CN106290695A - 地奈德及相关杂质的分离与测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种地奈德及相关杂质的分离与测定方法；所述的分离方法是在固定相的基础上，采用乙腈水溶液为流动相进行洗脱分离，所述固定相的极性小于流动相的极性，该方法有效的分离地奈德及相关杂质，有助于地奈德的分离纯化；基于该分离方法的反相HPLC法是采用高效液相色谱仪分析测定地奈德供试品溶液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化或自身对照法计算各杂质的相对含量，所采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱，采用的流动相为乙腈水溶液，该方法不仅能够实现地奈德及相关杂质的有效分离，还克服了USP38版地奈德原料药质量标准存在的缺陷，更适用于地奈德原料药及其制剂的质量控制。

Description

地奈德及相关杂质的分离与测定方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种地奈德及相关杂质的分离与测定方法。

背景技术

地奈德分子式为C₂₄H₃₂O₆，化学名为11β,21-二羟基-16α,17-[(1-甲基亚乙基)-二氧]孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，其结构式如下：

地奈德属糖皮质激素类药物，具有抗炎、抗过敏、止痒及减少渗出等作用；可以减轻、防止组织对炎症的反应，能消除局部非感染性炎症引起的发热、发红及肿胀，从而减轻炎症的表现；具有免疫抑制作用：防止或抑制细胞免疫反应、抑制初次免疫应答。地奈德的外用制剂可用于多种激素敏感性皮肤病的治疗如接触性皮炎、神经性皮炎、脂溢性皮炎、湿疹、银屑病、扁平苔藓、单纯性苔藓、汗疱症及瘙痒症等。

地奈德的合成方法已在多篇专利文献中公开，例如中国专利申请号为201010221376.7的专利文献公开了一种地奈德的合成方法，以16羟基泼尼松龙作为起始原料，酸催化下与丙酮反应制备地奈德；中国专利申请号为201410178879.9的专利文献公开了一种地奈德的合成方法，以醋酸泼尼松为原料经过消除、氧化、缩合、还原、水解制得地奈德。

因地奈德的合成路线均较长，且地奈德易分解，水溶液、酸、碱及光照条件下尤其容易分解，从而产生地奈德相关杂质。在USP38地奈德质量标准中公布了常见的地奈德工艺杂质有8种，分别为16-羟基泼尼松龙、泼尼松龙、乙二醛地奈德、16-烯去羟泼尼松龙、二氢地奈德、环氧地奈德、9-溴地奈德、乙酰地奈德。另外，本申请的发明人发现地奈德在酸、碱及光照条件下不稳，其中碱降解主要生成5个降解杂质，酸降解主要生成3个降解杂质，光降解主要生成1个降解杂质。

地奈德主要的相关杂质列表如下：

无论是地奈德合成过程中产生的工艺杂志还是降解产生的杂质，去除不完全最终会影响药物的纯度和质量。因此，实现地奈德及相关杂质的分离和测定对原料药及制剂的生产和贮存具有重要的意义。

USP38版地奈德原料药质量标准采用反相高效液相色谱法来检测有关物质，本申请的发明人用这此标准用于地奈德原料药及其制剂的相关杂质的检测均存在一定的局限性，原因在于：(1)USP38版地奈德原料药质量标准中规定色谱柱填料粒径为2.6μm，整个系统压力较高，高达28MPa；(2)采用USP38版地奈德原料药质量标准中色谱条件分析，地奈德主峰与地奈德降解杂质分离较差，分离度小于1.5；(3)USP38版地奈德原料药质量标准中色谱系统规定色谱柱温及进样器温度均为20℃，条件较为苛刻，耐用性较差。

发明内容

基于上述色谱法测定地奈德相关杂质的缺点，本申请的发明人经过长期的研究探索，发现当以乙腈水溶液为流动相，采用极性小于流动相的固定相，进行洗脱分离，可以有效的分离上述的工艺杂质和降解杂质，有助于地奈德的分离纯化；另外，将该方法应用于高效液相色谱，不仅能够实现地奈德及相关杂质的有效分离，而且能够准确测定地奈德及相关杂质的含量，除此之外，将该方法应用于高效液相色谱，还解决了USP38版地奈德原料药质量标准存在的上述问题，更适用于地奈德原料药及其制剂的质量控制。

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种分离地奈德及相关杂质的方法，该方法可以有效的将地奈德与主要的工艺杂质和降解杂质分离，有助于地奈德的分离纯化。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种分离地奈德及相关杂质的方法，所述的方法是在固定相的基础上，采用乙腈水溶液为流动相进行洗脱分离，所述固定相的极性小于流动相的极性。

进一步，所述的分离地奈德及相关杂质的方法，所述固定相优选为十八烷基硅烷键合硅胶。

本发明所述的分离地奈德及相关杂质的方法，其中所述相关杂质为地奈德合成过程中产生的工艺杂质和/或地奈德降解产生的杂质。

进一步，所述的分离地奈德及相关杂质的方法，所述乙腈水溶液中还含有三氟乙酸和/或磷酸。

进一步，所述三氟乙酸和/或磷酸与水的体积比为0.05-0.2：100，优选所述三氟乙酸和/或磷酸与水的体积比为0.1：100。

本发明的另一目的在于提供一种反相HPLC法分离测定地奈德及相关杂质的方法，该方法不仅能够实现地奈德及相关杂质的有效分离，而且能够准确测定地奈德及相关杂质的含量，该方法克服了现有的色谱法存在的缺陷，能更方便、准确、高效的分离测定地奈德及相关杂质。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种反相HPLC法分离测定地奈德及相关杂质的方法，所述反相HPLC法具体为：制备地奈德供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析测定地奈德供试品溶液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化或自身对照法计算各杂质的相对含量；所述反相HPLC法采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱，采用的流动相为乙腈水溶液，所采用的色谱柱固定相的极性小于流动相的极性。

本发明所采用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，当将该固定相用于液相色谱中，即液相色谱的色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶进行填料，硅胶填料粒径可以为3-5μm，优选5μm。色谱柱的长度可以为150mm-250mm，优选用250mm。并且色谱柱的柱温可以控制为20-30℃，优选为25℃，而进样器的温度为室温即可操作。检测器为紫外检测器，DAD检测器和VWD检测器均适用，检测波长为254nm。

进一步，所述的方法，优选采用流动相乙腈水溶液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的条件为：0min，水与乙腈的体积比为75:25；25min，水与乙腈的体积比为40:60；30min，水与乙腈的体积比为20:80；35min，水与乙腈的体积比为20:80；35.01min，水与乙腈的体积比为75:25；42min，水与乙腈的体积比为75:25。

优选的，所述乙腈水溶液中还含有三氟乙酸和/或磷酸，所述三氟乙酸和/或磷酸与水的体积比为0.05-0.2:100，优选所述三氟乙酸和/或磷酸与水的体积比为0.1:100。

进一步，所述的方法，所述流动相的流速为0.9-1.1ml/min，优选1.0ml/min。

本发明所述的一种反相HPLC法分离测定地奈德及相关杂质的方法中，在一个具体实施例中，采用如下的计算方法得到各相关杂质的含量：

总杂质＝Σ单个杂质含量

式中：A_X—测试样品中各相关杂质的峰面积；

A_r—对照溶液中地奈德峰面积。

本发明还提供了一种用于洗脱分离地奈德及相关杂质的洗脱液，所述洗脱液为含有三氟乙酸和/或磷酸的乙腈水溶液，所述三氟乙酸和/或磷酸与水的体积比为0.05-0.2:100。

本发明所述的反相HPLC法分离测定地奈德及相关杂质的方法可应用于地奈德原料药及地奈德制剂的质量控制。

所述的制剂包括但不限于地奈德乳膏、地奈德凝胶、地奈德洗剂和地奈德油膏。

本发明的有益效果在于：(1)本发明分离地奈德及相关杂质的方法，该方法可以有效的将地奈德与主要的工艺杂质和降解杂质分离，有助于地奈德的分离纯化。(2)本发明的反相HPLC法分离测定地奈德及相关杂质的方法，适用性好，专属性强，地奈德与各杂质分离较好，结果更准确、高效，克服了现有技术(USP38版地奈德原料药质量标准)测定地奈德及其制剂中相关杂质的缺点，可用于地奈德原料药及地奈德乳膏、地奈德凝胶、地奈德洗剂、地奈德油膏制备过程中杂质的检测和质量控制。

附图说明

图1为灵敏度检测的色谱图；

图2为采用本发明的方法检测地奈德乳膏的色谱图；

图3为采用本发明的方法检测地奈德乳膏空白基质的色谱图；

图4为采用本发明的方法检测USP地奈德混合杂质对照品的色谱图；

图5采用本发明的方法检测地奈德碱降解杂质的色谱图；

图6采用本发明的方法检测地奈德酸降解杂质的色谱图；

图7采用本发明的方法检测地奈德光照降解杂质的色谱图；

图8为采用USP38版地奈德原料药质量标准检测USP地奈德混合杂质对照品的色谱图；

图9为采用USP38版地奈德原料药质量标准检测地奈德碱降解杂质的色谱图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中，采用液相色谱方法分析时，需制备地奈德供试品溶液，当地奈德供试品为地奈德原料药时，地奈德原料药供试品溶液的制备方法为：取一定量的地奈德原料药，用0.1％磷酸水溶液-乙腈(体积比为60：40)超声使溶解并定量稀释成一定浓度作为地奈德原料药供试品溶液；然后精密量取1ml，置100ml棕色量瓶中，用0.1％磷酸水溶液-乙腈(体积比为60：40)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

当地奈德供试品为地奈德制剂时，如地奈德乳膏、地奈德凝胶、地奈德洗剂、地奈德油膏供试品溶液的制备方法为：取本品适量，置50ml棕色量瓶中，加0.1％磷酸乙腈(取磷酸1ml加至1000ml乙腈中，充分混匀)15ml，超声15分钟并不时振摇使完全分散，取出放冷，加氯化钠5g，摇匀，静置，取上层清液过滤，取滤液作为供试品溶液；然后精密量取1ml，置100ml棕色量瓶中，用0.1％磷酸乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

实施例1本发明HPLC分离检测方法的确定

基于采用USP38版地奈德原料药质量标准反相液相色谱法测定地奈德及其制剂有关杂质的局限性，本申请发明人经过反复筛选，最终确定本发明的反相HPLC法分离测定地奈德及相关杂质的方法具体为：制备地奈德供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析测定地奈德供试品溶液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化或自身对照法计算各杂质的相对含量；所述反相HPLC法采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱，采用的流动相为乙腈水溶液，所采用的色谱柱固定相的极性小于流动相的极性。

本发明的方法以十八烷基硅烷键合硅胶色为色谱柱填料，十八烷基硅烷键合硅胶的粒径为3-5μm，优选为5μm，而USP38版要求的粒径较小，对填料的要求更高。本发明的方法柱温为20-30℃，进样器温度为室温即可满足杂质峰之间的分离度要求，而USP38版要求柱温及进样器温度均为20℃，条件较为苛刻。另外，本发明的方法，系统压力小于12MPa，色谱系统耐用性好，而USP38版整个系统压力较高，高达28MPa，耐用性较差。本发明的方法对主峰与地奈德相关工艺杂质的分离良好，与USP38地奈德色谱系统相当；但本发明的方法对主峰与地奈德碱强制降解杂质的分离良好，优于USP38地奈德色谱系统。本发明的HPLC分离检测方法与USP38版对比见表1所示。

表1 本发明的HPLC分离检测方法与USP38版对比

本申请的发明人对上述的方法进行了优化，选择用不同厂家的十八烷基硅烷键合硅胶柱对本品杂质峰分离效果及主峰峰形均较理想，因此确定采用250mm×4.6mm，5μm规格的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，并采用流动相梯度洗脱进行地奈德及其制剂的有关物质检查，来提高检测专属性及灵敏度；将柱温设定为优选的25℃来改善杂质峰之间的分离度；同时为了提高对杂质的检测能力，将进样体积选择为10μl。

确定的最佳流动相梯度洗脱条件如下：

流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液(取三氟乙酸1.0ml加至1000ml水中，充分混匀)，流动相B为乙腈，流动相A与流动相B按下表2所列条件进行线性梯度洗脱：

表2 线性梯度洗脱程序

在本发明以下的实施例中，所采用的高效液相色谱仪器及色谱柱如下：

日本岛津SHIMADZU LC-20AT液相色谱仪，检测器：UV；色谱工作站：LCsolution，色谱柱：ODS柱(250mm×4.6mm，5μm)，检测波长为254nm，进样量为10μl；流速：1.0ml/min。

实施例2灵敏度的检测

称取地奈德对照品适量，用0.1％磷酸水溶液-乙腈(体积比为60：40)超声使溶解并稀释制成每1ml中约含0.25μg地奈德的溶液，作为灵敏度测试溶液。

精密量取上述灵敏度测试溶液10μl注入液相色谱仪，按照实施例1中的最佳的色谱条件进行测定，记录色谱图，如图1所示。由图1可以看出，灵敏度色谱图中，地奈德峰(S/N)大于10.0。图中，纵座标是峰面积(单位：mV/mAU)，横座标是时间(单位：min)，以下色谱图无特殊说明，纵座标均是峰面积(单位：mV/mAU)，横座标是时间(单位：min)。

实施例3地奈德乳膏及空白基质的检测

取本品15g，置50ml棕色量瓶中，加0.1％磷酸乙腈15ml，超声15min并不时振摇使凝胶完全分散，取出放冷，加氯化钠5g，摇匀，静置，取上层清液过滤，取滤液作为地奈德乳膏供试品溶液。同时取空白基质15g，置50ml棕色量瓶中，加0.1％磷酸乙腈15ml，超声15min并不时振摇使凝胶完全分散，取出放冷，加氯化钠5g，摇匀，静置，取上层清液过滤，取滤液作为空白基质供试品溶液。

分别精密量取供试品溶液和空白基质供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实施例1中确定的最佳色谱条件进行测定，记录色谱图。地奈德乳膏供试品溶液检测的色谱图如图2所示，图3为空白基质的检测色谱图。由图3可以看出，空白基质经过提取后，在本色谱系统中，辅料峰不干扰地奈德主峰及其有关物质的检测。

实施例4对USP地奈德杂质混合对照品的检测

考察本发明的方法对USP38地奈德质量标准中所述的USP地奈德杂质混合对照品的分离能力。取USP地奈德杂质对照品约7mg，置10ml量瓶中，加0.1％磷酸水溶液-乙腈(体积比为60：40)使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为USP地奈德杂质混合溶液。按照实施例1中的最佳的色谱条件进行测定，量取USP地奈德杂质混合溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，如图4所示。由图4可以看出，USP地奈德杂质混合对照品中各杂质均能有效分离，地奈德与邻近峰的分离度大于2.0，满足检测要求。对USP地奈德杂质对照品溶液的色谱图进行分析，按峰面积归一化法计算其含有的各杂质的相对含量，结果如表3所示。

表3 USP地奈德杂质对照品分离的试验结果

实施例5地奈德碱降解杂质的检测

地奈德在碱性环境下降解明显，故采用地奈德碱降解供试品溶液来考察色谱系统的专属性。取地奈德适量，置棕色50ml量瓶中，加乙腈15ml超声使溶解，再加1mol/L氢氧化钠溶液0.3ml，摇匀，于60℃水浴加热5min，取出，放冷，用0.1％磷酸水溶液-乙腈(体积比为60：40)稀释至刻度，摇匀，作为地奈德碱降解供试品溶液。按照实施例1中的最佳的色谱条件进行测定，量取地奈德碱降解供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，如图5所示。由图5可以看出，地奈德峰与碱降解杂质均能有效分离，地奈德与邻近峰的分离度大于2.0，满足检测要求。对色谱图5进行分析，按峰面积归一化法计算其含有的各杂质的相对含量，结果如表4所示。

表4 地奈德碱降解杂质分离的试验结果

实施例6地奈德酸降解杂质的检测

地奈德在酸性环境下亦有降解明显，故采用地奈德酸降解供试品溶液来考察色谱系统的专属性。取地奈德适量，置棕色50ml量瓶中，加乙腈15ml超声使溶解，再加1mol/l盐酸溶液0.3ml，摇匀，于60℃水浴加热30min，取出，放冷，用0.1％磷酸水溶液-乙腈(体积比为60：40)稀释至刻度，摇匀，作为地奈德酸降解供试品溶液。按照实施例1中的最佳的色谱条件进行测定，量取地奈德酸降解供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，如图6所示。由图6可以看出，地奈德峰与酸降解杂质均能有效分离，地奈德与邻近峰的分离度大于2.0，满足检测要求。对色谱图6进行分析，按峰面积归一化法计算其含有的各杂质的相对含量，结果如表5所示。

表5 地奈德酸降解杂质分离的试验结果

实施例7地奈德光照降解杂质的检测

地奈德对光不稳定，故采用地奈德光照降解供试品溶液来考察色谱系统的专属性。取地奈德适量，置白色50ml量瓶中，加0.1％磷酸-乙腈(60∶40)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，于4500lx光照箱中放置24h，取出，作为地奈德光照降解供试品溶液。按照实施例1中的最佳的色谱条件进行测定，量取地奈德光照降解供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，如图7所示。由图7可以看出，地奈德峰与碱降解杂质均能有效分离，地奈德与邻近峰的分离度大于2.0，满足检测要求。对色谱图7进行分析，按峰面积归一化法计算其含有的各杂质的相对含量，结果如表6所示。

表6 地奈德光照降解杂质分离的试验结果

对比实施例1

参照USP38版地奈德质量标准中有关物质检测方法对USP地奈德杂质混合对照品进行检测。

USP38版地奈德原料药质量标准的检测条件如下：

色谱柱：辛烷基键合硅胶色谱柱(4.6×150mm，2.6μm)；

柱温：20℃；

进样器温度：20℃；

检测波长：254nm；

流速：1.0ml/min；

稀释剂：0.1％磷酸水溶液-乙腈(体积比60：40)；

流动相A：0.1％磷酸水溶液；流动相B：乙腈，按下表7的条件进行梯度洗脱。

表7 USP38版地奈德原料药质量标准的检测条件(梯度洗脱表)

取USP地奈德杂质对照品约7mg，置10ml量瓶中，加0.1％磷酸-乙腈(体积比为60∶40)使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为USP地奈德杂质混合溶液。按照本实施例中USP38版地奈德原料药质量标准的色谱条件进行测定，精密量取5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图8所示。由图8可以看出，实施例1中的最佳的色谱条件及USP38版地奈德原料药质量标准的色谱条件对USP地奈德杂质对照品中各杂质的分离能力相当，分离出中杂质个数和杂质总量一致，色谱图中各杂质峰的洗脱顺序一致；杂质与主峰分离度均满足要求。对色谱图8进行分析，按峰面积归一化法计算其含有的各杂质的相对含量，结果如表8所示。

表8 USP地奈德杂质对照品分离的试验结果(USP38版地奈德色谱系统)

对比实施例2

参照USP38版地奈德质量标准中有关物质色谱系统对地奈德碱降解杂质进行检测。

取地奈德适量，置棕色50ml量瓶中，加乙腈15ml超声使溶解，再加1mol/L氢氧化钠溶液0.3ml，摇匀，于60℃水浴加热5min，取出，放冷，加0.1％磷酸-乙腈(体积比为60∶40)稀释至刻度，摇匀，作为地奈德碱降解供试品溶液。按照对比实施例1中的USP38版地奈德质量标准色谱条件进行测定，量取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，如图9所示。由图9可以看出，碱降解杂质4与工艺杂质二氢地奈德不能分离，地奈德峰与碱降解杂质4分离较差，分离度小于1.5，不能满足杂质检测的专属性要求。对色谱图9进行分析，按峰面积归一化法计算其含有的各杂质的相对含量，结果如表9所示。

表9 地奈德碱降解杂质分离的试验结果(USP38版地奈德色谱系统)

由实施例4-7及对比实施例1-2可以得知，USP38版地奈德原料药质量标准中有关物质检测方法可以比较准确的检测出USP地奈德混合杂质对照品中各工艺杂质；但是USP37版地奈德质量标准中有关物质检测方法不适用于地奈德碱降解杂质的检测，同时柱压较高，柱温及进样器温度控制苛刻；同样，USP37版地奈德质量标准中有关物质检测方法也不适用于地奈德酸降解及光降解杂质的检测。本发明的方法解决了USP38版地奈德检测方法的缺陷，能很好的适用于地奈德原料药及地奈德乳膏、地奈德凝胶、地奈德洗剂、地奈德油膏有关物质的检测。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种分离地奈德及相关杂质的方法，其特征在于，所述的方法是在固定相的基础上，采用乙腈水溶液为流动相进行洗脱分离，所述固定相的极性小于流动相的极性。

2.根据权利要求1所述的分离地奈德及相关杂质的方法，其特征在于，所述固定相为十八烷基硅烷键合硅胶。

3.根据权利要求1所述的分离地奈德及相关杂质的方法，其特征在于，所述相关杂质为地奈德合成过程中产生的工艺杂质和/或地奈德降解产生的杂质。

4.根据权利要求1所述的分离地奈德及相关杂质的方法，其特征在于，所述乙腈水溶液中还含有三氟乙酸和/或磷酸。

5.根据权利要求1所述的分离地奈德及相关杂质的方法，其特征在于，所述三氟乙酸和/或磷酸与水的体积比为0.05-0.2：100。

6.一种反相HPLC法分离测定地奈德及相关杂质的方法，其特征在于，所述反相HPLC法具体为：制备地奈德供试品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析测定地奈德供试品溶液中各物质的峰面积，按照峰面积归一化或自身对照法计算各杂质的相对含量；所述反相HPLC法采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱，采用的流动相为乙腈水溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用流动相乙腈水溶液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的条件为：0min，水与乙腈的体积比为75:25；25min，水与乙腈的体积比为40:60；30min，水与乙腈的体积比为20:80；35min，水与乙腈的体积比为20:80；35.01min，水与乙腈的体积比为75:25；42min，水与乙腈的体积比为75:25。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述乙腈水溶液中还含有三氟乙酸和/或磷酸，所述三氟乙酸和/或磷酸与水的体积比为0.05-0.2:100。

9.用于洗脱分离地奈德及相关杂质的洗脱液，其特征在于，所述洗脱液为含有三氟乙酸和/或磷酸的乙腈水溶液，所述三氟乙酸和/或磷酸与水的体积比为0.05-0.2:100。

10.权利要求6所述的方法在地奈德原料药及地奈德制剂质量控制中的应用。