CN107164434B - 一种生物合成菊二糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物合成菊二糖的方法，属于食品生物加工技术领域。本发明以菊糖为底物，采用菊糖果糖转移酶以及双果糖酐III水解酶两步法催化反应合成菊二糖。第一步是用菊糖果糖转移酶催化菊糖反应获得双果糖酐III，该步骤中所得合成的双果糖酐III可以用于下一步中菊二糖的生产，因此简化了双果糖酐III的纯化过程，节省能源消耗，降低生产成本。再向第一步反应所得的双果糖酐III溶液中加入双果糖酐III水解酶催化双果糖酐III合成菊二糖。本发明的工艺简单，效率高，菊糖合成菊二糖的转化率能够达到45%~50%。本发明提供了一种新型生产菊二糖的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物合成菊二糖的方法，特别涉及一种通过两种酶两步法实现菊二糖（inulobiose）的生物合成的方法，属于食品生物加工技术领域。
背景技术
双果糖酐 III （DFA III）是一种新型的功能性甜味剂，其结构主要是由两个果糖分子脱去两个水分子形成如下结构的糖苷（α-D-fructofuranose-2'1:2,3'-β-D-fructofuranose dianhydride）。
由于异头碳上的羟基都成糖苷键，因此DFA III是一种新型的非还原性双糖。DFAIII甜度只有蔗糖的1/2，但是热量相对蔗糖很低，只有蔗糖的1/15。因此，DFA III可以作为一种理想的蔗糖替代糖而应用到低能量食品及糖尿病人食品中，防治糖尿病。
菊二糖是一种较为稀有的二糖，是由两个果糖分子以β-1，4糖苷键连接脱去一份子水而成。菊二糖可以被β-呋喃果糖苷酶水解为两分子果糖，与此同时，菊二糖也可用于低聚果糖的合成。目前研究发现一种DFA III水解酶能够水解DFA III生成稀有的菊二糖。考虑到DFA III价格昂贵，本发明通过转化自然界存在较为广泛的菊糖，两步合成稀有的菊二糖，成本低，工艺简单。
发明内容
本发明的目的是提供一种廉价的菊二糖的合成方法，所制备的菊二糖具有较高的纯度。整个合成过程工艺简单，效率高，成本低。
本发明的技术方案，一种生物合成菊二糖的方法，以菊糖为底物，采用菊糖果糖转移酶以及双果糖酐III水解酶两步法催化反应合成菊二糖，先使用菊糖果糖转移酶将菊糖转化为功能性二糖双果糖酐III，再使用双果糖酐III水解酶转化双果糖酐III合成功能性菊二糖。
具体步骤如下：
（1）功能性二糖双果糖酐III的合成：将菊糖完全溶解于水中，浓度控制为100-200g/L，调节pH值为5.5~6.5，温度控制在50~55℃，加入菊糖果糖转移酶，加入量为0.08~0.1U/g菊糖，恒温反应2~20h；所得反应液也称菊糖转化液；
菊糖浓度控制在100-200g/L，菊糖果糖转移酶加入量控制在0.08~0.1U/g菊糖，此浓度范围内菊糖果糖转移酶的转化效率较高；pH控制在5.5~6.5，温度控制在50~55℃，此范围是菊糖果糖转移酶的最适pH和最适温度范围；
（2）功能性菊二糖的合成：将步骤（1）所得菊糖转化液温度控制在50~55℃，再向其中加入双果糖酐III水解酶，添加的双果糖酐III水解酶浓度为0.8~1U/g菊糖，pH值仍然控制在5.5~6.5，恒温反应2~20h；
温度控制在50~55℃，pH值仍然控制在5.5~6.5，再向其中加入双果糖酐III水解酶，添加的双果糖酐III水解酶浓度为0.8~1U/g菊糖。此范围是双果糖酐III水解酶的最适温度和pH范围，酶在此范围内活性较高；
（3）纯化：对步骤（2）反应液进行纯化，清除其中的副产物蔗糖，葡萄糖，果糖等；将步骤（2）反应后的溶液流经sepax色谱柱，洗脱液为超纯水；流速为0.8mL/min，洗脱温度为85℃，进样量为50μL。
步骤（1）所述菊糖果糖转移酶(Inulin fructotransferase)核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
步骤（2）所述双果糖酐III水解酶(DFA III hydrolysis enzyme )核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
检测菊二糖的方法：反应后的上清液用微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液用配备有示差折光显示器的HPLC分析。HPLC条件为：Sugarpak1，6.5mm id*300 mm钙型阳离子交换柱，超纯水作流动相，柱温为85℃，流速为0.4mL/min，进样量为10μL。菊二糖标样的浓度为0.2%。利用检测步骤（3）反应后溶液中菊二糖的峰面积与0.2%的菊二糖标样的峰面积的比值，计算得到反应液中合成的菊二糖的浓度。
根据本发明高转化率的要求，底物和酶的浓度需要有效的控制在一定的范围，这样整个反应体系才能够实现最大的转化菊糖合成菊二糖。
上述菊二糖的生物合成过程中，作为优选条件，步骤（1）中底物菊糖的浓度控制在100 ~200 g/L。菊糖浓度的控制决定菊糖的转化率，因此有效地控制反应体系中菊糖的浓度不仅可以提高反应的转化率，也可以充分地利用酶的活力，从而提高生产效率以及起到节约原料和能源的作用。
上述菊二糖合成过程中，酶的添加量要控制在合适的浓度，过多则不经济，过少则不能实现产率的最优化。 因此，以原料菊糖计，菊糖果糖转移酶的浓度添加量0.08 ~ 0.1U/g菊糖，双果糖酐III水解酶的添加量为0.8~1U/g菊糖，应符合动力学的要求。并且是达到稳定工艺，提高了生产效率，节约能源。
本发明的有益效果：本发明利用菊糖果糖转移酶先将廉价底物菊糖转化为功能性二糖双果糖酐III，再用双果糖酐III水解酶将合成的功能性二糖双果糖酐III转化为菊二糖，避免了双果糖酐III的分离纯化过程。由于菊二糖在自然界中极为稀有，且双果糖酐III价格昂贵，因此，本发明直接转化自然界中广泛存在的菊糖降低了成本。本发明中用菊糖果糖转移酶催化菊糖为双果糖酐III的转化率能够高达85%，用双果糖酐III水解酶催化双果糖酐III生成菊二糖的转化率高达55%，最终，利用双酶从菊糖制备菊二糖的转化率高达47%。整个工艺较为简单，生产成本低，能耗低，有利于实现菊二糖的大量生产。
附图说明
图1是菊糖果糖转移酶以菊糖为底物合成双果糖酐III（反应液稀释后HPLC）。
图2是双果糖酐III水解酶催化图1双果糖酐III后合成的菊二糖(反应液稀释后HPLC)。
具体实施方式
以下是用菊糖果糖转移酶和双果糖酐III水解酶实现转化菊糖为菊二糖的实例，说明本发明的方法，但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1
用去离子水将底物菊糖完全溶解，其浓度控制为100g/L，调节pH值为5.5，温度控制在55℃，加入菊糖果糖转移酶，加入量为0.1U/g 菊糖，恒温反应2 h；
将反应体系的温度保持至55℃，再向其中加入双果糖酐III水解酶，添加的双果糖酐III水解酶的浓度为1U/g菊糖，pH值仍然控制在5.5，恒温反应2 h；
取反应后溶液离心，上清液用微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液用配备有示差折光显示器的HPLC分析。HPLC条件为：Sugarpak1，6.5mm id*300mm钙型阳离子交换柱，纯水作流动相，柱温为85℃，流速为0.4mL/min。进样量为10μL，菊二糖标样的浓度为0.2%。利用反应后溶液中菊二糖的峰面积与0.2%的菊二糖标样的峰面积的比值，计算得到反应液中合成的菊二糖的浓度。所获得的菊二糖的转化率达到47%。
实施例2
用去离子水将菊糖底物完全溶解，其浓度控制为200g/L，调节pH值为5.5，温度控制在55℃，加入菊糖果糖转移酶，加入量为0.1U/g 菊糖，恒温反应2h；
将反应体系的温度保持在55℃，再向其中加入双果糖酐III水解酶，添加的双果糖酐III水解酶的浓度为1U/g菊糖，pH值仍然控制在5.5，恒温反应12h；所获得的菊二糖的转化率达到45%。
实施例3
用去离子水将菊糖底物完全溶解，其浓度控制为150 g/L，调节pH值为6.5，温度控制在50℃，加入菊糖果糖转移酶，加入量为0.08U/g菊糖，恒温反应12h；
将反应体系的温度提升至55℃，再向其中加入双果糖酐III水解酶，添加的双果糖酐III水解酶的浓度为0.8U/g菊糖，pH值仍然控制在6.5，恒温反应12h；所获得的菊二糖的转化率达到40%。
<160> 2
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 1353
<212> DNA
<213> 菊糖果糖转移酶
<400> 1
ttagggtgtg ggccggattg ccgtgtccgg gctgtaggac gtaatggtgg ttgcggatcc 60
gctgtcgagc acctttgaat gggtggtgga tccgtcaaga accacgtgct gggtggcaac 120
gttgctgacc acgtgattag tggctacgac attgccgtcc cctcccgcga tcaggatgat 180
ggttggctgg gcgcctgcgg ggacaccctt gttcggtggg acgtcatagg cgaagaggtt 240
gtttgaaatg aggttgttgt ctcccagcgt atggagaacg ccgtagaggt catcgagacc 300
gtttgtgcga ttgataaaag gggggaaccc ctcggtgccc ctgcggaagt gattggacgt 360
gatgaggttt tccttgcatc cattcagcag gcgcatcatg ccaggataga agccctgaaa 420
ccggttcgac gatacggagc agcggttaca gccgttgaac tcgatgaggc ttcgtcctcg 480
cgggaagaag ttgttccccg tgacaagcag gccctcgtgg ttttcagcca gaagcgtcac 540
accctcgggt cctgcaccca tcaggttgcc gctgacaatc gttgcctgcc cggcaccagt 600
tagttcgacg cagttcccgc actcggcgat catgttgtcg tggacccgga gggcatctgc 660
gccgcgaact atcagggcgt gctcaaggta gacgaatccc atcccggtga catgggtgga 720
gtcattgtcg gatgcgacct cgatgcccgt tttcccgttc ctgtagctgt tcccgtccgg 780
ggtgaaattg accccgtcca ggcagaagtc tctgaacacg attccggaca ggcgcggact 840
gccactccga cgcacgagga atgcctgtgg tgcggatggg ggcgtcagga cgcggatgtg 900
gctgccgcct ggctggaggt tcagccatcc cgtagggtcc acgttgtcct tgatgctgcg 960
ggagaagaag ccatggccga agcccgcgat ggtgaggtaa tccacgtcca ctaccacctg 1020
ggtgcgaagg tcgtagtccc ctgggggaat gatcaccacg gctcccggcc tggtgtccgg 1080
cgtcgtttgg cgctttttga tgtcggcaat gatgtcgttg atgacggcac cgatatccga 1140
ctcagctgtg accttgggct ggcccttgat ccgccaagct gtgacgtcat aggtgttcgg 1200
cgagttgaag gggccggctt tcgcatcctt cgcagcttca gctttcgggg acatccccag 1260
gcttagcgcg gccgccagcg agcccacggc tccagcgccg acgagcatcc gacgactggt 1320
gtttttcacg tcaagcgtct cgtcaatttc cat 1353
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 1413
<212> DNA
<213> 双果糖酐III水解酶
<400> 2
atgtccaaca gcaattatta caacgtcacc gcctggccca tcggggatcc gttcacgggc 60
gttggtgaag tcatcaacag catcatcgcg gacatcaagg accggcaaac ggccacggat 120
gagaacgacg gcggcaagcc gggagcggtg atttatcttc cgcccggcga ttatcgcctc 180
cggacacagg tagtcatcga cgtcagcttc ctcaggattg aaggctcagg tcatggcttc 240
acgtcctcga gcatccgttt caatgctccc gaggccgaat ggcccgatct tcatgagttg 300
tggcctggcg ggagccgcgt catggtggat ctgccgatca ttgatgacga gcggcccagt 360
gacttactgc cggaccagga atccaagggt gccgccttct acgttgaacg aagcggaagc 420
ccaaggatca gttccgttga gttctccaac ttctgcatag acggcttgca cttcaccccg 480
gacgggtccg ggctgcctgc ggagaacagt tacgtcaacg gcaagaccgg catttatgtg 540
gcgagcgcca atgactcttt ccgggtcaat ggaatgggtt tcgtctacct tgagaacgcg 600
ctcaccatct gcaaggcaga cgccctgtcc gtccacgaca acttcattgc tgaatgcgga 660
agctgcatag aactccgcgg ctggggtcaa gcctccaaga tcacggacaa cttgataggg 720
gccggcttca aaggtcactc gatctacgcc cagaaccatg gcggtctcct gatcaccgcg 780
aacaacatct tcccccgcgg tgccagcagc atccacttcg aaggtgtcac tcgatcaagc 840
gtctccaaca accgcctgca ctcgttttac cccggaatgg tggttcttgc ggagggcagc 900
tcggagaatt tggtgtccac caaccatttc cttcgtgacc acgagccgtg gacgccgttc 960
ctgggcgtcg acaacgggcg cgatgacctt tacgggattc tccgcatcag tggaagcaat 1020
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cacgtggtgg ccatggacgt tcgctctgcg tccagtgact cctgcttcgc ggcccaagtg 1200
gacgccttgt tgaccaccgg agcttcggac ggactcgccg taacggcggt gctggtcgac 1260
tccacctcgg cacggaatac catccttgac tccgggaacg acgcccaggt catcgcggac 1320
aggggtgcca atgctgtgag ggccacgccc accgtgggct ttgcggcagc agagtccacc 1380
caaagcagcc agggcgcggg tattcctcga taa 1413
Claims (1)
1.一种生物合成菊二糖的方法，其特征是：具体步骤如下：
（1）功能性二糖双果糖酐III的合成：将菊糖完全溶解于水中，浓度控制为100-200g/L，调节pH值为5.5~6.5，温度控制在50~55℃，加入菊糖果糖转移酶，加入量为0.08~0.1U/g菊糖，恒温反应2~12h；
（2）菊二糖的合成：将步骤（1）所得菊糖转化液温度控制在55℃，再向其中加入双果糖酐III水解酶，添加的双果糖酐III水解酶浓度为0.8~1U/g菊糖，pH值仍然控制在5.5~6.5，恒温反应2~12h；
（3）纯化：对步骤（2）反应液进行纯化，将步骤（2）反应后的溶液流经sepax色谱柱，洗脱液为超纯水，流速为0.8mL/min，洗脱温度为85℃，进样量为50μL；
编码步骤（1）所述菊糖果糖转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
编码步骤（2）所述双果糖酐III水解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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