率高，得到目前为止纯度最高的果果二糖单体。

Description

一种高纯果果二糖单体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种高纯果果二糖单体的制备方法，属于分离提纯技术领域。
背景技术
低聚果糖，分为蔗糖来源低聚果糖和菊粉来源低聚果糖，具体为果糖基经β-糖苷键连接，末端带有α-D-葡萄糖基、聚合度为3～9，或不带有α-D-葡萄糖基、聚合度为2～9的功能性低聚糖。
低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)天然存在于菊苣、牛蒡、蜂蜜、香蕉等多种植物当中。低聚果糖作为益生元的代表，具有润肠通便、增强免疫力、抗龋齿、促进矿物质的吸收、改善肠道菌群、调节微生态平衡的生理功能。
菊粉来源低聚果糖包括蔗-果型(GFn)低聚果糖和果-果型(Fn)低聚果糖。果果型低聚果糖(Fn；F为果糖基)的化学结构是2～10个果糖基经β(2→1)糖苷键相互连接而成的果果二糖(F2)、果果三糖(F3)、果果四糖(F4)、果果五糖(F5)、果果六糖(F6)、果果七糖(F7)、果果八糖(F8)、果果九糖(F9)等组分，主要来源为菊粉经内切型菊粉酶作用，从菊粉分子内部随机切断糖苷键，得到不同聚合度果果型低聚果糖及少量蔗果型低聚果糖。
低聚果糖在2000年通过美国FDA审核作为公认安全级(GRAS)的功能性低聚糖，由于FOS具有优异的生理学功能，成为近十年来医药、临床营养、保健等领域上广泛流行的功能性基料，应用范围多达500余种保健食品和药品、食品等，市场前景广阔。然而缺乏有效的检测手段，特别是缺少相应的果-果型(Fn)低聚果糖的商业化标准样品，难以精准检测菊粉来源低聚果糖原料及其在食品、保健食品等产品中的含量，一定程度上影响菊粉来源低聚果糖的推广。目前商业化的低聚果糖单体均为蔗-果型(GFn)低聚果糖(如蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等)，缺少高纯的果-果型(Fn)低聚果糖单体。因此，果-果型(Fn)低聚果糖单体的研制将有效解决菊粉来源低聚果糖检测的瓶颈问题，对整个低聚果糖行业起到重要的推动作用。
目前，果-果型(Fn)低聚果糖单体的研究或专利不多，主要涉及果果三糖、果果四糖等聚合度为3以上的果-果型(Fn)低聚果糖产品的制备。中国专利CN106543239A采用两次凝胶过滤色谱柱的高效液相色谱法制备纯度大于95％的果果三糖(F3)、果果四糖(F4)和40％的果果五糖(F5)。中国专利CN106632526A采用聚丙烯酰胺凝胶柱分离得到F3、F4、F5、F6、F7、F8或F9的果-果型(Fn)低聚果糖，纯度也仅大于95％。两专利制备所得果-果型(Fn)低聚果糖还没法作为高纯度对照品甚至标准样品使用。
果果二糖作为果-果型(Fn)低聚果糖之一，目前尚未见到高纯度果果二糖单体制备的报道。果果二糖在菊粉来源低聚果糖中的含量约为0.5％～3％，而在菊粉中含量则更低(通常少于1％)，远低于菊粉来源低聚果糖中果果三糖和果果四糖的含量，若使用上述专利方法富集果果二糖，制备效率太低，且纯度均不高。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高纯果果二糖单体的制备方法，该制备方法可解决原料中果果二糖比例低、难以富集的问题，同时可实现高纯度(98％以上)的符合标准样品要求的果果二糖单体的分离制备。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种高纯果果二糖单体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将菊粉或菊粉来源低聚果糖样品加水溶解，得到样品溶液；
(2)利用菊粉酶对样品溶液进行酶解，加热灭酶，滤膜过滤，得到样品酶解溶液；
(3)样品酶解溶液经一次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集糖聚合度为2的馏分，得到二糖洗脱液；
(4)二糖洗脱液经二次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集果果二糖馏分，得到果果二糖洗脱液；
(5)将收集的果果二糖洗脱液减压冷冻浓缩、干燥，得到高纯果果二糖单体。
本发明使用酶解法提高菊粉或菊粉来源低聚果糖原料中果果二糖的比例，同时降低同分异构体蔗糖比例，降低果果二糖和蔗糖的分离难度。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，菊粉的聚合度为2～60，菊粉来源低聚果糖的聚合度为2～9。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，菊粉溶液的质量浓度为5％～25％，菊粉来源低聚果糖溶液的质量浓度为10％～50％。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述菊粉溶液的质量浓度为10％～20％，所述菊粉来源低聚果糖溶液的质量浓度为20％～30％。菊粉溶液的质量浓度从溶解速度和液体流动性考虑，优选小于20％，从提高底物浓度来考虑，优选大于10％。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，菊粉酶的用量为5～100U/g菊粉或5～20U/g菊粉来源低聚果糖，pH值为3～7，酶解温度为40～70℃，酶解时间为2～24h。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述菊粉酶的用量为20～60U/g菊粉或10～15U/g菊粉来源低聚果糖，所述pH值为4～6，所述酶解温度为50～60℃，所述酶解时间为5～10h。该条件下，反应时间合适，反应时间过快不利于检测，反应时间过慢则效率低下。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，灭酶温度为80～100℃，灭酶时间为10～30min，滤膜的孔径为0.45μm。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，一次制备高效液相色谱法的色谱条件为：低分离度HILIC色谱柱，流动相为体积比为(70～80)：(30～20)的乙腈和水混合溶液，柱温为20～40℃，流动相速度为3～10mL/min，进样的质量浓度为10％～20％，进样量为100～300μL。低分离度HILIC色谱柱优选为Xmide色谱柱。
使用低分离度HILIC色谱柱的高效液相色谱法，快速分离不同聚合度糖组分，获得只含果果二糖或同时含有果果二糖和蔗糖的二糖组分。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，二次制备高效液相色谱法的色谱条件为：高分离度HILIC色谱柱，流动相为体积比为(70～85)：(30～15)的乙腈和水混合溶液，柱温为20～40℃，流动相速度为3～10mL/min，进样的质量浓度为10％～20％，进样量为100～300μL。高分离度HILIC色谱柱优选为Asahipak NH2P色谱柱。
使用高分离度HILIC色谱柱的高效液相色谱法，精准高效分离果果二糖和蔗糖，获得高纯度果果二糖单体。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述低分离度HILIC色谱柱和所述高分离度HILIC色谱柱的规格为10×250mm，20×250mm，30×250mm或以上，粒径为5μm。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤(4)所述的二次制备高效液相色谱法分离的使用与否，取决于步骤(2)的样品酶解溶液中果果二糖(F2)在二糖(F2和GF)组分中的比例；进一步地，样品酶解溶液中果果二糖(F2)在二糖(F2和GF)组分中的比例≥98％时，可不需步骤(4)所述的二次制备高效液相色谱法分离。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述制备方法还包括步骤(6)：用高效阴离子交换色谱-脉冲电化学检测法(HPAEC-PAD)测定原料、二糖洗脱液、果果二糖洗脱液及果果二糖单体中果果二糖的纯度。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述制备方法还包括步骤(7)：对果果二糖单体进行结构鉴定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供一种高纯果果二糖单体的制备方法，通过酶解法快速提高菊粉或菊粉来源低聚果糖中果果二糖的比例，同时降低同分异构体蔗糖的比例，利用制备高效液相色谱技术分离得到纯度98％以上的符合标准样品要求的果果二糖单体。本发明的制备方法分离时间短，制备量大，可以放大生产，回收率高，得到目前为止纯度最高的果果二糖单体。
(2)本发明使用酶解法可使果果二糖从菊粉或菊粉来源低聚果糖原料中的0.5％～3％快速提升至10％～15％，同时水解同分异构体蔗糖，降低果果二糖和蔗糖的分离难度。
(3)本发明提供了目前为止唯一的一种高纯度果果二糖单体的制备方法，解决了无法获得果果二糖纯品的问题，为准确定量食品中菊粉来源低聚果糖含量提供标准样品的检测基础。
附图说明
图1为实施例1中样品酶解溶液的高效液相色谱图。
图2为实施例1中二糖洗脱液的高效液相色谱图。
图3为实施例1中4个样品中各组分的离子色谱图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例是以菊粉为原料制备高纯果果二糖单体的方法，步骤如下：
(1)将15g菊粉样品(聚合度为2～60)用0.1M pH值为5的乙酸钠缓冲液溶解至质量浓度为15％的样品溶液；
(2)利用菊粉酶对样品溶液进行酶解，菊粉酶的用量为60U/g菊粉，pH值为5，酶解温度为50℃，酶解时间为5h；加热灭酶，灭酶温度为80℃，灭酶时间为30min，0.45μm滤膜过滤，得到样品酶解溶液；
(3)样品酶解溶液经一次制备高效液相色谱法分离，色谱条件为：Xmide色谱柱(粒径为5μm，规格：20×250mm)，流动相为体积比为78：22的乙腈和水混合溶液，柱温为30℃，流动相速度为5mL/min，进样的质量浓度为15％，进样量为200μL，利用蒸发光散射检测器色谱响应信号，如图1所示，收集糖聚合度为2的馏分(响应信号的2/3部分)，得到二糖洗脱液；
(4)二糖洗脱液经二次制备高效液相色谱法分离，色谱条件：Asahipak NH2P-5010E色谱柱(粒径为5μm，规格：10×250mm)，流动相为乙腈和水(体积比为80：20)，柱温为30℃，流动相速度为5mL/min，进样的质量浓度为15％，进样量为200μL，利用蒸发光散射检测器色谱响应信号，如图2所示，收集果果二糖馏分(响应信号的2/3部分)，得到果果二糖洗脱液；
(5)将收集的果果二糖洗脱液减压冷冻浓缩、干燥，得到高纯果果二糖单体；
(6)用HPAEC-PAD测定样品溶液、样品酶解溶液和二糖洗脱液、果果二糖单体中果果二糖的纯度；
(7)对所得果果二糖进行结构鉴定。
测定果果二糖纯度的HPAEC-PAD条件：
仪器：Thermo Scientific ICS-5000离子色谱仪
色谱柱：CarboPac PA20分离柱(柱尺寸：
Figure BDA0002337900150000062
粒径：6.5μm)及其保护柱(柱尺寸：
Figure BDA0002337900150000063
粒径：6.5μm)
柱温：30℃
进样量：25μL
流动相：A：氢氧化钠溶液(250mmol/L)，B：氢氧化钠溶液(250mmol/L)+乙酸钠溶液(500mol/L)，C：水
流速：0.4mL/min
检测器：脉冲安培检测器，金工作电极，Ag/AgCl参比电极，糖标准四电位波形。
洗脱梯度程序如表1所示。
表1
Figure BDA0002337900150000061
Figure BDA0002337900150000071
本实施例中样品溶液、样品酶解溶液和二糖洗脱液、果果二糖单体中果果二糖纯度结果如图3和表2所示，所得果果二糖单体的纯度为99.5％。
表2
名称 样品溶液(％) 样品酶解溶液(％) 二糖洗脱液(％) 果果二糖单体(％)
葡萄糖(Glc) 3.1 15.45 — —
果糖(Fru) 2.25 16.25 — —
蔗糖(GF) 2.45 6.96 35 —
蔗果三糖(GF2) 2.69 4.02 — —
果果二糖(F2) 1.5 14.56 65 99.5
蔗果四糖(GF3) 3.86 4.55 — —
果果三糖(F3) 1.45 13.89 — —
蔗果五糖(GF4) 3.9 6.7 — —
果果四糖(F4) 1.25 7.95 — —
蔗果六糖(GF5) 3.75 4.25 — —
果果五糖(F5) 0.89 3.44 — —
蔗果七糖(GF6) 3.5 — — —
果果六糖(F6) 0.74 1.5 — —
果果七糖(F7) 0.64 0.48 — —
聚合度大于7的糖组分 68.03 — — —
注：“—”为未检出。
对所得果果二糖进行结构鉴定：
果果二糖为白色粉末；
紫外光谱：最大吸收波长λmax＝198nm；
红外光谱数据：IR(cm-1)：3375(－OH伸缩振动)，2936(－CH2伸缩振动)，1417，1343，1263(－CH2弯曲振动)，1106，1061(C－O伸缩振动)；
元素分析：C：42.5％，H：6.6％，与果果二糖(C12H22O11)的元素组成(计算值C：42.1％，H：6.4％)相符。
旋光度：
Figure BDA0002337900150000081
(c＝0.49，H2O)
高分辨质谱：Thermo Q ExactiveOrbitrap质谱仪，HR-ESI-MS给出m/z377.0855[M+Cl]-(Calcd for C12H22Cl O11：377.0851)
核磁：Aglient DD2 600MHz超导核磁共振谱仪，综合1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、HMBC、COSY对化合物的核磁数据进行归属，结果见表3。
表3
Figure BDA0002337900150000082
Figure BDA0002337900150000091
结合红外光谱、高分辨质谱、核磁共振谱推测化合物分子式为C12H22O11，紫外光谱、红外光谱、旋光度、高分辨质谱、核磁共振氢谱、碳谱数据与果果二糖的文献报道值一致，确定该组分为果果二糖。
实施例2
本实施例是以菊粉来源低聚果糖为原料制备高纯果果二糖单体的方法，步骤如下：
(1)将10g菊粉来源低聚果糖(聚合度为2～9)样品用0.1M pH值为5的乙酸钠缓冲液溶解至质量浓度为20％的样品溶液；
(2)利用菊粉酶对样品溶液进行酶解，菊粉酶的用量为15U/g菊粉来源低聚果糖，pH值为5，酶解温度为50℃，酶解时间为5h；加热灭酶，灭酶温度为100℃，灭酶时间为10min，0.45μm滤膜过滤，得到样品酶解溶液；
(3)样品酶解溶液经一次制备高效液相色谱法分离，色谱条件为：Xmide色谱柱(粒径为5μm，规格：10×250mm)，流动相为体积比为75：25的乙腈和水混合溶液，柱温为30℃，流动相速度为3mL/min，进样的质量浓度为10％，进样量为100μL，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，收集糖聚合度为2的馏分(响应信号的2/3部分)，得到二糖洗脱液；
(4)将收集的二糖洗脱液减压冷冻浓缩、干燥，得到高纯果果二糖单体；
(5)用HPAEC-PAD测定制备样品溶液、样品酶解溶液和果果二糖单体中各组分含量，结果如表4所示。所得果果二糖单体的纯度为99.1％。
表4
Figure BDA0002337900150000092
Figure BDA0002337900150000101
注：“—”为未检出。
实施例3
本实施例是以菊粉为原料制备高纯果果二糖单体的方法，步骤如下：
(1)将15g菊粉样品(聚合度为2～60)用0.1M pH值为5的乙酸钠缓冲液溶解至质量浓度为5％的样品溶液；
(2)利用菊粉酶对样品溶液进行酶解，菊粉酶的用量为5U/g菊粉，pH值为3，酶解温度为40℃，酶解时间为24h；加热灭酶，灭酶温度为80℃，灭酶时间为30min，0.45μm滤膜过滤，得到样品酶解溶液；
(3)样品酶解溶液经一次制备高效液相色谱法分离，色谱条件为：Xmide色谱柱(粒径为5μm，规格：20×250mm)，流动相为体积比为70：30的乙腈和水混合溶液，柱温为20℃，流动相速度为3mL/min，进样的质量浓度为10％，进样量为100μL，利用蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集糖聚合度为2的馏分(响应信号的2/3部分)，得到二糖洗脱液；
(4)二糖洗脱液经二次制备高效液相色谱法分离，色谱条件：Asahipak NH2P-5010E色谱柱(粒径为5μm，规格：10×250mm)，流动相为乙腈和水(体积比为70：30)，柱温为20℃，流动相速度为3mL/min，进样的质量浓度为10％，进样量为100μL，利用蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集果果二糖馏分(响应信号的2/3部分)，得到果果二糖洗脱液；
(5)将收集的果果二糖洗脱液减压冷冻浓缩、干燥，得到高纯果果二糖单体。所得果果二糖单体的纯度为99.0％。
实施例4
本实施例是以菊粉为原料制备高纯果果二糖单体的方法，步骤如下：
(1)将15g菊粉样品(聚合度为2～60)用0.1M pH值为5的乙酸钠缓冲液溶解至质量浓度为25％的样品溶液；
(2)利用菊粉酶对样品溶液进行酶解，菊粉酶的用量为100U/g菊粉，pH值为7，酶解温度为70℃，酶解时间为2h；加热灭酶，灭酶温度为80℃，灭酶时间为30min，0.45μm滤膜过滤，得到样品酶解溶液；
(3)样品酶解溶液经一次制备高效液相色谱法分离，色谱条件为：Xmide色谱柱(粒径为5μm，规格：30×250mm)，流动相为体积比为80：20的乙腈和水混合溶液，柱温为40℃，流动相速度为10mL/min，进样的质量浓度为20％，进样量为300μL，利用蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集糖聚合度为2的馏分(响应信号的2/3部分)，得到二糖洗脱液；
(4)二糖洗脱液经二次制备高效液相色谱法分离，色谱条件：Asahipak NH2P-5010E色谱柱(粒径为5μm，规格：30×250mm)，流动相为乙腈和水(体积比为85：15)，柱温为40℃，流动相速度为10mL/min，进样的质量浓度为20％，进样量为300μL，利用蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集果果二糖馏分(响应信号的2/3部分)，得到果果二糖洗脱液；
(5)将收集的果果二糖洗脱液减压冷冻浓缩、干燥，得到高纯果果二糖单体。所得果果二糖单体的纯度为99.2％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种高纯果果二糖单体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将菊粉或菊粉来源低聚果糖样品加水溶解，得到样品溶液；
(2)利用菊粉酶对样品溶液进行酶解，加热灭酶，滤膜过滤，得到样品酶解溶液；
(3)样品酶解溶液经一次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集糖聚合度为2的馏分，得到二糖洗脱液；
(4)二糖洗脱液经二次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集果果二糖馏分，得到果果二糖洗脱液；
(5)将收集的果果二糖洗脱液减压冷冻浓缩、干燥，得到高纯果果二糖单体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，菊粉的聚合度为2～60，菊粉来源低聚果糖的聚合度为2～9。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，菊粉溶液的质量浓度为5％～25％，菊粉来源低聚果糖溶液的质量浓度为10％～50％。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉溶液的质量浓度为10％～20％，所述菊粉来源低聚果糖溶液的质量浓度为20％～30％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，菊粉酶的用量为5～100U/g菊粉或5～20U/g菊粉来源低聚果糖，pH值为3～7，酶解温度为40～70℃，酶解时间为2～24h。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉酶的用量为20～60U/g菊粉或10～15U/g菊粉来源低聚果糖，所述pH值为4～6，所述酶解温度为50～60℃，所述酶解时间为5～10h。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，灭酶温度为80～100℃，灭酶时间为10～30min，滤膜的孔径为0.45μm。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，一次制备高效液相色谱法的色谱条件为：低分离度HILIC色谱柱，流动相为体积比为(70～80)：(30～20)的乙腈和水混合溶液，柱温为20～40℃，流动相速度为3～10mL/min，进样的质量浓度为10％～20％，进样量为100～300μL。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，二次制备高效液相色谱法的色谱条件为：高分离度HILIC色谱柱，流动相为体积比为(70～85)：(30～15)的乙腈和水混合溶液，柱温为20～40℃，流动相速度为3～10mL/min，进样的质量浓度为10％～20％，进样量为100～300μL。
10.如权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述低分离度HILIC色谱柱和所述高分离度HILIC色谱柱的规格为10×250mm，20×250mm，30×250mm或以上，粒径为5μm。
CN201911363873.8A 2019-12-26 2019-12-26 一种高纯果果二糖单体的制备方法 Active CN111057730B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911363873.8A CN111057730B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 一种高纯果果二糖单体的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911363873.8A CN111057730B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 一种高纯果果二糖单体的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111057730A true CN111057730A (zh) 2020-04-24
CN111057730B CN111057730B (zh) 2022-09-23

Family

ID=70303813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911363873.8A Active CN111057730B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 一种高纯果果二糖单体的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111057730B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113416759A (zh) * 2021-05-24 2021-09-21 厦门大学 一种苹果果胶来源的中性低聚糖的制备方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5660872A (en) * 1992-11-24 1997-08-26 Raffinerie Tirlemontoise, S.A. Method for separating a polydispersed saccharide composition, resulting products and use thereof in food compositions
JP2005132774A (ja) * 2003-10-30 2005-05-26 Nippon Beet Sugar Mfg Co Ltd ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの精製方法
US20050256307A1 (en) * 2002-04-09 2005-11-17 Vili Ravanko Purification of pure disaccharide solution
CN104878056A (zh) * 2015-04-27 2015-09-02 量子高科(中国)生物股份有限公司 一种生产高纯度低聚果糖的方法
CN104892691A (zh) * 2015-05-28 2015-09-09 量子高科(中国)生物股份有限公司 一种高纯度蔗果聚糖单体的制备方法
CN105177084A (zh) * 2015-10-29 2015-12-23 福建福大百特生物科技有限公司 一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法
CN106543239A (zh) * 2016-11-09 2017-03-29 中国检验检疫科学研究院 一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法
CN106632526A (zh) * 2016-12-08 2017-05-10 中国科学院烟台海岸带研究所 低聚果糖糖单体分离纯化的方法
US20190002939A1 (en) * 2016-01-26 2019-01-03 Jiangnan University Highly Efficient Method for Synthesizing Difructose Anhydride III

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5660872A (en) * 1992-11-24 1997-08-26 Raffinerie Tirlemontoise, S.A. Method for separating a polydispersed saccharide composition, resulting products and use thereof in food compositions
US20050256307A1 (en) * 2002-04-09 2005-11-17 Vili Ravanko Purification of pure disaccharide solution
JP2005132774A (ja) * 2003-10-30 2005-05-26 Nippon Beet Sugar Mfg Co Ltd ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの精製方法
CN104878056A (zh) * 2015-04-27 2015-09-02 量子高科(中国)生物股份有限公司 一种生产高纯度低聚果糖的方法
CN104892691A (zh) * 2015-05-28 2015-09-09 量子高科(中国)生物股份有限公司 一种高纯度蔗果聚糖单体的制备方法
CN105177084A (zh) * 2015-10-29 2015-12-23 福建福大百特生物科技有限公司 一种菊粉酶突变体发酵生产低聚果糖的方法
US20190002939A1 (en) * 2016-01-26 2019-01-03 Jiangnan University Highly Efficient Method for Synthesizing Difructose Anhydride III
CN106543239A (zh) * 2016-11-09 2017-03-29 中国检验检疫科学研究院 一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法
CN106632526A (zh) * 2016-12-08 2017-05-10 中国科学院烟台海岸带研究所 低聚果糖糖单体分离纯化的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张媛媛等: "高效液相色谱—蒸发光散射检测法同时测定单糖、双糖及低聚果糖", 《食品科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113416759A (zh) * 2021-05-24 2021-09-21 厦门大学 一种苹果果胶来源的中性低聚糖的制备方法
CN113416759B (zh) * 2021-05-24 2024-02-13 厦门大学 一种苹果果胶来源的中性低聚糖的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111057730B (zh) 2022-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Functional properties, structural studies and chemo-enzymatic synthesis of oligosaccharides
Liu et al. Preparative separation and purification of rebaudioside a from steviol glycosides using mixed-mode macroporous adsorption resins
Zhang et al. Preparation and structure elucidation of alginate oligosaccharides degraded by alginate lyase from Vibro sp. 510
CN110437288A (zh) 一种新型海参岩藻多糖及其制备方法和应用
CN111057730B (zh) 一种高纯果果二糖单体的制备方法
Zhang et al. Preparation, characterization, and bioactivity evaluation of oligosaccharides from Atractylodes lancea (Thunb.) DC.
CN109030658A (zh) 一种婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的检测方法
CN112210576A (zh) 一种高纯度蔗果三糖及其制备方法
Liang et al. Structural characterization and anticoagulant activity of homogalacturonan from durian peel
CN104530253B (zh) 一种黄精多糖的柱层析分离方法和提取方法
Campos et al. Effect of Yacon (Smallanthus sonchifolius) fructooligosaccharide purification technique using activated charcoal or ion exchange fixed bed column on recovery, purity and sugar content
Sarkar et al. Glucans from alkaline extract of a hybrid mushroom (backcross mating between PfloVv12 and Volvariella volvacea): structural characterization and study of immunoenhancing and antioxidant properties
Shi et al. An efficient protocol for the preparation of linear arabino-oligosaccharides
CN114591448A (zh) 一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖及其制备和用途
CN102907671A (zh) 具有解酒和抗醉酒功能的果胶酶解产物的制备方法及应用
CN103613684A (zh) 一种不同乙酰度的n-乙酰化壳六糖的分离纯化方法
Garcia-Vaquero Analytical methods and advances to evaluate dietary fiber
Cui et al. Purification and identification of oligosaccharides from Cimicifuga heracleifolia Kom. rhizomes
CN102590210B (zh) 一种测定蔗汁中α-葡聚糖含量的方法
CN110632201A (zh) 一种精确检测乳粉中低聚半乳糖含量的方法
CN112094955B (zh) 纯品多糖制备寡糖的方法
CN102864191A (zh) 肝素双糖混合物及其制备方法和应用
CN109856272A (zh) 采用柱前衍生hplc-ms法检查启脾丸中寡糖掺伪的方法
Brochu et al. Isolation and characterization of major polysaccharides from maple sugar
Wang et al. Purification, characterization and bioactivities of a 4-O-methylglucuronoxylan from Aralia echinocaulis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 529040 No.133, Gaoxin West Road, Gaoxin District, Jiangmen City, Guangdong Province

Applicant after: Smart Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.

Address before: 529040 No.133, Gaoxin West Road, Gaoxin District, Jiangmen City, Guangdong Province

Applicant before: QUANTUM HI-TECH(CHINA) BIOLOGICAL Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220421

Address after: No. 52133, Ximen Road, Gaoxin District, Guangdong Province

Applicant after: Quantum hi tech (Guangdong) biology Co.,Ltd.

Address before: 529040 No.133, Gaoxin West Road, Gaoxin District, Jiangmen City, Guangdong Province

Applicant before: Smart Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant