JP2010233576A

JP2010233576A - ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉ結晶の製造方法

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Publication number: JP2010233576A
Application number: JP2010126143A
Authority: JP
Inventors: Hiroto Kikuchi; 裕人菊地; Hiroaki Sakurai; 博章櫻井; Norimitsu Takagi; 紀充高木; Tsutomu Aritsuka; 勉有塚; Yoshihiro Senba; 美博仙波; Fusao Tomita; 房男冨田; Kozo Asano; 行蔵浅野
Original assignee: Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2003-03-05
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2010-10-21
Anticipated expiration: 2024-03-02
Also published as: JPWO2004078989A1; JP5130326B2; KR101203024B1; EP1612274A1; EP2450452A1; JP4572167B2; US20060051845A1; US7998710B2; KR20120003976A; WO2004078989A1; KR20050105933A; KR101132994B1; EP1612274A4

Abstract

【課題】ジフルクトース・ジアンヒドリドＩＩＩ（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｒａｎｏｓｅ−１，２'；２，３'ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ、以下、ＤＦＡＩＩＩという）以外の糖及び各種不純物、特に臭いまでも除去したＤＦＡＩＩＩ結晶の製造方法を提供する。
【解決手段】純度６０％以上のＤＦＡＩＩＩをＲ−Ｂｘ１０以上の濃度で有するＤＦＡＩＩＩ粗液に、粉末活性炭を０．１〜５％添加して攪拌した後、固液分離し（ケイソウ土濾過、メンブランフィルター濾過、限外濾過、連続遠心分離等）、分離液を濃縮した後、直ちに冷却結晶化して、高純度のＤＦＡＩＩＩ結晶を製造する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ジフルクトース・ジアンヒドリドＩＩＩ（ＤｉｆｒｕｃｔｏｓｅｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅＩＩＩ：α−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ−β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ−２'，１：２，３'−ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（以下、ＤＦＡＩＩＩということもある）結晶の製造方法に関するものであって、更に詳細には、ＤＦＡＩＩＩ含有液から高純度のＤＦＡＩＩＩ結晶を、特に、再結晶処理を多数回くり返すことなく臭いまでも除去されて高度に精製されたＤＦＡＩＩＩ結晶をきわめて効率よく得ることのできる工業的方法に関するものである。

ジフルクトース・ジアンヒドリドＩＩＩ（ｄｉｆｒｕｃｔｏｓｅｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅＩＩＩ：ＤＦＡＩＩＩ）は、フラクトース２分子が１，２'；２，３'で結合している難消化性二糖類であって（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ−１，２'；２，３'ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、水への溶解性が高く、蔗糖の９０〜９５％程度を示すが、その甘味度は蔗糖の５２％程度である。

ＤＦＡＩＩＩは、最近の本出願人に属する研究者らの研究により、Ｃａ等ミネラルの吸収促進作用を有することが明らかにされ（例えば、特許文献１参照）、今後、特に高齢者や乳幼児等にとって、医薬上、健康食品、特定保健用食品、その他飲食品上、有益な物質として期待されている。したがって、高純度のＤＦＡＩＩＩが、特に取扱いのうえからもまた加工のし易さからも、結晶化したＤＦＡＩＩＩの製造が、しかも研究試薬用のように小規模高コスト生産ではなく、大規模低コスト生産法の開発が待望されている。

ＤＦＡＩＩＩは、従来、イヌリン又はイヌリン含有物（例えば、キクイモ、ゴボウ、チコリ等の抽出液）に、細菌又はそれが生産する酵素フラクトシルトランスフェラーゼであるイヌリンフラクトトランスフェラーゼを作用させてＤＦＡＩＩＩ含有液を製造した後、これを更に処理して高濃度ＤＦＡＩＩＩ液を得ている。

例えば、ＤＦＡＩＩＩ含有液を活性炭カラムに通液してＤＦＡＩＩＩを吸着させた後、エタノールで溶離してＤＦＡＩＩＩ含量の多い画分を回収し、蒸発乾固する方法が提案されているが（例えば、特許文献２、３参照）、この方法は実験室的な回収方法であって、工業的大量生産方法とはいい難いものである。また、上記酵素反応によって得た液をイオン交換樹脂によって精製し、これを濃縮乾固する方法も提案されているが（例えば、特許文献４参照）、ＤＦＡＩＩＩの純度が低く、高純度のＤＦＡＩＩＩ結晶を得る方法とはいい難いものである。しかも、従来の方法で結晶化したＤＦＡＩＩＩ結晶は、他の不純物は除去できても、臭いまでは除去することができず、臭いの残留という欠点は不可避であった。たしかに再結晶によれば臭いの除去も一応は可能であるが、再結晶処理を多数回くり返す必要があり、そのたび毎に収率、歩留りが低下し、再結晶法は工業的な方法ではない。

このように、臭いも除去した高純度ＤＦＡＩＩＩ結晶、しかもこれを工業的に大量生産するのに成功した報告は未だなされていないのが現状である。

特開平１１−４３４３８号公報特公昭５６−２６４００号公報特開平０３−２５９０９０号公報特開平０１−２８５１９５号公報

上記したように、近年、ＤＦＡＩＩＩについて有用な用途が開発されるに伴い、ＤＦＡＩＩＩの需要が高まってきている。そして医薬用途に使用する場合はもちろんのこと飲食品用途に使用する場合においても、ＤＦＡＩＩＩ以外の糖及び各種不純物を除去した高純度ＤＦＡＩＩＩ結晶が要望されており、特に、これらの用途においては不純物の内、色のほかに臭いが結晶中に残存しないことが要望されている。しかしながら、従来の方法では、結晶から臭いを除くことがきわめて難しく、多数回再結晶処理をくり返すことなく、臭いまでも除去してきわめて高度に精製された結晶化ＤＦＡＩＩＩを効率良く工業的に大量生産することはできず、当業界においてこの問題点を解決することが要望されている。

本発明は、上記のように、従来の結晶化方法では工業的に臭いを除去することができなかったのであるが（換言すれば、結晶化しても臭いが残存していたのであるが）、本発明方法ではそれをはじめて可能にしただけでなく、効率化、工業的大量生産にもはじめて成功したものである。

すなわち、本発明者らは、各方面から研究した結果、ＤＦＡＩＩＩ含有液を粒状活性炭充填カラムに通液するのではなく、ＤＦＡＩＩＩ含有液に少量の粉末状活性炭を加えて攪拌した後、これをケイソウ土濾過、メンブランフィルター濾過等の固液分離処理を行って得られた液状部の濃縮液を結晶化したところ、高純度のＤＦＡＩＩＩ結晶がきわめて効率的に得られること、しかも純度９５％以上、すなわち９５〜９９％ときわめてピュアーなＤＦＡＩＩＩ結晶が得られることをはじめて見出した。また、この研究の過程において、ＤＦＡＩＩＩ含有液をクロマトグラフィー処理して得たＤＦＡＩＩＩ画分は、これに活性炭を加え固液分離した後の液状部は直接結晶化することも可能であること、しかもこれらの方法で得られた結晶には臭いがないこともはじめて見出した。

本発明は、これら有用新知見に基づき更に検討研究を行った結果遂に完成されたものであって、従来なし得なかった臭いもなく高純度のＤＦＡＩＩＩ結晶ないし顆粒状物の工業的大量生産の開発にはじめて成功したものであり、きわめて高価なＤＦＡＩＩＩを低コストで精製、結晶化すること、しかも従来わずかに実験室規模で行われていた再結晶を多数回くり返すことによる臭いの除去処理も実施する必要がないこともはじめて可能としたものである。

すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）純度６０％以上のジフルクトース・ジアンヒドリドＩＩＩ（以下、ＤＦＡＩＩＩという）をＲ−Ｂｘ１０以上の濃度で含有するＤＦＡＩＩＩ粗液（イヌリンにアースロバクターエスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）ＡＨＵ１７５３株（ＦＥＲＭＢＰ−８２９６）由来のイヌリンフラクトシルトランスフェラーゼ（デポリメライジング）（ｉｎｕｌｉｎｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ））を作用させて製造した酵素反応液を除く）に粉末活性炭を固形分に対して０．１％〜５％添加して清浄化した後、固液分離し、分離した液状部を濃縮した後、直ちに冷却結晶化すること、を特徴とする臭いまでも除去されたＤＦＡＩＩＩ結晶の製造方法。
（２）液状部を濃縮した後、ＤＦＡＩＩＩをＲ−Ｂｘ６０以上の濃度で含有すること、を特徴とする（１）に記載の方法。
（３）冷却結晶化工程において、１５〜２０℃まで冷却して結晶化すること、を特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
（４）冷却結晶化工程において、２３時間以上かけて冷却して結晶化すること、を特徴とする（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）ＤＦＡＩＩＩ粗液が、ＤＦＡＩＩＩ含有液、クロマトグラフィー処理して得たＤＦＡＩＩＩ画分、結晶又は粗結晶シラップの少なくともひとつであること、を特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）粉末活性炭の平均粒径が１５〜５０ミクロンであり、最大粒径が２００ミクロン以下であること、を特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）固液分離する方法が、濾過助剤を使用する濾過、メンブランフィルターを用いる方法、限外濾過膜を用いる方法から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法。

本発明によって、従来効率よく工業生産することができなかった高純度のＤＦＡＩＩＩ結晶の工業生産にはじめて成功した。しかも、本発明によれば、特定の活性炭処理とＤＦＡＩＩＩ含有液の純度向上との有機的結合によって、純度９９ｗ／ｗ％にも達するきわめて高純度の精製されたＤＦＡＩＩＩ結晶を効率的に工業生産できるだけでなく、従来法では再結晶を多数回くり返さなければ除去することができなかった結晶中の臭いの工業的且つ効率的除去にもはじめて成功したという著効も奏される。

このように、本発明に係るＤＦＡＩＩＩ結晶は、単に純度が高いだけでなく、臭いがないというきわめて顕著な効果が奏されるので、医薬用途や飲食品用途に使用するのに特に適しており、例えばカルシウム吸収剤として自由に使用できる特徴も奏される。

ＤＦＡＩＩＩ結晶の製造フローの一例を示す。クロマト処理による精製フローの例を示す。各種イヌリン商品の液体クロマトグラムである。ＭＦ（メンブランフィルター）濾過試験の結果を示す。

以下、本発明について詳述する。

本発明は、ＤＦＡＩＩＩ含有液を精製して高純度のＤＦＡＩＩＩ結晶を効率的に工業生産するものである。ＤＦＡＩＩＩ含有液としては、ＤＦＡＩＩＩを含有し後記する条件を満たす液状物をすべて包含するものであって、イヌリン又はイヌリン含有液にフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得たＤＦＡＩＩＩ生成反応液のほか、ＤＦＡＩＩＩ化学合成液や本精製工程において生成する各種精製度のＤＦＡＩＩＩを含有する液体がすべて包含される。

例えばイヌリン（及び／又はイヌリン含有液）と酵素を用いてＤＦＡＩＩＩを製造する場合、イヌリンは、フラクトースが多数重合したもので、主にチコリ（あるいは、キクイモ、ゴボウ等）から抽出したものが使用されるため、重合度及び純度が異なるものが市販されているだけでなく、これを酵素によって分解すると、生成した反応液には、ＤＦＡＩＩＩ以外のフラクトース重合物、酵素、酵素源として使用した微生物、その培養物、色素、臭い等の不純物が含まれることは不可避であり、そのため、従来は、純粋なＤＦＡＩＩＩ結晶又はその含有物を工業的に低コストで効率良く得るまでには至っていない。

酵素反応液の清浄法としては、既述のように、イオン交換樹脂及び活性炭カラムを用いる方法が知られているが（特許文献４及び２、３）、処理、操作が煩雑で効率的ではないだけでなく、他のフラクトース重合体を除去することがきわめて困難であるため、これらの重合体が残存してしまい、ＤＦＡＩＩＩ純度が低いという非常に大きな欠点は避けられないし、特に臭いが残存してしまう。

また、活性炭カラムを使用する方法は、ＤＦＡＩＩＩのほか他のフラクトース重合体、色素等の不純物を非選択的に一旦活性炭に吸着せしめた後、エタノールを用いて各種画分を溶出し、ＤＦＡＩＩＩリッチ画分を集めて回収するものであって、少量のしかも粉末状の活性炭を酵素反応液に添加して不純物を吸着し（ＤＦＡＩＩＩはそのほとんどが液中に残留する）しかる後に粉末状活性炭を除去する本発明に係る清浄化方法とはその原理自体が相違することはもとより、操作方法、操作効率、精製度が全く異なり、しかも使用する活性炭の種類、粒度、使用量が全然相違しており、本発明とは全く別異の方法であって、本発明の特許性とは関係のないものである。両者は、方法自体が全く相違しているのである。

なお、特許文献４（イオン交換樹脂法）の実施例４において、キクイモ上清をセライト濾過して得た濾液を活性炭処理する工程が記載されているが、これは、キクイモ上清濾液は不純物が多くて後で行うイオン交換樹脂処理に支障をきたすためこれをスムースに実施する目的で行う前処理ないし最初の単なる部分精製工程であって、そもそも本発明の活性炭処理とは技術的意義を全く異にするものである。しかも、使用する活性炭の粒度、使用量についての規定もなければ、処理対象として特定純度のＤＦＡＩＩＩを特定濃度含有する特定のＤＦＡＩＩＩ含有液（本発明におけるＤＦＡＩＩＩ精製液）についての記載すらなく（キクイモ上清濾液が本発明でＤＦＡＩＩＩ精製液として使用する特定したＤＦＡＩＩＩ含有液でないことは明白である）、そのうえ、本発明においては活性炭によって清浄化した後には結晶化工程が行われるのに対して、この方法においてはイオン交換樹脂処理が行われていて全く相違しているだけでなく、そもそも結晶化自体が行われていない。ましてや脱臭もされていない。したがってこの方法も本発明に係る方法とは何らの関係もないものである。

このように従来技術とは全く異なる本発明を実施して高純度のＤＦＡＩＩＩ結晶を高収率で製造するには、出発粗結晶化原料として、純度６０％以上、好ましくは７０％以上のＤＦＡＩＩＩをＲ−Ｂｘ６０以上、好ましくは７０以上の濃度で含有するＤＦＡＩＩＩ粗液を使用するのが好適である。この特定のＤＦＡＩＩＩ粗液を使用することにより、純度９５％以上、あるいは９９％以上の純粋なＤＦＡＩＩＩ結晶を回収率３５％以上（対イヌリン）で効率的に大量生産することができる。ＤＦＡＩＩＩ粗液としては、ＤＦＡＩＩＩ含有液、クロマトグラフィー処理して得たＤＦＡＩＩＩ画分、結晶又は粗結晶シラップの少なくともひとつが使用される。

このＤＦＡＩＩＩ含有液は、フラクトース重合度が１０以上、好ましくは１０〜１００、更に好ましくは１０〜６０のイヌリンを酵素処理すれば得ることができるし、また、純度の低いＤＦＡＩＩＩ含有液であっても、クロマトグラフィー（以下、クロマトということもある）処理して、上記した特定のＤＦＡＩＩＩ画分を分画して回収してもよい。必要あれば濃縮、遠心分離、濾過その他の常法によって成分調整を行い、上記した組成を有するＤＦＡＩＩＩ含有液を調製してもよい。

フルクトース単位を転移触媒して、ＤＦＡＩＩＩの様なオリゴ糖を合成する酵素は、広義で「フラクトシルトランスフェラーゼ」である。フラクトシルトランスフェラーゼは、大きく２種類に大別される。（１）フルクトース単位（スクロースなどの２糖類を含む）を基質とし、これを加水・転移して、オリゴ糖を合成する酵素（場合として、多糖も合成する）。（２）イヌリンやレバンなどのフラクタンを基質とし、これを加水・転移して、オリゴ糖を合成する酵素である。発明者らがイヌリンからのＤＦＡＩＩＩ製造に使用したのは、フラクトシルトランスフェラーゼの中でも、学名がイヌリンフルクトトランスフェラーゼであり、（２）の種類に属する。イヌリンフルクトトランスフェラーゼ（以後、単にＩＦＴとする）を生成する微生物としては、アースロバクター属、クルイベロマイセス属、ストレプトマイセス属、エンテロバクター属に属する各種細菌、酵母、放線菌等が報告されており、これらを適宜使用することが可能である。これらの微生物を培養して、精製酵素、粗製酵素、酵素含有物、微生物培養物等の形態として適宜使用される。

その非限定例を以下に示す：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．；ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓＩＦＯ１２１４０；ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＩＦＯ１２１３７；ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｐａｓｃｅｎｓＩＦＯ１２１３９；Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．

これら微生物由来の酵素を使用する場合、分離精製した酵素のほか、粗精製酵素、微生物培養物、同処理物（培養上清、分離菌体、菌体破砕物等）も使用可能である。なお、ＤＦＡＩＩＩ結晶を食品用途に使用する場合には、酵素としてフラクトシルトランスフェラーゼ、特にＩＦＴを使用するのが好適であって、上記微生物由来の酵素のほか、今回、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１５年（２００３）２月１８日付けでＦＥＲＭＢＰ−８２９６として寄託されたＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＡＨＵ１７５３株は、ＩＦＴ生産能にすぐれているので、本菌株由来の酵素は好適に使用可能である。

なお、イヌリンの酵素分解によるＤＦＡＩＩＩの生成は、ＤＦＡＩＩＩ単独のものが生成されることが最も好ましいが、実際上ではＤＦＡＩＩＩ以外のフラクトースの重合物が種々生成される。それが酵素分解液の純度の低下の原因となっている。このため、ＤＦＡＩＩＩを結晶化するための原料として、イヌリン以外の不純物の混入量の出来るだけ少ないものや、また、ＤＦＡＩＩＩ以外のフラクトース重合物が生成しない酵素の選択が必要である。そして、このように精製されたＤＦＡＩＩＩ含有液が得られれば、これをＤＦＡＩＩＩ粗液として、直ちに本発明に係る清浄濾過、結晶化工程に入っていくことができる。

以下、結晶ＤＦＡＩＩＩの製造フローの一例として図１に示した製造フローを参照しながら、本発明を詳細に説明する。

イヌリンをイヌリン分解酵素で処理した後、酵素を失活させて、ＤＦＡＩＩＩ含有液（酵素反応液）を得る。この際、高純度ＤＦＡＩＩＩ結晶を効率的に製造するには、原料イヌリンとしては、フラクトース重合度が１０以上、好ましくは１０〜６０のものを使用するのがよい。酵素としては既述したものが適宜使用可能であり、酵素処理及び失活は常法にしたがえばよい。このようにして、Ｒ−Ｂｘ１０以上、好ましくは１５以上、更に好ましくは２０以上、より好ましくは２０〜３０で、ＤＦＡＩＩＩ純度６０％以上、好ましくは６５％以上、更に好ましくは７０％以上、更に好ましくは７０〜８５％のＤＦＡＩＩＩ含有液を得る。化学合成によっても、同様にＤＦＡＩＩＩ含有液を製造することができる。なお、原料イヌリンとしては、上記したようにフラクトース重合度が１０以上のものが好適であるが、不純物を含有するイヌリン、例えばフラクトース重合度が５程度のものであっても、シラップの副生量が多くなり、循環処理する回数や量が多くなって効率面ではやや低下するものの、この製造で充分処理することができる。

上記によって得たＤＦＡＩＩＩ含有液のほか、これと同じ性質を有するクロマト処理して得たＤＦＡＩＩＩ画分、結晶又は粗結晶シラップの少なくともひとつからなるＤＦＡＩＩＩ粗液は、次に清浄濾過する。清浄濾過は、ＤＦＡＩＩＩ粗液の活性炭処理及び固液分離処理を指すものである。活性炭処理は、ＤＦＡＩＩＩ粗液に粉末活性炭を少量添加して、必要あれば加熱及び／又は攪拌して、ＤＦＡＩＩＩ以外の不純物を活性炭に吸着せしめる処理である。

粉末活性炭としては、平均粒径が１５〜５０ミクロン、好ましくは２５〜４５ミクロン、更に好ましくは約３５ミクロン；最大粒径が２００ミクロン以下、好ましくは１７０ミクロン以下、更に好ましくは１５０ミクロン以下、例えば１４７ミクロン以下のものが使用される。その添加量は、固形分に対して、５％以下、好ましくは０．１〜３％、更に好ましくは０．５〜１．５％とするのが良く、ＤＦＡＩＩＩ粗液の組成に応じて適宜規定する。

固液分離処理としては、ハイフロスーパーセル（和光純薬製）やケイソウ土濾過等の濾過助剤を使用する濾過（例えば、セラミック濾過機による濾過：日本ポール（株）製ＰＲ−１２型が使用可能）、メンブランフィルター（ＭＦ）濾過、連続遠心分離法、分子篩法、逆浸透膜法、場合によっては限外濾過（ＵＦ）膜の少なくともひとつが適宜利用される。固液分離は、常圧、加圧、又は減圧の少なくともいずれかで実施される。

上記の内、例えば、限外濾過膜（ＵＦ膜）を使用する濾過、メンブランフィルター（ＭＦ）濾過、連続遠心分離処理によれば、ケイソウ土等の濾過助剤を使用することなく、直接固液分離することができる。ＭＦ膜としては、例えばセラミック膜（例えば、月島機械（株）商品名ダリア）等が使用可能であるし、連続遠心分離（５，０００〜２５，０００ｒｐｍ、好ましくは８，０００〜１５，０００ｒｐｍ；６，５００〜１０，０００Ｇ、好ましくは７，５００〜９，５００Ｇ：例えば１０，０００ｒｐｍ、８，２００Ｇ）によれば、ＤＦＡＩＩＩ結晶（結晶粒径２５０〜５００μｍ）と微細結晶（ＤＦＡＩＩＩ以外の結晶、主に４、５糖類：結晶粒径１００μｍ以下）とを分離することができるので、粗結晶シラップや結晶シラップの濾過にも適用できる。

固液分離して得た濾液は、これを濃縮する。濃縮は、常法によって行われ、例えば蒸発濃縮缶等が用いられる。得られた濃縮液は、粗結晶母液であって、蒸発結晶化または冷却結晶化等によって粗結晶化処理する。粗結晶化された母液は、粗結晶と粗結晶シラップに分離するが、それには、遠心分離が利用される。

結晶化された母液から分離された粗結晶シラップ及び結晶シラップの濾過には、遠心分離、例えば連続遠心分離（例えば、アルファ・ラバル社製）を用いた固液分離が行われる。シラップ中には未結晶のＤＦＡＩＩＩ以外のフラクトース重合度の異なるオリゴ糖が含有されている。フラクトース重合度が高い程、結晶化がし易く、結晶の粒径が小さいことが新たに判明した。この性質を利用してＤＦＡＩＩＩと他のオリゴ糖を分けることができる。これによりＤＦＡＩＩＩ以外のオリゴ糖が除去されてＤＦＡＩＩＩ以外のオリゴ糖の循環蓄積が防止でき、ＤＦＡＩＩＩの結晶化原料の純度の低下を抑さえることができる。このＤＦＡＩＩＩ以外のオリゴ糖が循環蓄積されると粗結晶母液（濃縮液）の純度が低下し、効率的（工業的）に結晶化できる純度（粗結晶の場合、純度６０％以上）を確保することが難しくなる。特に、粗結晶母液（濃縮液）の純度低下を防ぐためシラップの製造系外への排出を行う方法もあるがＤＦＡＩＩＩの損失となるので避けるほうが良い。

ＤＦＡＩＩＩ含有液（粗液）の清浄濾過処理によって得た濾液は、常法によって濃縮する。例えば、砂糖等の製造で用いられるカランドリア型濃縮効用缶により濃縮し、濃縮液を得る。濃縮液は、濃度Ｒ−Ｂｘ６０〜８５、好ましくは６５〜８０、例えば７７程度に濃縮すればよい。

濃縮液は、粗結晶化するが、結晶缶を用いる蒸発結晶化、冷却結晶化等の結晶化処理が利用される。蒸発結晶缶は、例えば砂糖製造用として用いられている結晶缶であればよい。冷却結晶缶は砂糖製造用として使用されているものと同様な形状の横型又は縦型のクリスタライザーが用いられる。このように、結晶缶に供給されるＤＦＡＩＩＩを含有した液体を粗結晶母液（濃縮液）という。ＤＦＡＩＩＩの粗結晶化の際、結晶缶内に結晶が付着しないような処置をとるとよい。例えば攪拌機をそれに付設すると結晶率の上昇の効果がある。遠心分離機は砂糖製造用に用いられているものであればよい。ＤＦＡＩＩＩ粗結晶を乾燥させる場合には、常圧の場合、５０〜１００℃の温度条件下で行う。なお、減圧乾燥も可能である。

粗結晶化工程により結晶が析出した母液（濃縮液）について、固液分離を行い、粗結晶（ＤＦＡＩＩＩ純度は９５〜９８％程度にまで達する）と粗結晶シラップに分離する。固液分離処理は、既述した方法で行えばよく、例えば上記のように遠心分離機（５００〜６，０００ｒｐｍ、好ましくは１，０００〜５，０００ｒｐｍ、例えば２，０００〜４，０００ｒｐｍ、５００Ｇ〜３，０００Ｇ、好ましくは８００〜２，０００Ｇ、例えば約１，２００Ｇ）で両者を分離し、粗結晶シラップは、固液分離し、又はすることなく、所望する場合、精製工程に戻してやり、粗結晶は水又は湯に再溶解して、再溶解液とし、これを製品結晶化用の結晶母液用のＤＦＡＩＩＩ精製液として使用する。

再溶解液（ＤＦＡＩＩＩ精製液：Ｒ−Ｂｘは１０〜６０、好ましくは２０〜５５、更に好ましくは４０〜５０、ＤＦＡＩＩＩ純度は９０％以上、好ましくは９０〜９８％となり、例えば９５〜９８％程度にまで達する）は、上記粗結晶の条件と同様に、清浄濾過、濾液の濃縮、濃縮液（製品結晶母液）の製品結晶化、製品結晶及び結晶シラップの分離、製品結晶の乾燥、包装、ＤＦＡＩＩＩ結晶製品（純度９８〜９９％以上、色もなければ臭いもない高度に精製された結晶）を製造する。なお、結晶から分離したシロップ（結晶シロップ、粗結晶シロップ）は、所望する場合、濾過し又は濾過することなく、ＤＦＡＩＩＩ含有液からＤＦＡＩＩＩ製品に至る全精製工程（図１のフロー）の少なくともひとつに戻してやる。

また、本発明においては、クロマト分離法を利用してＤＦＡＩＩＩ結晶を製造することも可能である。すなわち、ＤＦＡＩＩＩ結晶化全精製工程（図１）で生成する各種生成物をクロマト処理原液（Ｒ−Ｂｘ４０〜７５）として、これをクロマト処理し、ＤＦＡＩＩＩを精製して結晶化することが可能である。そのクロマト処理による精製フローの一例を図２に示す。

クロマト処理原液（Ｒ−Ｂｘ４０〜７５）は、クロマトで処理して、ＤＦＡＩＩＩ画分を分離する。既述した再溶解液（ＤＦＡＩＩＩ液）と同様の精製度を有するＤＦＡＩＩＩリッチ画分は、ＤＦＡＩＩＩ精製液として、これを清浄濾過、濃縮、結晶化することにより製品結晶を製造することができ（ルートＡ）、あるいは、上記再溶解液（ＤＦＡＩＩＩ液）に添加してＤＦＡＩＩＩ精製液とし、これを結晶化することもできる（ルートＢ）。また、ＤＦＡＩＩＩリッチ画分とは異なりＤＦＡＩＩＩ含量が低いＤＦＡＩＩＩ非リッチ画分及びごく少量しかＤＦＡＩＩＩを含まない非ＤＦＡＩＩＩ画分については、前者は製造フロー（図１に示すようなＤＦＡＩＩＩ含有液からＤＦＡＩＩＩ製品に至る全精製工程）の適宜個所に戻してやればよいし（ルートＣ）、後者について精製工程に導入するか、場合によっては廃棄する（ルートＤ）。

ＤＦＡＩＩＩを含む液体（純度４０％以上）をクロマト処理する場合、処理液のＤＦＡＩＩＩ画分は純度７０〜９８％のものが得られるので、ＤＦＡＩＩＩ純度８５％以上、好ましくは９０〜９５％、場合によっては９５〜９８％のＤＦＡＩＩＩリッチ画分は、ルートＡにしたがって、清浄濾過、濃縮、製品結晶化することができる。したがって、例えば、粗結晶化工程を経ることなく粗結晶用の母液（濃縮液）をクロマト処理してＤＦＡＩＩＩ画分（ＤＦＡＩＩＩリッチ画分）を分離し、これをＤＦＡＩＩＩ精製液として活性炭処理濾過後、この濃縮液を製品結晶母液として使用し、他は上記したのと同じ操作を行って、臭いもなく高度に精製されたＤＦＡＩＩＩ結晶製品を得ることができる。もちろん、この画分を再溶解液に添加してＤＦＡＩＩＩ精製液として使用するルート、例えばルートＢでも可能である。また、上記で分離したＤＦＡＩＩＩ非リッチ画分は、ルートＣにしたがって、精製工程（ＤＦＡＩＩＩ含有液〜ＤＦＡＩＩＩ製品の全精製工程）例えば図１の適宜個所に戻してやり、全体として無駄やロスを生じることなく、本フローを循環させて徹底的に効率化することができる。

また、非常に不純物含量が少ないイヌリン、例えばフラクトースの重合度が１０以上、好ましくは１０〜６０であり、ポリサッカライド含量が８０％以上、好ましくは１００％のイヌリンを原料とし、そしてフラクトトランスフェラーゼとして精製酵素を用いてこれを処理し、そして得られたＤＦＡＩＩＩ含有液をクロマト処理し、得られたＤＦＡＩＩＩリッチ画分は、活性炭清浄濾過等を行うことなく、直接、濃縮し、結晶化することができる。得られたＤＦＡＩＩＩ結晶は更に臭い、着色は全くなくきわめて高純度な結晶であり、高純度イヌリン及び／又は精製フラクトシルトランスフェラーゼを使用することにより、清浄濾過を行うことなく、しかも、分離、濃縮、結晶化の各処理はわずか１回で臭いのない高純度なＤＦＡＩＩＩ結晶をきわめて効率的に製造することができる。

クロマト分離法としては、その分離装置は固定床方式（ワンパス方式）、連続方式（疑似移動床方式）、半連続方式（固定床方式と連続方式の組合）が適用できる。その装置の充填イオン交換樹脂としては、クロマト用のＮａ形、Ｋ形、Ｃａ形等の強酸性イオン交換樹脂が使用される。その樹脂は均一粒径のスチレンジビニルベンゼン系樹脂等が用いられている。イオン交換樹脂のメーカーから種々のクロマト用樹脂が販売されているが、糖液に適用できるものであればいずれも使用できる。クロマト処理は結晶母液のＤＦＡＩＩＩ純度が低い場合、その純度を上げるのにも適宜使用される。

本発明は、更に、ＤＦＡＩＩＩ純度が７０％未満のＤＦＡＩＩＩ含有液（結晶母液）についても、工業的に結晶させることができる。

本発明においては、ＤＦＡＩＩＩ純度が７０％未満のＤＦＡＩＩＩ含有液の精製度を高めるため、ＤＦＡＩＩＩ含有液を、イースト処理、清浄濾過処理又はクロマトグラフィー処理の少なくとも一つで処理することによりＤＦＡ含有液のＤＦＡＩＩＩ純度を大幅に上昇させることができる。

本発明は、ＤＦＡＩＩＩ含有液をイースト処理、清浄濾過処理、クロマト処理の少なくともひとつから選ばれる処理によって精製する方法に関するものであり、本法を利用することにより高純度のＤＦＡＩＩＩ結晶を効率的に工業生産できるものである。ＤＦＡＩＩＩ含有液としては、ＤＦＡＩＩＩを含有し後記する条件を満たす液状物をすべて包含するものであって、フラクトースの重合体、例えばイヌリン又はイヌリン含有液にフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得たＤＦＡＩＩＩ生成反応液のほか、各種ＤＦＡＩＩＩ生合成液、ＤＦＡＩＩＩ化学合成液や本精製工程において生成する各種精製度のＤＦＡＩＩＩを含有する液体、あるいは市販のＤＦＡＩＩＩを溶解した液体等ＤＦＡＩＩＩを含有する液体がすべて包含される。

例えばイヌリン（及び／又はイヌリン含有液）と酵素を用いてＤＦＡＩＩＩを製造する場合、イヌリンは、グルコース１つにフラクトースが多数重合したもので、主にキクイモ（あるいは、チコリ、ゴボウ等）から抽出したものが使用されるため、重合度及び純度が異なるものが市販されているだけでなく、これを酵素によって分解すると、生成した反応液には、ＤＦＡＩＩＩ以外のフラクトース重合物、酵素、酵素源として使用した微生物、その培養物、色素、臭い等の不純物が含まれることは不可避であり、そのため、従来は、精製されたＤＦＡＩＩＩ、ひいては、純粋なＤＦＡＩＩＩ結晶又はその含有物を工業的に低コストで効率良く得るまでには至っていない。

ＤＦＡＩＩＩ含有液からＤＦＡＩＩＩを結晶化する際、工業的、経済的に結晶可能なＤＦＡＩＩＩの純度は６０％が限度である（好ましくは７０％よりも高い方がよい）。換言すれば、ＤＦＡＩＩＩ純度が６０〜７０％以下のＤＦＡＩＩＩ含有液から工業的、経済的にＤＦＡＩＩＩを結晶化することができず、従来、純度７０％以下のＤＦＡＩＩＩ含有液（純度６０％以下のＤＦＡＩＩＩ含有液の場合はなおさらのこと）は、工業的結晶化に採算がとれないため、使用することができなかったのである。

本発明は、このような現状に鑑み、従来工業的に使用することができなかったＤＦＡＩＩＩ純度が低いＤＦＡＩＩＩ含有液からＤＦＡＩＩＩを高度に精製する方法を開発して、例えば純粋なＤＦＡＩＩＩ結晶が得られる程度に高純度に精製されたＤＦＡＩＩＩを効率良く得るため、各方面から研究の結果、ＤＦＡＩＩＩ含有液をクロマトグラフィー処理（以下、クロマト処理ということもある）、清浄濾過処理、イースト処理の少なくともひとつで処理することを骨子とする新規方法を開発したものである。

ＤＦＡＩＩＩ含有液としては、上記したように、ＤＦＡＩＩＩ生合成液、化学合成液、市販ＤＦＡＩＩＩ溶解液その他ＤＦＡＩＩＩを含有するがＤＦＡＩＩＩ純度の低いＤＦＡＩＩＩ含有液体のいずれもが使用可能である。

本発明においては、ＤＦＡＩＩＩ含有液としては、高純度ＤＦＡ含有液が使用できることはもちろんのこと、上記したように純度の低いＤＦＡ含有液も使用することができ、イースト処理、清浄濾過処理、クロマト処理の少なくともひとつの処理によって、従来経済的ないし工業的理由によって使用できなかった純度の低いＤＦＡＩＩＩ含有液（純度７０％以下のもの、６０％以下のものも可能）も原料として使用可能となり、効率的にＤＦＡＩＩＩを精製することがはじめて可能となった。

先ず、イースト処理は、ＤＦＡＩＩＩ含有液とイーストを接触させればよく、両者を混合し、必要あれば攪拌してインキュベートしてもよいし、通気しながら培養してもよい。イーストとしては、パン酵母、清酒酵母、ビール酵母、ブドウ酒酵母その他各種の酵母が適宜使用可能であって、ドライイースト、圧搾酵母その他各種の市販品も充分に使用可能である。イーストによって、二糖類、単糖類が分解されたり菌体内に取り込まれるので、イースト処理は、主に二糖類及び／又は単糖類を系外に除去するのに有用である。

清浄濾過処理は、ＤＦＡＩＩＩ含有液の粉末活性炭処理の清浄等を目的とする処理と、固液分離を目的とする処理が含まれる。固液分離処理は、遠心分離、濾過、珪藻土等の濾過助剤を用いる濾過、メンブランフィルターを用いる方法、セラミック膜を用いる方法、限外濾過膜を用いる方法、その他固体と液体を分離する方法をすべて包含するものである。

そして、クロマト処理は、クロマト用のイオン交換樹脂を用い、固定床、連続床（疑似移動床）、半連続等各方式によって適宜行うことができ、二糖類と他の糖類を分離するものである。したがって、クロマト処理によれば、二糖類であるＤＦＡＩＩＩと他の糖類を効率的に分離することができる。

このように、二糖類としてはＤＦＡＩＩＩのみが含まれている場合には、クロマト処理はＤＦＡＩＩＩの精製にきわめて有効である。しかしながら、クロマト処理では、ＤＦＡＩＩＩと他の二糖類を分離することは、双方共に二糖類であることから、非常に困難である。したがって、例えば、イヌリンをイヌリン分解酵素処理して得たＤＦＡＩＩＩ含有液中に二糖類であるＤＦＡＩＩＩの他にこれまた二糖類である蔗糖も含まれる場合、クロマト処理では、ＤＦＡＩＩＩと蔗糖（他の二糖類）の分離が非常に難しくなる。したがって、このような場合には他の処理を組み合わせることによってＤＦＡＩＩＩの精製を効率的に実施することが可能であり、例えば、前処理としてイースト処理を行ってＤＦＡＩＩＩ以外の二糖類を系外に除去した後、クロマト処理を行えばよい。

このように、本発明においては、ＤＦＡＩＩＩ含有液に応じて、イースト処理、固液分離処理、クロマト処理の内、最適な処理を実施すればよいし、必要ある場合には、これらの処理を適宜併用したり組み合わせたり、あるいは、各処理や複数の処理を更にくり返したりすることにより、従来工業的に使用できなかった低純度ＤＦＡＩＩＩ含有液も効率的に精製することがはじめて可能となった。

例えば、ＤＦＡＩＩＩ生合成液については、フラクトースの重合体を原料として用い、これにフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて製造することができる。

その場合、原料として用いるフラクトースの重合体としては、上記したようにイヌリン等の天然の重合体のほか、生合成及び／又は化学合成した重合体のいずれも使用可能であるが、フラクトースの重合度は２以上、好ましくは１０以上であって、１０〜６０が好適域である。また、重合体におけるポリサッカライドの含量は７０％以上が好ましく、更に好適には１００％である。しかしながら、本発明においては、純度の低いＤＦＡＩＩＩ含有液も効率的に精製できるので、このような高品位フラクトース重合体のほか、低品位のものも適宜可能である。

なお、本発明において、フラクトース重合体は、フラクトースのみが重合したホモポリマーのほか、他の糖を含むヘテロポリマーのいずれであってもよく、例えば、イヌリンはフラクトース重合体にグルコースが１分子結合した一種のヘテロポリマーである。また、フラクトース重合体にはフラクトース重合体含有物も包含される。

これらフラクトースの重合体の内、天然由来物としてはイヌリンが有利に使用されるが、生合成又は化学合成したものも使用され、例えば次のようにして生合成したものも使用可能である。

例えば、シュークロースにフラクトース合成酵素（例えば、イヌリン合成酵素）を作用させて、イヌリンを生合成することができる。イヌリン合成酵素としては、シュークロース：シュークロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（ＳＳＴ）及びβ−（２−１）フルクタン：β−（２−１）フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＦＴ）等が使用される。また、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｙｄｏｗｙ）ＩＦＯ４２８４、ＩＦＯ７５３１やストレプトコッカス・ミュータンス等の微生物の産生する酵素がイヌリン類似物を生産するが、イヌリン類似物もフラクトースの重合体及び／又はそれの含有物であるので、本発明におけるＤＦＡＩＩＩ含有液の原料として使用できる。

なお、生合成法等フラクトース重合体の製造工程において、グルコースが副生する場合には、グルコースイソメラーゼ等グルコースをフラクトースに変換する酵素を用いてグルコースをフラクトースに変換したり、あるいは、グルコースオキシダーゼ等グルコースをグルコン酸に変換するといった酵素を用いてグルコースを他の物質に変換して、グルコース量を低下せしめ、イヌリン（又はイヌリン類似物）の収率を高めることができる。また、ＤＦＡＩＩＩ含有液にイーストを加え、通気攪拌培養等のイースト処理を行って、ＤＦＡＩＩＩ以外の不純物をイーストに消費させてクロマト処理前のＤＦＡＩＩＩ含有液の純度を高めてもよい。

以下、ＤＦＡＩＩＩ含有液として、フラクトースの重合体をフラクトシルトランスフェラーゼ処理して得たものを例にとって説明するが、フラクトースの重合体としてはイヌリンを例にとって説明する。

なお、イヌリンの酵素分解によるＤＦＡＩＩＩの生成は、ＤＦＡＩＩＩ単独のものが生成されることが最も好ましいが、実際上ではＤＦＡＩＩＩ以外のフラクトースの重合物が種々生成される。それが酵素分解液の純度の低下の原因となっている。このため、クロマトグラフィー処理を行うが、所望する場合には、ＤＦＡＩＩＩを結晶化するための原料として、イヌリン以外の不純物の混入量の出来るだけ少ないものや、また、ＤＦＡＩＩＩ以外のフラクトース重合物が生成しない酵素の選択が必要である。そして、このように精製されたＤＦＡＩＩＩ含有液が得られれば、これをＤＦＡＩＩＩ粗液として、直ちに本発明に係る清浄濾過、結晶化工程に入っていくことができる。

イヌリンをイヌリン分解酵素で分解したＤＦＡＩＩＩ含有液のＤＦＡＩＩＩ純度の一例を、後記するＡ〜Ｄ社の製品について示せば、次のとおりである：
Ａ社品７５％、Ｂ社品５９％、Ｃ社品５２％、Ｄ社品７８％
そして、Ｄ社品をイヌリン酵素分解して結晶化する際のシラップのＤＦＡＩＩＩ純度の一例を示せば、次のとおりである：
粗結晶シラップ５３％、製品結晶シラップ９５％
上記したＩＦＴ処理等の酵素処理によって得たＤＦＡＩＩＩ含有液はもちろんのこと、その他の方法で調製した各種ＤＦＡＩＩＩ含有液は、クロマトグラフィー処理（以下、クロマト処理ということもある）イースト処理、清浄濾過処理の少なくともひとつで処理して、不純物を除去して精製し、各種精製度のＤＦＡＩＩＩを得ることができる。

その場合、精製度の高いＤＦＡＩＩＩ含有液からは、精製度の高いＤＦＡＩＩＩ（直ちに高純度結晶化工程に入っていける程度に精製度の高いもの）が得られ、精製度の低いＤＦＡＩＩＩ含有液からは、精製度の低いＤＦＡＩＩＩが生成するが、クロマト処理や他の処理をくり返すだけでも精製度を高めることができる。したがって、本発明によれば、各種精製度のＤＦＡＩＩＩ含有液を自由に使用し、所望する精製度のＤＦＡＩＩＩを得ることができる。

クロマト処理によってＤＦＡＩＩＩ含有液から不純物が除去され、高度に精製される。また、精製度が低いフラクションは、再度又はそれ以上の回数でクロマト処理したり、他の方法にて精製することができる。

ＤＦＡＩＩＩ含有液は、そのままクロマト処理してもよいが、濃縮処理といった濃度を高める処理により、更なる効率化が図られる。濃縮処理としては、例えば濃縮缶による濃縮（例えば、５０〜８０℃、１４０ｍｍＨｇ以下）が挙げられるが、その他各種濃縮処理が適宜可能である。

本発明の好適例のひとつとして、次のような精製方法が例示される。先ず、原料として市販されている又はシュークロースから生合成したイヌリンを用い、これにＩＦＴを接触せしめて酵素処理し、得られたＤＦＡＩＩＩ含有液をクロマト処理して、夾雑している不純物を除去し、ＤＦＡＩＩＩの精製を行うものである。そしてこの間、所望するのであればイースト処理等の各種の精製を適宜行うことができる。

本発明によれば、純度の低いＤＦＡＩＩＩ含有液であってもクロマト処理、イースト処理、清浄濾過処理の少なくともひとつで処理することにより、精製されたＤＦＡＩＩＩ精製液が効率よく工業生産できるので、精製されたＤＦＡＩＩＩは各種の用途に広く利用することができ、本発明によれば、ＤＦＡＩＩＩ含有液を直ちに結晶化できる程度にまで高度に精製することができる。したがって純度が９５ｗ／ｗ％以上というきわめて高純度のＤＦＡＩＩＩの結晶、結晶破砕物、又は顆粒状物を製造することができ、医薬やサプリメント等として各種用途に広範に利用することができる。

また、本発明は、イヌリンフルクトトランスフェラーゼ（単にＩＦＴということもある。）をはじめとするフラクトシルトランスフェラーゼの効率的大量生産方法も含むものである。

本発明においては、イヌリンの添加によって活性を低下させることなく、本酵素の生産量が飛躍的に増大することをはじめて見出したもので、２００リットル以上もの大容量タンクにおける大量培養でもＩＦＴを大量生産することができる。

本酵素を生成する微生物（菌体外に本酵素を分泌するもの、及び／又は、菌体内に本酵素を蓄積するものを問わない）を培養して、培養物から本酵素を取得するに際して、イヌリンを添加した培地を用いて培養を行う必要がある。イヌリンの添加量は、０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％であって、例えば、イヌリンを約１％添加した培地を使用することができる。

また、更に、培地には酵母エキスを微量栄養源として添加すると好適である。その際、酵母エキスを０．０２〜２．０％、好ましくは０．１〜１．５％添加すればよく、例えば、酵母エキスを約０．５％添加した培地を使用することができる。

本発明を実施するには、上記のようにイヌリンを添加した培地（好適には、更に酵母エキスを添加した培地）で本酵素生産菌を培養すればよい。その際、その他の培地組成及び培養条件等に格別の限定はなく、使用菌に応じて適宜行えばよいが、培養時の通気量については、０．５ｖｖｍ以上、好ましくは１〜２ｖｖｍとするのがよい。

上記した本発明に係る培養方法によれば、本酵素は大量に生産することができ、従来法では酵素調製量が１〜多くても数十ユニット（酵素単位）／ｍｌ（培養液）であったのが、本法では、高活性（数百ユニット（酵素単位）／ｍｌ（培養液）以上）とすることがはじめて可能になったという著効が奏される。

しかも、上記著効は、実験室や小規模生産レベルで奏されることはもちろんのこと、容量が５０リットル以上、例えば１００リットル以上の大型発酵タンクを用いる大型微生物培養装置を使用した場合にも奏されるという特徴を有し、２００リットル容のジャーファーメンターの使用も確認されており、それ以上の大容量発酵タンク、例えば３００〜５００リットル容の発酵タンクの使用も可能である。

このように本発明は、酵素の大量生産をはじめて可能にしたものであり、しかも酵素活性をいささかも低下させることがないものであって、そのポイントを例示すれば次のとおりである。
（培養装置に関して）
（１）大型微生物培養装置を導入したこと。
フルクトシルトランスフェラーゼの調製は、実験室レベルでは成功されているので、容易に考えられる発展項目でもあるが、これらの誘導酵素は、培養装置を大型にすることで、活性値が実験室レベルより顕著に低下することが多くある。２００リットル容以上タンクの導入で、事実活性値が上昇したことは、新たな重大発見である。
（培養方法に関して）
（２）酵素の誘導物質であるイヌリンの最適添加量を、大型微生物培養装置に合わせ、決定したこと。
（３）酵素の生産量増加、および安定性上昇の要素として、酵母エキスを見出し、その最適添加量を大型微生物培養装置に合わせ、決定したこと。
（４）酵素の生産量増加の要素として、培養中の空気の通気量を見出し、その最適量を大型微生物培養装置に合わせ、決定したこと。

使用する微生物としては、アースロバクター属、クルイベロマイセス属、ストレプトマイセス属、エンテロバクター属、バチルス属、ミクロバクテリウム属に属する微生物のほか、各種細菌、酵母、糸状菌、放線菌等が適宜使用可能である。

本発明において使用できる微生物の非限定例を以下に示す：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、同（ＩＦＯ１２１４０）、同（ＡＴＣＣ２１１２４）、Ａ．ｐａｓｃｅｎｓ（ＩＦＯ１２１３９）、同Ｔ１３−２、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ（ＩＦＯ１２１３７）、同Ｃ１１−１、Ａ．ｎｉｃｔｉｎｏｖｏｒａｎｓＧＳ−９、Ａ．ｉｌｉｃｉｓＯＫＵ１７Ｂ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、同Ｈ６５−７、同ＡＨＵ１７５３（ＦＥＲＭＢＰ−８２９６）、同ＭＣＩ−２４９３；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ（ＡＴＣＣ１２４２４）、同ＣＢＳ６５５６、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、同（ＩＦＯ１７３５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ、同Ｅ８７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．、同ＭＣＩ−２５２４；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、同Ｎｏ．９４９；Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ、同ＯＫＵＭＺ．３１Ｂ、同ＭＣＩ−２５５４、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．、同Ｓｎｕ−７；Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．、同ＭＣＩ−２４９４；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．、同ＡＬ−２１０；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、同Ｓ４５；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ。

本酵素を生産するに当っては、例えば上記したような本酵素生産菌を用い、既述した特定の培養条件のほかは常法にしたがって培養を行い、培養物中から酵素製造の常法にしたがって本酵素を抽出精製すればよい。例えば、得られた培養物を遠心分離して除菌し、得られた濾液に硫安（６５％飽和）を加えて、塩析し、析出した沈殿物を遠心分離により取得し、少量の水に懸濁させた後、透析して粗酵素液を得ることができる。そして所望するのであれば、常法にしたがい、例えば粗製酵素をクロマトグラフィー処理等既知の精製方法を１種又は２種以上組み合わせて、精製酵素とすることができる。

なお、本酵素生産菌が上記のように本酵素を菌体外へ分泌するタイプではなく、菌体内に蓄積するタイプの場合には、培養物から菌体を分離し、得られた菌体を超音波処理等常用される菌体破壊処理に対して菌体を破壊し、しかる後に上記したようにして酵素を分離、精製すればよい。

しかも、本発明では、小規模に本酵素を生産できることはもちろんのこと、特に上記した培養条件によれば、２００リットル以上、更には５００リットル以上もの大容量発酵タンクを用いても、何らの弊害も生じることなく、酵素力価を低下させることなく、高活性の酵素を大量に生産できるという工業上特にすぐれた効果が奏される。

本発明においては、酵素としては、分離精製した酵素のほか、粗精製酵素、微生物培養物、同処理物（培養上清、分離菌体、菌体破砕物等）も使用可能である。なお、ＤＦＡＩＩＩ結晶を食品用途に使用する場合には、酵素としてフラクトシルトランスフェラーゼ、特にＩＦＴを使用するのが好適であって、上記微生物由来の酵素のほか、今回、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１５年（２００３）２月１８日付けでＦＥＲＭＢＰ−８２９６として寄託されたＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＡＨＵ１７５３株は、ＩＦＴ生産能にすぐれているので、本酵素生産菌として好適に使用可能である。

このようにして大量生産した酵素は、酵素自体として試薬や研究用に利用されるほか、多数の応用が可能であって、そのひとつとして、本酵素をイヌリンに作用させることにより、各種のオリゴ糖を合成することができる。例えばフラクトースの重合度が１０以上、好ましくは１０〜６０のイヌリンにフラクトシルトランスフェラーゼを作用させることによってＤＦＡＩＩＩ含有液を製造することができるが、その際、イヌリンフラクトトランスフェラーゼ（デポリメライジング）（ｉｎｕｌｉｎｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ））として、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ・）ＡＨＵ１７５３株（ＦＥＲＭＢＰ−８２９６）由来の精製酵素、粗製酵素、酵素含有物、菌体、菌培養物、同処理物の少なくともひとつを使用することができる。

このようにして、効率的に且つ低コストでＤＦＡＩＩＩ含有液を製造することが可能となったので、例えばこれに粉末活性炭を例えば固形分に対し５％以下添加して清浄化した後、固液分離し、分離した液状部を濃縮した後、直ちに結晶化し、必要あれば、これらの操作をくり返したり、クロマトグラフィー処理を組み合わせたりして、更に精製して、臭いも除去されてきわめて高純度の結晶ＤＦＡＩＩＩを得ることができる。

以下、実施例をあげて本発明を更に詳しく説明する。

イヌリンのフラクトース重合度（分子量分布）
市販イヌリンを購入しフラクトース重合度を調査した。下記の条件で液体クロマトグラフィー分析装置を使用したクロマトグラムを図３に示す。
１）イヌリンの分析サンプル
イ．Ａ社品
ロ．Ｂ社品
ハ．Ｃ社品
二．Ｄ社品
上記サンプルに係わるカタログの表示を下記表１に示す。

２）分析条件〈ＢＲ〉
カラム：Ｄｉｏｎｅｘ，ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１，４×２５０ｍｍＩ．Ｄ．
カードカラム：Ｄｉｏｎｅｘ，ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１Ｇｕａｒｄ
カラム温度：室温
溶離液：グラジエント
０分１００分
割合（％）割合（％）
１ＮＮａＯＨ１５１５
１ＭＮａＯＡｃ０４５
水８５４０
カーブＮｏ． − ２
検出器：Ｄｉｏｎｅｘ，ＰｕｌｓｅｄＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｏｒ
検出モード：ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＡｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ
パルス電圧：Ｅ１：＋０．０５Ｖ（４００ｍｓｅｃ），Ｅ２：＋０．７５Ｖ（２００ｍｓｅｃ），Ｅ３：−０．１５Ｖ（４００ｍｓｅｃ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
レンジ：１μＣ
注入量：各０．１％水溶液を５μｌ注入
分析サイクル：１２０ｍｉｎ

３）結果
各クロマトグラムの流出時間によるピーク値を比較する。リテンションタイムの経過に従って各ピークは重合度（分子量）の高いものとなる。
（Ｃ社品）流出時間約６．５ｍｉｎから約４０ｍｉｎの間に約４０個のピークが存在している。このピークの状態から流出時間６．５から１４．５ｍｉｎのものが多いため重合度の低いポリサッカライドの割合が多い。
（Ｄ社品）流出時間約１４．５ｍｉｎから４６ｍｉｎの間に約４０個のピークが存在した。このことから比較的重合度の高いポリサッカライドが多い。
（Ｂ社品）流出時間約７．９ｍｉｎから３０ｍｉｎの間に約３０個のピークがあった。流出時間１４．５ｍｉｎ以上の割合が多いが１４．５ｍｉｎ未満のポリサッカライドも含まれる。
（Ａ社品）流出時間約９ｍｉｎから４１ｍｉｎの間に４０個のピークがあった。Ｄ社品と同様な傾向のピークを示したが、流出時間６．５から１４．５ｍｉｎの間にも多少ピークが散見された。
これらの結果とカタログから推察すると滞留時間６．５ｍｉｎの重合度が２で、１４．５ｍｉｎのピークが重合度１０と予想される。

（１）ＩＦＴ酵素生産量及びイヌリンからのＤＦＡＩＩＩの反応収率
上記市販品４種のイヌリンを使用し、後記するフラクトシルトランスフェラーゼを使用して酵素反応を行い、ＤＦＡＩＩＩの生成率を調査した。イヌリンを８０℃のお湯で完全に溶解した後、６０℃まで冷却する。そこにＩＦＴを５０００ｕｎｉｔ／ｋｇイヌリンを添加し、６０℃、２４時間攪拌しながら反応させる。反応液のＩＦＴ酵素生産量を下記の通り測定した。また、反応液を失活（８０℃）させ、活性炭（太閤活性炭Ｓ）及び珪藻土（ラジオライト７００）で清浄濾過し、清浄反応液を液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと記す。カラム：ＳｈｏｄｅｘＳｕｇａｒＫＳ−８０１，３００×８ｍｍＩ．Ｄ．、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度８０℃）を使用しＤＦＡＩＩＩを定量した。ＩＦＴの酵素生産量及びＤＦＡＩＩＩの生成収率の結果を表２に示した。

その結果から明らかなように、酵素生産量及びＤＦＡＩＩＩの反応収率ともＤ社品が最も良かった。図３及び表２の結果からフラクトース重合度が高い分布のものほど、即ち、Ａ社品及びＤ社品は重合度１０以上のものと予想されるが、これらがＤＦＡＩＩＩ収率がよかった。尚、イヌリンは、分子量（重合度）が高くなると溶解性が悪く、ハンドリングしづらくなるため、ＤＦＡＩＩＩの工業生産には重合度１００程度が限界である。

（２）酵素生産量（酵素活性）の測定法
２ｍｌ容チューブに１０％イヌリン溶液０．５ｍｌと０．１Ｍクエン酸・ＮａＯＨバッファー（ｐＨ５．５）０．４５ｍｌを入れ、６０℃の湯浴で約５分間加温した。そこに、粗酵素液５０μｌを加え、６０℃で１０分間反応させた。沸とう水中に５分間保持することにより反応を停止させた。ＨＰＬＣにより生成したＤＦＡＩＩＩを定量した。１ｕｎｉｔは１分間に１μｍｏｌのＤＦＡＩＩＩを生成する酵素量とした

イヌリンからＤＦＡＩＩＩの製造
（１）上記Ｄ社品２００ｋｇを８０℃のお湯１０００ｋｇで溶解し、６０℃まで冷却する。その溶液に下記酵素生産で得られたＩＦＴ５０００ｕｎｉｔｓ／ｋｇイヌリンを添加し、６０℃で２４時間攪拌しＤＦＡＩＩＩの含有液を生成させる。この反応完了液を８０℃に上げ酵素を失活させる。この失活液に固形分当たり１％の割合で太閤活性炭Ｓ（二村化学工業製：平均粒径約３５ミクロン、１４７ミクロン以下）を添加し６０℃、１０分間攪拌する。この完了液を珪藻土（昭和化学工業製ラジオライト７００）濾過を行った。すなわちセラミック製の筒（日本ポール（株）製ＰＲ−１２型セラミックチューブ）の内面に上記珪藻土をプレコートしておき、筒内に活性炭含有反応液を加圧通過させて、加圧濾過し、筒外から濾液を回収した。

（２）この濾液を濃縮缶で濃縮（６０〜７０℃ １２０ｍｍＨｇ以下）する。最終濃度Ｒ−Ｂｘ７７まで濃縮した後、その母液を結晶化工程に移した。結晶は冷却結晶化法を行った。６０℃の濃縮液を冷却缶外部に冷却外套及び攪拌機が設けられた缶で、２３時間かけて１５〜２０℃に冷却する。結晶の析出した母液を分離機（３０００ｒｐｍ、１２００Ｇ）で粗結晶とシラップに分離する。その粗結晶（ＤＦＡＩＩＩ純度９７％）を再溶解し、得られた再溶解液（ＤＦＡＩＩＩ精製液）を、上記条件と同様に活性炭処理、珪藻土濾過を行い濃縮、結晶化・分離し、製品結晶（ＤＦＡＩＩＩ純度９９％）を得る。得られた結晶を５０℃で通風乾燥し、ＤＦＡＩＩＩ７．２ｋｇ（水分０．１％）が得られた。この結晶は、着色もなく臭いも認められなかった。

（３）上記（１）において、珪藻土濾過にかえてメンブランフィルター（ＭＦ）濾過を行った。
すなわち、酵素反応完了液（約Ｒ−Ｂｘ２０）を失活させて、それに太閤活性炭Ｓを固形分当たり１％添加し、６０℃、１０分間攪拌する。それを、０．１４μｍのメンブランフィルター（月島機械株式会社製：セラミック膜ＴＳＫ−ＴＡＭＩダリア）を使用し、濾過を行った。濃縮率は１０倍とした。結果を図４に示す。その結果から明らかなように、透過液量の低下もみられず順調に濾過できることを確認した。透過液は透明であった。

（４）上記（１）、（２）において、ＤＦＡＩＩＩ含有液（酵素反応完了液：濃度Ｒ−Ｂｘ６０、ＤＦＡＩＩＩ純度７８．６％、その他２１．４％（主に４糖類および５糖類））について、以下によってクロマト処理を行い、下記する画分を得た（表３）。このようにして、通液量０．６００〜０．７００Ｌ／Ｌ−Ｒ画分を回収して、ＤＦＡＩＩＩ画分（純度９７．３％）を得た。このようにしてクロマト分画して得たＤＦＡＩＩＩ画分は、ＤＦＡＩＩＩリッチ画分として、清浄濾過した後に濃縮して製品結晶母液として使用できるほか、粗結晶再溶解液（ＤＦＡＩＩＩ精製液）としてあるいはそれに添加して使用できることも確認された。また、ＤＦＡＩＩＩ純度７６．８％画分は、例えばＤＦＡＩＩＩ非リッチ画分としてルートＣに利用できることも確認された。

（クロマト処理条件）
クロマト用樹脂：Ｎａ型強酸性樹脂（オルガノ製ＣＲ−１３１０型）
カラム：２２×５２５ｍｍ、２００ｍｌ
クロマト処理原液：ＤＦＡＩＩＩ酵素反応液を失活した後粉末活性炭で清浄濾過した液。〈ＢＲ〉
Ｒ−Ｂｘ６０、ＤＦＡＩＩＩ純度７８．６％、
供給量２．５％Ｌ／Ｌ−Ｒ
通液条件：７０℃、ＳＶ＝０．６（２．０ｍｌ／ｍｉｎ）
溶離液：水
回収フラクション：５ｍｌ／フラクション。

フラクトシルトランスフェラーゼの製造
（１）アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）ＡＨＵ１７５３株（ＦＥＲＭＢＰ−８２９６）を下記の培養条件で培養し、酵素液を作成した。

（２）培地１：１％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．０。５００ｍｌ容の振とう坂口フラスコに、１００ｍｌを調製し、高圧蒸気殺菌をした。
培地２：１％イヌリン、０．２％硝酸ナトリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％リン酸二水素カリウム、０．０１ｇ／Ｌ硫酸第二鉄、０．５％酵母エキス、ｐＨ７．０。２００Ｌ容のジャーファーメンター（日立製作所製、モデルＦＦ−０２）に、１００Ｌを調製し、高圧蒸気殺菌をした。）

（３）培養（酵素生産）
前培養；保存スラント培地より、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＡＨＵ１７５３株の一白金耳量菌体を、無菌的に（培地１）に接種した。そして、２７℃、２４時間、振とう培養をした。振とう条件は、１５センチ幅、１２０ｒｐｍ。
本培養：前培養で調製した培養液（フラスコ１０本分、１Ｌ分）を、無菌的に（培地２）に接種した。そして、ジャーファーメンターを２７℃で、１７時間、運転した。通気量は、１ｖｖｍ（１００Ｌ／分）、攪拌数は、３００ｒｐｍ。

（４）菌体回収、およびその他（３）で調製した培養液を、遠心分離器で菌体と上清とに分離し、上清をＤＦＡＩＩＩ酵素液とした。酵素液をリン酸にて、ｐＨ５．５に調整後、マイナス２０℃で保存した。

（結果）
この操作により、ＩＦＴを、
濃度：３００ユニット／ミリリットル（培養液）、（実験室レベルの３倍）
全量：４．５×１０の７乗、ユニット量、（工業生産に対応できる十分量）
時間：１７時間、（実験室レベルより短時間）
に製造できた。
（培養条件）
・前培養：２７℃、２４時間、振とう培養
・本培養：前培養液を本培養液に接種（本培養液量に対して１％の前培養液量）し、２７℃、２４時間振とう培養する。
（酵素液の調整）
本培養液を遠心分離（２０００Ｇ、４℃、２０分）し、上澄みを酵素液として使用する。

ＤＦＡＩＩＩ酵素反応液のイースト処理
イヌリン（Ｃ社品）２００ｋｇを８０℃の湯１ｋｇに溶解し、ＩＦＴ５０００ｕｎｉｔｓ／ｋｇイヌリンを添加し、６０℃で１２時間攪拌し、ＤＦＡＩＩＩ含有液を生成させた。
この反応終了液を８０℃にまで加温して酵素を失活させた後、この失活反応完了液を３０℃に冷却し、しかる後にイースト（日本甜菜製糖（株）製：ニッテンイースト）１００ｇ（水分６６％）を添加し、３０℃で１２時間通気培養した。
得られたイースト反応液を濾過（セラミック膜等）し、その濾過液を濃縮して、Ｂｘ５０〜７０程度までにし、これをクロマト分離処理のクロマト原液とした。

ＤＦＡＩＩＩ顆粒状物の製造
ＤＦＡＩＩＩ結晶を乳鉢で微粉砕した後、ＤＦＡＩＩＩ１００に対して水１０を加え、均一に混合した。これを押出し造粒機（不二パウダル（株）製、ＦＩＮＥＲＹＵＺＥＲ、型式ＥＸＲ−６０、処理能力４０〜１５０ｋｇ／ｈｒ）にて造粒し、７０℃の送風定温恒温機（ヤマト科学（株）製、型式ＤＮ９１０）で３時間乾燥し、顆粒状ＤＦＡＩＩＩを製造した。

熟練したパネラー２０人により、結晶ＤＦＡＩＩＩと微粉砕ＤＦＡＩＩＩ、顆粒状ＤＦＡＩＩＩの官能試験を実施した。得られた結果を下記表４に示した。表４に示すように、微粉砕ＤＦＡＩＩＩは結晶ＤＦＡＩＩＩより甘味が強くなり、口溶けや甘味の切れが向上し、結果的に好ましいという結果が得られた。さらに顆粒状ＤＦＡＩＩＩでは微粉砕ＤＦＡＩＩＩに対して甘味の強さは変わらないものの、口溶けや甘味の切れが向上し、総合評価も高かった。

以上のことから、口溶け感や甘味の切れなど、食味や食感において敬遠される面があった結晶ＤＦＡＩＩＩは、微粉砕後、更に顆粒化することで、これらの点を改善できることが確認された。
なお、結晶化条件は、ＤＦＡＩＩＩ冷却結晶化時のＲ−Ｂｘ：６５以上であった（５０℃における溶解度より判断した）。

フラクトシルトランスフェラーゼの大量生産
（１）アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）ＡＨＵ１７５３株（ＦＥＲＭＢＰ−８２９６）を下記の培養条件で培養し、酵素液を作成した。

（２）《培地１》：１％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．０。５００ｍｌ容の振とう坂口フラスコに、１００ｍｌを調製し、高圧蒸気殺菌をした。
《培地２》：１％イヌリン、０．２％硝酸ナトリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％リン酸二水素カリウム、０．０１ｇ／Ｌ硫酸第二鉄、０．５％酵母エキス、ｐＨ７．０。２００Ｌ容のジャーファーメンター（日立製作所製、モデルＦＦ−０２）に、１００Ｌを調製し、高圧蒸気殺菌をした。

（３）培養（酵素生産）
前培養：保存スラント培地より、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＡＨＵ１７５３株の一白金耳量菌体を、無菌的に（培地１）に接種した。そして、２７℃、２４時間、振とう培養をした。振とう条件は、１５センチ幅、１２０ｒｐｍ。
本培養：前培養で調製した培養液（フラスコ１０本分、１Ｌ分）を、無菌的に（培地２）に接種した。そして、ジャーファーメンターを２７℃で、１７時間、運転した。通気量は、１ｖｖｍ（１５０Ｌ／分）、攪拌数は、３００ｒｐｍ。

本発明において寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＡＨＵ１７５２（ＦＥＲＭＢＰ−８２９６）。

Claims

純度６０％以上のジフルクトース・ジアンヒドリドＩＩＩ（以下、ＤＦＡＩＩＩという）をＲ−Ｂｘ１０以上の濃度で含有するＤＦＡＩＩＩ粗液（イヌリンにアースロバクターエスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）ＡＨＵ１７５３株（ＦＥＲＭＢＰ−８２９６）由来のイヌリンフラクトシルトランスフェラーゼ（デポリメライジング）（ｉｎｕｌｉｎｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ））を作用させて製造した酵素反応液を除く）に粉末活性炭を固形分に対して０．１％〜５％添加して清浄化した後、固液分離し、分離した液状部を濃縮した後、直ちに冷却結晶化すること、を特徴とする臭いまでも除去されたＤＦＡＩＩＩ結晶の製造方法。
液状部を濃縮した後、ＤＦＡＩＩＩをＲ−Ｂｘ６０以上の濃度で含有すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
冷却結晶化工程において、１５〜２０℃まで冷却して結晶化すること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
冷却結晶化工程において、２３時間以上かけて冷却して結晶化すること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
ＤＦＡＩＩＩ粗液が、ＤＦＡＩＩＩ含有液、クロマトグラフィー処理して得たＤＦＡＩＩＩ画分、結晶又は粗結晶シラップの少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
粉末活性炭の平均粒径が１５〜５０ミクロンであり、最大粒径が２００ミクロン以下であること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
固液分離する方法が、濾過助剤を使用する濾過、メンブランフィルターを用いる方法、限外濾過膜を用いる方法から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。