JP2021534738A - 食品及び栄養補助食品としてのスクロースイソメラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト及び動物の両方のための栄養補助食品としてのスクロースイソメラーゼの使用に関する。スクロースイソメラーゼは、それが消費された後に食品中のスクロースの量を酵素的に低減し得、したがって食品のグリセミック指数を低下させ得る。スクロースイソメラーゼサプリメントは、血糖を低下させ、消費される食品及び/飲料のグリセミック指数を低下させ、且つ体重を管理するか又は減らすのに特に有益である。
高い血中グルコースは、世界的な疾病負担の原因において非常に高い順位に位置し、肥満症及び2型糖尿病を引き起こし、且つそれらをもたらし得る。糖又はデンプンのような急速に吸収される炭水化物を含有する食品及び飲料は、血中グルコースの急速な上昇を引き起こし、次いでインスリン放出のスパイクが起こり、血中グルコースが急速に減少する。かかる炭水化物を欠く食品及び飲料は、インスリン放出の急速なスパイクなしに、血中グルコースのゆっくりとした低い上昇を与える。血中グルコースにおけるこの反応は、食品のグリセミック指数(GI)として表され、グルコース含有参照又は白パンの摂取に対する反応(100に設定される)に対して表される。多くの食品に関して、GIが決定されている。ゆっくりと消化、吸収及び代謝される、炭水化物食品をベースとする食事(即ち低GI食)は、高GI食よりも優れたインスリン感受性を付与することが分かっている。低GI食は、高GI食と比較して、2型糖尿病及び循環器疾患のリスクの低減と関連する。満腹、体重維持及び食事に関連する疾患の予防における高GI食と比較した低GIの役割が示唆されている。グリセミック負荷(GL)は、食品中の利用可能な炭水化物のグラム数に食品のGIを掛け、次いで100で割ることによって計算される。
本発明者らは、意外にも、栄養補助食品として又は医療用食事の一部若しくは医療用補助食品として酵素、スクロースイソメラーゼを使用すると、酵素と共に消費された場合に甘い食品及び/又は飲料のスクロース含有量が低くなることを見出した。したがって、栄養補助食品として又は乾燥食品若しくは飲料の一部(プレミックス等)として使用されるスクロースイソメラーゼは、消費前に食品又は飲料の組成及び特性に影響を及ぼすことなく、腸管内のかかる食品のグリセミック指数を低下させるであろう。結果として、栄養補助食品としてのスクロースイソメラーゼは、食習慣を変えることなく、2型糖尿病及び心血管疾患のリスクを低下させるために使用され得る。また、グリセミック負荷を低下させることにより、栄養補助食品としてのスクロースイソメラーゼは、体重維持のためのプログラムに適合し得、糖分の多い食事に関連する疾患を予防し得る。栄養補助食品としてのスクロースイソメラーゼは、糖の取り込みを遅らせることにより、スポーツ栄養にも有用であり得る。スクロースイソメラーゼは、食事代替品の炭水化物含有量を乱すことなく、低炭水化物食が推奨又は処方される糖尿病性又は前糖尿病性患者のための即時混合可能な代替品にも含まれ得る。
グループI:セラチア・プリムシカ(Serratia plymuthica)及びプロタミノバクター・ラブラム(Protaminobacter rubrum)を含む;
グループII:エルヴィニア・ラポンティキ(Erwinia rhapontici)を含む;
グループIII;エンテロバクター(Enterobacter)属、ラウルテラ・プランティコラ(Roaultella planticola)及びクレブシエラ・シンガポレンシス(Klebsiella singaporensis)を含む;
グループIV:パントエア・ディスペルサ(Pantoea dispersa)を含む;及び
グループV:シュードモナス・メソアシドフィラ(Pseudomonas mesoacidophila)及び根粒菌(Rhizobium)属を含む。
ユニプロット:D0VX20として同定される酵素を含むプロタミノバクター・ラブラム(Protaminobacter rubrum)、
ユニプロット:Q6XNK6として同定される酵素を含むパントエア・ディスペルサ(Pantoea dispersa)、
ユニプロット:Q6XKX6として同定される酵素を含むラウルテラ・プランティコラ(Roaultella planticola)、
ユニプロット:Q2PS28として同定される酵素を含むシュードモナス・メソアシドフィラ(Pseudomonas mesoacidophila)、
ユニプロット:B5ABD8として同定される酵素を含むエンテロバクター(Enterobacter);及び
ユニプロット:S5YEW8として同定される酵素を含むペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carotovorum)
において見出されるイソメラーゼが挙げられる。
・デザート − アイスクリーム、プリン、カスタード、ヨーグルト、
・製菓 − スイーツ、チョコレート、
・焼き菓子 − クッキー、ペストリー、パイ、ドーナツ、朝食用シリアル、
・飲料 − ソフトドリンク、エネルギードリンク、フルーツジュース、風味付けされたミルク、
・果物及び野菜 − トウモロコシ、トロピカルフルーツ、デート、バナナ、ビートの根、かぼちゃ、
・塗り物 − ジャム、マーマレード、チョコレートスプレッド、ピーナツバター、
・コンパニオン動物のための食品:ご褒美又はよく噛む必要のあるおやつの形態の食品
を含む。
本発明による食事性及び医薬組成物は、特に経口投与の従来のいずれかの形態、例えば食事若しくは飼料のための添加剤/サプリメント、食事若しくは飼料プレミックス、強化食品若しくは飼料、錠剤、丸剤、顆粒、糖衣丸、カプセル並びに粉末及びタブレットなどの発泡性製剤などの固体状態又は例えば飲料、ペースト及び油性懸濁液としての液剤、乳剤若しくは懸濁液などの液体状態で体に投与するのに適したいずれかの生薬形態をとり得る。ペーストは、ハード又はソフトシェルカプセルに封入され得、それにより、カプセルは、例えば、魚、ブタ、家禽又はウシゼラチン、植物タンパク質又はリグニンスルホネートのマトリックスを特徴とする。食事性及び医薬組成物は、放出制御又は遅延放出製剤の形態をとり得る。本発明の組成物は、鼻腔への適用など、局所的に投与されない。
栄養補助食品としての酵素の投与量は、摂取スクロース100g当たり0.1〜500mgの純粋なスクロースイソメラーゼタンパク質、好ましくは摂取スクロース100g当たで0.5〜100mg、2〜50mg、10〜25mgのスクロースイソメラーゼタンパク質である。当然のことながら、投与量は、1日当たり又は食事若しくは飲料当たりでどの程度のスクロースが摂取されたかに応じて異なる。例えば、人が、西洋諸国で一般的な量である1日に添加スクロース75グラムを消費した場合、1日の酵素の好ましい量は、7.5〜20mgの純粋なスクロースイソメラーゼタンパク質であろう。例えば、人が、100g/Lのスクロースを含有する飲料300mlを飲んだ場合、酵素の好ましい量は、飲料と合わされる3〜7.5mgの純粋なスクロースイソメラーゼタンパク質となるであろう。
[相同性]
本開示の目的のために、2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の配列相同性又は配列同一性のパーセンテージを決定するため、配列は最適な比較のためにアラインされることが本明細書において定義される。2つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される2つの配列のいずれかにおいてギャップが導入され得る。かかるアライメントは、比較される配列の完全長にわたって実施することができる。代わりに、アライメントは、より短い長さ、例えば約20、約50、約100以上の核酸/ベース又はアミノ酸にわたって実施され得る。配列同一性は、報告されるアライン領域にわたる2つの配列間の同一マッチのパーセンテージである。
[実施例1]
スクロースイソメラーゼとしてアノテートされた6つのタンパク質がユニプロットデータベースから選択された。配列は、プロタミノバクター・ラブラム(Protaminobacter rubrum)(ユニプロット:D0VX20)、パントエア・ディスペルサ(Pantoea dispersa)(ユニプロット:Q6XNK6)、ラウルテラ・プランティコラ(Roaultella planticola)(ユニプロット:Q6XKX6)、シュードモナス・メソアシドフィラ(Pseudomonas mesoacidophila)(ユニプロット:Q2PS28)、エンテロバクター(ユニプロット:B5ABD8)及びペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carotovorum)(ユニプロット:S5YEW8)に由来する。推定シグナルペプチドは、グラム陰性のためのSignalP4.1予測ソフトウェアによって予測された(Petersen,Nature Methods,8:785−786,2011)。存在する場合、これらのシグナルペプチドは、メチオニン(M)で置き換えられ、この結果、配列番号1〜6に示すタンパク質配列が得られた。
この研究で使用されるグルカンスクラーゼは、製品供給業者から入手した(ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)グルカンスクラーゼに関して、シグマ・アルドリッチ社(Sigma Aldrich);ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)グルカンスクラーゼに関して、NZYTech社)。
SDS−PAGEに続いてクマシー染色を用いて、試料に存在する酵素を可視化した。個々の酵素を定量化するために、正確な分子量のバンドに焦点を合わせた。バンドの染色強度は、ImageQuantソフトウェアによって定量化された。選択されたバンドのタンパク質染色強度を、同じゲル上に流れるウシ血清アルブミン(BSA)の既知量と比較し、元の酵素ストック溶液に戻って計算した。
CarboPac PA20カラムを備えたDionex HPLC(HPAEC BioLC system,Dionex5000)を使用して、酵素と共にスクロース含有溶液をインキュベートした後の糖プロファイルを分析した。インキュベート後、試料を希釈し、濾過し、表2に記載のプログラムを使用して糖成分を分離した。
これらの実験におけるグリセミック指数(GI)を計算し、様々な糖のGIを仮定した;スクロース:65;フルクトース:15;グルコース:100;イソマルツロース:32;トレハルロース:32。Wolever(European Journal of Clinical Nutrition(2013)67,1229−1233)は、カナダの規定に準拠して、GI>70が高いとみなされ、GI<55が低いと述べている。製品におけるそれぞれの糖の含有率%を100で割り、そのGI値を掛けた。すべての数を累計して、様々な処理製品のGIを計算した。
[異なるpHでのスクロースイソメラーゼの活性]
異なるpHでのスクロースに対する異なるスクロースイソメラーゼの活性を試験するために、本発明者らは、10%希釈(0.07〜0.21mgタンパク質/ml)において、異なる酵素と共に20%スクロース/250mMリン酸ナトリウム緩衝液をインキュベートした。溶液のpHを4.5及び6.0のいずれかに設定し、インキュベーションを37℃で6時間行い、その後、99℃で5分間加熱することによって反応を停止させた。Dionex HPLC法を用いて、異なる糖へのスクロースの転化を定量化した。それぞれの酵素の2〜4通りの異なる試料を使用した実験から得られた、インキュベーション後の試料で検出されたすべての糖の総量に対する平均パーセンテージとして、以下の表3に結果を示す。
[異なるpHでのグルカンスクラーゼの活性]
異なるpHでのスクロースに対する異なるグルカンスクラーゼの活性を試験するために、本発明者らは、10%希釈において、異なる酵素と共に20%スクロース/250mMリン酸ナトリウム緩衝液をインキュベートした。溶液のpHを4.5及び6.0のいずれかに設定し、インキュベーションを37℃で6時間行い、その後、99℃で5分間加熱することによって反応を停止させた。Dionex HPLC法を用いて、糖の組成を定量化した。それぞれの酵素を使用した実験から得られた、転化後の糖全体に対するパーセンテージとして、以下の表4に結果を示す。グルカンは、異なる形態で存在し得るため、これらの実験で使用されるHPLC法を用いて定量化することは難しい。したがって、酵素が添加されないブランクのフルクトース及びグルコース含有量に対して補正した後、グルカンの総形成は、フルクトース及びグルコースの増加の違いから計算された。したがって、示される数値は、単に形成されたグルカンの総量の大まかな推定量である。
[コーラ中のスクロースイソメラーゼの活性]
スクロースイソメラーゼ及びグルカンスクラーゼの活性をコーラ(コカ・コーラ(Coca−Cola)(登録商標);地元のスーパーマーケットで入手)中で試験した。この実験では、酵素を再びこのマトリックス中で10%希釈において添加し、37℃で130分間インキュベートし、その後、90℃で5分間加熱することによって反応を停止させた。約100g/Lの糖総量がコーラ中で測定される。コーラは、非常に酸性(pH2.6)であるため、スクロースの一部は、特に加熱工程中にグルコース及びフルクトースに転化され、測定されるスクロースの総量は、おそらく低く、コーラ中に存在するフルクトース及びグルコースの量は、高い。再びDionex HPLC法を用いて、様々な糖へのスクロースの転化を定量化した。インキュベーション後に試料中で検出されるすべての糖の総量に対する平均パーセンテージとして、結果を以下に示す。以下の表5に示すように、糖全体の40〜50%は、Sis14及びSis15スクロースイソメラーゼを用いて低グリセミック糖のイソマルツロース及びトレハルロースに転化され、グリセミック指数が低くなる。実施例2の緩衝剤実験で既に見られたように、Sis14は、イソマルツロースに対して優先を有すると思われるが、Sis15は、トレハルロース形成に対する優先を有する。Sis2は、コーラにおいて全く活性を示さなかったが、Sis10、Sis12及びSis4は、8〜15%の転化率を示した。
[模擬胃の条件でのチョコレートミルクにおけるスクロースイソメラーゼの活性]
スクロースイソメラーゼ及びグルカンスクラーゼの活性をチョコレートミルクにおいて試験した。脱脂チョコレートミルク(Friesland Campina)は、中性pH(pH6.4)を有し、約100g/Lのスクロースを含有する。この実験において、37℃に設定された水浴中で20rpmにおいて攪拌下でチョコレートミルク100mlをインキュベートし、HClの添加によってpHを徐々に下げた。ブタの胃粘膜粉末からのペプシン>250u/mg固形分(シグマ社(Sigma);P7000)を最終濃度0.02mg/mlで添加し、スクロースイソメラーゼを実験の開始時に0.1%(v/v)で添加した。0.5時間インキュベートした後、HClを添加することにより、pHを4.0で設定し、1時間後にpH3.0に設定し、1.5時間後にpH2.0に設定した。インキュベーションして5〜10分後(t=0)、1時間後(t=1)及び2時間後(t=2)に試料1mlを採取し、加熱によって(99℃で5分間)酵素活性を即座に不活性化した。上述のHPLC法を用いて、試料を分析し、異なる糖を定量化し、試料中で検出されたすべての糖の総量に対するパーセンテージで表し、以下の表6に示す。再び、コーラの実験でも確認されるように、試料は、低pHで加熱することにより、グルコース及びフルクトースへのスクロースの(化学的)転化を示した(特にt=2試料において優勢)。
[模擬胃条件でのアイスクリームにおけるスクロースイソメラーゼの活性]
スクロースイソメラーゼ及びグルカンスクラーゼの活性をアイスクリームで試験した。アイスクリーム(Albert Heijn Roomijs vanilla)は、中性pH(pH6.5)を有し、約230g/kgのスクロースを含有した。酵素投与量、ペプシン添加、pH設定、サンプリング時間及び量及びHPLCでの糖分析を含む、実施例4に記載のように正確に実験を行った。再び、異なる糖を定量化し、試料中で検出された糖の総量に対するパーセンテージで表した。糖分析の結果を以下の表7に示す。
Claims (10)
- スクロースイソメラーゼを含む栄養補助剤、薬剤又は栄養補助食品組成物。
- ヒトに適している、請求項1に記載の組成物。
- コンパニオン動物に適している、請求項2に記載の組成物。
- 配列番号1〜6の配列のいずれか1つに対して少なくとも60%の同一性、好ましくは90%、95%、98%、99%、100%の同一性を有するスクロースイソメラーゼを含む、請求項1に記載の組成物。
- 配列番号4に対して少なくとも60%の同一性、好ましくは90%、95%、98%、99%、100%の同一性を有するスクロースイソメラーゼを含む、請求項4に記載の組成物。
- スクロースを摂取するヒトを含む動物における血中グルコースレベルの上昇を低下させる方法であって、請求項1に記載の栄養補助剤、薬剤又は栄養補助食品を、それを必要とするヒトを含む前記動物に投与することを含む方法。
- ヒト又はコンパニオン動物によって消費される食品又は飼料のグリセミック指数を低下させる方法であって、請求項1に記載のスクロースイソメラーゼを含む栄養補助剤、薬剤又は栄養補助食品を前記ヒト又はコンパニオン動物に投与することを含む方法。
- ヒト又はコンパニオン動物において体重を減らすか又は体重減少を維持する方法であって、請求項1に記載のスクロースイソメラーゼを含む栄養補助剤、薬剤又は栄養補助食品を前記ヒト又はコンパニオン動物に投与することを含む方法。
- a)血糖レベルの上昇を低下させること;
b)持久的エクササイズを実施する動物の増加した持久力;
c)体重の減少又は減少した体重の維持;
d)摂取食品又は飼料のグリセミック指数を低下させること;及び
e)持続的なエネルギー放出並びに/又はスクロース含有食事後の急速な血糖上昇及びいわゆる食後の「眠気」の予防若しくは最小化
からなる群から選択される、ヒトを含む動物における状態を達成するための、スクロースイソメラーゼを含む栄養補助剤、薬剤又は栄養補助食品の使用。 - スクロースイソメラーゼを含む乾燥食品又は飲料混合物。
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