一种测定人参皂苷RZ1原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK1
的方法
技术领域
本发明涉及药物分析,尤其涉及一种测定人参皂苷RZ1原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK1的方法。
背景技术
申请人研究发现人参皂苷RZ1可有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化。人参皂苷RZ1最早由韩国学者Sang Myung LEE从加热炮制的人参中分离得到(参考文献:Ginsenosides from Heat Processed Ginseng,Chem Pharm Bull,2009),生源上由人参皂苷RG3脱水而得。
人参皂苷RZ1有两个同分异构体,即人参皂苷RK1和RG5,三者化学结构式及生源降解途径如下所示:
人参皂苷RG3的C20羟基与C21氢发生消除反应得到人参皂苷RK1,人参皂苷RG3的C20羟基与C22氢发生消除反应得到人参皂苷RG5和RZ1,人参皂苷RK1与RG5、RZ1为双键位置异构,人参皂苷RG5与RZ1为双键顺反异构。
其中,人参皂苷RZ1与人参皂苷RK1在液相色谱的保留行为非常相似,极难分离。以上述人参皂苷RZ1最早发现者Sang Myung LEE为例(参考文献:Ginsenosides from HeatProcessed Ginseng,Chem Pharm Bull,2009),研究者采用了二维液相色谱才将人参皂苷RZ1与人参皂苷RK1分开。但是,本领域技术人员知道,二维液相色谱发展非常不成熟,重现性差,不能满足药物质量控制的严格要求。各国药典对二维液相色谱都非常慎重,目前仅有美国药典收载了个别极其难以分离的品种。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种测定人参皂苷RZ1原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK1的方法,以使用常规的一维液相色谱就实现人参皂苷RZ1原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK1的检测控制。
为实现上述目的,本发明提供了以下技术方案:
一种测定人参皂苷RZ1原料或制剂中异构体杂质人参皂苷RK1的HPLC方法,固定相为十八烷基硅烷键合硅胶,流动相添加有羧甲基-β-环糊精。
在一个具体实施例中,所述流动相为甲醇水溶液或乙腈水溶液,其中添加有适量浓度的羧甲基-β-环糊精。
在一个具体实施例中,HPLC色谱参数如下:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱;
流动相:由0.2%磷酸水溶液与甲醇按照体积比44:56混合而成,用三乙胺调节pH至7.2,还含有浓度为0.1g/L的羧甲基-β-环糊精,等度洗脱;
流速:1.0mL/min;
柱温:38-42℃;
检测波长:203nm。
在一个具体实施例中,柱温为40℃。
在一个具体实施例中,HPLC色谱参数如下:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱;
流动相:由0.2%磷酸水溶液与乙腈按照体积比52:48混合而成,用三乙胺调节pH至7.2,还含有浓度为0.1g/L的羧甲基-β-环糊精,等度洗脱;
流速:1.0mL/min;
柱温:38-42℃;
检测波长:203nm。
在一个具体实施例中,柱温为40℃。
羧甲基-β-环糊精作为反相高效液相色谱流动相添加剂用于分离人参皂苷RZ1和人参皂苷RK1的用途。
本发明提供的HPLC方法通过在流动相中添加异构体选择剂羧甲基-β-环糊精,仅使用等度洗脱就可以有效将人参皂苷RZ1和人参皂苷RK1分离,分离度高。
附图说明
图1是人参皂苷RZ1和人参皂苷RK1在实施例1色谱条件下的分离效果图,A图流动相中含有羧甲基-β-环糊精,B图流动相中不含有羧甲基-β-环糊精。
具体实施方式
实施例1:流动相为甲醇水溶液
1、试验材料
Waters2695液相色谱仪(美国Waters);
赛多利斯电子天平(德国Sartorius);
色谱柱:Waters XBridgeTM C18色谱柱(5μm,4.6×250mm;美国Waters);
人参皂苷RZ1和人参皂苷RK1标准品自制,纯度均大于98%;
甲醇、85%磷酸、三乙胺为色谱纯,水为去离子水,羧甲基-β-环糊精为分析纯。
2、试验方法和试验结果
2.1溶液配制
色谱峰定位溶液:配制含有人参皂苷RZ1或人参皂苷RK1的单标溶液,浓度0.1mg/mL。
系统适用性溶液:配制人参皂苷RZ1和人参皂苷RK1浓度为0.5mg/mL的混标溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液:精密称取人参皂苷RZ1原料用流动相溶解配制成浓度为1.0mg/mL的溶液。
2.2色谱条件
色谱柱:Waters XBridgeTM C18色谱柱(5μm,4.6×250mm);
流动相:由0.2%磷酸水溶液(85%磷酸2mL+去离子水998mL)与甲醇按照体积比44:56混合而成,添加羧甲基-β-环糊精至浓度为0.1g/L,用三乙胺调节pH至7.2,等度洗脱;
柱温:40℃;
检测波长:203nm;
进样量:10μL。
2.3系统适用性
精密量取色谱峰定位溶液、系统适用性溶液10μL注入液相色谱仪,记录色谱图。系统适用性溶液色谱图如图1A,该色谱条件下人参皂苷RZ1和人参皂苷RK1可基线分离,出峰顺序依次为人参皂苷RZ1、人参皂苷RK1,二者分离度大于2.0。
图1B作为对比,流动相中不添加羧甲基-β-环糊精,其他色谱参数相同,结果人参皂苷RK1与人参皂苷RZ1共同出峰。
2.4检测限和定量限
精密称取人参皂苷RK1对照品适量,加流动相溶解并稀释至峰高约为基线噪音的3倍、10倍。人参皂苷RK1检测限约为0.8×10-3μg,定量限约为2.5×10-3μg,灵敏度高。
2.5线性关系
配制约1mg/mL的人参皂苷RK1母液,采用稀释法配制六个不同浓度的线性溶液,最低浓度约为定量限浓度,最高浓度约为0.5mg/mL。分别精密量取各线性溶液10μL注入液相色谱仪,记录色谱图。以浓度对峰面积作图,结果人参皂苷RK1在该色谱条件下线性良好,线性方程和回归系数为:Y=1835.4 X-56.5,R2=0.9999。
2.6精密度
精密称取人参皂苷RK1对照品适量,加流动相溶解配制成浓度约为1μg/mL的人参皂苷RK1溶液,精密量取10μL注入液相色谱仪,连续进样5针,记录色谱图。人参皂苷RK1峰面积的RSD为0.45%,精密度良好。
2.7溶液稳定性
精密称取人参皂苷RK1对照品适量,加流动相溶解配制成浓度约为1μg/mL的人参皂苷RK1溶液,于0、4、8、12、24h精密量取10μL注入液相色谱仪,记录色谱图。人参皂苷RK1不同时间点峰面积的RSD为0.86%,24小时稳定性良好。
2.8加样回收率
精密称取同一批人参皂苷RZ1原料9份,每3份1组,每份约10mg,置于10mL量瓶中,精密加入不同量的人参皂苷RK1,使人参皂苷RK1的加入量分别为5μg、10μg、15μg,用流动相溶解定容,摇匀,作为回收率试验溶液进行分析,计算回收率。结果人参皂苷RK1的平均回收率为100.4%(RSD=1.35%),符合要求。
2.9人参皂苷RZ1原料中RK1含量测定
取人参皂苷RZ1原料适量,精密称定,加流动相溶解并稀释至每1mL中含1mg的溶液,摇匀滤过,作为供试品溶液。另精密称取人参皂苷RK1适量,加流动相溶解并稀释至每1mL中含1μg的溶液,作为对照品溶液。分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各10μL注入液相色谱仪,记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与人参皂苷RK1保留时间相同的杂质峰,按外标法以峰面积计算人参皂苷RK1的含量。3批人参皂苷RZ1原料中检出人参皂苷RK1分别为0.18%,0.21%,0.22%。
实施例2:流动相为乙腈水溶液
1、试验材料
Waters2695液相色谱仪(美国Waters);
赛多利斯电子天平(德国Sartorius);
色谱柱:Waters XBridgeTM C18色谱柱(5μm,4.6×250mm;美国Waters);
人参皂苷RZ1和人参皂苷RK1标准品自制,纯度均大于98%;
乙腈、85%磷酸、三乙胺为色谱纯,水为去离子水,羧甲基-β-环糊精为分析纯。
2、试验方法和试验结果
2.1溶液配制
色谱峰定位溶液:配制含有人参皂苷RZ1或人参皂苷RK1的单标溶液,浓度0.1mg/mL。
系统适用性溶液:配制人参皂苷RZ1和人参皂苷RK1浓度为0.5mg/mL的混标溶液作为系统适用性溶液。
供试品溶液:精密称取人参皂苷RZ1原料用流动相溶解配制成浓度为1.0mg/mL的溶液。
2.2色谱条件
色谱柱:Waters XBridgeTM C18色谱柱(5μm,4.6×250mm);
流动相:由0.2%磷酸水溶液(85%磷酸2mL+去离子水998mL)与乙腈按照体积比52:48混合而成,添加羧甲基-β-环糊精至浓度为0.1g/L,用三乙胺调节pH至7.2,等度洗脱;
柱温:40℃;
检测波长:203nm;
进样量:10μL。
2.3系统适用性
精密量取色谱峰定位溶液、系统适用性溶液10μL注入液相色谱仪,记录色谱图。该色谱条件下人参皂苷RZ1和人参皂苷RK1可基线分离,出峰顺序依次为人参皂苷RZ1、人参皂苷RK1,二者分离度大于2.0,峰形符合规定。
2.4检测限和定量限
精密称取人参皂苷RK1对照品适量,加流动相溶解并稀释至峰高约为基线噪音的3倍、10倍。人参皂苷RK1检测限约为1.0×10-3μg,定量限约为3.0×10-3μg,灵敏度高。
2.5线性关系
配制约1mg/mL的人参皂苷RK1母液,采用稀释法配制六个不同浓度的线性溶液,最低浓度约为定量限浓度,最高浓度约为0.5mg/mL。分别精密量取各线性溶液10μL注入液相色谱仪,记录色谱图。以浓度对峰面积作图,结果人参皂苷RK1在该色谱条件下线性良好,线性方程和回归系数为:Y=1742.4 X-63.2,R2=0.9999。
2.6精密度
精密称取人参皂苷RK1对照品适量,加流动相溶解配制成浓度约为1μg/mL的人参皂苷RK1溶液,精密量取10μL注入液相色谱仪,连续进样5针,记录色谱图。人参皂苷RK1峰面积的RSD为0.53%,精密度良好。
2.7溶液稳定性
精密称取人参皂苷RK1对照品适量,加流动相溶解配制成浓度约为1μg/mL的人参皂苷RK1溶液,于0、4、8、12、24h精密量取10μL注入液相色谱仪,记录色谱图。人参皂苷RK1不同时间点峰面积的RSD为0.75%,24小时稳定性良好。
2.8加样回收率
精密称取同一批人参皂苷RZ1原料9份,每3份1组,每份约10mg,置于10mL量瓶中,精密加入不同量的人参皂苷RK1,使人参皂苷RK1的加入量分别为5μg、10μg、15μg,用流动相溶解定容,摇匀,作为回收率试验溶液进行分析,计算回收率。结果人参皂苷RK1的平均回收率为99.9%(RSD=1.28%),符合要求。
2.9人参皂苷RZ1原料中RK1含量测定
取人参皂苷RZ1原料适量,精密称定,加流动相溶解并稀释至每1mL中含1mg的溶液,摇匀滤过,作为供试品溶液。另精密称取人参皂苷RK1适量,加流动相溶解并稀释至每1mL中含1μg的溶液,作为对照品溶液。分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各10μL注入液相色谱仪,记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与人参皂苷RK1保留时间相同的杂质峰,按外标法以峰面积计算人参皂苷RK1的含量。3批人参皂苷RZ1原料中检出人参皂苷RK1分别为0.17%,0.22%,0.22%。
本领域技术人员应当知道,上述具体实施方式仅用于解释本发明,本发明的保护范围并不局限于上述具体实施方式。