CN107505409B - 一种测定人参皂苷rz1原料或制剂中异构体杂质人参皂苷rk1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定人参皂苷RZ₁原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK₁的方法，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相添加有羧甲基‑β‑环糊精，色谱参数如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：由0.2％磷酸水溶液与甲醇按照体积比44:56混合而成，或由0.2％磷酸水溶液与乙腈按照体积比52:48混合而成，用三乙胺调节pH至7.2，还含有浓度为0.1g/L的羧甲基‑β‑环糊精，等度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：38‑42℃；检测波长：203nm。本发明提供的HPLC方法通过在流动相中添加异构体选择剂羧甲基‑β‑环糊精，仅使用等度洗脱就可以有效将人参皂苷RZ₁和人参皂苷RK₁分离，分离度高，方法学验证合格。

Description

一种测定人参皂苷RZ1原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK1 的方法

技术领域

本发明涉及药物分析，尤其涉及一种测定人参皂苷RZ₁原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK₁的方法。

背景技术

申请人研究发现人参皂苷RZ₁可有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化。人参皂苷RZ₁最早由韩国学者Sang Myung LEE从加热炮制的人参中分离得到(参考文献：Ginsenosides from Heat Processed Ginseng,Chem Pharm Bull,2009)，生源上由人参皂苷RG₃脱水而得。

人参皂苷RZ₁有两个同分异构体，即人参皂苷RK₁和RG₅，三者化学结构式及生源降解途径如下所示：

人参皂苷RG₃的C20羟基与C21氢发生消除反应得到人参皂苷RK₁，人参皂苷RG₃的C20羟基与C22氢发生消除反应得到人参皂苷RG₅和RZ₁，人参皂苷RK₁与RG₅、RZ₁为双键位置异构，人参皂苷RG₅与RZ₁为双键顺反异构。

其中，人参皂苷RZ₁与人参皂苷RK₁在液相色谱的保留行为非常相似，极难分离。以上述人参皂苷RZ₁最早发现者Sang Myung LEE为例(参考文献：Ginsenosides from HeatProcessed Ginseng,Chem Pharm Bull,2009)，研究者采用了二维液相色谱才将人参皂苷RZ₁与人参皂苷RK₁分开。但是，本领域技术人员知道，二维液相色谱发展非常不成熟，重现性差，不能满足药物质量控制的严格要求。各国药典对二维液相色谱都非常慎重，目前仅有美国药典收载了个别极其难以分离的品种。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种测定人参皂苷RZ₁原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK₁的方法，以使用常规的一维液相色谱就实现人参皂苷RZ₁原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK₁的检测控制。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种测定人参皂苷RZ₁原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK₁的HPLC方法，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相添加有羧甲基-β-环糊精。

在一个具体实施例中，所述流动相为甲醇水溶液或乙腈水溶液，其中添加有适量浓度的羧甲基-β-环糊精。

在一个具体实施例中，HPLC色谱参数如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相：由0.2％磷酸水溶液与甲醇按照体积比44:56混合而成，用三乙胺调节pH至7.2，还含有浓度为0.1g/L的羧甲基-β-环糊精，等度洗脱；

流速：1.0mL/min；

柱温：38-42℃；

检测波长：203nm。

在一个具体实施例中，柱温为40℃。

在一个具体实施例中，HPLC色谱参数如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相：由0.2％磷酸水溶液与乙腈按照体积比52:48混合而成，用三乙胺调节pH至7.2，还含有浓度为0.1g/L的羧甲基-β-环糊精，等度洗脱；

流速：1.0mL/min；

柱温：38-42℃；

检测波长：203nm。

在一个具体实施例中，柱温为40℃。

羧甲基-β-环糊精作为反相高效液相色谱流动相添加剂用于分离人参皂苷RZ₁和人参皂苷 RK₁的用途。

本发明提供的HPLC方法通过在流动相中添加异构体选择剂羧甲基-β-环糊精，仅使用等度洗脱就可以有效将人参皂苷RZ₁和人参皂苷RK₁分离，分离度高。

附图说明

图1是人参皂苷RZ₁和人参皂苷RK₁在实施例1色谱条件下的分离效果图，A图流动相中含有羧甲基-β-环糊精，B图流动相中不含有羧甲基-β-环糊精。

具体实施方式

实施例1：流动相为甲醇水溶液

1、试验材料

Waters2695液相色谱仪(美国Waters)；

赛多利斯电子天平(德国Sartorius)；

色谱柱：Waters XBridge^TM C18色谱柱(5μm,4.6×250mm；美国Waters)；

人参皂苷RZ₁和人参皂苷RK₁标准品自制，纯度均大于98％；

甲醇、85％磷酸、三乙胺为色谱纯，水为去离子水，羧甲基-β-环糊精为分析纯。

2、试验方法和试验结果

2.1溶液配制

色谱峰定位溶液：配制含有人参皂苷RZ₁或人参皂苷RK₁的单标溶液，浓度0.1mg/mL。

系统适用性溶液：配制人参皂苷RZ₁和人参皂苷RK₁浓度为0.5mg/mL的混标溶液作为系统适用性溶液。

供试品溶液：精密称取人参皂苷RZ₁原料用流动相溶解配制成浓度为1.0mg/mL的溶液。

2.2色谱条件

色谱柱：Waters XBridge^TM C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；

流动相：由0.2％磷酸水溶液(85％磷酸2mL+去离子水998mL)与甲醇按照体积比44:56 混合而成，添加羧甲基-β-环糊精至浓度为0.1g/L，用三乙胺调节pH至7.2，等度洗脱；

柱温：40℃；

检测波长：203nm；

进样量：10μL。

2.3系统适用性

精密量取色谱峰定位溶液、系统适用性溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液色谱图如图1A，该色谱条件下人参皂苷RZ₁和人参皂苷RK₁可基线分离，出峰顺序依次为人参皂苷RZ₁、人参皂苷RK₁，二者分离度大于2.0。

图1B作为对比，流动相中不添加羧甲基-β-环糊精，其他色谱参数相同，结果人参皂苷 RK₁与人参皂苷RZ₁共同出峰。

2.4检测限和定量限

精密称取人参皂苷RK₁对照品适量，加流动相溶解并稀释至峰高约为基线噪音的3倍、10倍。人参皂苷RK₁检测限约为0.8×10^-3μg，定量限约为2.5×10^-3μg，灵敏度高。

2.5线性关系

配制约1mg/mL的人参皂苷RK₁母液，采用稀释法配制六个不同浓度的线性溶液，最低浓度约为定量限浓度，最高浓度约为0.5mg/mL。分别精密量取各线性溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度对峰面积作图，结果人参皂苷RK₁在该色谱条件下线性良好，线性方程和回归系数为：Y＝1835.4 X-56.5，R²＝0.9999。

2.6精密度

精密称取人参皂苷RK₁对照品适量，加流动相溶解配制成浓度约为1μg/mL的人参皂苷 RK₁溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，连续进样5针，记录色谱图。人参皂苷RK₁峰面积的RSD为0.45％，精密度良好。

2.7溶液稳定性

精密称取人参皂苷RK₁对照品适量，加流动相溶解配制成浓度约为1μg/mL的人参皂苷 RK₁溶液，于0、4、8、12、24h精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。人参皂苷RK₁不同时间点峰面积的RSD为0.86％，24小时稳定性良好。

2.8加样回收率

精密称取同一批人参皂苷RZ₁原料9份，每3份1组，每份约10mg，置于10mL量瓶中，精密加入不同量的人参皂苷RK₁，使人参皂苷RK₁的加入量分别为5μg、10μg、15μg，用流动相溶解定容，摇匀，作为回收率试验溶液进行分析，计算回收率。结果人参皂苷RK₁的平均回收率为100.4％(RSD＝1.35％)，符合要求。

2.9人参皂苷RZ₁原料中RK₁含量测定

取人参皂苷RZ₁原料适量，精密称定，加流动相溶解并稀释至每1mL中含1mg的溶液，摇匀滤过，作为供试品溶液。另精密称取人参皂苷RK₁适量，加流动相溶解并稀释至每1mL 中含1μg的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与人参皂苷RK₁保留时间相同的杂质峰，按外标法以峰面积计算人参皂苷RK₁的含量。3批人参皂苷RZ₁原料中检出人参皂苷RK₁分别为0.18％，0.21％，0.22％。

实施例2：流动相为乙腈水溶液

1、试验材料

Waters2695液相色谱仪(美国Waters)；

赛多利斯电子天平(德国Sartorius)；

色谱柱：Waters XBridge^TM C18色谱柱(5μm,4.6×250mm；美国Waters)；

人参皂苷RZ₁和人参皂苷RK₁标准品自制，纯度均大于98％；

乙腈、85％磷酸、三乙胺为色谱纯，水为去离子水，羧甲基-β-环糊精为分析纯。

2、试验方法和试验结果

2.1溶液配制

色谱峰定位溶液：配制含有人参皂苷RZ₁或人参皂苷RK₁的单标溶液，浓度0.1mg/mL。

系统适用性溶液：配制人参皂苷RZ₁和人参皂苷RK₁浓度为0.5mg/mL的混标溶液作为系统适用性溶液。

供试品溶液：精密称取人参皂苷RZ₁原料用流动相溶解配制成浓度为1.0mg/mL的溶液。

2.2色谱条件

色谱柱：Waters XBridge^TM C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；

流动相：由0.2％磷酸水溶液(85％磷酸2mL+去离子水998mL)与乙腈按照体积比52:48 混合而成，添加羧甲基-β-环糊精至浓度为0.1g/L，用三乙胺调节pH至7.2，等度洗脱；

柱温：40℃；

检测波长：203nm；

进样量：10μL。

2.3系统适用性

精密量取色谱峰定位溶液、系统适用性溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。该色谱条件下人参皂苷RZ₁和人参皂苷RK₁可基线分离，出峰顺序依次为人参皂苷RZ₁、人参皂苷 RK₁，二者分离度大于2.0，峰形符合规定。

2.4检测限和定量限

精密称取人参皂苷RK₁对照品适量，加流动相溶解并稀释至峰高约为基线噪音的3倍、 10倍。人参皂苷RK₁检测限约为1.0×10^-3μg，定量限约为3.0×10^-3μg，灵敏度高。

2.5线性关系

配制约1mg/mL的人参皂苷RK₁母液，采用稀释法配制六个不同浓度的线性溶液，最低浓度约为定量限浓度，最高浓度约为0.5mg/mL。分别精密量取各线性溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度对峰面积作图，结果人参皂苷RK₁在该色谱条件下线性良好，线性方程和回归系数为：Y＝1742.4 X-63.2，R²＝0.9999。

2.6精密度

精密称取人参皂苷RK₁对照品适量，加流动相溶解配制成浓度约为1μg/mL的人参皂苷 RK₁溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，连续进样5针，记录色谱图。人参皂苷RK₁峰面积的RSD为0.53％，精密度良好。

2.7溶液稳定性

精密称取人参皂苷RK₁对照品适量，加流动相溶解配制成浓度约为1μg/mL的人参皂苷 RK₁溶液，于0、4、8、12、24h精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。人参皂苷RK₁不同时间点峰面积的RSD为0.75％，24小时稳定性良好。

2.8加样回收率

精密称取同一批人参皂苷RZ₁原料9份，每3份1组，每份约10mg，置于10mL量瓶中，精密加入不同量的人参皂苷RK₁，使人参皂苷RK₁的加入量分别为5μg、10μg、15μg，用流动相溶解定容，摇匀，作为回收率试验溶液进行分析，计算回收率。结果人参皂苷RK₁的平均回收率为99.9％(RSD＝1.28％)，符合要求。

2.9人参皂苷RZ₁原料中RK₁含量测定

取人参皂苷RZ₁原料适量，精密称定，加流动相溶解并稀释至每1mL中含1mg的溶液，摇匀滤过，作为供试品溶液。另精密称取人参皂苷RK₁适量，加流动相溶解并稀释至每1mL 中含1μg的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与人参皂苷RK₁保留时间相同的杂质峰，按外标法以峰面积计算人参皂苷RK₁的含量。3批人参皂苷RZ₁原料中检出人参皂苷RK₁分别为0.17％，0.22％，0.22％。

本领域技术人员应当知道，上述具体实施方式仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不局限于上述具体实施方式。

Claims (5)

1.一种测定人参皂苷RZ₁原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK₁的HPLC方法，其特征在于：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相由0.2％磷酸水溶液与甲醇按照体积比44:56混合而成，用三乙胺调节pH至7.2，还含有浓度为0.1g/L的羧甲基-β-环糊精，等度洗脱；或流动相由0.2％磷酸水溶液与乙腈按照体积比52:48混合而成，用三乙胺调节pH至7.2，还含有浓度为0.1g/L的羧甲基-β-环糊精，等度洗脱。

2.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于，色谱参数如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相：由0.2％磷酸水溶液与甲醇按照体积比44:56混合而成，用三乙胺调节pH至7.2，还含有浓度为0.1g/L的羧甲基-β-环糊精，等度洗脱；

流速：1.0mL/min；

柱温：38-42℃；

检测波长：203nm。

3.根据权利要求2所述的HPLC方法，其特征在于：柱温为40℃。

4.根据权利要求1所述的HPLC方法，其特征在于，色谱参数如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相：由0.2％磷酸水溶液与乙腈按照体积比52:48混合而成，用三乙胺调节pH至7.2，还含有浓度为0.1g/L的羧甲基-β-环糊精，等度洗脱；

流速：1.0mL/min；

柱温：38-42℃；

检测波长：203nm。

5.根据权利要求4所述的HPLC方法，其特征在于：柱温为40℃。