JPS63273491A - ガラクトオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産１上り亘」欠！ 本発明は、ビフイドバクテ１功ム薗増殖促進作用を有す
るオリゴ糖を製造する方法に関するものである。

従来の技術 乳糖のβ−〃ラクトシル転移反応等により生成するガラ
クトース−グルコース系のオリゴ糖は母乳オリゴ糖の主
要構成成分であり、且つヒト腸内に生息する有用細菌・
ビフィドバクテリウム菌の増殖促進因子として有用なも
のである（特公昭５８−２０２６６号公報等）。

一般弐〇ａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ　（但し式中Ｇａ
ｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルツース残基、ｎは
１〜４の整数を、それぞれ表わす）で示されるこのオリ
ゴ糖（この明細書では、これをガラクトオリゴ糖ともい
う）は、その後、発酵乳や乳児用粉乳へ添加されるなど
、種々の分野で利用されるようになった。

乳糖からガラクトオリゴ糖を生成させる方法としては、
乳糖に７スベルギル又・オリゼのβ−がラクトシグーゼ
を作用させる方法（前出公報）、クリプトコツカス属酵
母を利用する方法（特開昭６０−２５１８９６号公報）
などがあるが、いずれの方法によっても、乳糖のすべて
をガラクトオリゴ糖に変換することはできず、得られる
ものは２０〜６０％程度のガラクトオリゴ糖のほかに未
反応の乳糖を主体とする二糖類と副生するグルコース、
ガラクトース等の単糖類とを含有する糖混合物の溶液（
この溶液を、本明細書では糖液という）である。そこで
ビフィドバクテリウム菌増殖促進因子としての活性の高
いガラクトオリゴ糖製品を得るためには、糖液の精製、
すなわち該糖液中のガラクトオリゴ糖と他の糖類とを分
離し、なるべく純度の高いガラクトオリゴ糖を得ること
が必要になる。

そのための従来の精製法としては、まず活性炭法があっ
ｔこ（前出公報）。この方法は、活性炭カラムに糖液を
流してその中の糖類をカラムに吸着させ、次いで水また
は低濃度のエタノールで単糖類および乳糖を溶出させて
除き、その後、高濃度のエタ／−ルでガラクトオリゴ糖
を溶出させて溶出液からガラクトオリゴ糖を得るもので
、主たる分離モードは吸着分配である。しかしながら、
この方法は分子サイズによる糖の分離が不充分であって
、高純度のガラクトオリゴ糖を得ようとすると収率がき
わめて悪いという欠点がある。また、エタノールを使用
するため、エタノール代、エタノールの回収費、蒸留装
置建設費等がかさみ、精製コストが高いのも問題である
。

三次元架橋結合を形成させたデキストラン、セルロース
、ポリアクリル７ミド等を基材とするゲル濾過剤を用い
て分子サイズによる分離を行うゲル濾過法もあったが、
これは、ゲル濾過剤の寿命が短いこと、単位樹脂量当り
の適正負荷量が小さく過負荷状態では分離能が極端に悪
くなること、にもかかわらずかなり高価であること、な
どにより、実験室規楳でしか実施することができない。

その他、一般的なオリゴ糖の分離法としては、イオン交
換基を持たない多孔性ポリマーからなる合成吸着剤を用
いる方法がある（特開昭６１−１３０２９７号公報等）
、この方法は、合成吸着剤を充填したカラムに被処理液
を供給し、吸着された糖類を水または水とアルコールの
濃度勾配により溶出させるもので、糖と吸着剤の間の親
和力の差により糖が分子量の小さい順に溶出し、分離が
行われる。しかしながら、この方法を糖液の精製に適用
しても、水だけでの溶出では五糖類以上のガラクトオリ
ゴ糖の回収に時間がかかりすぎ、回収率も満足できるも
のではなく、しがも回収糖濃度がきわめて低いことがわ
かった。溶出にアルコール水溶液を用いればガラクトオ
リゴ糖の回収率は上がるが、次の糖液を負荷する前にカ
ラム内を水で平衡化しなければならないので連続的な分
離ができないし、アルコール化も必要になる。要するに
この方法も、能率が悪いうえにコストが高く、実際的で
はない。

一方、糖液には前述のようにかなりの未反応乳糖が含ま
れているから、これを効率よく回収し、原料乳糖として
再利用することがガラクトオリゴ糖の製造コストを下げ
るために望ましい。しかしなが呟回収乳糖の再利用には
、その乳糖がグルコースやガラクトースなどの単糖類を
含有するとβ−〃ラクトシダーゼを作用させたとき転移
二糖類を生じ、結果としてガラクトオリゴ糖の生成量が
低下するだけでなく、ガラクトースにより酵素反応が阻
害されて反応の進行が遅くなるという問題がある。した
がって、再利用する回収乳糖はできるだけ単糖類含有率
の低いものでなければならないが、従来のガラクトオリ
ゴ糖分離精製法によっては、β−がラクトシグーゼ処理
に再利用可能な程度に単糖含有率の低い乳糖を同時に得
ることは困難であった。

一明が解　しようとする問題点 本発明の目的は、上述のような現状に鑑み、糖液から従
来よりも効率よく高純度のガラクトオリゴ糖を回収し得
る精製工程を含む高品質ガラクトオリゴ糖の製造法を提
供することにある。

本発明の他の目的は、高純度のガラクトオリゴ糖ととも
に（β−〃ラクトシダーゼを用いる場合にも使用可能な
程度に）単糖含有率の低い乳糖を回収し回収乳糖を原料
乳糖として再利用することにより安価に高品質ガラクト
オリゴ糖を得ることができる、従来よりも有利なガラク
トオリゴ糖の製法を提供することにある。

問題点を解決するための手段 上記目的を達成した本発明は、乳糖がらガラクトオリゴ
糖への転移反応を生起させることのできる任意の酵素ま
たは微生物を乳糖に作用させてガラクトオリゴ糖を含有
する糖液を得、次いで強酸性陽イオン交換樹脂を用いる
カラムクロマトグラフィーにより上記糖液中の糖成分の
分離を行い、カラム溶出液よりガラクトオリゴ糖高含有
画分を採取することを特徴とする第一の発明と、上記第
一発明の製法においてさらにカラム溶出液より乳糖高含
有画分を採取しこれを原料乳糖の一部として再利用する
ことを特徴とする第二の発明との二発明からなる。

本発明の製法においては、まず任意の方法により乳糖か
らガラクトオリゴ糖を生成させる。すなわち、乳糖から
ガラクトオリゴ糖への転移反応を生起させることのでき
る酵素（たとえばβ−がラクトシグーゼ）＊たけ微生物
（たとえばクリプトコツカス酵母）を乳糖に作用させて
、ガラクトオリゴ糖を含有する糖液を得る。

酵素を用いる代表的な処理法について述べると、たとえ
ばアスペルギルス・オリゼのβ−ガラクトシダーゼを用
いて、乳糖濃度１０〜９０重量％、酵素濃度１〜１００
単位／ｍｌで、ｐＨ約３〜８、温度約２０℃以上におい
て酵素処理を行う。

反応が進むにつれてグルツース、ガラクトース等の単糖
とガラクトオリゴ糖がほぼ直線的に増加するが、その後
はやや複雑な変化を示し、オリゴ糖はある時点から徐々
に減少する傾向を示す。したがって、通常は最高のオリ
ゴ糖収率を与える時点で反応を打切る。酵素反応は、処
理液を約９０℃以上に５〜１０分間加熱すれば停止させ
ることができる。

微生物を利用する場合は、乳糖を含有する培地でその微
生物を培養し、培養液中にガラクトオリゴ糖を生成させ
たのち微生物を除去して糖液を得る。

転移反応に酵素を用いた場合も微生物を用いた場合も、
得られた糖液は、必要に応じて粉炭による脱色処理やイ
オン交換樹脂による脱塩処理などの予備的精製を施し、
糖濃度が低い場合はさらに減圧下に濃縮するなどしてか
呟強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラ
フィーによる精製を行う。

糖類の分離精製に用いる強酸性陽イオン交換樹脂は、ク
ロマトグラフィー用の、なるべく粒径の均一度が高いも
のであることが望ましい。さら１こ、その中でも、スチ
レンジビニルベンゼン共重合体を基体とし一８ｏ、−基
を交換基とするもののＮａ形、Ｋ形またはＣａ形のもの
が適当である。Ｎａ形のものは特に糖類分離能にすぐれ
ており、最も好ましい０本発明の製法において特に好ま
しい強酸性陽イオン交換樹脂の具体例としては、ユニビ
ーズＵＢＫ−１０１Ｌ、同ＵＢＫ−５３０（いずれも三
菱化成株式会社製品）がある。

上述のようなイオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグ
ラフィーは、樹脂カラム、被処理糖液および溶出用の水
の温度を約５０〜９０°Ｃ１望ましくは約６０〜８０℃
の範囲で、できるだけ一定に保って実施することが、良
好な分離を達成するために必要である。カラムに供給す
る糖液の糖濃度は３０〜６５％（ｗ／＋ｓ）程度が適当
で、これよりも濃度が高いと分離パターンに乱れを生じ
る。

強酸性陽イオン交換樹脂を用いて行うクロマトグラフィ
ーによる糖液構成成分の分離は、分子サイズ排除効果（
架橋樹脂内へ浸透し得ない大きな分子サイズの糖から先
に溶出させる効果）による。

分離操作は、基本的には次のようにして行う。

■　カラムに糖液を供給して樹脂に糖類を吸着させる。

その量は、樹脂量の約２〜２０％ｖ／ｖが適当である。

■　カラムにＳｖ約０．１〜２　／　Ｈｒで水を流して
糖類を溶出させる。

■　溶出液より、最初に溶出するガラクトオリゴ糖高含
有画分を採取し、以下、順次溶出するガラクトオリゴ糖
・乳糖画分（両成分混在画分）、乳糖高含有画分、乳糖
・単糖類画分（両成分混在画分）および単糖類高含有画
分を採取する（必要がなければ、ガラクトオリゴ糖を含
まない溶出液の分画は省略する）。

大量の糖液を連続的に処理して高純度のガラクトオリゴ
糖を得ようとする場合は、第１図に示したような直列接
続の二つのカラム・Ｃ−１，Ｃ−２を用いて次のような
６ステツプ１サイクルの循環操作法を採用するのが有利
である（第１図中の数字はステップ番号を示す）。

ステップ１：糖液Ｓを上部カラムＣ−１に注入する。こ
のとき下部カラムＣ−２の出口からは、前回注入した糖
液Ｓより分離された乳糖高含有画分りが溶出する。

ステップ２：上部カラムＣ−１と下部カラムＣ−２との
連活部より下部カラムＣ−２に水Ｗを注入し、下部カラ
ムＣ−２出口からの乳糖高含有画分りの溶出を終わらせ
る。

ステップ３　：乳糖高含有画分りに続いて下部カラムＣ
−２出口より溶出して来る乳糖・単糖類画分Ｌ−Ｍ　（
前回注入した糖ＷＬＳから分離されたもの）を上部カラ
ムＣ−１に戻す。

ステップ４：上部カラムＣ−１人口より水Ｗを注入し、
下部カラムＣ−２の出口より単糖類高含有画分Ｍ（前回
注入した糖液Ｓから分離されたもの）を溶出させる。

ステップ５　：上部カラムＣ−１の入口より水Ｗを注入
し、ステップ１で供給した糖液Ｓから分離されたガラク
トオリゴ糖高含有画分０を下部カラムＣ−２の出口より
溶出させる。

ステップ６：ガラクトオリゴ糖高含有画分Ｏに続いて下
部カラムＣ−２の出口より溶出して来るガラクトオリゴ
糖・乳糖画分０・Ｌを上部カラムＣ−１に戻す。

この方法によれば、高純度のガラクトオリゴ糖、乳糖お
よび単糖類を、いずれも回収容易な高濃度溶出液の形で
半連続的に得ることができ、ガラクトオリゴ糖の精製損
失もほとんどない。

そしてステップ１，２で得た乳糖高含有画分は、第二発
明の製法においてそのままガラクトオリゴ糖調製原料と
して再利用することができる。なおガラクトオリゴ糖調
製法が前述のように単糖類の存在を嫌うβ−〃ラクトシ
グーゼ法の場合は、回収乳糖中の単糖類の量が問題にな
るが、単糖類含有率が充分低くなるように分画条件を選
ぶことにより、また新たに仕込まれる乳糖と混合して使
用することにより、転移反応に支障がない程度に単糖含
有率の低い反応原料を調製することは容易である。しか
しながら、必要ならば乳糖高含有画分は濃縮して乳糖を
品出させるなどの方法によりさらに単糖類を除いてから
再利用してもよい。

発明の効果 本発明のガラクトオリゴ糖製造法は、従来の製造法と比
べると下記のように多くの点で有利なものである。

（１）　きわめて高純度の、したがってビフィドバクテ
リウム菌増殖促進因子としての活性の高いガラクトオリ
ゴ糖を、容易に製造することができる。、また、単糖類
お上り乳糖の含有率の低い製品が得られることによって
、甘味やカロリーが使用上の障害になったり乳糖不耐症
体質者が下痢を起こしたりするといった問題も無くなり
、さらに、凍結乾燥法または噴霧乾燥法により取扱い容
易な粉末化することも容易になる。

以上により、ガラクトオリゴ糖のすぐれた性質を従来よ
りも広い範囲で活用することが可能になる。

（２）　クロマトグラフィーに用いる強酸性陽イオン交
換樹脂は耐圧縮性、耐久性、繰作性にすぐれており、し
かも安価であるから、工業的な大規模実施に適している
。

（３）強酸性陽イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフ
ィーは、イオン交換基を持たない吸着樹脂や活性炭を使
用する方法と違って有機溶媒を必要とせず、水だけで溶
出でき、１サイクル終わるたびにカラムを水で平衡化す
る必要もない。

したがって、連続的な精製揉作を容易に且つきわめて能
率よく行うことができ、ガラクトオリゴ糖や乳糖の純度
および回収率も高い。そして有機溶媒使用にともなう回
収管その他の賛用も不要であるか呟ランニングコストが
きわめて低い。

（４）回収される乳糖が高純度であり、多くの場合その
まま反応原料として再利用できる品質を持つ、したがっ
て、これを再利用することによりきわめて高い収率でガ
ラクトオリゴ糖を製造することが可能である。

（５）上記（２）〜（４）により、きわめて安価にガラ
クトオリゴ糖を提供することが可能である。

・　（６）回収される単糖類高含有画分は甘味シロップ
として飲食品製造にそのまま利用でき、また甘味料原料
として利用することもできる。

ＩＬ胴 以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例　１ 局方乳糖５００ｇを１ｅの温水に溶解し、これにｐＨ４
，５の緩衝液お上りβ−がラクトシグーゼ１万単位を加
え、４０℃で５時間反応させた。次いで反応液を９５℃
に加熱して酵素を失活させ、ろ過後、強酸性陽イオン交
換樹脂・ダイヤイオン５ＫＩＢと強塩基性陰イオン交換
樹脂・ダイヤイオンＰＡ３０８との混床樹脂塔を通して
脱塩処理し、さらに減圧下に濃縮して糖濃度を４３％１
／彎にした。得られた糖液の糖組成は、ガラクトオリゴ
糖２４．２％、乳糖４３．６％、グルコース２３．５％
、ガラクトース８．７％であった。

この糖液を、６０℃に加熱したクロマトグラフィー用強
酸性陽イオン交換樹脂カラム（内径１０ｍｍ、長さ１０
００ｎ＋ｍのジャケット付カラム；使用樹脂：ユニビー
ズｔＪＢＫ−１０１Ｌ、Ｎａ形）に樹脂量の５％加えた
のち、６０℃の温水で溶出した。糖液および温水の注入
速度（ＳＶ）は０．５／Ｈｒとした。

カラムからの溶出液を２ｍｌずつ分取して、糖組成を高
速液本クロマトグラフィーで分析した。その結果を第２
図に示す。

実施例　２ 食品グレードの乳糖４ｋｇを２．３Ｃの温水に溶解し、
実施例１で用いたものと同じ酵素を８万単位加えて６７
℃で２時間反応させた。その後、反応液を９５°Ｃに１
０分間加熱して酵素を失活させ、粉炭とセライトを加え
てろ過し、イオン交換樹脂を用いてろ液を脱塩処理した
。得られた糖液（全糖濃度６２．５％；糖組成：ガラク
トオリゴ糖２９．５％、乳糖４５．２％、単糖類２５．
３％）を、６０℃に加熱したクロマトグラフィー用強酸
性陽イオン交換樹脂カラム（内径３５．５ｍｍ、長さ９
１０■のステンレス鋼製カラム２本を直列に連結したも
の；使用樹脂：ユニビーズＵＢＫ−５３０．Ｎａ形。

１８１０Ｉ１１１）を用いる前述の６ステツプ１サイク
ルの循環捏作法により３６サイクル、連続的に処理した
。なお、１回の糖液仕込量は１２０＋＋＋ｌ、溶出用温
水の温度は６０℃、糖液および温水の注入速度（ＳＶ）
は０．２５４／Ｈｒとした。

これにより得られた各糖画分の組成は次のとおりであっ
た。

ガラクトオリゴ糖高含有画分（約９９）は減圧濃縮し、
更に凍結乾燥して、白色の粉末状ガラクトオリゴ糖８０
０ｇを得た。

実施例　３ 実施例１と同様にして乳糖に７スペルギルス・オリゼの
β−ガラクトシダーゼを作用させて、糖組成がガラクト
オリゴ糖３０．１％、乳糖５０．０％、単糖類１９．９
％の糖液を得た。

これをイオン交換樹脂で脱塩脱色して得られた全糖濃度
５５％−／Ｗの糖液２０ｇを、実施例１の場合と同じイ
オン交換樹脂を充填したカラム（内径１５ｃｍ、長さ１
２０ｃｍのステンレス製カラム２本を直列に連結したも
の）を用いる前述の循環繰作法により処理した。但し糖
液仕込量は１，８７　　Ｑ／サイクルとし、カラム溶出
液のうちガラクトオリゴ糖高含有画分、乳糖高含有画分
および単糖類高含有画分はそれぞれ１１サイクル分をま
とめて濃縮した。

乳糖高含有画分の濃縮液（固形分量８．１２ｋｇ：糖組
成ニガラクトオリゴ糖１３．５％、乳糖８１．９％、単
糖類４．６％）は、乳糖５．８８ｋｇを混合してか呟上
記と同様の酵素反応、予備的精製および糖分難処理に付
した。

このような酵素処理と糖分難処理を１０回繰返し、得ら
れたガラクトオリゴ糖高含有画分の濃縮液を脱色用イオ
ン交換樹脂カラムに通してわずかな着色を除き、糖濃度
５０％Ｗ／＋１の透明溶液６６Ｑを得た。これを噴霧乾
燥したところ、流動性のよい白色粉末（ガラクトオリゴ
糖純度９０％）３２ｋｇが得られた。

また単糖類高含有画分の濃縮液（濃度７０％ｗ／ｗ、単
糖類純度９９％、グルフース／ガラクトース＝３／１）
２６Ｑ、が得られ、これはそのままマイルドな甘味シロ
ップとして利用可能なものであった。

【図面の簡単な説明】 第１ｌ：本発明の製造法における糖分難処理のための循
環掻作法の説明図

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）乳糖から一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ（
   但し、式中Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコ
   ース残基、ｎは１〜４の整数を、それぞれ表わす）で示
   されるオリゴ糖への転移反応を生起させることのできる
   酵素または微生物を乳糖に作用させて上記オリゴ糖を含
   有する糖液を得、次いで強酸性陽イオン交換樹脂を用い
   るカラムクロマトグラフィーにより上記糖液中の糖成分
   の分離を行い、カラム溶出液よりガラクトオリゴ糖高含
   有画分を採取することを特徴とするガラクトオリゴ糖の
   製造法。
2. （２）β−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させてオリゴ
   糖を生成させる特許請求の範囲第１項記載の製造法。
3. （３）スチレンジビニルベンゼン共重合体を基体とし−
   ＳＯ＿３＾−を交換基とする強酸性陽イオン交換樹脂の
   Ｎａ形のものをカラムクロマトグラフィーに用いる特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。
4. （４）乳糖から一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ（
   但し、式中Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコ
   ース残基、ｎは１〜４の整数を、それぞれ表わす）で示
   されるオリゴ糖への転移反応を生起させることのできる
   酵素または微生物を乳糖に作用させて上記オリゴ糖を含
   有する糖液を得、次いで強酸性陽イオン交換樹脂を用い
   るカラムクロマトグラフィーにより上記糖液中の糖成分
   の分離を行い、カラム溶出液よりガラクトオリゴ糖高含
   有画分を採取すること、およびカラム溶出液より乳糖高
   含有画分を採取し該画分を原料乳糖の一部として再利用
   することを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造法。
5. （５）β−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させてオリゴ
   糖を生成させる特許請求の範囲第５項記載の製造法。
6. （６）スチレンジビニルベンゼン共重合体を基体とし−
   ＳＯ＿３−を交換基とする強酸性陽イオン交換樹脂のＮ
   ａ形のものをカラムクロマトグラフィーに用いる特許請
   求の範囲第５項記載の製造法。