CN106543239A - 一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其包括:S1：溶解：将菊粉来源的低聚果糖混合物溶于超纯水中，配制成低聚果糖溶液；S2：色谱分离：将配制的低聚果糖溶液进样至HPLC上，利用凝胶过滤色谱柱进行分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集分离出的相应组分；S3：冷冻干燥：将所述步骤S2中的所述馏分收集管收集的组分冷冻干燥，即获得低聚果糖的纯品。该方法操作简单、过程易于控制，可快速制备出纯度大于95％的果果三糖、果果四糖纯品，同时可以获得含量为40％的果果五糖(其余杂质为蔗果五糖、果果四糖、蔗果四糖)纯品。

Description

一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法

技术领域

本发明涉及低聚果糖纯品的制备方法，尤其涉及一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法。

背景技术

低聚果糖(fructooligosaccharide，FOS)，又名寡果糖或蔗果低聚糖，是果糖基经β(2→1)糖苷键连接而成的，聚合度为2-9的功能性低聚糖。研究表明，低聚果糖进入人体后，在肠道内能迅速促进双歧杆菌等益生菌的增殖，改善肠道菌群平衡；此外，低聚果糖在预防龋齿，促进矿物质吸收和肠内有毒废物排除等方面均发挥重要功能。因此，低聚果糖已作为一种营养强化剂广泛添加于各种食品和保健品中。

食品中添加的低聚果糖主要有两种来源，一种是以蔗糖为原料，由果糖基转移酶转化、精制而得到，其主要成分为蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)；另一种是以菊苣或菊芋提取的菊粉为原料，经酶解或酸解而生成的聚合度为2-9的果聚糖，其主要成分是果果三糖(F3)、果果四糖(F4)和果果五糖(F5)等。目前，只有蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)有商业化的纯品，而果果三糖(F3)、果果四糖(F4)和果果五糖(F5)的纯品还无法获得，再加上食品基质比较复杂，这也导致了很难对食品中的菊粉来源的低聚果糖进行精确定量。

为了实现对食品中的低聚果糖进行精确定量，目前通行的做法是通过对低聚果糖混合物进行酶解，变成蔗糖、果糖的单体形态后进行单体的定量，然后通过一定的转换系数将结果转化成低聚果糖的含量。这种方法由于不是对低聚果糖进行直接定量，所以不仅定量结果准确度低，而且还影响了对不同结构的低聚果糖(三糖vs四糖vs五糖)功效成分研究的开展。因此，如何获得果果型低聚果糖纯品，已成为该领域研究的瓶颈问题，而在该领域的技术突破，将对于相关研究的开展，起到重要的推动作用。

目前国际上对于菊粉为原料进行低聚果糖的生产，主要是通过将菊粉酶解变成单糖、二糖、低聚果糖混合物(三糖、四糖、五糖等)及多糖的混合物，后通过凝胶色谱、层析、膜分离等进行净化和干燥，最后获得低聚果糖混合物作为最终产品，此产品可作为食品配料加入食品中使用，另外，纯度较高的，也可以作为营养强化剂使用。而对于低聚果糖混合物，目前尚无进一步对各种形态的糖(果果三糖、果果四糖、果果五糖等)进一步分离纯化的技术,无法获得高纯度的果果三糖、果果四糖、果果五糖纯品，使得食品中的低聚果糖无法进行精确定量，取而代之的方法是通过对低聚果糖混合物进行酶解，变成蔗糖、果糖的单体形态后进行单体的定量，然后通过一定的转换系数将结果转化成低聚果糖的含量。这种方法不仅定量结果准确度低，而且还影响了对不同结构的低聚果糖(三糖vs四糖vs五糖)功效成分研究的开展。

发明内容

为克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其操作简单、过程易于控制，可以快速制备出高纯度的果果三糖(F3)、果果四糖(F4)和果果五糖(F5)三种低聚果糖纯品。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其包括：

S1：溶解：将菊粉来源的低聚果糖混合物溶于超纯水中，配制成低聚果糖溶液；

S2：色谱分离：将配制的低聚果糖溶液进样至HPLC上，利用凝胶过滤色谱柱进行分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集分离出的相应组分；

S3：冷冻干燥：将所述步骤S2中的所述馏分收集管收集的组分冷冻干燥，即获得低聚果糖的纯品。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述步骤S1中，配制成的所述低聚果糖溶液的质量浓度为20％。

进一步，在所述步骤S2中，所述凝胶过滤色谱柱为键和Ca离子的磺酸化聚苯乙烯填料的凝胶过滤色谱柱，用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集果果三糖所在的组分。

进一步，所述步骤S2中收集的所述果果三糖所在的组分中果果三糖的纯度大于95％。

进一步，所述步骤S2具体包括一次色谱分离和二次色谱分离；

所述一次色谱分离中，采用的所述凝胶过滤色谱柱为键和Na离子的磺酸化聚苯乙烯二乙烯基苯填料的凝胶过滤色谱柱，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集果果四糖所在的组分，获得一次色谱分离后的果果四糖所在的组分；

所述二次色谱分离包括：将获得的所述一次色谱分离后的果果四糖所在的组分冷冻干燥后再溶于超纯水中，配制成质量浓度为20％的溶液；将该溶液进样至HPLC，利用键和Ca离子的磺酸化聚苯乙烯填料的凝胶过滤色谱柱进行分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集果果四糖所在的组分，获得二次色谱分离后的果果四糖所在的组分。

进一步，所述二次色谱分离后的果果四糖所在的组分中的果果四糖的纯度大于95％。

进一步，在所述步骤S2中，所述凝胶过滤色谱柱为键和Na离子的磺酸化聚苯乙烯二乙烯基苯填料的凝胶过滤色谱柱，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集果果五糖所在的组分。

进一步，所述收集的果果五糖所在的组分中果果五塘的纯度为大于40％。

进一步，在所述步骤S2中，所述HPLC的色谱条件为：流动相为去离子水，等度洗脱，柱温为85℃，流速为0.25-0.45ml/min，进样量为10-40μL。

进一步，在所述步骤S3之前，还包括纯度分析的步骤，具体包括：

将经所述步骤S2收集的各个组分涡旋混匀，取混匀后的物质加入去离子水进行稀释，经稀释后进样至HPAEC-PAD中进行纯度分析；

所述HPAEC-PAD的色谱条件为采用CarboPac PA 200阴离子交换柱，柱温为30℃，进样量为25μL，流速为0.4ml/min；

淋洗液：A相为去离子水，B相为0.2mol/L NaOH，C相为0.4mol/L NaAc。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：该方法操作简单、过程易于控制，可快速制备出纯度大于95％的果果三糖、果果四糖纯品，同时可以获得含量为40％的果果五糖(其余杂质为蔗果五糖、果果四糖、蔗果四糖)纯品，解决了现有技术中无法获得上述三种低聚果糖纯品的问题，为准确定量食品中的低聚果糖的含量，研究不同的低聚果糖功效的差异等提供基础。

附图说明

图1为本发明实施例一提供的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法的流程图；

图2-1为本发明实施例二中菊粉来源低聚果糖混合物经柱1分离的色谱图；

图2-2为本发明实施例二中菊粉来源低聚果糖混合物经柱1分离后制得的收集组分1-5的HPAEC-PAD色谱图；

图2-3为本发明实施例二中菊粉来源低聚果糖混合物经柱2分离的色谱图；

图2-4为本发明实施例二中菊粉来源低聚果糖混合物经柱2分离后制得的收集组分1-6的HPAEC-PAD色谱图；

图3为本发明实施例三种利用HPAEC-PAD分析制备的F3、F4和F5纯度的色谱图；

图4-1为本发明实施例四中的添加蔗糖来源(a)和菊粉来源(b)低聚果糖的乳粉样品典型HPAEC-PAD色谱图；

图4-2为本发明实施例四中的婴幼儿配方米粉样品中低聚果糖的典型HPAEC-PAD色谱图；

图4-3为本发明实施例四中的挂面样品中低聚果糖的典型HPAEC-PAD色谱图；

图4-4为本发明实施例四中的固体饮料样品中低聚果糖的典型HPAEC-PAD色谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例一

如图1所示，本实施例提供了一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其包括：

S1：溶解：将菊粉来源的低聚果糖混合物溶于超纯水中，配制成低聚果糖溶液；

S2：色谱分离：将配制的低聚果糖溶液进样至HPLC上，利用凝胶过滤色谱柱进行分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集分离出的相应组分；

S3：冷冻干燥：将所述步骤S2中的所述馏分收集管收集的组分冷冻干燥，即获得低聚果糖的纯品。

其中的菊粉来源的低聚果糖混合物的纯度在90％以上，低聚果糖混合物中包括果果三糖、果果四糖、果果五糖、蔗果三糖、蔗果四糖及蔗果五糖等成分。

在本实施例的其中一个实施方式中，步骤S1中，将适量的菊粉来源的高纯度低聚果糖混合物溶于超纯水中，配制成质量浓度为20％(w/w)的低聚果糖溶液。优化和的色谱条件为：流动相为去离子水，等度洗脱，柱温为85℃，流速为0.25-0.45ml/min，进样量为10-40μL。

采用高效液相色谱(HPLC)，并结合示差折光检测器作为低聚果糖分离的仪器，利用凝胶过滤色谱柱作为分离纯化色谱柱，整个分离纯化过程操作简单，易于控制，可快速制备出高纯度的果果三糖(F3)、果果四糖(F4)和果果五糖(F5)三种低聚果糖纯品。

实施例二

为提高低聚果糖中果果三糖、果果四糖及果果五糖的分离纯度，本实施例具体探究了色谱条件及凝胶过滤色谱柱的选用。

实施方式1

凝胶过滤色谱柱采用键和Ca离子的磺酸化聚苯乙烯填料的凝胶过滤色谱柱(SCR-101-C，300×7.9mm，10μm，Shimadzu)，记为柱1，采用该柱1进行低聚果糖的分离时，优化后的色谱条件为：流动相为去离子水，等度洗脱，流速为0.3mL/min，柱温为85℃。进样浓度为20％(w/w)低聚果糖混合液，进样量为10μL。

菊粉来源低聚果糖混合物经过柱1分离后出现五个色谱峰，如图2-1所示；按照出峰顺序依次收集五个组分，将收集的五个组分进行离子色谱分析，其色谱图见图2-2。由图2-1和2-2可以看出：果果三糖、果果四糖和果果五糖三种目标物质出现在收集的组分3、组分4和组分5中。其中，组分3中几乎全部为果果三糖(F3)，而其余两组分的成分复杂。

实施方式2

凝胶过滤色谱柱采用键和Na离子的磺酸化聚苯乙烯二乙烯基苯填料的凝胶过滤色谱柱(MCI Gel CK04S，200×10mm，11μm，Mitsubishi)，记为柱2，采用该柱2进行低聚果糖的分离时，优化后的色谱条件为：流动相为去离子水，等度洗脱，流速为0.4mL/min，柱温为85℃，进样浓度为20％(w/w)菊粉来源低聚果糖溶液，进样量为10μL。

菊粉来源低聚果糖混合物经柱2分离后出现六个色谱峰，如图2-3所示。按照出峰顺序依次收集六个组分后进行离子色谱分析的色谱图见图2-4所示。可以看出：果果三糖、果果四糖以及果果五糖三种目标物质出现在收集组分4、组分5和组分6中。其中，组分6中大部分为果果三糖(F3)，组分5中大部分为果果四糖(F4)，组分4中成分为F5、GF4、F4和GF3。

在上述实施方式1和实施方式2中所采用的离子色谱分析采用高效离子色谱仪-电化学检测器(HPAEC-PAD)进行分析，色谱条件如下：

色谱柱采用CarboPac PA 200阴离子交换柱，包括分析柱(3mm×250mm)和保护柱(3mm×50mm)；柱温为30℃，进样体积为25μL，流速为0.4ml/min，淋洗液：A相为去离子水，B相为0.2mol/L NaOH，C相为0.4mol/L NaAc，淋洗程序如表1所示。

表1淋洗程序

基于实施方式1和实施方式2针对采用柱1和柱2进行色谱分离的效果，本实施例优选地采用柱1分离和纯化果果三糖，即在步骤S2中，采用柱1进行色谱分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号，采用馏分收集管收集收集组分3，即收集了果果三糖所在的组分，该组分3中几乎全部为果果三糖，果果三糖的纯度达到95％以上。

基于实施方式1和实施方式2针对采用柱1和柱2进行色谱分离的效果，本实施例针对果果四糖的分离和纯化优选采用下述方式：在步骤S2中，采用一次色谱分离和二次色谱分离；在一次色谱分离中，采用柱2进行色谱分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，采用馏分收集管收集组分5，即果果四糖所在的组分，获得一次色谱分离后的果果四糖所在的组分，该组分5中大部分为果果四糖。为进一步提高果果四糖的纯度，再进行二次色谱分离，具体为：将获得的经一次色谱分离后的组分5冷冻干燥后再溶于超纯水中，配制成质量浓度为20％的溶液；将该溶液进样至HPLC，采用柱1进行分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，采用馏分收集管收集果果四糖所在的组分，获得二次色谱分离后的果果四糖所在的组分，该组分中果果四糖的纯度达到95％以上。

基于实施方式1和实施方式2针对采用柱1和柱2进行色谱分离的效果，本实施例针对果果五糖的分离和纯化优选采用下述方式：在步骤S2中，采用柱2进行色谱分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，采用馏分收集管收集组分4，即收集果果五糖所在的组分，尽管该组分4为F5、GF4、F4和GF3的混合物，但是GF4、F4和GF3的纯品均可由现有的方法获得，可通过计算将GF4、F4和GF3的量扣除后算出果果五糖的量，经计算其中果果五糖的纯度在40％左右。

经过上述针对果果三糖、果果四糖及果果五糖的分离纯化方法，将馏分收集管收集的果果三糖所在的组分、果果四糖所在的组分及果果五糖所在的组分分别进行冷冻干燥，即获得果果三糖、果果四糖及果果五糖的纯品。

另外，为判断经上述分离纯化方法后，所获得的各组分中相应物质的纯度，在步骤S3之前还包括纯度分析的步骤，具体包括：将步骤S2收集的果果三糖所在的组分、果果四糖所在的组分及果果五糖所在的组分蜗旋混匀后取出2μL，去离子水稀释至1mL后利用高效离子色谱仪-电化学检测器(HPAEC-PAD)进行纯度分析，色谱条件同上述描述。

利用HPAEC-PAD的分析方式对果果三糖、果果四糖及果果五糖的纯度进行了分析，结果如图3所示，由图3可以看出，制备的果果三糖和果果四糖的纯度达到了95％以上，果果五糖的纯度为40.2％(其它组分为别的几种低聚果糖，计算时用总量减去别的几种杂质后获得)。由此可知，制备的果果三糖、果果四糖及果果五糖可以作为标准物质用于食品中菊粉来源低聚果糖的定量分析。

实施例三

利用上述实施例的分离纯化方法获得的低聚果糖纯品对GF2、GF3、GF4和F3、F4、F5在0.05～10mg/L浓度范围内的线性关系以及相关系数进行了考察，分别以各化合物质量浓度(mg/L)为横坐标x，峰面积为纵坐标y绘制标准曲线，得到线性回归方程。以GF2、GF3、GF4标准溶液在信噪比(S/N)为10时的进样浓度定义为定量限，结果见表2，表明GF2、GF3、GF4和F3、F4、F5六种物质在该浓度范围内线性关系良好。本方法具有较高的灵敏度，能够满足四类食品基质中GF2、GF3、GF4和F3、F4、F5的检测要求。

表2

注：y为峰面积，x为分析物浓度(mg/L)

实施例四

本实施例提供了将实施例一或2制备的低聚果糖的标准品应用于食品中的低聚果糖的测定方案。

本实施例对购自市场不同品牌的乳粉、婴幼儿配方米粉、挂面和固体饮料四类食品基质进行了测定。以乳粉为例，添加蔗糖来源和菊粉来源的典型乳粉样品的色谱图见图4-1，该图中的a图为添加蔗糖来源的低聚果糖的乳粉样品的HPAEC-PAD色谱图，b图为添加菊粉来源的低聚果糖的乳粉样品的HPAEC-PAD色谱图，色谱峰，1为GF2，2为F2，3为GF3，4为F3，5为GF4，6为F4，7为GF5，8为F5。婴幼儿配方米粉、挂面和固体饮料的HPAEC-PAD色谱图分别见图4-2、4-3及4-4，图4-2中的色谱峰：1为GF2，2为F2，3为GF3，4为F3，5为GF4，6为F4，7为GF5，8为F5；图4-3中的色谱峰：1为GF2，2为GF3，3为GF4；图4-4中的色谱峰：1为GF2，2为GF3，3为GF4。从图中可以看到，乳粉、婴幼儿配方米粉和挂面基质比固体饮料的基质复杂，基质中除了低聚果糖外还含有单糖、双糖、多糖的杂峰。低聚果糖各个成分的色谱峰与基质中的其他杂峰分离效果良好，含有的杂峰并不影响目标物的检测。13种食品中低聚果糖的具体检测结果见表3，检测结果表明大部分食品样品标示值与检测值相符，还有少部分样品的标示值明显高于检测值。

表3 13种食品中低聚果糖的检测结果(mg/100g)(n＝3)

综上所述，采用本发明提供的菊粉来源的低聚果糖纯品的制备方法，可以获得纯度大于95％的果-果三糖、果-果四糖纯品，同时可以获得含量为40％的果-果五糖(其余杂质为蔗-果五糖、果-果四糖、蔗-果四糖)纯品，解决了现有技术中无法获得上述三种低聚果糖纯品的问题，这些纯品的获得，可以为准确定量食品中的低聚果糖的含量，研究不同的低聚果糖功效的差异等提供基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，包括：

S1：溶解：将菊粉来源的低聚果糖混合物溶于超纯水中，配制成低聚果糖溶液；

S2：色谱分离：将配制的低聚果糖溶液进样至HPLC上，利用凝胶过滤色谱柱进行分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集分离出的相应组分；

S3：冷冻干燥：将所述步骤S2中的所述馏分收集管收集的组分冷冻干燥，即获得低聚果糖的纯品。

2.根据权利要求1所述的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，配制成的所述低聚果糖溶液的质量浓度为20％。

3.根据权利要求2所述的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述凝胶过滤色谱柱为键和Ca离子的磺酸化聚苯乙烯填料的凝胶过滤色谱柱，采用馏分收集管收集果果三糖所在的组分。

4.根据权利要求3所述的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中收集的所述果果三糖所在的组分中果果三糖的纯度大于95％。

5.根据权利要求2所述的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括一次色谱分离和二次色谱分离；

所述一次色谱分离中，采用的所述凝胶过滤色谱柱为键和Na离子的磺酸化聚苯乙烯二乙烯基苯填料的凝胶过滤色谱柱，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集果果四糖所在的组分，获得一次色谱分离后的果果四糖所在的组分；

所述二次色谱分离包括：将获得的所述一次色谱分离后的果果四糖所在的组分冷冻干燥后再溶于超纯水中，配制成质量浓度为20％的溶液；将该溶液进样至HPLC，利用键和Ca离子的磺酸化聚苯乙烯填料的凝胶过滤色谱柱进行分离，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集果果四糖所在的组分，获得二次色谱分离后的果果四糖所在的组分。

6.根据权利要求5所述的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，所述二次色谱分离后的果果四糖所在的组分中的果果四糖的纯度大于95％。

7.根据权利要求2所述的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述凝胶过滤色谱柱为键和Na离子的磺酸化聚苯乙烯二乙烯基苯填料的凝胶过滤色谱柱，利用示差折光检测器检测色谱响应信号，根据所述色谱响应信号采用馏分收集管收集果果五糖所在的组分。

8.根据权利要求7所述的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，所述收集的果果五糖所在的组分中果果五塘的纯度大于40％。

9.根据权利要求3至8任一项所述的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述HPLC的色谱条件为：流动相为去离子水，等度洗脱，柱温为85℃，流速为0.25-0.45ml/min，进样量为10-40μL。

10.根据权利要求3至8任一项所述的菊粉来源低聚果糖纯品的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3之前，还包括纯度分析的步骤，具体包括：

将经所述步骤S2收集的各个组分涡旋混匀，取混匀后的物质加入去离子水进行稀释，经稀释后进样至HPAEC-PAD中进行纯度分析；

所述HPAEC-PAD的色谱条件为采用CarboPac PA 200阴离子交换柱，柱温为30℃，进样量为25μL，流速为0.4ml/min；

淋洗液：A相为去离子水，B相为0.2mol/L NaOH，C相为0.4mol/L NaAc。