JPH04271792A - ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの製造方法 - Google Patents
ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの製造方法Info
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- JPH04271792A JPH04271792A JP3461591A JP3461591A JPH04271792A JP H04271792 A JPH04271792 A JP H04271792A JP 3461591 A JP3461591 A JP 3461591A JP 3461591 A JP3461591 A JP 3461591A JP H04271792 A JPH04271792 A JP H04271792A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はジフルクトース・ジアン
ヒドリドＩＩＩ （以下、ＤＦＡＩＩＩ ということも
ある）の製造方法に関するものである。
ヒドリドＩＩＩ （以下、ＤＦＡＩＩＩ ということも
ある）の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする問題点】ジフ
ルクトース・ジアンヒドリドＩＩＩ は２個のフラクト
ース分子が１−２′及び２−３′で脱水縮合した二糖類
であり、ジャクソンらにより１９２９年に単離同定され
ている（Ｂｕｒ．ｓｔａｎｄ．Ｊ．Ｒｅｓ．，３，２７
，１９２９）。
ルクトース・ジアンヒドリドＩＩＩ は２個のフラクト
ース分子が１−２′及び２−３′で脱水縮合した二糖類
であり、ジャクソンらにより１９２９年に単離同定され
ている（Ｂｕｒ．ｓｔａｎｄ．Ｊ．Ｒｅｓ．，３，２７
，１９２９）。
【０００３】ＤＦＡＩＩＩ は、動物体内では代謝され
ず、非発酵性の糖であるため、低カロリー甘味料として
注目されており、今後美容食等多方面に利用されること
が予想される。ジャクソンらは、フルクトースを主成分
とする多糖分であるイヌリンを酸加水分解することによ
り、ＤＦＡＩＩＩ を得ているが収率はわずか２％弱で
あり、化学的に生産する方法として効率的とは言えない
。
ず、非発酵性の糖であるため、低カロリー甘味料として
注目されており、今後美容食等多方面に利用されること
が予想される。ジャクソンらは、フルクトースを主成分
とする多糖分であるイヌリンを酸加水分解することによ
り、ＤＦＡＩＩＩ を得ているが収率はわずか２％弱で
あり、化学的に生産する方法として効率的とは言えない
。
【０００４】そこで近年、微生物学的方法を利用してイ
ヌリンからＤＦＡＩＩＩ を製造する方法が提唱されて
いる。１９７２年に田中らにより、アルスロバクター・
ウレアファシエンスの生産するイヌリン分解酵素を用い
てイヌリンからＤＦＡＩＩＩ を生産させることが報告
されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｏｉｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，２８４，２４８，１９７２）。
ヌリンからＤＦＡＩＩＩ を製造する方法が提唱されて
いる。１９７２年に田中らにより、アルスロバクター・
ウレアファシエンスの生産するイヌリン分解酵素を用い
てイヌリンからＤＦＡＩＩＩ を生産させることが報告
されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｏｉｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，２８４，２４８，１９７２）。
【０００５】また、田村らによりシュードモナス・フル
オレッセンスの生産するイヌリン分解酵素を用いてイヌ
リンからＤＦＡＩＩＩ を生産させることが提案されて
いる（特開昭６３−２１９３７２号公報）。しかし、そ
れらのＤＦＡＩＩＩ の生産能は工業的に使用するには
未だ十分とは言えず、従来、微生物を用いる方法による
ＤＦＡＩＩＩ の製造方法は、まだ経済的とはいえず、
効率的に酵素を生産せしめＤＦＡＩＩＩ を生産させる
方法の提供が要望されていた。
オレッセンスの生産するイヌリン分解酵素を用いてイヌ
リンからＤＦＡＩＩＩ を生産させることが提案されて
いる（特開昭６３−２１９３７２号公報）。しかし、そ
れらのＤＦＡＩＩＩ の生産能は工業的に使用するには
未だ十分とは言えず、従来、微生物を用いる方法による
ＤＦＡＩＩＩ の製造方法は、まだ経済的とはいえず、
効率的に酵素を生産せしめＤＦＡＩＩＩ を生産させる
方法の提供が要望されていた。
【０００６】冨田らは、アルスロバクター・エスピーＭ
ＣＩ−２４９６〔微工研菌寄第１１２８８号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１１２８８）〕由来のイヌリン分解酵素により、従
来より効率よくＤＦＡＩＩＩ を製造することができる
ことを報告している〔９０年農芸化学会大会予稿集第３
５７頁（１９９０）、８９年発酵工学大会予稿集第２３
４頁（１９８９）及び特願平２−５９６９９号公報〕。
ＣＩ−２４９６〔微工研菌寄第１１２８８号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１１２８８）〕由来のイヌリン分解酵素により、従
来より効率よくＤＦＡＩＩＩ を製造することができる
ことを報告している〔９０年農芸化学会大会予稿集第３
５７頁（１９９０）、８９年発酵工学大会予稿集第２３
４頁（１９８９）及び特願平２−５９６９９号公報〕。
【０００７】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、更に、
イヌリンからＤＦＡＩＩＩ を効率良く製造する方法に
ついて培養条件に着目して鋭意研究を進めた結果、イヌ
リン分解酵素産生能を有するアルスロバクター属に属す
る細菌、例えばアルスロバクター・エスピーＭＣＩ２４
９６（微工研菌寄第１１２８８号）を酵母エキスを０．
０４〜０．８％含む培養液で培養することにより、イヌ
リン分解酵素を良好に産生させることができ、培養液中
のイヌリンを分解してＤＦＡＩＩＩ を更に効率よく生
産させ得る事を見出し、本発明を完成するに至った。
イヌリンからＤＦＡＩＩＩ を効率良く製造する方法に
ついて培養条件に着目して鋭意研究を進めた結果、イヌ
リン分解酵素産生能を有するアルスロバクター属に属す
る細菌、例えばアルスロバクター・エスピーＭＣＩ２４
９６（微工研菌寄第１１２８８号）を酵母エキスを０．
０４〜０．８％含む培養液で培養することにより、イヌ
リン分解酵素を良好に産生させることができ、培養液中
のイヌリンを分解してＤＦＡＩＩＩ を更に効率よく生
産させ得る事を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明の要旨は、少なくともイ
ヌリン及び０．０４〜０．８％の酵母エキスを含む培養
液中で、イヌリン分解酵素産生能を有するアルスロバク
ター属に属する細菌を培養して得られるイヌリン分解酵
素とイヌリンを反応させることを特徴とするＤＦＡＩＩ
Ｉ の製造方法に存する。
ヌリン及び０．０４〜０．８％の酵母エキスを含む培養
液中で、イヌリン分解酵素産生能を有するアルスロバク
ター属に属する細菌を培養して得られるイヌリン分解酵
素とイヌリンを反応させることを特徴とするＤＦＡＩＩ
Ｉ の製造方法に存する。
【０００９】以下、本発明を説明する。本発明で使用す
るイヌリン分解酵素産生能を有するアルスロバクター属
に属する細菌としては、例えば、特願平２−５９６９９
号公報に記載されているようなアルスロバクター・エス
ピーＭＣＩ２４９６〔微工研菌寄第１１２８８号（ＦＥ
ＲＭＰ−１１２８８）〕、特開平１−２２５４９２号公
報に記載されているようなアルスロバクター・イリシス
ＭＣＩ２２９７〔微工研菌寄第９８９３号（ＦＥＲＭＰ
−９８９３）〕，アルスロバクター・ウレアファシエン
ス（Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｏｉｐｈｙｓ，Ａｃｔａ， ２
８４，２４８，１９７２）等が挙げられる。
るイヌリン分解酵素産生能を有するアルスロバクター属
に属する細菌としては、例えば、特願平２−５９６９９
号公報に記載されているようなアルスロバクター・エス
ピーＭＣＩ２４９６〔微工研菌寄第１１２８８号（ＦＥ
ＲＭＰ−１１２８８）〕、特開平１−２２５４９２号公
報に記載されているようなアルスロバクター・イリシス
ＭＣＩ２２９７〔微工研菌寄第９８９３号（ＦＥＲＭＰ
−９８９３）〕，アルスロバクター・ウレアファシエン
ス（Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｏｉｐｈｙｓ，Ａｃｔａ， ２
８４，２４８，１９７２）等が挙げられる。
【００１０】本発明で使用する培養液は、キクイモ，ゴ
ボウ，チコリ等のイヌリン含有量の高い植物の抽出液及
び／又はイヌリンを唯一の炭素源として含む。通常、イ
ヌリン量は培養液中０．５％以上、好ましくは１〜４％
、特に好ましくは１〜２％含む。また、本発明の培養液
は、有機窒素源として酵母エキスを０．０４〜０．８％
、好ましくは、０．０５〜０．７％、特に好ましくは、
０．１〜０．５％含む。従来、イヌリン分解酵素産生能
を有するアルスロバクター属に属する細菌を培養する際
、酵母エキスは０．０２％程度しか使用されていなかっ
たが、上記範囲とすることによってイヌリン分解酵素を
培養上清に効率よく産生させることができる。その他、
培養液中には、無機窒素源として、硫酸アンモニウム、
硝酸ソーダ、尿素、硝酸カリウム等、その他必要に応じ
て、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム
、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生
成する無機塩類を添加することは有効である。
ボウ，チコリ等のイヌリン含有量の高い植物の抽出液及
び／又はイヌリンを唯一の炭素源として含む。通常、イ
ヌリン量は培養液中０．５％以上、好ましくは１〜４％
、特に好ましくは１〜２％含む。また、本発明の培養液
は、有機窒素源として酵母エキスを０．０４〜０．８％
、好ましくは、０．０５〜０．７％、特に好ましくは、
０．１〜０．５％含む。従来、イヌリン分解酵素産生能
を有するアルスロバクター属に属する細菌を培養する際
、酵母エキスは０．０２％程度しか使用されていなかっ
たが、上記範囲とすることによってイヌリン分解酵素を
培養上清に効率よく産生させることができる。その他、
培養液中には、無機窒素源として、硫酸アンモニウム、
硝酸ソーダ、尿素、硝酸カリウム等、その他必要に応じ
て、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム
、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生
成する無機塩類を添加することは有効である。
【００１１】具体的には、例えば、下記のような組成の
培養液が好適に使用できる。 かかる培養液中で上記アルスロバクター属に属する細菌
の培養は、培養温度２０〜５０℃で、１２〜１２０時間
程度振とう培養を行うのが好適である。
培養液が好適に使用できる。 かかる培養液中で上記アルスロバクター属に属する細菌
の培養は、培養温度２０〜５０℃で、１２〜１２０時間
程度振とう培養を行うのが好適である。
【００１２】本発明においては、イヌリン或いはキクイ
モ、ゴボウ等のイヌリン含有量の高い植物の抽出液を唯
一の炭素源として含む溶液中で、上記のようにして得ら
れるイヌリン分解酵素を作用させる。その際、該細菌そ
のものを作用させてもよいし、また、該細菌から該酵素
を抽出し、それを作用させてもよい。酵素を作用させる
場合、まず前記方法により培養を行った培養液を遠心分
離により除菌し、得られたろ液に硫安（６５％飽和）を
加え塩析を行い、析出した沈澱物を遠心分離により取得
し、少量の水に懸濁させたのち透析を行い、粗酵素液を
得る。この粗酵素液を例えばｐＨ７．０に調整した０．
０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液中でイヌリンに作用させ
ることによっても所望のＤＦＡＩＩＩ が得られる。本
粗酵素液は、例えばＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６
５０Ｍ，ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（
東ソー製）によるイオン交換クロマトグラフィーにて精
製を行うことにより、電気泳動的に単一のバンドを示す
酵素標品を得ることができる。
モ、ゴボウ等のイヌリン含有量の高い植物の抽出液を唯
一の炭素源として含む溶液中で、上記のようにして得ら
れるイヌリン分解酵素を作用させる。その際、該細菌そ
のものを作用させてもよいし、また、該細菌から該酵素
を抽出し、それを作用させてもよい。酵素を作用させる
場合、まず前記方法により培養を行った培養液を遠心分
離により除菌し、得られたろ液に硫安（６５％飽和）を
加え塩析を行い、析出した沈澱物を遠心分離により取得
し、少量の水に懸濁させたのち透析を行い、粗酵素液を
得る。この粗酵素液を例えばｐＨ７．０に調整した０．
０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液中でイヌリンに作用させ
ることによっても所望のＤＦＡＩＩＩ が得られる。本
粗酵素液は、例えばＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６
５０Ｍ，ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（
東ソー製）によるイオン交換クロマトグラフィーにて精
製を行うことにより、電気泳動的に単一のバンドを示す
酵素標品を得ることができる。
【００１３】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明の方法をさらに
具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り
これらに限定されるものではない。 （実施例１）硝酸ナトリウム０．５％，硫酸マグネシウ
ム０．０５％、塩化カリウム０．０５％，リン酸１カリ
ウム０．０５％，塩化第二鉄０．００１％を含んだ基本
培地にイヌリン１％及び、酵母エキスをそれぞれ０．０
２％，０．０５％，０．１％，０．５％，０．７％，１
％加えた培地１００ｍｌをｐＨ７．０に調整して５００
ｍｌの坂口フラスコに入れ、１２０℃２０分間蒸気滅菌
した。この滅菌した培地にアルスロバクター・エスピー
ＭＣＩ２４９６菌を１白金耳接種し、１６０ｒｐｍで２
７℃、３０時間培養した。培養終了後遠心分離により菌
体を除去し、培養濾液を得た。得られた培養濾液を粗酵
素液とする。粗酵素液中のイヌリンフラクトトランスフ
ェラーゼの活性は粗酵素液に５％のイヌリン，５０ｍＭ
クエン酸緩衝液ｐＨ５．５を含む全量１ｍｌの反応液を
用いて測定した。この反応液を６０℃で１０分間反応さ
せ、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止さ
せた。生成したＤＦＡＩＩＩ をＨＰＬＣで定量した。 なお１ｕｎｉｔ（Ｕ）の酵素量は、本条件下で１分間に
１μｍｏｌのＤＦＡＩＩＩ を生産する酵素量と定義し
た。その結果酵母エキスの量を変化させた時の培養液中
のイヌリンフラクトトランスフェラーゼの活性は以下の
表１のようになった。
具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り
これらに限定されるものではない。 （実施例１）硝酸ナトリウム０．５％，硫酸マグネシウ
ム０．０５％、塩化カリウム０．０５％，リン酸１カリ
ウム０．０５％，塩化第二鉄０．００１％を含んだ基本
培地にイヌリン１％及び、酵母エキスをそれぞれ０．０
２％，０．０５％，０．１％，０．５％，０．７％，１
％加えた培地１００ｍｌをｐＨ７．０に調整して５００
ｍｌの坂口フラスコに入れ、１２０℃２０分間蒸気滅菌
した。この滅菌した培地にアルスロバクター・エスピー
ＭＣＩ２４９６菌を１白金耳接種し、１６０ｒｐｍで２
７℃、３０時間培養した。培養終了後遠心分離により菌
体を除去し、培養濾液を得た。得られた培養濾液を粗酵
素液とする。粗酵素液中のイヌリンフラクトトランスフ
ェラーゼの活性は粗酵素液に５％のイヌリン，５０ｍＭ
クエン酸緩衝液ｐＨ５．５を含む全量１ｍｌの反応液を
用いて測定した。この反応液を６０℃で１０分間反応さ
せ、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止さ
せた。生成したＤＦＡＩＩＩ をＨＰＬＣで定量した。 なお１ｕｎｉｔ（Ｕ）の酵素量は、本条件下で１分間に
１μｍｏｌのＤＦＡＩＩＩ を生産する酵素量と定義し
た。その結果酵母エキスの量を変化させた時の培養液中
のイヌリンフラクトトランスフェラーゼの活性は以下の
表１のようになった。
【００１４】
【表１】
【００１５】（実施例２）実施例１と同様の基本培地に
イヌリン１％と酵母エキス０．５％を加え２７℃、７２
時間培養後の上清のイヌリンフラクトトランスフェラー
ゼ活性を測定したところ、９２Ｕ／ｍｌであった。この
粗酵素液を用いてＤＦＡＩＩＩ を生産させた。反応液
は、５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．５，イヌリン２５
％および粗酵素液を最終活性として１８．４Ｕ／ｍｌ含
み、全量５０ｍｌとした。６０℃で４時間反応させ、反
応溶液中に蓄積するＤＦＡＩＩＩ を定量したところ、
１２．５ｇのイヌリンから１０．３ｇのＤＦＡＩＩＩ
が生成した。 収率は８２．４％であった。
イヌリン１％と酵母エキス０．５％を加え２７℃、７２
時間培養後の上清のイヌリンフラクトトランスフェラー
ゼ活性を測定したところ、９２Ｕ／ｍｌであった。この
粗酵素液を用いてＤＦＡＩＩＩ を生産させた。反応液
は、５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．５，イヌリン２５
％および粗酵素液を最終活性として１８．４Ｕ／ｍｌ含
み、全量５０ｍｌとした。６０℃で４時間反応させ、反
応溶液中に蓄積するＤＦＡＩＩＩ を定量したところ、
１２．５ｇのイヌリンから１０．３ｇのＤＦＡＩＩＩ
が生成した。 収率は８２．４％であった。
【００１６】（実施例３）実施例１と同様の基本培地に
酵母エキス０．５％及びイヌリンをそれぞれ０．５％，
１％，２％，５％，加えた培地で２７℃３０時間培養し
、培養液上清中のイヌリンフラクトトランスフェラーゼ
の活性は以下の表２のようになった。
酵母エキス０．５％及びイヌリンをそれぞれ０．５％，
１％，２％，５％，加えた培地で２７℃３０時間培養し
、培養液上清中のイヌリンフラクトトランスフェラーゼ
の活性は以下の表２のようになった。
【００１７】
【表２】
【００１８】
【発明の効果】本発明の製法によれば、アルスロバクタ
ー属に属する細菌を酵母エキスを０．０４〜０．８％含
みイヌリンを含んだ培養液で培養することによりイヌリ
ン分解酵素を効率良く生産させ、その培養上清中のイヌ
リン分解酵素とイヌリン溶液を反応させることにより、
ＤＦＡＩＩＩ を効率良く経済的に取得することが可能
となる。
ー属に属する細菌を酵母エキスを０．０４〜０．８％含
みイヌリンを含んだ培養液で培養することによりイヌリ
ン分解酵素を効率良く生産させ、その培養上清中のイヌ
リン分解酵素とイヌリン溶液を反応させることにより、
ＤＦＡＩＩＩ を効率良く経済的に取得することが可能
となる。
Claims (2)
- 【請求項１】 少なくともイヌリン及び０．０４〜０
．８％の酵母エキスを含む培養液中で、イヌリン分解酵
素産生能を有するアルスロバクター属に属する細菌を培
養して得られるイヌリン分解酵素とイヌリンを反応させ
ることを特徴とするジフルクトース・ジアンヒドリドＩ
ＩＩ の製造方法 - 【請求項２】 アルスロバクター属に属する細菌がア
ルスロバクター・エスピー・ＭＣＩ２４９６（微工研菌
寄第１１２８８号）であることを特徴とする請求項１記
載のジフルクトース・ジアンヒドリドＩＩＩ の製造方
法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3461591A JPH04271792A (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3461591A JPH04271792A (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04271792A true JPH04271792A (ja) | 1992-09-28 |
Family
ID=12419283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3461591A Pending JPH04271792A (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04271792A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004078989A1 (ja) * | 2003-03-05 | 2004-09-16 | Nippon Beet Sugar Mfg. Co., Ltd. | ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの精製方法 |
| JP2006223283A (ja) * | 2005-02-17 | 2006-08-31 | Mitsui Norin Co Ltd | 環状イヌロオリゴ糖及びジフルクトース・ジアンヒドリド含有組成物 |
| US8039615B2 (en) | 2004-12-28 | 2011-10-18 | Nippon Beet Sugar Manufacturing Co., Ltd. | Process for producing difructose dianhydride III crystals |
-
1991
- 1991-02-28 JP JP3461591A patent/JPH04271792A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004078989A1 (ja) * | 2003-03-05 | 2004-09-16 | Nippon Beet Sugar Mfg. Co., Ltd. | ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの精製方法 |
| EP1612274A1 (en) * | 2003-03-05 | 2006-01-04 | Nippon Beet Sugar Mfg. Co., Ltd. | Process for purifying difructose-dianhydride iii |
| JPWO2004078989A1 (ja) * | 2003-03-05 | 2006-06-08 | 日本甜菜製糖株式会社 | ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの精製方法 |
| JP4572167B2 (ja) * | 2003-03-05 | 2010-10-27 | 日本甜菜製糖株式会社 | ジフルクトース・ジアンヒドリドｉｉｉの精製方法 |
| EP1612274A4 (en) * | 2003-03-05 | 2011-05-11 | Nippon Beet Sugar Mfg | PROCESS FOR PURIFYING DIFRUCTOSE-DIANHYDRIDE III |
| US7998710B2 (en) | 2003-03-05 | 2011-08-16 | Nippon Beet Sugar Mfg., Co., Ltd. | Process for purifying difructose dianhydride III |
| US8039615B2 (en) | 2004-12-28 | 2011-10-18 | Nippon Beet Sugar Manufacturing Co., Ltd. | Process for producing difructose dianhydride III crystals |
| US8304534B2 (en) | 2004-12-28 | 2012-11-06 | Nippon Beet Sugar Manufacturing Co., Ltd. | Process for producing difructose dianhydride III crystals |
| JP2006223283A (ja) * | 2005-02-17 | 2006-08-31 | Mitsui Norin Co Ltd | 環状イヌロオリゴ糖及びジフルクトース・ジアンヒドリド含有組成物 |
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