CN103884786A

CN103884786A - 一种同时测定16种人参皂苷单体hplc方法

Info

Publication number: CN103884786A
Application number: CN201410022314.1A
Authority: CN
Inventors: 郜玉钢; 郭冲; 张连学; 臧埔; 何忠梅; 赵岩; 祝洪燕; 王立岩; 杨鹤; 刘双利
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2034-01-20
Also published as: CN103884786B

Abstract

本发明提供一种同时测定Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol16种人参皂苷单体HPLC方法，测定范围包括含有上述1种以上皂苷单体的人参、西洋参等药用植物及其制剂；与现有技术相比，本发明同时测定的人参皂苷单体种类多达16种，提高了效率；本发明只用乙腈和水作流动相，解决了磷酸盐对色谱柱损耗大,系统清洗麻烦等问题；本发明建立的HPLC方法线性范围广、方法准确、重现性好、快捷简便、稳定可靠。本发明为人参、西洋参等药用植物及其制剂的质量控制提供理论依据。

Description

一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法

技术领域

本发明涉及人参、西洋参等药用植物及其制剂中人参皂苷单体含量的测定方法，属于对中药材及其制剂进行质量控制的技术领域。

背景技术

人参是我国地道药材中应用最广泛的代表，人参皂苷是人参的主要药效成分，人参皂苷具有增强记忆力，提高免疫力，改善心血管，调节内分泌，延缓衰老和抗肿瘤等功能，人参皂苷的含量测定已经成为国内外研究的热点。

随着社会的发展，对于药品质量控制的要求也越来越高，但由于人参化学成分复杂，人参皂苷种类多样，现已确定并分离的人参皂苷化合物单体有50余种，根据苷元的不同，人参皂苷被分为原人参二醇类皂苷、原人参三醇类皂苷及齐墩果酸类皂苷。因此建立同时、多种、快捷、方便、可靠的人参皂苷检测方法对人参及其制剂的质量控制具有重要意义。

虽然大量研究报道了人参皂苷单体含量的HPLC测定方法，但大多为同时测定12种以下人参皂苷单体含量方法，尚未见同时测定16种人参皂苷单体含量的报道。

本发明提供一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法，所测定的16种人参皂苷单体为Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol，测定范围包括含有上述1种以上皂苷单体的人参、西洋参等药用植物及其制剂；由以下步骤完成：对照品溶液的制备，样品溶液的制备，16种人参皂苷含量测定标准曲线的建立，样品中人参皂苷含量的测定；与现有技术相比，本专利同时测定的人参皂苷单体种类多达16种，提高了效率；本专利方法只用乙腈和水作流动相，解决了磷酸盐对色谱柱损耗大,系统清洗麻烦等问题，流动相配制方便，简便了操作；本专利方法色谱柱为普通色谱柱，便于购买，降低成本；本专利方法16种人参皂苷单体在0.5～40μg范围内均呈良好的线性关系、线性范围广，方法准确、重现性好、快捷简便、稳定可靠。本专利方法能够更好地分析人参皂苷单体的含量，为人参、西洋参等药用植物及其制剂的质量控制提供理论依据。

发明内容：

1、一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法，所测定的16种人参皂苷单体分别为Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol，测定样品范围包括含有上述皂苷中1种以上的人参、西洋参等药用植物及其制剂；由以下步骤完成：

（1）对照品溶液的制备

分别精密称取16种人参皂苷单体对照品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、CK、Rh2、protopanaxadiol5mg，至于5ml容量瓶，用甲醇溶解并定容，制得1mg﹒ml-1的溶液；

（2）样品溶液的制备

分为固体样品和液体样品两种：精密称取固体样品人参及其制剂粉末1g，用滤纸包好，放置索氏提取器中，加适量石油醚，80℃回流提取8h，弃去石油醚液，加适量甲醇，80℃回流提取10h，收集提取液,加色谱纯甲醇定容，用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用；液体样品直接用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用。

（3）16种人参皂苷含量测定标准曲线的建立

色谱条件：C18色谱柱为150×4.6mm，5μm；流动相为乙腈和水，流动相梯度洗脱条件：0min为18%乙腈，40min为21%乙腈，42min为26%乙腈，46min为32%乙腈，66min为33.5%乙腈，71min为38%乙腈，86min为65%乙腈，91min为65%乙腈，96min为85%乙腈，103min为85%乙腈，105min为18%乙腈，106min为18%乙腈；流速1.0mL·min-1；检测波长203nm，柱温35℃；将1.0mg﹒ml-1的对照品溶液进样2uL，4uL，6uL，10uL,16uL,20uL,建立标准曲线，计算每个皂苷单体线性回归方程；

（4）样品中人参皂苷含量的测定

按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定，制备的样品溶液进样量为20uL,利用线性回归方程，计算样品中16种人参皂苷含量。

附图说明

图1是人参皂苷单体对照品混标与人参及人参制剂样品色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法，本发明领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改进工艺参数实现，所有类似的替换和改动对本领域技术人员是显而易见的，都视为本发明。本发明所述一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法

1、材料

日本岛津LC-2010A高效液相色谱仪，配有LC-2010A型液相色谱泵，LC-2010A型自动进样器，CLASS-vP色谱工作站；日本岛津AUY220电子分析天平，昆山舒美KQ-250DV超声波清洗器。

人参药材购自于吉林省抚松县，经张连学教授鉴定为人参；人参茎叶采自吉林农业大学药植园，生脉散为实验室自制；生脉饮（吉林敖东延边药业股份有限公司，批号Z22024479）。

人参皂苷对照品Rg1（201022），Re（201035），Rf（201007），Rb1(201058)、Rg2(201023)，Rc(201069)，Rb2(201078)，Rb3(201029)，F1(201225)，Rd(201018)，F2(201255)，Rg3(201237)，protopanaxatriol(201206)，Compound K(201243)，Rh2(2012009)，protopanaxadiol(201235)购自于吉林大学天然药物化学实验室，含量均在98%以上，乙腈、甲醇(均为色谱纯)；水为娃哈哈超纯水；其余试剂为分析纯。

2、方法

2.1对照品溶液的制备

分别精密称取16种人参皂苷对照品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol各5mg，加甲醇制成上述16种人参皂苷的质量浓度分别为1.0，0.94，1.12，1.0，0.98，0.94，0.96，0.96，1.12，0.88，0.86，1.0，1.06，0.96，1.04，0.94mg·ml-1的对照品溶液，0.45μm滤膜过滤，备用。

2.2样品溶液的制备

分为固体样品和液体样品两种：精密称取固体样品人参及其制剂粉末1g，用滤纸包好，放置索氏提取器中，加适量石油醚，80℃回流提取4h，弃去石油醚液，加适量甲醇，80℃回流提取10h，收集提取液,加色谱纯甲醇定容，用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用；液体样品直接用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用。

2.316种人参皂苷含量测定标准曲线的建立

色谱条件：C18色谱柱为150×4.6mm，5μm；流动相为乙腈和水，流动相梯度洗脱条件：0min为18%乙腈，40min为21%乙腈，42min为26%乙腈，46min为32%乙腈，66min为33.5%乙腈，71min为38%乙腈，86min为65%乙腈，91min为65%乙腈，96min为85%乙腈，103min为85%乙腈，105min为18%乙腈，106min为18%乙腈；流速1.0mL·min^-1；检测波长203nm，柱温35℃；将1.0mg﹒ml^-1的对照品溶液进样2uL，4uL，6uL，10uL,16uL,20uL,建立标准曲线，以进样中人参皂苷质量（Y）对峰面积（X）作图，计算每个皂苷单体线性回归方程。精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验按常规方法进行。

2.4样品含量测定取人参、人参茎叶、生脉散、生脉饮按供试品溶液制备方法制成样品溶液，按2.3色谱条件进样分析，根据线性回归方程计算16种人参皂苷的含量。

3、结果

3.1色谱峰的归属

图1中，A是人参皂苷对照品，B是生晒参，C是人参茎叶，D是生脉散，E是生脉饮；图1中人参皂苷对照品从左到右1～16号峰分别代表Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol。由图1可见,根据单标对照品保留时间，保留时间分别为Rg1:35.744min、Re:37.706min、Rf:51.174min、Rb1:54.133min、Rg2:55.108min、Rc:56.263min、Rb2:59.083min2、Rb3:60.089min、F1：61.493min、Rd:66.602min、F2：78.779min、Rg3：81.297min、Protopanaxatriol：83.391min、Compound K：87.040min、Rh2：88.351min、Protopanaxadiol：101.596min，确定人参单体皂苷单体在混标中位置。从对照品溶液中可以检出16个单体人参皂苷单体,样品溶液中待检的单体人参皂苷单体也能和其他的杂峰分开，各组分的分离度良好。

3.2线性关系考察

分别精密称取对照品溶液2，4，6，10，16，20μL进样，以进样中人参皂苷质量（Y）对峰面积（X）作图，得到线性回归方程，见表1。本方法测定16种人参皂苷在0.38～22.40μg范围内呈良好的线性关系（r值均>0.9990(n=6)）。

表1人参皂苷单体的回归方程

3.3精密度试验

分别进对照品溶液20μL，重复进样6次，Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，F1，Rd，F2，Rg3，protopanaxatriol，Compound K，Rh2，protopanaxadiol峰面积的RSD分别为1.12%，1.54%，0.65%，1.36%，1.43%，1.3%，0.78%，1.35%，0.98%，0.78%，0.56%，1.29%，0.95%，1.06%，0.8%，0.75%，可见精密度良好。

3.4稳定性试验

在0，2，4，8，16，24h进样20μL，Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，F1，Rd，F2，Rg3，protopanaxatriol，Compound K，Rh2，protopanaxadiol峰面积的RSD分别为1.65%，1.73%，1.92%，1.53%，1.6%，2.05%，1.49%，1.82%，1.5%，1.39%，1.46%，1.38%，1.43%，2.18%，1.34%，1.91%，说明供试品溶液在24h内稳定。

3.5重复性试验

取同一批样品，按样品制备方法制备6份，分别进样20μL，Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，F1，Rd，F2，Rg3，protopanaxatriol，Compound K，Rh2，protopanaxadiol含量的RSD分别为0.12%，0.12%，1.22%，0.37%，1.14%，0.67%，0.40%，1.63%，1.90%，2.42%，0.42%，0.41%，1.39%，1.66%，1.86%，0.97%，均小于2.5%，重复性较好。

3.6回收率试验

按本方法液相色谱条件，精密移取一定量的对照品溶液加入到样品中，按本方法液相色谱条件进行操作，与样品溶液同时测定。Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，F1，Rd，F2，Rg3，protopanaxatriol，Compound K，Rh2，protopanaxadiol回收率分别为98.71%，99.35%，100.23%，96.46%，97.30%，99.26%，95.37%，101.33%，99.69%，97.23%，100.11%，96.88%，98.37%，97.78%，99.65%，101.21%，RSD分别为1.37%，0.89%，1.78%，1.25%，1.81%，0.89%，1.26%，1.38%，1.05%，0.67%，1.22%，1.07%，1.49%，1.03%，0.73%，1.29%。3.7样品含量测定

取人参、人参茎叶、生脉散、生脉饮按供试品溶液制备方法制成样品溶液，按2.3色谱条件进样分析，根据线性回归方程计算16种人参皂苷的含量，见表2。不同样品中皂苷单体种类和含量不同，本方法可为人参、西洋参等药用植物及其制剂的质量控制提供理论依据。表2人参及其制剂中16种人参皂苷含量（n=6）%

Claims

1.一种同时测定16种人参皂苷单体HPLC方法，所测定的16种人参皂苷单体分别为Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、Compound K、Rh2、protopanaxadiol，测定样品范围包括含有上述皂苷中1种以上的人参、西洋参等药用植物及其制剂；由以下步骤完成：

（1）对照品溶液的制备分别精密称取16种人参皂苷单体对照品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3、protopanaxatriol、CK、Rh2、protopanaxadiol 5mg，至于5ml容量瓶，用甲醇溶解并定容，制得1mg﹒ml^-1的溶液；

（2）样品溶液的制备分为固体样品和液体样品两种：精密称取固体样品人参及其制剂粉末1g，用滤纸包好，放置索氏提取器中，加适量石油醚，80℃回流提取4h，弃去石油醚液，加适量甲醇，80℃回流提取10h，收集提取液,加色谱纯甲醇定容，用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用；液体样品直接用0.45μm滤膜过滤入样品瓶备用。

（3）16种人参皂苷单体含量测定标准曲线的建立色谱条件：C18色谱柱为150×4.6mm，5μm；流动相为乙腈和水，流动相梯度洗脱条件：0min为18%乙腈，40min为21%乙腈，42min为26%乙腈，46min为32%乙腈，66min为33.5% 乙腈，71min为38%乙腈，86min为65%乙腈， 91min为65%乙腈，96min为85%乙腈，103min为85%乙腈，105min为18%乙腈，106min为18%乙腈；流速1.0 mL·min^-1；检测波长 203 nm，柱温35℃；将1.0mg﹒ml^-1的对照品溶液进样2uL，4uL，6uL，10uL,16uL,20uL,建立标准曲线，计算每个皂苷单体线性回归方程；

（4）样品中人参皂苷含量的测定按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定，制备的样品溶液进样量为20uL,利用线性回归方程，计算样品中16种人参皂苷含量。