JP2010505822A - ガラクトオリゴ糖(gos)によるコレラ毒素の抑制 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
−さまざまな重合度を有するガラクトオリゴ糖(GOS)の混合物を用意すること;
−(任意的に)該GOS混合物の遊離ラクトースを単糖(グルコース及びガラクトース)へ転化することにより遊離ラクトースを除去すること;
−該(ラクトースの無い)GOS混合物を陽イオン交換樹脂に適用すること;
−水移動相を用いてGOS種を重合度の増大と共に段階的に溶出すること及び異なる重合度を有するGOSを夫々含む別個の溶出画分を集めること;
−GM1に結合するCtxに対する抑制効果について夫々の溶出画分を分析すること;及び、
−GM1に結合するCtxを抑制することができる1以上の画分を選ぶこと、
の工程を含む上記方法を提供する。
図1:陽イオン交換精製されたGOS画分番号とGOS三糖、四糖、五糖及び六糖(DP3、DP4、DP5及びDP6とそれぞれ示される)の相対的存在量との間の相関。実験の詳細については、実施例1を参照されたい。
図2:Ctx−HRPのGOS画分2抑制。n=6。P=0.000は、このGM1に連関されたELISAにおけるGOS画分2とCtx−HRPとの間の相互作用が非常に有意なものであることを示す。log変換された結合Ctx−HRP値から計算された分散分析。実験の詳細については実施例2を参照されたい。
図3:GOS画分2用量応答。n=6。global r2=0.925は、強く適合したシグモイド応答を示す。logEC50とEC50値との間の差異は、有意差があるとはいえないと分かり(P=0.9411)、それ故に、帰無仮説は棄却された。
図4:GM1へ結合するCtx−HRPに対するGOS画分1〜15の抑制活性。夫々の画分のGOS種含有量については、図1を参照されたい。パネルA:100mg・ml−1対10ng・ml−1Ctx−HRPの抑制。n=6。大きなr2値は、変動の73.56%が、GOS画分間の種組成における差異により引き起こされることを示す。パネルB:100mg・ml−1GOS画分1〜15対20ng・ml−1Ctx−HRPの抑制。n=6。大きなr2値は、変動の74.14%が、GOS画分間の種組成における差異により引き起こされることを示す。
図5:DP6の用量及びCtx−HRPの抑制の間の相関。n=6。P=0.2748は、適合されたシグモイド用量応答曲線の夫々の間に統計的な差異はないことを示す。さらに、Ctx−HRPの濃度は、DP6の有効性に影響しない。DP6値は、logスケールに変換された。R2=0.8516及びEC50=5.10%DP6。
全ての溶液は、超高純度ミリQ水を用いて調製された。用いられた市販のガラクトオリゴ糖混合物VivinalGOS(商標)は、73%w・w−1乾燥物質(このうち57%w・w−1はガラクトオリゴ糖であった;23%w・w−1は無水ラクトースであった;19%w・w−1は無水グルコースであった及び0.9%w・w−1はガラクトースであった)の典型的な組成を有した(Friesland Foods Domo、ズウォレ、オランダ)。HPLC標準曲線生成のための標準は、分析グレードD−(+)−グルコース一水和物及びβ−ラクトース(Sigma−Aldrich Company Ltd.(ジリンガム、ドーセット州、英国)から購入された)であった。HPLCグレードMeOH及びH2Oは、Rathburns Chemical Co.,(ピーブルシャー、スコットランド)から購入され、NH4ACはBDH(VWR International、プール、英国)から購入された。マルトヘプタノース、マルトヘキサノース、マルトペンタノース、マルトテトラオース、ラフィノース、ラクトース及びグルコースは、Sigma−Aldrich(ジリンガム、ドーセット州、英国)から購入された。分画されたGOS粉は、UBK−530陽イオン交換樹脂(三菱化成工業株式会社、東京、日本)により製造された。2−AB(2−アミノベンズアミド)標識化グルコースホモポリマー(GHP)ラダーが、Ludger Ltd(アビンドン、オックスフォードシャー州、英国)から購入された。最初に、全てのオリゴ糖が、H2Oに溶解されて10mg・ml−1とされ、そして次に、注入前にさらに希釈された。
VivinalGOSからのラクトースの除去は、グルコース及びガラクトース及び三糖〜七糖の間の分離を改善する為に実施された。該反応において、ラクトースは加水分解されてグルコースとガラクトースとを形成する。これらの単糖は、陽イオン交換において高い親和性により保持される。この目的の為に、VivinalGOS(商標)は、陽イオン交換精製の前に、β−ガラクトシダーゼ調製物Maxilact(商標)L5000により前処理された。最初に、30%溶液w・w−1のVivinalGOS(商標)が調製され、そして、1M水酸化ナトリウムを用いてpH6.5に調整された。40℃への加熱後、0.9%のMaxilactが該VivinalGOS(商標)に添加され、そして、4時間インキュベートされた。処理後、該溶液は4.5へとpH調整され、そして、該ラクターゼを不活性化するために10分間100℃で加熱された。沈殿した酵素は、19,000RPMで60分間、遠心により除去された。得られたラクトースの無いVivinal GOS溶液が、陽イオン交換実験において用いられた。
本技術は、Matsumotoら(Method for producing galactooligosaccharides, E.P. Office, Editor. 1987)から採用された。簡潔に言うと、Na型樹脂Unibead UBK−530が選択された(三菱化成工業株式会社、東京、日本)。2000mlのUBK−530樹脂が水和され、そして、微粒子(fines)が、製造者の指示に従い除去された。その後、該樹脂は、Na+イオンとK+イオンとを交換する為に、1M KCl溶液により12時間、振とうしている水浴中で、20℃で処理された。
イオン交換クロマトグラフィーの間に集められた画分が、ガラクトオリゴ糖についてSlegteらにより開発されたプロトコル("Determination of trans-Galactooligosaccharides in Selected Food Products by Ion Exchange Chromatography: Collaborative Study". Journal of AOAC International, 2002. 85 Part 2: p. 417-423)に従い、パルスドアンペロメトリック検出を伴う高性能陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC−PAD)(Dionex corp.,カリフォルニア州、米国)を用いて分析された。簡潔に言うと、スルホン化エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン粒子の250×4mm内径ガードカラムを有する、薄皮のCarboPac PA−1陰イオン交換樹脂カラムが用いられた。移動相は、500mM酢酸ナトリウムを有する、(A)12.5mM NaOH、(B)125mM NaOH、及び(C)125mM NaOHの勾配であった。分析の為の溶出勾配は、de Slegteらにより以前に報告されたとおりに実施された。20μLの夫々の試料が、室温で、1ml・分−1の流量で、注入され及び分析された。
ZIC(商標)−HILIC、PEEK Column、150×2.1mm 5μmが、該カラムからの固定相「出血」が特に低いと示されたので、選択された(SeQuant AB、ウーメオ、スウェーデン)。両性イオンZIC(商標)−HILIC固定相が、多孔性シリカに付けられた。該分離は、弱い静電相互作用に重ねられた親水性分画機構により達成される。他の分析パラメーターは:1μL注入体積、214nmのUV検出、及び31分実行時間であった。GOS画分の一つが、20、30、40、50及び60℃で分析された。全てさらなるクロマトグラフィーの実行は60℃でのものであった。ACN:H2OよりもMeOH:H2Oのより高い濃度において、GOS画分を溶解することが可能なので、アセトニトリルでなくむしろメタノールが用いられた。。100%H2O中に炭水化物を注入することは、該溶媒が固定相へと分画することを許容せず、結果的に、該試料は、分離無しの栓(plug)として溶出された。移動相は、H2O中の95%MeOH−5mM NH4ACから構成された。勾配実験は、該時間を変えた。この中で勾配ポンプをプログラムすることにより50:50 MeOH:H2O濃度。5%の低い水含有量は、適当な水和を維持する為及び固定相と移動相の間の静電相互作用を改善する為に用いられた。Agilent 1100HPLCシステムは、接続された(online)脱気剤を有するAgilent 1100シリーズキャピラリーポンプ(Agilent、ストックポート、英国)、UV検出器、自動サンプラー、及びDionex CS 14 陽イオン交換ガード(4mm×50mm)から構成された。流量は100から200μl・分−1へと変化し、及び、214nmが、該UV検出器により監視された。
特定の操作パラメーターを含むイオン化及び検出の説明が、修正された製造者説明書に従い記載される(Bruker Daltonics microTOF instrument、Bruker Daltonics、ブレーメン、ドイツ)。
陽イオン交換方法は、Matusmotoら(12)から、Royal Friesland FoodsのJ.de Slegteとの個人的な情報交換を受けて修正された。以前に、対イオンNa+、K+及びCa2+が、どれがラクトース、ガラクトース及びグルコースからのGOSの最もきれいな分離を与えるかを決定する為に、試験された。UBK−530樹脂のカリウム型は、VivinalGOS(商標)に関して最もよい結果を与え、そしてそれ故に、さらなる実験の為に選ばれた(未発表のデータ)。HPAEC−PADは、それぞれの1分の分画について、、オリゴ糖組成を決定する為に用いられた。最初の画分は、高濃度のGOSを含んだ。IEXカラムから集められた夫々の逐次の画分にともなう、高分子量ガラクトオリゴ糖からグルコース及びガラクトースへの、組成における変化があった。UBK−530樹脂は、圧縮に対する優れた抵抗性を示し、糖は有機溶媒無しでも溶出され、そして、該カラムは注入の間で平衡化を要求せず、それ故に、準連続的な精製が達成された。
60℃±0.5℃に加熱されたカラムを用いて、200μl・分−1の流量及び、水中の95%MeOH−5mM NH4ACから水中の50%MeOH−5mM NH4ACへの25分における勾配は、部分的に、GOS画分1〜15の組成を解明した。DataAnalysis v3.2ソフトウェアにおけるソフトウェア積分特徴を用いて、DP3、続いてDP4、DP5、DP6及びDP7として同定された糖の群の夫々の下の面積を積分することが可能である。
分析グレードD−(+)−グルコース一水和物、β−ラクトース、ウシ脳から単離されたモノシアロガングリオシド−GM1、TWEEN(商標)20、ウシ血清アルブミン(BSA)、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)、ジメチルスルホキシド(DMSO)及び硫酸(H2SO4)は全て、Sigma Aldrich(ジリンガム、ドーセット州、英国)から購入された。ホスフェート緩衝生理食塩水(PBS)が、Oxoid Ltd(ベージングストーク、ハンプシャー州、英国)から、タブレット形態で購入され、そして、カルシウム及びマグネシウムが除かれた以外は、Dulbecco及びVogtの元の配合(1954)に一致させられた。夫々のタブレットは、製造者の指示に従い蒸留水中に希釈された。ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合されたVibrio cholera毒素Bサブユニット(Lista Biologicals、カリフォルニア州、米国、により製造された)は、Quadratech Ltd、サリー州、英国、により輸入され、及び同社から購入された。ガラクトオリゴ糖は、Friesland Foods Domo(ズウォレ、オランダ)からの贈り物であり、そして、使用の前に陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製され及び分画された。全ての溶液は、超高純度MilliQ水を用いて調製された。
マイクロタイタープレート(F96 Maxisorp; Fisher Scientific、ラフバラ、英国)が、160mMのNaCl及び9mMのリン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.2)(PBS)中に1ウェル当たり100μlの500ng・ml−1の溶解されたガングリオシドGM1と伴に、室温で、一晩、インキュベートされた。付着していないガングリオシドは、0.1%Tween20を含むPBSにより3回該ウェルを洗浄することにより除去された。該プレート表面上のさらなる結合部位は、2%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)−PBS溶液の200μlにより、室温で一晩、該ウェルをインキュベートすることによりブロックされ、次に、0.1%Tween 20−PBSにより3回洗浄された。
図2は、Ctx−HRPの夫々異なる濃度での、結合したCtx−HRPの濃度とGOS画分番号2の容量との間の交互作用プロットを示す。GOS画分番号2が例として選ばれたが、同様の抑制水準が典型的に、画分1〜9について、測色応答において目に見える減少を伴い、少なくとも12.5mg・ml−1の糖を伴うCtx−HRPの全ての3つの濃度で観察された。低濃度のGOSでのより大きなエラーバーは、反復の間の部分的な抑制及び/又は低濃度での弱い親和性により引き起こされる。さらに、結合したCtx−HRPの濃度及び用量GOS画分2及び用量Ctx−HRPの間の2要因分散分析は、GOS用量が該抑制に影響することを裏付ける(P<0.001)。加えて、記述統計R2(η2又はイータ二乗)は、“用量Ctx−HRP”及び“用量GOS”の平均の間の差異に起因する、全体分散(overall variation)の部分を表す。98.43%のR2は、変動の大部分が、群を定義し(すなわち増加する濃度)及びさらに結合Ctx−HRPとGOS画分2濃度との間の関係を強める処理に起因することを意味する。大きなF値は、“用量GOS”及び“結合したCtx−HRP”の平均値の間の変動(variation)が、偶然に観察されるものだろうより大きいことを意味し、さらに“用量GOS”が結合Ctx−HRPに影響するという概念を支持する。
図1は、実施例1に記載されたとおりの陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離された夫々の画分の間のGOSプロファイルにおける変化を示す。DP6の存在量は、Ctx抗付着活性と密接に相関するとみられたので、結合したCtx−HRPの平均が、夫々の画分においてGOS DP6(六糖)の相対的存在量に対してプロットされた(図5)。該相関は指数関数的減衰関係に従った;さらに、logスケール(片対数プロット)において該DP6濃度を表すことはシグモイド的散布図を結果する。Prismソフトウェアは次に、該データを、抑制Ctx−HRPの点において正規化する為に及びシグモイド用量応答曲線を適合させてCtx−HRPの夫々の濃度についてのEC50値を計算する為に用いられた。前述のとおり、EC50は、特異的な結合の半分について競合するインヒビターの濃度をいい、IC50値と同じである。夫々の曲線EC50値についての95%信頼区間は重なり合い、そしてさらに、logEC50値の間に統計的な差異はない。該EC50値は、5.1%の大域的な計算された数字(global calculated figure)を伴い、4.40、5.11及び6.25%DP6相対的存在量であると計算された。この類似はさらに、GOSの有効性が、用いられたCtx−HRP濃度にわたり類似であることを裏付けた。重要なことに、夫々のGOS画分の生物学的活性が、100mg・ml−1の濃度で測定され、そしてそれ故に、夫々の画分間の主要な差異は、相対的な糖の存在量及びすなわち組成である。
GOS画分1〜8は、ELISAアッセイにおいてコレラ毒素に対して、高水準の抑制を一貫して示す。HILIC−ESI−MSからの夫々のGOS画分のGOS種プロファイルは、ELISAにおける結合Ctxの濃度に対して相関し、そして、0.925の大域的(global)R2値で、最も適当な抑制リガンドとしてのDP6構造物を明らかにした。本明細書上記において実施例1は、DP6存在量が、夫々の画分とともに段階的な様式で、GOS画分1の23%からGOS画分10の9%及びGOS画分16の0%へと減少することを示す。また、DP5存在量は抑制活性と相関すると見える。DP3及びDP4の同時の増加が観察され、主にDP6〜DP4を含有する画分からDP4〜DP3を含有する画分へのシフトを示唆する。高い全体GOS画分濃度が、十分にCtx−HRPを抑制するのに十分高いDP6濃度を維持する為に重要であり得る。これは、なぜ分画されていないGOSが如何なる場合もCtxを抑制しないのかを説明しうる(GOS画分0;図4A及びB)。それ故に、分画それ自身が、特定のGOS種、すなわち市販のGOS配合物中に別なふうに薄められているGOS五糖及び六糖を濃厚にすることにより、有効性を増加した。
Claims (17)
- ガラクトオリゴ糖(GOS)を含む組成物であって、5以上、好ましくは6以上の重合度を有するGOS種が、該組成物中に存在する全GOS種の合計乾燥重量に対し30重量%(w%)超の量で存在する上記組成物。
- β結合ガラクトシル残基、特にはβ(1−4)及び/又はβ(1−6)結合されたものを含むGOS種を含む、請求項1に記載の組成物。
- 該組成物中に存在する全GOS種が、該組成物の乾燥重量に対し少なくとも50重量%、好ましくは少なくとも60重量%、より好ましくは少なくとも70重量%を占める、請求項1又は2に記載の組成物。
- 該組成物の乾燥重量に対し、少なくとも40重量%の量で5の重合度を有するGOS及び/又は少なくとも10重量%の量で6以上の重合度を有するGOSを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- ガラクトオリゴ糖(GOS)を含む組成物であって、該組成物中の該GOS種の乾燥重量に基づき、5以上の重合度を有するGOS種の割合が、5未満の重合度を有するGOS種を超えて存在する上記組成物。
- 該組成物が、単糖及び/又は二糖、特にはガラクトース及び/又はグルコース及び/又はラクトースを本質的に含まない、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 該組成物中に存在する全GOS種の合計乾燥重量に対し少なくとも15重量%の、6の重合度を有するGOS種を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 食品グレード非消化性シアル化オリゴ糖(SOS)、好ましくは3’−シアリルラクトースなどの乳由来のSOSをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- コレラ毒素(Ctx)がGM1に結合することを抑制することができるGOS画分を提供する方法であって、
−種々の重合度を有するガラクトオリゴ糖(GOS)の混合物を用意すること;
−任意的に該GOS混合物から遊離ラクトースを除去すること;
−該(ラクトース不含の)GOS混合物を陽イオン交換樹脂に適用すること;
−水移動相を用いてGOSを重合度の増大と共に段階的に溶出すること及び分離した溶出画分を集めること;
−GM1に結合するCtxに対する抑制効果について夫々の溶出画分を分析すること;及び
−GM1に結合するCtxを抑制することができる1以上の画分を選択すること、
の工程を含む上記方法。 - 種々の重合度を有するGOSの該混合物を用意することが、乳清透過物又はラクトースをβガラクトシダーゼを用いた酵素的トランスガラクトシデーションに付すこと含む、請求項9に記載の方法。
- 種々の重合度を有するGOSの該混合物が、市販のGOS混合物、好ましくは商品名VivinalGOS(商標)として市販されるGOS混合物を含む、請求項9又は10に記載の方法。
- 請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法により得られる、GM1へのコレラ毒素(Ctx)の結合を抑制することができるGOS画分。
- コレラ毒素ファミリーメンバーの付着及び/若しくは摂取に関連する又は当該付着及び/若しくは摂取により引き起こされる急性又は慢性疾患の処置又は予防の為の栄養組成物又は医薬組成物の製造のために、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物又は請求項12に記載のGOS画分を使用する方法。
- コレラ毒素ファミリーメンバーにより引き起こされる急性又は慢性疾患、特には下痢性疾患の予防又は処置の為の栄養組成物又は医薬組成物の製造のための請求項13に記載の使用方法。
- 該コレラ毒素ファミリーメンバーが、V.choleraeコレラ毒素(Ctx−B)又は毒素原性E.coli(ETEC)の熱不安定性エンテロトキシン(LT−B)である、請求項13又は14に記載の使用方法。
- コレラ毒素ファミリーメンバーの摂取に関連する又は当該摂取により引き起こされる急性又は慢性疾患の処置及び/又は予防を、そのような処置を必要とするヒトを含む哺乳類において行う方法であって、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物又は請求項12に記載のGOS画分の治療的に有効な量を該哺乳類に投与することを含む上記方法。
- 該疾患が、毒素原性E.coli(ETEC)により引き起こされるコレラ又は下痢性疾患である、請求項16に記載の方法。
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