CN114487231A - 三七茎叶中十二种人参皂苷的hplc同步测定方法及应用 - Google Patents
三七茎叶中十二种人参皂苷的hplc同步测定方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法，包括以下步骤：S1、将三七茎叶制备成富含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷F2、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rk1、人参皂苷C‑K、人参皂苷Rh2这十二种人参皂苷的供试品溶液；S2、采用高效液相色谱法对供试品溶液进行测定，测定参数如下：C18色谱柱长×内径＝250mm×4.6mm，粒径5μm；柱温40℃；检测波长203nm；进样量10μL；流速1.0mL·min‑1；洗脱方式为梯度洗脱。本发明方法不仅为三七茎叶生物转化后皂苷的质量分析方法提供参考，为三七茎叶的高值化开发利用提供依据，同时也可用于参类药材质控及各人参皂苷的定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法及应用。
背景技术
三七茎叶系五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥茎叶。其主要含有丰富的皂苷和糖类、黄酮类化合物、蛋白质、粗纤维、粗脂肪、矿物质等。是药食同源及药食同用资源。现代药理学研究表明，三七茎叶具有降血脂、保护心肌、抗氧化、抗炎、抗抑郁、改善睡眠等作用，具有很好的研发前景。
人参属药材含有丰富的皂苷，是质控的主要目标成分，其测定较多依赖液相色谱同步分析方法，本领域技术人员进行了同步测定多种皂苷的艰苦研发探索，如李瑞婷等采用高效液相色谱同步测定三七中的5种皂苷(R4、Re、Rd、Rg1、Rb1)(安徽农业科学，2020,16:184)，雷蓉等利用超高效液相色谱测定三七茎叶的三种皂苷(Rb1、Rb2、Rb3)(药物分析杂志，2018，7:1146)；但三七茎叶皂苷种类繁多，经生物转化还会产生种类更多、活性更优异的稀有皂苷，探索研究能进行更多种类三七皂苷的同步测定方法及条件，具有重要的现实意义。
发明内容
因此，本发明提供了三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法及应用，以解决上述背景技术中存在的问题。本发明采用经过特定改良后的高效液相色谱法对三七茎叶生物转化后的十二种人参单体皂苷成分进行测定，为三七茎叶生物转化后皂苷的质量分析方法提供参考，为三七茎叶的高值化开发利用提供依据，同时也可用于参类药材质控及各人参皂苷的定量分析。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
第一方面，本发明实施例提供了三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法，包括以下步骤：
S1、将三七茎叶制备成富含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷F2、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rk1、人参皂苷C-K、人参皂苷Rh2这十二种人参皂苷的供试品溶液；
S2、采用高效液相色谱法对供试品溶液进行测定，测定参数如下：C18色谱柱长×内径＝250mm×4.6mm，粒径5μm；柱温40℃；检测波长203nm；进样量10μL；流速1.0mL·min-1；洗脱方式为梯度洗脱。
优选地，S2中，采用高效液相色谱法对供试品溶液进行测定时，所用的流动相为乙腈(A)：水(B)。
优选地，S2中，采用高效液相色谱法对供试品溶液进行测定时，梯度洗脱的条件为：
时间0min时，A(％)：B(％)＝19:81；
时间30min时，A(％)：B(％)＝19:81；
时间35min时，A(％)：B(％)＝24:76；
时间40min时，A(％)：B(％)＝24:76；
时间55min时，A(％)：B(％)＝28:72；
时间110min时，A(％)：B(％)＝29:71；
时间130min时，A(％)：B(％)＝33:67；
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时间170min时，A(％)：B(％)＝41:59；
时间190min时，A(％)：B(％)＝45:55；
时间210min时，A(％)：B(％)＝50:50；
时间220min时，A(％)：B(％)＝55:45。
优选地，S1的操作具体为：
将三七茎叶及其发酵物粉碎，过40目筛，加10倍量50wt％乙醇溶液回流提取三次，浓缩，冷冻干燥，即得冻干粉末；
将冻干粉末与甲醇按照固液比0.012g/mL混合，称量，在100W、50条件下超声处理30min；冷却，再称量，用甲醇补足损失的量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
第二方面，本发明实施例提供了上述三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法在参类药材质控及人参皂苷的定量分析方面的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明经研究改良和探索提供了HPLC同步测定12种皂苷的方法，且具有良好的线性关系范围、精密度和重复性，并且具有高准确度、可靠性和稳定性。
(2)本发明提供的测定方法采用乙腈-水流动相体系，与一般的乙腈-磷酸-水流动相体系相比，分离效果更好；并且，对人参皂苷整体分离度及峰形有显著改善的同时，不含有磷酸等增加色谱柱清洗难度的物质，使本发明提供的测定方法更加简单易行、效率高。
(3)由于样品成分复杂，含有多种人参皂苷，分离难度较大，故本发明提供的测定方法采用了特定条件的梯度洗脱方式，更利于多组分的分离，可显著提升测定结果的准确度和可靠性。
(4)本发明提供的测定方法应用范围广泛，不仅可以用于三七茎叶中人参皂苷的测定，为三七茎叶生物转化后皂苷的质量分析方法提供参考，为三七茎叶的高值化开发利用提供依据，还可用于参类药材的质控和各人参皂苷的定量分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的附图。
以下附图仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，任何形式的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的的前提下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例中混合对照品溶液HPLC色谱；
图2为本发明实施例中三七茎叶发酵物供试品溶液HPLC色谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明请进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，若存在术语“包括”、“具有”以及它们的任何变形，其意图皆在于覆盖不排他的包含，例如，包括了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于已明确列出的那些步骤或单元，而是还可包含虽然并未明确列出的但对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元，或者基于本发明构思进一步的优化方案所增加的步骤或单元。
实施例
1、仪器与材料
1.1仪器与设备
本实施例中所使用的仪器与设备详细情况见表1。
表1-本实施例仪器与设备
1.2药品及试剂
本实施例中所用的药品及试剂详情见表2。
表2-本实施例中所用的药品及试剂
2.实验方法
2.1色谱条件
色谱柱：Agilent C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈(A)：水(B)；柱温40℃；检测波长203nm；进样量10μL；流速1.0mL·min-1；梯度洗脱条件见表3。
表3-本实施例中流动相梯度洗脱条件
为了验证本实施例中色谱条件与梯度洗脱条件的突出有益效果，故进行了对比实验，实验结果表明，洗脱时间小于220min，色谱峰数量少于12，不能同步测定12种皂苷类成分；柱温下调后(至30℃)、进样量下调后(至5uL)，都会使基线漂移且色谱峰峰形变差。以上结果证明了，本实施例所用的特定色谱条件和梯度洗脱条件，其突出的有益效果确定。
2.2溶液的配制
2.2.1混合对照品储备液的配制
分别精密称取人参皂苷Rg1、Rh1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2对照品10.2mg、10.9mg、11.2mg、9.7mg、10.5mg、11.5mg、11.6mg、10.4mg、10.4mg、10.0mg、10.6mg、11.6mg置于同一个10mL容量瓶中，加色谱级甲醇溶解并稀释至刻度，作为混合对照品储备液，备用。
2.2.2供试品溶液的配制
将三七茎叶及其发酵物粉碎，过40目筛。称取适量加10倍量50％乙醇回流提取三次，浓缩，冷冻干燥，即得冻干粉末。参照中国药典2020年版一部中三七含量测定方法，略做改动。取冻干粉0.6g，精密称定，加入50mL甲醇，称量，超声(100W，50kHz)处理30min，冷却，再称量，用甲醇补足损失的量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
3实验结果
3.1色谱分离
在本实施例中“2.1”项的色谱条件下，混合对照品溶液与供试品溶液中各峰可基本分离，混合对照品溶液HPLC色谱图见图1，三七茎叶发酵物供试品溶液HPLC色谱见图2。
其中，1.人参皂苷Rg1、2.人参皂苷Rh1、3.人参皂苷Rb1、4.人参皂苷Rc、5.人参皂苷Rb2、6.人参皂苷Rb3、7.人参皂苷Rd、8.人参皂苷F2、9.人参皂苷Rg3、10.人参皂苷Rk1、11.人参皂苷C-K、12.人参皂苷Rh2。
3.2线性关系考察
分别取配好的混和对照品储备液稀释得到一系列不同浓度混和标准操作溶液。按本实施例中“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以各对照品溶液的浓度(mg·mL-1)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，各对照品在其相应的浓度范围内线性关系均良好，结果见表4。
表4-线性考察结果
结果表明，各对照品回归方程的相关系数均不小于0.9990，人参皂苷Rg1、Rh1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2分别在0.0204～1.02mg·mL-1、0.0218～1.09mg·mL-1、0.03584～1.12mg·mL-1、0.0388～0.97mg·mL-1、0.021～1.05mg·mL-1、0.046～1.15mg·mL-1、0.00696～1.16mg·mL-1、0.0052～1.04mg·mL-1、0.0052～1.04mg·mL-1、0.005～1.00mg·mL-1、0.00212～1.06mg·mL-1和0.0058～1.16mg·mL-1范围内线性关系良好。
3.3精密度试验
精密吸取混合对照品溶液10μL，按本实施例中“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD值，结果见表5。
表5-精密度实验结果
结果测得人参皂苷Rg1、Rh1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2峰面积的RSD(n＝6)分别为0.16％、0.14％、0.27％、0.41％、0.46％、1.21％、0.18％、0.17％、0.40％、0.51、0.22％和0.24％，表明此方法精密度良好。
3.4重复性试验
精密称定样品粉末0.6g，按本实施例中“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按本实施例中“2.1”项下色谱条件检测分析，记录峰面积，计算RSD值，结果见表6。
表6-重复性实验结果
结果表明，人参皂苷Rg1、Rh1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2峰面积的RSD(n＝6)分别为0％、0％、1.55％、2.99％、4.00％、1.54％、3.92％、4.47％、2.28％、2.13、2.86％和2.37％，表明该方法重复性良好。
3.5稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10μL，按本实施例“2.1”项下色谱条件分别于0、12、24、36、48、60h进样，记录峰面积，计算RSD值，结果见表7。
表7-稳定性实验结果
结果显示，人参皂苷Rg1、Rh1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2峰面积的RSD(n＝6)分别为0％、0％、2.29％、3.56％、4.77％、1.08％、1.63％、1.37％、2.46％、5.88％、1.35％和4.46％，表明该对照品溶液在60h内稳定。
3.6回收率试验
3.6.1空白加标回收试验
分别制备低、中、高3个不同浓度的12种皂苷的混标溶液，加入到甲醇溶液中，进样2次取平均值。同时甲醇溶液进样2次，作为空白数据。目的是验证方法的准确性以及排除溶剂的干扰。试验结果见表8。
表8-空白加标回收试验结果
结果人参皂苷Rg1、Rh1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2对照品的平均回收率(n＝6)分别为94.70％、99.17％、99.26％、102.97％、96.07％、107.58％、103.74％、99.16％、95.37％、104.30％、96.56％和98.94％，各测定组分的平均加样回收率均在94.70～107.58％，加样回收率良好，说明该方法具有良好的稳定性及准确度。
3.6.2样品加标回收试验
精密称取已知含量的三七茎叶发酵物粉末6份，每份0.6g，低、中、高浓度水平各2份。分别精密加入人参皂苷Rg1、Rh1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2对照品适量，按上述试验方法和色谱条件测定峰面积，计算回收率，结果见表9。
表9-样品加标回收试验结果
结果Rg1、Rh1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2对照品的平均回收率(n＝6)分别为98.69％、100.11％、102.46％、100.09％、94.56％、95.87％、103.52％、106.97％、101.54％、101.43、100.18％和104.90％，实验结果表明，各测定组分的平均加样回收率均在94.56％～106.97％，加样回收率良好。
3.7含量测定
按本实施例“2.2.2”项的方法制备供试品溶液3份，按本实施例“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算12种成分的含量，结果见表10。由表10可知，RSD均小于3％，表明该方法准确可靠。
表10-12种单体皂苷含量测定结果
本实施例通过对高效液相色谱条件进行特定优化，确定了测定三七茎叶皂苷及其转化产物中12种皂苷HPLC测定的条件为Agilent C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速1.0mL·min-1，柱温40℃，检测波长203nm，进样量10μL。通过精密度、重复性、稳定性和空白加标回收率和样品加标回收率的计算，证明该方法稳定可靠，简单易行，快速准确，可为三七茎叶及其生物转化产物的质量分析方法提供参考，为三七茎叶的高值化开发利用提供依据，同时也可用于参类药材质控及各人参皂苷的定量分析。
本实施例比较了乙腈-水和乙腈-磷酸-水流动相体系，乙腈-水的分离效果最好。而加入磷酸对供试品中人参皂苷整体的分离度及峰形没有显著改善，且增加了色谱柱清洗难度，故最终确定乙腈-水为最佳流动相体系，由于样品成分复杂，分离难度较大，所以采用梯度洗脱方式，更利于多组分的分离。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述；这些未明确写出的实施例，也都应当认为是本说明书记载的范围。
上文中通过一般性说明及具体实施例对本发明作了较为具体和详细的描述。应当指出的是，在不脱离本发明构思的前提下，显然还可以对此具体实施例作出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将三七茎叶制备成富含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷F2、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rk1、人参皂苷C-K、人参皂苷Rh2这十二种人参皂苷的供试品溶液；
S2、采用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行测定，测定参数如下：C18色谱柱长×内径＝250mm×4.6mm，粒径5μm；柱温40℃；检测波长203nm；进样量10μL；流速1.0mL·min-1；洗脱方式为梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法，其特征在于，S2中，采用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行测定时，所用的流动相为乙腈(A)：水(B)。
3.根据权利要求1所述的三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法，其特征在于，S2中，采用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行测定时，梯度洗脱的条件为：
时间0min时，A(％)：B(％)＝19:81；
时间30min时，A(％)：B(％)＝19:81；
时间35min时，A(％)：B(％)＝24:76；
时间40min时，A(％)：B(％)＝24:76；
时间55min时，A(％)：B(％)＝28:72；
时间110min时，A(％)：B(％)＝29:71；
时间130min时，A(％)：B(％)＝33:67；
时间150min时，A(％)：B(％)＝37:63；
时间170min时，A(％)：B(％)＝41:59；
时间190min时，A(％)：B(％)＝45:55；
时间210min时，A(％)：B(％)＝50:50；
时间220min时，A(％)：B(％)＝55:45。
4.根据权利要求1所述的三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法，其特征在于，S1的操作具体为：
将三七茎叶及其发酵物粉碎，过40目筛，加10倍量50wt％乙醇溶液回流提取三次，浓缩，冷冻干燥，即得冻干粉末；
将所述冻干粉末与甲醇按照固液比0.012g/mL混合，称量，在100W、50条件下超声处理30min；冷却，再称量，用甲醇补足损失的量，摇匀，过滤，取续滤液作为所述供试品溶液。
5.权利要求1所述的三七茎叶中十二种人参皂苷的HPLC同步测定方法在参类药材质控及人参皂苷的定量分析方面的应用。
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