KR20210047318A - 식품 및 영양 보충제로서의 수크로스 이성질화 효소 - Google Patents

식품 및 영양 보충제로서의 수크로스 이성질화 효소 Download PDF

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Abstract

수크로스 이성질화 효소는 영양 보충제로 사용하거나 분말 식품/음료 제제와 혼합될 수 있다. 사람을 포함한 동물이 수크로스를 섭취하면 수크로스 이성질화 효소는 식품에 존재하는 수크로스에 작용하여 수크로스를 다른 당으로 전환시킬 것이다. 이는 식품의 제형을 변경하지 않고 식품의 당 지수를 낮추는 결과를 가져온다.

Description

식품 및 영양 보충제로서의 수크로스 이성질화 효소
본 발명은 인간과 동물 모두를 위한 영양 보충제로서의 수크로스 이성질화 효소의 용도에 관한 것이다. 수크로스 이성질화 효소는 소비된 식품의 수크로스 양을 효소에 의해 감소시켜 식품의 당 지수(glycemic index)를 낮출 수 있다. 수크로스 이성질화 효소 보충제는 혈당을 낮추고, 섭취한 식품 및/또는 음료의 당 지수를 낮추고, 체중을 관리하거나 줄이는데 특히 유용하다.
고혈당은 전 세계적 질병 원인에서 매우 높은 순위를 차지하며 비만 및 당뇨병 2형으로 이어질 수 있다. 당이나 전분과 같이 빠르게 흡수되는 탄수화물이 포함된 식품 및 음료는 혈당을 빠르게 증가시킬 수 있으며, 그 후 급격한 인슐린 방출로 이어지고, 이는 혈당을 빠르게 감소시킨다. 이러한 탄수화물이 결여된 식품 및 음료는 급격한 인슐린 방출 증가 없이 혈당을 더 느리고 낮게 증가시킨다. 혈당에 대한 이 반응은 식품의 당 지수(GI)로 표현되며, 이는, 글루코스 또는 흰빵을 포함하는 기준물 섭취에 대한 반응(100으로 설정)과 대비되어 표현된다. 많은 식품에 대해 GI가 결정되었다. 더 천천히 소화, 흡수 및 대사되는 탄수화물 식품을 기반으로 한 식단(즉, 저 GI 식단)은 고 GI 식단보다 더 우수한 인슐린 민감성을 제공하는 것으로 나타났다. 저 GI 식단은 고 GI 식단에 비해 2형 당뇨병 및 심혈관 질환의 위험 감소와 관련이 있다. 포만감, 체중 유지 및 식이-관련 질병의 예방에서 고 GI 식단에 비해 저 GI의 역할이 제안되었다. 당 부하(Glycemic load, GL)는 식품 내의 이용가능 탄수화물 그램 수와 식품의 GI를 곱한 다음 100으로 나누어 계산된다.
수크로스는 식단에 풍부하며 식단에 포함된 모든 탄수화물의 약 35-40%를 구성한다. 혈당 부하를 낮추려는 사람들에 있어서 도전 과제는 많은 선호하는 자신의 식품 및 음료에 다량의 수크로스가 포함되어 있다는 점이다. 예를 들어, 일부 캔디 바에는 최대 30g의 수크로스(50 중량%)이 들어 있고, 콜라 캔(330cc)에는 39g의 수크로스가 들어 있고, 초콜릿 우유는 450cc에 58g의 수크로스가 들어 있으며, 아이스크림에는 종종 28 중량%의 수크로스가 포함되어 있다. 그러나 이러한 식품의 당 함량을 줄이는 것은 종종 단맛, 식감 및 선호도 특성에 부정적인 영향을 미친다. 이러한 제품 내의 수크로스를 GI가 낮은 다른 당 (예를 들면, 타가토스, 알룰로스 또는 팔라티노스), 당 알콜 (예를 들면, 소르비톨, 만니톨 또는 자일리톨) 또는 고 효능 감미료 (예를 들면, 아스파탐, 수크랄로스 또는 스테비아)로 대체하는 것은 덜 달콤한 최종 제품을 야기하거나, 식품 또는 음료의 질감 및/또는 맛에 부정적인 영향을 미쳐, 이에 따라 제품의 선호도를 감소시킬 것이다. 따라서 이러한 수크로스 대체물은 식품에 자주 사용되지 않으며, 이의 용도는 주로 가당 음료에 초점이 맞추어져 있다.
이소말툴로스는 상표명 팔라티노스(Palatinose)™로 베네오(Beneo)로부터 식품 산업에서 입수할 수 있으며 당 대체물로 식품에 사용된다. 팔라티노스™는 소장에서 완전히 이용될 수 있지만 4 내지 5 배 더 천천히 가수 분해되어 더 낮은 혈당 반응성 및 더 낮은 인슐린 수준을 제공한다. 수크로스를 팔라티노스™로 대체하면 인슐린 피크가 낮아지고 운동시 지방 연소가 증가하는 것으로 나타났다. 베네오는 팔라티노스™를 체중 관리, 비-우식성(non-cariogenic) 특성, 스포츠에서의 지구력 향상, 임신성 당뇨병 예방, 지속적인 인지 기능, 및 노인의 대사 프로필 개선을 위한 것으로 판매한다 (참조: Beneo-institute, 2017; http://www.beneo.com/Expertise/BENEO-Institute/News Papers/BENEO paper palatinose US 201708v1 web USLetter 1.pdf).
트레할룰로스(특허 문헌에서 "비탈로스"라고도 함)의 경우에도, 장(intestinal) 수크라제에 의해 천천히 소화되기 때문에 유사한 이점이 예상되지만 임상 데이터가 더 적다. 혈당 수치와 인슐린 반응은 이소말툴로스와 비슷하거나 약간 더 적합하다 (유럽 특허 EP 2418971 B1에 보고됨).
소장에서의 수크라제/아밀라제의 활성에 대한 이러한 당의 억제 효과가 문헌에 제시되어 있지만(참조: Kashimura & al, 2008 J. Agric. Food Chem. 56:5892-5898), 이에 대한 확실한 증거는 여전히 없다. 이러한 억제 효과는 수크로스와 전분의 전환을 늦추고 이로써 혈당 부하를 더욱 감소시킬 수 있다. 따라서, 이소말툴로스 및/또는 트레할룰로스 소비는, 전분 함유 식품과 결합될 때, 장에서 수크라제/아밀라제 활성을 억제함으로써 혈당 부하 감소에 추가적인 이점을 가질 수 있다.
식품 및 음료에 이소말툴로스 또는 트레할룰로스를 사용할 때의 한 가지 문제점은 그램당 이러한 당의 단맛이 수크로스의 단맛보다 훨씬 낮다는 것이다. 따라서 수크로스를 이러한 수크로스 이성질체로 대체하려면 식품 또는 음료의 조성을 크게 변경해야 한다. 더 낮은 단맛은 예를 들어 최종 제품의 맛에 영향을 미칠 수 있는 추가 인공 감미료 첨가에 의해 보상되어야 한다. 또한, 이소말툴로스는 수크로스에 비해 상대적으로 비싸며, 따라서 식품 또는 음료 제품에 첨가하지 않는 경제적 이유가 될 수 있다.
따라서, 소비 후 고 혈당 반응을 일으키지 않는 달콤하고 소비자의 선호도에 충족되는 식품 및 음료에 대한 사회적인 필요성이 존재한다. 의식이 있는 소비자는 수크로스가 함유된 식품/음료를 섭취한 후 고 당 지수 및 혈당 증가를 방지하기를 원할 수 있다. 더욱이, 위장에서 고 당 지수 탄수화물을 저 당 지수 탄수화물로 전환시키는 것은 1형 및 2형 당뇨병 환자의 혈당 조절에 임상적으로 중요한 이점을 제공한다. 당 지수를 낮추는 영양 요법은 2형 당뇨병 환자의 당화 헤모글로빈(A1C)을 1.0% 내지 2.0% 감소시킬 수 있으며, 당뇨병 관리의 다른 구성 요소와 함께 사용하면 임상 및 대사 결과를 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도, 수크로스 이성질화 효소를 영양 보충제로 사용하거나 의학적 식이 요법 또는 의학적 식이 보충제의 일부로 사용하면, 상기 효소와 함께 섭취된 단 식품 및/또는 음료의 수크로스 함량이 낮아진다는 것을 발견하였다. 따라서, 영양 보충제로 또는 건조 식품 또는 음료(예를 들면, 프리믹스 등)의 일부로 사용되는 수크로스 이성질화 효소는, 소비 이전의 식품 또는 음료의 조성 및 특성에 영향을 주지 않고도 장관에서의 이러한 식품의 당 지수를 낮출 것이다. 따라서, 식습관을 바꾸지 않고도 2형 당뇨병 및 심혈관 질환의 위험을 줄이는데 영양 보충제로서 수크로스 이성질화 효소를 사용할 수 있다. 또한, 당 부하를 낮춤으로써 영양 보충제로서의 수크로스 이성질화 효소는 체중 유지 프로그램에 적합할 수 있으며, 고당 식단 관련 질병을 예방할 수 있다. 영양 보충제로서의 수크로스 이성질화 효소는 또한, 당 섭취를 늦춤으로써 스포츠 영양에 유용할 수 있다. 수크로스 이성질화 효소는, 식사 대체제의 탄수화물 함량을 방해하지 않으면서, 저탄수화물 식단을 권고받거나 처방받은 당뇨병 환자 또는 전 당뇨병 환자를 위한 즉석 혼합 식사 대체제에도 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는, 수크로스를 포함하는 식품 또는 음료를 섭취하는 인간을 포함한 동물에서 인슐린 수치를 감소시키는 방법이며, 상기 방법은 상기 식품 또는 음료를 섭취하기 전에 또는 그와 함께 상기 동물 또는 인간에게 유효량의 수크로스 이성질화 효소 영양제, 식이 보충제, 또는 약제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태는, 인간을 포함한 동물에 의해 섭취되는 수크로스를 포함하는 식품 또는 음료의 당 지수를 낮추는 방법이며, 이 방법은 상기 동물 또는 인간에게 영양제, 식이 보충제, 또는 약제의 형태로 수크로스 이성질화 효소를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태는, 영양 보충제, 건조 및/또는 분말 식품 또는 음료, 또는 식품 또는 음료의 당 지수를 낮추는 약제를 제조하기 위한 수크로스 이성질화 효소의 용도이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는, 식품 또는 음료의 당 지수를 낮추는 영양 보충제로서의 수크로스 이성질화 효소이다.
새로운 연구에 따르면 운동 선수의 지속적인 지구력의 핵심은 이른바“빠른 탄수화물”소비가 아니라, 혈당 형태로 에너지를 공급하는 대신 혈당 균형을 맞추는“느린 탄수화물”소비에 있을 수 있음을 제시한다. 본 발명의 목적 상, "지구력 운동"은 걷기, 조깅, 수영 또는 자전거 타기 등과 같이 호흡 및 심박수를 증가시키는 운동을 의미한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는, 지구력 운동 동안에 수크로스가 포함된 식품 또는 음료를 섭취하는 지구력 운동을 수행하는 사람에게 유효량의 수크로스 이성질화 효소를 투여하는 것을 포함하는, 운동 선수의 지구력 운동 수행 능력을 향상시키기 위해 일정 기간 동안 당 흡수를 늦추거나 유지하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는, 운동의 지구력 활동과 관련되고 또한 수크로스를 함유한 식품 또는 음료를 섭취하는 사람에게 유효량의 수크로스 이성질화 효소를 투여하는 것을 포함하는 운동 선수의 지속적 지구력을 향상시키는 방법이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는, 지구력 운동을 수행하는 사람의 능력을 증가시키기 위한 수크로스 이성질화 효소의 용도이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 에너지 방출을 유지하고 혈당 상승 및 소위 수크로스-함유 식사후 식후 "딥(dip)"을 최소화하기 위해 당 흡수를 유지하고/하거나 늦추는 방법이며, 이는, 수크로스가 포함된 식품을 섭취하는 건강한 사람 또는 (전)당뇨병 환자에게 유효량의 수크로스 이성질화 효소를 투여하는 것을 포함한다. 다. 이것은 특히, 사람이 식사(예를 들면, 점심 식사)를 하고 식후 몇 시간 동안 긴장을 유지하고 졸음을 피하고자 하는 상황에서 유용하다.
본 발명의 또 다른 실시양태는, 동물 또는 사람에게 유효량의 수크로스 이성질화 효소를 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함한 동물이 체중 감량 또는 체중 감소 유지를 하도록 돕는 방법이다.
일 실시양태에서, 수크로스 이성질화 효소는 인간 영양에 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 수크로스 이성질화 효소는 수크로스를 섭취할 수 있는 동물, 바람직하게는 반려 동물(예를 들어, 일반적으로 애완 동물로 사용되는 고양이, 개, 말 및 길들여진 돼지)에게 도움을 주기 위해 사용된다. 반려 동물은 종종 비만에 걸리기 쉽고 그로 인한 부작용으로 고통받는다. 본 발명의 수크로스 이성질화 효소는 비싸고 불편한 인슐린 주사에 의존하지 않고도 반려 동물의 당뇨병, 체중 증가 및 관련 대사 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
수크로스 이성질화 효소는 수크로스를 함유하는 식품 또는 음료를 섭취하기 전에 적어도 하루에 한 번 섭취하는 것이 바람직하다. 또한, 섭취 직전에(즉, 섭취하기 1 시간 미만, 보다 바람직하게는 섭취하기 30 분 미만 전에) 복용하는 것이 바람직하다 (섭취 직전 또는 섭취 중에 복용하는 것이 특히 바람직하다). 또 다른 실시양태에서, 수크로스 이성질화 효소는 식사 후 2 시간 이내에 섭취한다.
도 1은 실시예 1에 상세히 설명된 바와 같이 당을 분리하기 위해 사용된 HPLC의 판독 값이다.
수크로스 이성질화 효소는 수크로스로부터 이소말툴로스를 산업적으로 생산하는데 사용된다. 우리가 아는 한, 수크로스 이성질화 효소를 보충제로 사용하고 이때 상기 보충제에서 수크로스 이성질화 효소가 정제 또는 기타 적합한 제제를 만드는 것과 관련된 공정 및 인간의 소화 공정 모두를 견뎌 위장 및/또는 소화관에서 여전히 활성 상태로 유지된다는 것에 대한 기재는 없었다. 수크로스 이성질화 효소는 당업계에 알려져 있기는 하지만, 이의 활성은 실험실 완충액의 맥락에서만 관찰되었다.
수크로스 이성질화 효소는 수크로스(2-O-α-D-글루코피라노실-D-프룩토스)를 더 저혈당의 당 이소말툴로스(6-O-α-D-글루코피라노실-D-프룩토스) 및/또는 트레할룰로스(1-O-α-D-글루코피라노실-D-프룩토스)로 전환시킨다 (참조: Mu & al (2014) Appl Microbiol Biotechnol 98:6569-6582).
본원 실시예 4 내지 6에 나타낸 바와 같이, 다른 메커니즘을 통해 수크로스에 작용하는 또 다른 효소인 글리코실 트랜스퍼라제는, 인간 소화계를 모방한 조건 하에 놓일 때 비활성인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 수크로스를 기질로 사용하는 효소가 영양 보충제로 사용하기에 적합할 것이라고 예측할 수 없었다.
본 발명의 수크로스 이성질화 효소는, 섭취된 당에 유효량이 작용할 수 있을 정도로 충분히 잘, 제형화 및 소화 과정에서 생존하기에 충분히 견고하다면, 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 수크로스 이성질화 효소에는 하기와 같은 적어도 5 가지의 당업계-인정된 부류가 있다 (참조: Goulter et al 2012 Enz and Microb Technol 50:57-64):
그룹 I: 세라티아 플리뮤티카(Serratia plymuthica) 및 프로타미노박터 루브룸(pro taminobacter rubrum) 함유 군
그룹 II: 에르위니아 라폰티씨(Erwinia rhapontici) 함유 군
그룹 III: 엔테로박터 종(Enterobacter sp), 로아울텔라 플란티콜라(Roaultella planticola) 및 클렙시엘라 싱가포렌시스(Klebsiella singaporensis) 함유 군
그룹 IV: 판토에아 디스퍼사(Pantoea dispersa) 함유 군, 및
그룹 V: 슈도모나스 메소애시도필리아(Pseudomonas mesoacidophilia) 및 리조븀 종(Rhizobium sp.) 함유 군.
바람직한 수크로스 이성질화 효소의 예는 다음에서 발견되는 것들을 포함한다:
프로타미노박터 루브룸(protaminobacter rubrum), 예컨대 Uniprot:D0VX20으로 식별된 효소,
판토에아 디스퍼사(Pantoea dispersa), 예컨대 Uniprot:Q6XNK6으로 식별된 효소,
로아울텔라 플란티콜라(Roaultella planticola), 예컨대 Uniprot:Q6XKX6으로 식별된 효소,
슈도모나스 메소애시도필리아(Pseudomonas mesoacidophilia), 예컨대 Uniprot:Q2PS28로 식별된 효소,
엔테로박터 종(Enterobacter sp), 예컨대 Uniprot:B5ABD8로 식별된 효소; 및
펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum), 예컨대 Uniprot:S5YEW8로 식별된 효소.
존재하는 경우, 이들의 신호 펩티드는 메티오닌(M)으로 대체되었고, 이것은 각각 하기에 나타낸 서열 번호 1 내지 6에 기재된 단백질 서열을 생성하였다.
바람직한 수크로스 이성질화 효소는 실시예에서 Sis4, Sis10, Sis 12, Sis14 및 Sis15로 식별된 것들을 포함한다. 특히 바람직한 수크로스 이성질화 효소는 Sis4이다.
본원에 기술된 발명은 식품 및 음료 제형에서 이소말툴로스, 트레할룰로스 또는 기타 저혈당 당 대체제의 사용과 관련된 종래의 문제를 회피한다. 수크로스 이성질화 효소를 영양 성분으로 공급함으로써 식품 또는 음료 제제를 변경할 필요가 없으며 이소말툴로스 및/또는 트레할룰로스는 위장 또는 상부 장관에서 소화 중에만 형성된다.
본 발명과 관련된 바람직한 수크로스-함유 식품/음료는 다음과 같은 기호 식품을 포함한다 :
＊ 디저트 - 아이스크림, 푸딩, 커스터드, 요구르트
＊ 과자 - 스위츠, 초콜릿
＊ 구운 과자 - 쿠키, 페스트리, 파이, 도넛, 아침 시리얼
＊ 음료 - 청량 음료, 에너지 드링크, 과일 주스, 가향 우유
＊ 과일 및 채소 - 옥수수, 열대 과일, 대추 야자, 바나나, 비트, 호박
＊ 스프레드 - 잼, 마멀레이드, 초콜릿 스프레드, 땅콩 버터
＊ 반려 동물용 식품 - 트리츠 또는 씹는 스낵 형태
제형
본 발명에 따른 식이 및 약학적 조성물은, 특히 경구 투여에 통상적인 임의의 형태로 신체에 투여하기에 적합한 임의의 생약 형태, 예를 들어 고체 형태, 예컨대 식품 또는 사료용 첨가제/보충제, 식품 또는 사료 프리믹스, 강화 식품 또는 사료, 정제, 알약, 과립, 당의정, 캡슐 및 발포성 제형, 예컨대 분말 및 정제, 또는 액체 형태, 예컨대 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어 음료, 페이스트 및 유성 현탁액일 수 있다. 페이스트는 경질 또는 연질 쉘 캡슐에 캡슐화될 수 있으며, 이에 따라 캡슐은 예를 들어 어류, 돼지, 가금류 또는 소 젤라틴, 식물성 단백질 또는 리그닌 설포네이트의 매트릭스를 특징으로 한다. 식이 및 약학적 조성물은 제어 또는 지연 방출 제형의 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 비강에 적용하는 것과 같이 국소적으로 투여되지 않는다.
본 발명에 따른 식이 조성물은 보호성 하이드로콜로이드 (예를 들면, 검, 단백질, 변성 전분), 결합제, 필름 형성제, 캡슐화제/재료, 벽/쉘 재료, 매트릭스 화합물, 코팅, 유화제, 표면 활성제, 가용화제 (오일, 지방, 왁스, 레시틴 등), 흡착제, 담체, 충전제, 보조(co)-화합물, 분산제, 습윤제, 가공 보조제(용매), 유동제, 맛 차폐제, 증량제, 젤리화제, 겔 형성제, 항산화제 및 항균제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 추가적으로 통상적인 제약학적 첨가제 및 보조제, 부형제 또는 희석제, 예를 들어 비제한적으로 물, 임의의 기원의 젤라틴, 식물성 검, 리그닌 설포네이트, 탤크, 당, 전분, 아라비아 검, 식물성 오일, 폴리알킬렌 글리콜, 향미제, 방부제, 안정제, 유화제, 완충제, 윤활제, 착색제, 습윤제, 충전제 등을 함유할 수 있다.
복용량
영양 보충제로서 상기 효소의 복용량은 섭취한 수크로스 100g 당 0.1 내지 500mg의 순수 수크로스 이성질화 효소 단백질이며, 바람직하게는 섭취한 수크로스 100g 당 수크로스 이성질화 효소 0.5 내지 100mg, 2 내지 50mg, 10 내지 25mg이다. 물론 상기 복용량은 하루 또는 식사 또는 음료 당 섭취되는 수크로스의 양에 따라 다르다. 예를 들어, 한 사람이 하루에 75g의 첨가된 수크로스를 섭취하는 경우 (일부 서방 국가에서 일반적으로 사용되는 양), 일일 효소의 바람직한 양은 7.5 내지 20mg의 순수 수크로스 이성질화 효소 단백질이 될 것이다. 예를 들어, 한 사람이 100g/l의 수크로스를 함유한 300ml의 음료를 마신다면, 바람직한 효소량은 음료와 함께 섭취하기 위해 3 내지 7.5mg의 순수 수크로스 이성질화 효소 단백질이 될 것이다.
수크로스 이성질화 효소를 포함하는 전형적인 조성물은 이산화 규소, (마이크로)셀룰로스 (예를 들면, 아비셀(Avicel) PH102), 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 폴리비닐 피롤리돈 (예를 들면, 크로스포비돈) 및/또는 말토덱스트린을 포함할 수 있다. 300mg의 정제당, 이러한 조성물은 예를 들어, 60mg의 건조된 효소 제형 (예를 들면, 7.5 내지 20mg의 순수한 수크로스 이성질화 효소와 60mg까지의 말토덱스트린을 함유함), 15mg의 크로스 포비돈, 2.5mg의 마그네슘 스테아레이트 및 222.5mg의 아비셀 PH102을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 건조 식품, 청량 음료 분말 또는 식사 대체 분말일 수 있다. 이러한 건조 조성물은 전형적으로 0.5 미만의 수분 활성도(Aw)를 갖는다. 전형적인 등장성(isotonic) 스포츠 에너지 드링크 분말은 100g 분말 당 최대 90g의 탄수화물을 함유할 수 있으며, 이 중 75g은 당 (주로 수크로스 및 글루코스)일 수 있다. 또한, 상기 분말에는 100g 당 2.15g의 미네랄 염 (주로 염화칼륨, 구연산 칼륨, 구연산 나트륨, 염화나트륨 및 구연산 마그네슘)뿐 아니라 일부 구연산, 향료 및 색소가 포함된다. 바람직하게는 수크로스 이성질화 효소는 이러한 분말 100g 당 7.5 내지 20mg의 순수 건조 효소로 첨가된다.
효소
상동성(homology)
본 개시의 목적을 위해, 본원에서는, 2 개의 아미노산 서열 또는 2 개의 핵산 서열의 서열 상동성 또는 서열 동일성(identity)의 백분율을 결정하기 위해, 상기 서열들이 최적의 비교 목적을 위해 정렬됨이 규정된다. 두 서열 사이의 정렬을 최적화하기 위해, 비교되는 두 서열 중 어느 하나에 갭(gap)이 도입될 수 있다. 이러한 정렬은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행될 수 있다. 달리, 상기 정렬은 더 짧은 길이에 걸쳐, 예를 들어 약 20 개, 약 50 개, 약 100 개 이상의 핵산/기반(based) 또는 아미노산에 걸쳐 수행될 수 있다. 서열 동일성은 보고된 정렬된 영역에 걸쳐 두 서열 간의 동일한 매칭의 백분율이다.
두 서열 간의 서열 비교 및 서열 동일성 백분율 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 당업자는 2 개의 서열을 정렬하고 2 개의 서열 간의 동일성을 결정하기 위해 여러 다른 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다는 사실을 알 것이다 (참고: Kruskal, JB (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and JB Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). 두 아미노산 서열 사이 또는 두 뉴클레오티드 서열 사이의 % 서열 동일성은, 두 서열의 정렬을 위한 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다 (참고: Needleman, S.B. 및 Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열 모두 상기 알고리즘에 의해 정렬될 수 있다. 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 NEEDLE에서 구현되었다. 이 개시의 목적을 위해 EMBOSS 패키지로부터의 NEEDLE 프로그램이 사용되었다 (버전 2.8.0 이상, EMBOSS : The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). 단백질 서열의 경우 EBLOSUM62가 치환 매트릭스에 사용된다. 뉴클레오티드 서열의 경우 EDNAFULL이 사용된다. 사용되는 선택적 매개 변수는 10의 갭 오픈 페널티(gap-open penalty) 및 0.5의 갭 확장 페널티(gap extension penalty)이다. 당업자는, 이러한 모든 다른 매개 변수가 약간 다른 결과를 생성하지만 다른 알고리즘을 사용할 때 두 서열의 전체적인 백분율 동일성은 크게 변하지 않음을 인식할 것이다.
상기 기재된 바와 같이 프로그램 NEEDLE에 의한 정렬 후, 질의(query) 서열과 본 개시의 서열 사이의 서열 동일성의 백분율은, 두 서열에서 동일한 아미노산 또는 동일한 뉴클레오티드를 나타내는 상기 정렬 내의 상응하는 위치의 수를, 상기 정렬 내의 총 갭의 수를 뺀 후의 상기 정렬의 총 길이로 나눔으로써 계산된다. 본원에서 정의된 동일성은 NOBRIEF 옵션을 사용하여 NEEDLE에서 얻을 수 있으며, 프로그램 출력에서 "최장 동일성(longest-identity)"으로 지정된다.
본 개시의 핵산 및 단백질 서열은 추가로, 공개 데이터 베이스에 대한 검색을 수행하여 예를 들어 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-10]의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 BLASTN 프로그램, 스코어 = 100, 워드 길이 = 12로 수행하여, 본 개시의 핵산 분자에 대해 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 BLASTX 프로그램, 스코어 = 50, 워드 길이 = 3으로 수행하여, 본 개시의 단백질 분자에 대해 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는(gapped) 정렬을 얻기 위해, 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402]에 기술된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램(예를 들면, BLASTX 및 BLASTN)의 기본 매개 변수를 사용할 수 있다. 인터넷 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에 있는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 홈페이지를 참조한다.
본원에 사용된 용어 "변이체", "유도체", "돌연변이" 또는 "상동체"는 호환적으로 사용될 수 있다. 이들은 폴리펩티드 또는 핵산을 나타낼 수 있다. 변이체는 기준 서열에 대한 하나 이상의 위치에서의 치환, 삽입, 결실, 절단, 변환 및/또는 반전을 포함한다. 변이체는 예를 들어 부위-포화 돌연변이 유발, 스캐닝 돌연변이 유발, 삽입 돌연변이 유발, 무작위 돌연변이 유발, 부위-지정 돌연변이 유발 및 방향-진화뿐만 아니라 다양한 다른 재조합 접근법에 의해 만들어 질 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 적은 수의 아미노산 잔기가 기준 폴리펩티드와 다를 수 있으며, 기준 폴리펩티드와의 1 차 아미노산 서열 상동성/동일성 수준에 의해 정의될 수 있다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 동일성 백분율을 결정하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며 본원에 설명되어 있다. 일반적으로, 상기 변이체는 기준 폴리펩티드의 특징적인 특성은 유지하지만 일부 특정의 측면에서 변경된 특성을 갖는다. 예를 들어, 상기 변이체는 변경된 pH 최적치, 변경된 기질 결합 능력, 효소 분해 또는 기타 분해에 대한 변경된 저항성, 증가된 또는 감소된 활성, 변경된 온도 또는 산화 안정성을 가질 수 있지만 그 특징적인 기능은 유지한다. 변이체는 추가로, 기준 폴리펩티드의 특성을 변화시키는 화학적 변형을 거친 폴리펩티드를 포함한다.
상기 핵산과 관련하여, 상기 용어는, 변이체 폴리펩티드를 코딩하거나, 기준 핵산과 특정 정도의 상동성/동일성을 갖거나, 엄격한 조건 하에서 기준 핵산 또는 이의 보체(complement)에 혼성화하는 핵산을 의미한다. 바람직하게는, 변이체 핵산은 기준 핵산과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 심지어 99% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 동일성 백분율을 결정하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며 본원에 설명되어 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1
수크로스 이성질화 효소
수크로스 이성질화 효소로 기록된 6 개의 단백질을 Uniprot 데이터베이스에서 선택하였다. 서열은 프로타미노박터 루브룸(Protaminobacter rubrum)(Uniprot:D0VX20), 판토에아 디스퍼사(Pantoea dispersa) (Uniprot:Q6XNK6), 라오울텔라 프란티콜라(Raoultella planticola)(Uniprot:Q6XKX6), 슈도모나스 메소애시도필라(Pseudomonas mesoacidophila)(Uniprot:Q2PS28), 엔테로박터(Enterobacter)(Uniprot:B5ABD8), 및 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum)(Uniprot:S5YEW8)으로부터 유래되었다. 추정 신호 펩티드는, 그람 음성에 대한 SignalP 4.1 예측 소프트웨어에 의해 예측되었다 (참조: 문헌[Petersen, Nature Methods, 8 : 785-786, 2011]). 존재하는 경우 이러한 신호 펩티드는 메티오닌(M)으로 대체되었고, 이는 하기 서열 번호 1 내지 6에 기재된 단백질 서열을 생성하였다.
상기 단백질 서열 (서열 번호 1 내지 6)은 WO2017050652 (A1)에 기재된 바와 같이 대장균에서 발현되었다. 추정 수크로스 이성질화 효소를 암호화하는 합성 DNA 서열은 DNA2.0 (GeneGPS® 기술)의 알고리즘에 따라 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었다. 클로닝 목적을 위해, NdeI 부위를 포함하는 DNA 염기 서열을 5'-말단에 도입하고, 정지 코돈 및 AscI 부위를 포함하는 DNA 염기 서열을 3'-말단에 도입하였다. 추정 수크로스 이성질화 효소를 암호화하는 합성 DNA를, 5'NdeI 및 3'AscI 제한 부위를 통해, 아라비노스 유도성 프로모터 PBAD 및 조절자 araC (참고: 문헌 [Guzman (1995) J. Bact. 177: 4121-4130), 카나마이신 내성 유전자 Km(R) 및 pBR322로부터의 복제 기원 ori327 (참고: 문헌 [Watson (1988) Gene. 70:399-403])을 포함하는 아라비노스 유도성 대장균 발현 벡터 내로 클로닝하였다. ampC 및 araB에서 추가적으로 절단된 대장균 호스트 RV308 (lacIq-, su-, ΔlacX74, gal IS II::OP308, strA, http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/ERP005879)을, 화학적 적격 세포 (미국 캘리포리아주 어바인 소재의 지모 리서치(Zymo Research)의 믹스 앤드 고우(Mix and Go!) 대장균 형질 전환 키트로 제조된 지-컴피턴트(Z-Competent) 세포)를 사용하여 형질 전환시켰다. 하기 서열 번호 1 내지 6으로부터의 여러 클론을 서열 확인하고, 100μg/ml 네오마이신(O/N)을 함유하는 2xPY에서 배양하였다. 전배양(preculture) (1/100 vol)을 사용하여, 매직미디어(MagicMedia)TM 대장균 발현 배지(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Fisher Scientific Inc)) 및 100μg/ml의 네오마이신 (24 웰 MTP, 3ml 부피, 통기성 밀봉, 550RPM 80%RH) 중의 발효물을 접종하고, 30℃에서 4 시간 성장시킨 후, 0.02% 아라비노스 (최종 농도)로 배양을 유도하고, 30℃에서 48 시간 동안 배양을 계속하였다. 고속 원심 분리에 의해 세포 펠렛을 분리하고, 추가 사용시까지 동결시켰다. 동결된 세포 펠릿을 재현 탁시키고 1.2ml 용해(lysis) 완충액 (Tris-HCl 50mM, DNaseI 0.1mg/ml, 리소자임 2mg/ml, MgSO4 25μM)으로 37℃에서 1 시간 동안 배양하여 무-세포(cell-free) 추출물(CFE)을 제조하였다. 원심 분리에 의해 세포 파편(debris)을 제거하고 추가 특성분석시까지 CFE를 -20℃에 보관하였다.
글루칸 수크라제
이 연구에 사용된 글루칸 수크라제는 상업적 공급처에서 구입하였다 (류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 글루칸 수크라제의 경우, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 글루칸 수크라제의 경우, 엔지와이테크(NZYTech)).
이 연구에 사용된 모든 효소는 표 1에 언급되어 있다.
이 연구에 사용된 효소.
수크로스 이성질화 효소 (표 이후에 서열이 기재됨)
우니프롯 ID 서열 번호 공여자(donor) 미생물 명칭 스톡
농도
(mg/ml)
D0VX20 1 프로타미노박터 루브룸(Protaminobacter rubrum)* Sis10 2.2
Q6XNK6 2 판토에아 디스퍼사(Pantoea dispersa) Sis2 1.0
Q6XKX6 3 라오울텔라 프란티콜라(Raoultella planticola) Sis12 1.7
Q2PS28 4 슈도모나스 메소애시도필라(Pseudomonas mesoacidophila)* Sis4 2.0
B5ABD8 5 엔테로박터(Enterobacter) Sis14 0.9
S5YEW8 6 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum) Sis15 0.7

글루칸 수크라제
ID 공급처 공여자 미생물 명칭 스톡
농도
(mg/ml)
D9909 Sigma 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) B-1299 1.0
SmGtf70B NZYTech 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 70B 1.0
SmGtf70C NZYTech 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 70C 1.0
SmGtf70D NZYTech 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 70D 1.0
*프로타미노박터 루브룸은 세라티아 플리무티카(Serratia plymuthica)로 재명명될 가능성이 크고, 슈도모나스 메소애시도필라는 리조븀 종((Rhizobium species)으로서 지정되었다 (문헌 [Goulter et al. (2012) Enzyme Microb. Technol. 50, 57-64] 참조).
서열 번호 1 내지 6:
서열 번호 1 (SEQ ID NO:1)
MTIPKWWKEAVFYQVYPRSFKDTNGDGIGDINGIIEKLDYLKALGIDAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYRKIMKEYGTMEDFDRLISEMKKRNMRLMIDVVINHTSDQNEWFVKSKSSKDNPYRGYYFWKDAKEGQAPNNYPSFFGGSAWQKDEKTNQYYLHYFAKQQPDLNWDNPKVRQDLYAMLRFWLDKGVSGLRFDTVATYSKIPDFPNLTQQQLKNFAAEYTKGPNIHRYVNEMNKEVLSHYDIATAGEIFGVPLDQSIKFFDRRRDELNIAFTFDLIRLDRDSDQRWRRKDWKLSQFRQIIDNVDRTAGEYGWNAFFLDNHDNPRAVSHFGDDRPQWREPSAKALATLTLTQRATPFIYQGSELGMTNYPFKAIDEFDDIEVKGFWHDYVETGKVKADEFLQNVRLTSRDNSRTPFQWDGSKNAGFTSGKPWFKVNPNYQEINAVSQVTQPDSVFNYYRQLIKIRHDIPALTYGTYTDLDPANDSVYAYTRSLGAEKYLVVVNFKEQMMRYKLPDNLSIEKVIIDSNSKNVVKKNDSLLELKPWQSGVYKLNQ
서열 번호 2 ( SEQ ID NO:2)
MASPLTKPSTPIAATNIQKSADFPIWWKQAVFYQIYPRSFKDSNGDGIGDIPGIIEKLDYLKMLGVDAIWINPHYESPNTDNGYDISDYRKIMKEYGSMADFDRLVAEMNKRGMRLMIDIVINHTSDRHRWFVQSRSGKDNPYRDYYFWRDGKQGQAPNNYPSFFGGSAWQLDKQTDQYYLHYFAPQQPDLNWDNPKVRAELYDILRFWLDKGVSGLRFDTVATFSKIPGFPDLSKAQLKNFAEAYTEGPNIHKYIHEMNRQVLSKYNVATAGEIFGVPVSAMPDYFDRRREELNIAFTFDLIRLDRYPDQRWRRKPWTLSQFRQVISQTDRAAGEFGWNAFFLDNHDNPRQVSHFGDDSPQWRERSAKALATLLLTQRATPFIFQGAELGMTNYPFKNIEEFDDIEVKGFWNDYVASGKVNAAEFLQEVRMTSRDNSRTPMQWNDSVNAGFTQGKPWFHLNPNYKQINAAREVNKPDSVFSYYRQLINLRHQIPALTSGEYRDLDPQNNQVYAYTRILDNEKYLVVVNFKPEQLHYALPDNLTIASSLLENVHQPSLQENASTLTLAPWQAGIYKLN
서열 번호 3 ( SEQ ID NO:3)
MAPSVNQNIHVHKESEYPAWWKEAVFYQIYPRSFKDTNDDGIGDIRGIIEKLDYLKSLGIDAIWINPHYDSPNTDNGYDISNYRQIMKEYGTMEDFDNLVAEMKKRNMRLMIDVVINHTSDQHPWFIQSKSDKNNPYRDYYFWRDGKDNQPPNNYPSFFGGSAWQKDAKSGQYYLHYFARQQPDLNWDNPKVREDLYAMLRFWLDKGVSSMRFDTVATYSKIPGFPNLTPEQQKNFAEQYTMGPNIHRYIQEMNRKVLSRYDVATAGEIFGVPLDRSSQFFDPRRHELNMAFMFDLIRLDRDSNERWRHKSWSLSQFRQIISKMDVTVGKYGWNTFFLDNHDNPRAVSHFGDDRPQWREASAKALATITLTQRATPFIYQGSELGMTNYPFRQLNEFDDIEVKGFWQDYVQSGKVTATEFLDNVRLTSRDNSRTPFQWNDTLNAGFTRGKPWFHINPNYVEINAEREETREDSVLNYYKKMIQLRHHIPALVYGAYQDLNPQDNTVYAYTRTLGNERYLVVVNFKEYPVRYTLPANDAIEEVVIDTQQQATAPHSTSLSLSPWQAGVYKLR
서열 번호 4 ( SEQ ID NO:4)
MEEAVKPGAPWWKSAVFYQVYPRSFKDTNGDGIGDFKGLTEKLDYLKGLGIDAIWINPHYASPNTDNGYDISDYREVMKEYGTMEDFDRLMAELKKRGMRLMVDVVINHSSDQHEWFKSSRASKDNPYRDYYFWRDGKDGHEPNNYPSFFGGSAWEKDPVTGQYYLHYFGRQQPDLNWDTPKLREELYAMLRFWLDKGVSGMRFDTVATYSKTPGFPDLTPEQMKNFAEAYTQGPNLHRYLQEMHEKVFDHYDAVTAGEIFGAPLNQVPLFIDSRRKELDMAFTFDLIRYDRALDRWHTIPRTLADFRQTIDKVDAIAGEYGWNTFFLGNHDNPRAVSHFGDDRPQWREASAKALATVTLTQRGTPFIFQGDELGMTNYPFKTLQDFDDIEVKGFFQDYVETGKATAEELLTNVALTSRDNARTPFQWDDSANAGFTTGKPWLKVNPNYTEINAAREIGDPKSVYSFYRNLISIRHETPALSTGSYRDIDPSNADVYAYTRSQDGETYLVVVNFKAEPRSFTLPDGMHIAETLIESSSPAAPAAGAASLELQPWQSGIYKVK
서열 번호 5 ( SEQ ID NO:5)
MAYSAETSVTQSIQTQKESTLPAWWKEAVFYQIYPRSFKDTNGDGIGDIRGIIEKLDYLKSLGIDAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYEKIMQEYGTMEDFDTLVSEMKKRNMRLMIDVVINHTSDQHPWFIQSKSSKENPYREYYFWRDGKDNQPPNNYPSFFGGSAWQKDDKTGQYYLHYFARQQPDLNWDNPKVRGDLYAMLRFWLDKGVSGMRFDTVATYSKIPGFPDLTPEQQKNFAEQYTTGPNIHRYLQEMKQEVLSRYDVVTAGEIFGVPLERSSDFFDRRRNELDMSFMFDLIRLDRDSNERWRHKKWTLSQFRQIINKMDSNAGEYGWNTFFLDNHDNPRAVSHFGDDSPQWIEPSAKALATIILTQRATPFIFQGSELGMTNYPFKKLNEFDDIEVKGFWQDYVQTGKVSAEEFIDNVRLTSRDNSRTPFQWNDRKNAGFTSGKPWFRINPNYVEINADKELIRNDSVLNYYKEMIKLRHKTPALIYGTYKDISPEDDSVYAYTRTLGKERYLVVINFTEKTVRYPLPENNVIKSILIEANQNKTAEKQSTVLTLSPWQAGVYELQ
서열 번호 6 ( SEQ ID NO:6)
MATNHNEQDTKTVIAVNDGVSAHPVWWKEAVFYQVYPRSFKDSNGDGIGDLKGLTEKLDYLKTLGINAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYRKIMKEYGTMDDFDNLIAEMKKRDMRLMIDVVVNHTSNEHKWFVESKKSKDNPYRDYYIWRDGKDGTPPNNYPSFFGGSAWQKDNVTQQYYLHYFGVQQPDLNWDNPKVREEVYDMLRFWIDKGVSGLRMDTVATFSKNPAFPDLTPEQLKNFAYTYTQGPNLHRYIQEMHQKVLAKYDVVSAGEIFGVPLEEAAPFIDQRRKELDMAFSFDLIRLDRAVEERWRRNDWTLSQFRQINNRLVDMAGQYGWNTFFLSNHDNPRAVSHFGDDRPEWRIRSAKALATLALTQRATPFIYQGDELGMTNYPFTSLSEFDDIEVKGFWQDFVETGKVKPDVFLENVKQTSRDNSRTPFQWSNAEQAGFTTGTPWFRINPNYKNINAEDQTQNPDSIFHFYRQLIALRHATPAFTYGAYQDLDPNNNEVLAYTRELNQQRYLVVVNFKEKPVHYALPKTLSIKQTLLESGQKDKVAPNATSLELQPWQSGIYQLN
효소 정량화
SDS-PAGE에 이어 쿠마시 염색(Coomassie staining)을 사용하여 샘플에 존재하는 효소를 가시화하였다. 개별 효소의 정량화를 위해 정확한 분자 질량의 밴드에 중점을 두었다. 밴드의 염색 강도(stain intensity)는 이미지콴트(ImageQuant) 소프트웨어로 정량화하였다. 선택된 밴드의 단백질 염색 강도를, 동일한 겔에서 실행된 알려진 양의 소 혈청 알부민 (BSA)과 비교하고, 원래의 효소 스톡 용액으로 다시 계산하였다.
당 식별 및 정량화
효소를 가진 수크로스-함유 용액의 배양 후 당 프로파일은, 카보팩(CarboPac) PA20 컬럼이 장착된 디오넥스(Dionex) HPLC (HPAEC BioLC 시스템, 디오넥스 5000)를 사용하여 분석되었다. 배양 후, 샘플을 희석한 후 여과하고 표 2에 설명된 프로그램을 사용하여 당 성분을 분리하였다.
디오넥스에서 당을 분리하는 데 사용되는 HPLC 방법
단계 시간 (분) NaOH ( mM ) 설명
1 -15 25 평형화
2 0 25 주입
3 15 25 등용매 실행
4 30 30 약간의 구배
5 40 126 컬럼 세척 (또한, 아세트산으로)
6 50 25 다음 실행을 위한 준비
HPLC 상의 피크는 메르크 밀리포어(Merck Millipore)에서 얻은 수크로스, 글루코스, 프룩토스, 이소말툴로스, 류크로스, 트레할룰로스 및 이소말토스 (2 내지 75mg/ml 범위)의 순수 용액을 스파이킹함으로써 할당하고 정량화하였다. 이 기술을 사용하여 서로 다른 당들을 분리하는 예는 도 1에 나와 있다. 각 당에 대한 응답 계수(response factor)는 당 농도에 대해 검출된 통합 피크 영역으로부터 농도 대 피크 영역에 대한 선형 곡선 피트(fit)를 플로팅함으로써 계산되었다. 응답 계수는 각 샘플에 존재하는 당의 절대량을 계산하는 데 사용되었다. 상대적 당 농도 (백분율)는 샘플에서 측정된 각 당의 절대량을 샘플에서 검출된 모든 당의 총량으로 나눈 다음 100을 곱하여 계산하였다.
당 지수(glycemic index) 계산
이 실험에서 당 지수 (GI)는 다음의 다양한 당들의 GI를 추정하여 계산되었다. 수크로스: 65; 프룩토스: 15; 글루코스: 100; 이소말툴로스: 32; 트레할로스: 32. 월레버(Wolever)의 문헌 [European Journal of Clinical Nutrition (2013) 67, 1229-1233]은, 캐나다 규정에 따르면 70 초과의 GI는 높은 것으로 간주되고 55 미만의 GI는 낮은 것으로 간주됨을 언급하였다. 제품에 포함된 각 당의 백분율 함량을 100으로 나누고 그의 GI를 곱하였다. 모든 수치들을 합산하여 다양한 처리된 제품의 GI를 계산하였다.
실시예 2
상이한 pH에서의 수크로스 이성질화 효소의 활성
상이한 pH에서 수크로스에 대한 다양한 수크로스 이성질화 효소의 활성을 시험하기 위해 20% 수크로스/250mM 인산 나트륨 완충액을 10% 희석 배율(0.07 내지 0.21 mg 단백질/ml)의 다양한 효소와 함께 배양하였다. 용액의 pH는 4.5와 6.0으로 설정하고 37℃에서 6 시간 동안 배양한 후 99℃에서 5 분간 가열하여 반응을 중지시켰다. 수크로스의 다른 당으로의 전환은 디오넥스 HPLC 방법을 사용하여 정량화되었다. 각각의 효소의 2-4 개의 상이한 제제를 사용한 실험으로부터 얻은 결과가, 배양 후 샘플에서 검출된 모든 당의 총량의 평균 백분율로서 하기 표 3에 기재되어 있다.
수크로스 이성질화 효소를 사용한 상이한 pH에서의 수크로스의 다양한 당으로의 전환
평균% pH 4.5 수크로스 프룩토스 글루코스 이소말툴로스 이소말토스 류크로스 트레할로스
Sis10 1 18 17 37 5 1 21
Sis2 0 16 20 49 3 1 12
Sis12 4 2 4 64 1 1 26
Sis4 0 9 14 22 0 9 46
Sis14 1 0 3 63 0 0 33
Sis15 0 1 4 33 0 1 61
Figure pct00001
표 3으로부터, 모든 시험된 효소가 pH 6.0과 pH 4.5에서 거의 완전히 수크로스를 전환시킬 수 있음이 분명해졌다. 생성물 형성은 효소에 다소 의존적이지만, 모든 수크로스 이성질화 효소에서, 가장 두드러진 생성물은 이소말툴로스와 트레할룰로스이며, 대부분의 조건에서 총 당의 60-100%에 해당한다.
실시예 3
상이한 pH에서의 글루칸 수크라제의 활성
상이한 pH에서 수크로스에 대한 다양한 글루칸 수크라제의 활성을 시험하기 위해 20% 수크로스/250mM 인산 나트륨 완충액을 10% 희석 배율의 다양한 효소와 함께 배양하였다. 용액의 pH는 4.5와 6.0으로 설정하고 37℃에서 6 시간 동안 배양한 후 99℃에서 5 분간 가열하여 반응을 중지시켰다. 당 조성물은 디오넥스 HPLC 방법을 사용하여 정량화되었다. 각각의 효소를 사용한 실험으로부터 얻은 결과는 전환 후 총 당의 백분율로서 표 4에 기재되어 있다. 글루칸은 다양한 형태로 존재할 수 있기 때문에, 이러한 실험에 사용된 HPLC 방법을 사용하여 정량화하는 것은 어렵다. 따라서, 효소를 첨가하지 않은 블랭크의 프룩토스과 글루코스 함량을 보정한 후, 프룩토스과 글루코스의 증가 차이로부터 글루칸의 총 형성을 계산하였다. 따라서, 표시된 수치는 형성된 글루칸의 총량에 대한 대략적인 추정치일 뿐이다.
글루칸 수크라제를 사용한 다양한 pH에서의 수크로스의 다양한 당으로의 전환
평균% pH 4.5 수크로스 프룩토스 글루코스 이소말툴로스 이소말토스 류크로스 트레할로스 글루칸
B-1299 90 1 -1 4 0 0 0 7
70B 9 43 6 -1 0 0 2 41
70C 3 40 5 0 0 11 2 39
70D 100 -5 -1 5 0 0 0 1
블랭크 106 -5 -1 0 0 0 0 0
평균% pH 6.0 수크로스 프룩토스 글루코스 이소말툴로스 이소말토스 류크로스 트레할로스 글루칸
B-1299 97 0 -1 0 0 0 0 4
70B 5 34 4 7 0 14 2 34
70C 1 41 5 0 0 13 1 40
70D 106 -5 -1 0 0 0 0 1
blanc 104 -5 -1 3 0 0 0 0
표 4로부터, 일부 글루칸 수크라제 (70B 및 70C)는 pH 6.0과 pH 4.5에서 거의 모든 수크로스를 전환시킬 수 있는 반면, 나머지는 활성이 거의 없음을 알 수 있다. 생성물 형성은 효소에 다소 의존적이며, 글루칸 수율은 이러한 조건에서 최대 약 30-40%이다. 이러한 효소에 의해 형성되는 다른 당은 주로 류크로스와 일부 이소말툴로스이다.
실시예 4
콜라에서의 수크로스 이성질화 효소의 활성
수크로스 이성질화 효소와 글루칸 수크라제의 활성을, 콜라 (코카콜라®, 지역 슈퍼마켓)에서 시험하였다. 이 실험을 위해 상기 효소를 다시 이 매트릭스에 10% 희석 배율로 첨가하고 37℃에서 130 분 동안 배양한 후 90℃에서 5 분 동안 가열하여 반응을 중단시켰다. 상기 콜라에서 총 당은 약 100g/L로 측정되었다. 콜라는 매우 산성(pH 2.6)이기 때문에 수크로스의 일부는 특히 가열 단계에서 글루코스와 프룩토스로 전환되며, 측정된 수크로스의 총량은 아마도 더 적을 것이고 프룩토스 및 글루코스의 양은 더 높을 것이다. 역시, 수크로스의 다른 당으로의 전환을 디오넥스 HPLC 방법을 사용하여 정량화하였다. 결과는 배양 후 샘플에서 검출된 모든 당의 총량의 평균 백분율로서 아래에 기재되어 있다. 아래 표 5에 나타난 바와 같이, 전체 당의 40-50%는 Sis14 및 Sis15 수크로스 이성질화 효소를 사용하여 저혈당 당 이소말툴로스 및 트레할룰로스로 전환될 수 있으며, 이는 낮은 당 지수로 이어진다. Sis14는 이소말툴로스 형성을 선호하는 것으로 보이며, Sis15는 실시예 2의 완충제 실험에서 이미 알 수 있듯이 트레할룰로스 형성을 선호하는 것으로 보인다. Sis2는 콜라에서 아무런 활성을 나타내지 않았고, 반면 Sis10, Sis12 및 Sis4는 8 내지 15% 전환율을 나타내었다.
콜라에서의 당 전환
% 콜라 수크로스 프룩토스 글루코스 이소말툴로스 트레할로스 당 지수
Sis10 42 23 28 7 1 61
Sis2 49 23 28 0 0 63
Sis12 39 22 27 9 4 60
Sis4 35 22 28 5 10 59
Sis14 2 26 31 28 13 49
Sis15 2 24 28 18 28 48
대조군 50 23 27 0 0 63
글루칸 수크라아제는 어느 것도 콜라에서 유의미한 활성을 나타내지 않았다.
실시예 5
모의 위장 조건에서 초콜릿 우유에서의 수크로스 이성질 화 효소의 활성
수크로스 이성질화 효소 및 글루칸 수크라제의 활성을 초콜릿 우유에서 시험하였다. 탈지 초콜릿 우유 (프리스랜드 캄피나(Friesland Campina))는 중성 pH (pH 6.4)를 가지며 약 100g/L 수크로스를 포함한다. 이 실험에서는 100ml 초콜릿 우유를 37℃로 설정된 수조에서 20rpm으로 교반하면서 항온처리하고 HCl을 첨가하여 pH를 단계적으로 감소시켰다. 돼지 위 점막 분말로부터의 펩신 (250u/mg 초과의 고체)(시그마(Sigma); P7000)을 0.02 mg/ml의 최종 농도로 첨가하고, 수크로스 이성질화 효소를 실험 초기에 0.1% (v/v)로 첨가하였다. 0.5 시간 동안 항온처리한 후, HCl을 첨가하여 pH를 4.0으로 설정하고, 1 시간 후 pH 3.0으로 설정하고, 1.5 시간 후 pH 2.0으로 설정하였다. 5-10 분 (t = 0), 1 시간 (t = 1) 및 2 시간 (t = 2) 항온처리 후 1ml 샘플을 채취하고, 가열 (99℃, 5 분 동안)에 의해 효소 활성을 즉시 비활성화하였다.
위에서 설명한 바와 같이 HPLC 방법을 사용하여 샘플을 분석하고, 다양한 당을 정량화하고 샘플에서 검출된 모든 당의 총량에 대한 백분율로 표시했으며, 이는 아래 표 6에 나와 있다. 역시 콜라 실험에서 관찰된 바와 같이, 샘플은 낮은 pH에서 가열함으로써 수크로스가 글루코스 및 프룩토스로 (화학적) 전환되는 것을 보여 주었다 (특히 t = 2 샘플에서 우세함).
초콜릿 우유에서의 당 전환
% 쵸코
 시간 수크로스 프룩토스 글루코스 이소말툴로스 트레할로스 당 지수
Sis10 t=0 77 9 -2 17 0 54
t=1 54 12 0 33 1 48
t=2 14 24 20 40 1 46
Sis2 t=0 96 11 -3 -3 0 59
t=1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
t=2 62 23 14 1 0 58
Sis12 t=0 97 11 -3 -7 1 60
t=1 65 13 0 10 13 51
t=2 24 29 23 11 13 51
Sis4 t=0 82 10 -3 5 6 55
t=1 24 10 -2 22 46 37
t=2 4 15 6 33 42 35
Sis14 t=0 101 13 -4 -10 0 60
t=1 82 15 2 -1 2 58
t=2 15 41 41 0 2 58
Sis15 t=0 103 6 -4 -7 2 63
t=1 58 12 -2 7 24 48
t=2 20 28 23 8 21 50
대조군 t=0 103 0 -3 0 0 64
t=1 86 13 1 0 0 59
t=2 43 31 27 0 0 59
표 6으로부터, 특히 Sis4는 모의 위장 조건에서 초콜릿 우유에 들어있는 총 수크로스의 최대 75%를 이소말툴로스 및 트레할룰로스와 같은 저혈당 당으로 전환시킬 수 있음이 분명해졌다. Sis10은 수크로스의 약 40%를 특히 이소말툴로스로 전환시킬 수 있는 반면, Sis15는 총 약 30%의 주로 트레할룰로스를 생성하고, Sis12는 두 수크로스 이성질체를 총 약 20% 생성한다. Sis2 및 Sis14는 이 실험에서 효과를 나타내지 않았다. 따라서, 위장 소화를 모의한 조건에서 훨씬 낮은 효소 용량으로도 이러한 효소의 대부분은 초콜릿 우유와 같은 일반 식품의 당 지수를 낮출 수 있다.
이 실험에서 글루칸 수크라아제는 어느 것도 초콜릿 우유에서 유의미한 활성을 나타내지 않았다.
실시예 6
모의 위장 조건에서의 아이스크림에서의 수크로스 이성질화 효소의 활성
수크로스 이성질화 효소 및 글루칸 수크라제의 활성을 아이스크림에서 시험하였다. 아이스크림(알버트 헤인 루미스 바닐라(Albert Heijn Roomijs vanilla))은 중성 pH (pH 6.5)이며 약 230g/kg 수크로스를 포함한다. 이 실험은 효소 복용량, 펩신 첨가, pH 설정, 샘플링 시간 및 양, 및 HPLC 상의 당 분석을 비롯하여 실시 예 4에 기술된 바와 동일하게 수행되었다. 역시, 다양한 당을 정량화하고 샘플에서 검출된 총 당량의 백분율로 표시하였다. 당 분석의 결과는 아래 표 7에 기재되어 있다.
아이스크림에서의 당 전환
% 아이스크림 시간 수크로스 프룩토스 글루코스 이소말툴로스 트레할로스 당 지수
Sis10 t=0 97 4 -1 0 0 63
t=1 73 7 2 16 2 56
t=2 32 26 28 13 1 57
Sis2 t=0 98 5 0 -3 0 64
t=1 96 5 -1 0 0 62
t=2 38 29 30 3 0 60
Sis12 t=0 101 0 -1 0 0 65
t=1 83 5 0 8 5 58
t=2 19 33 38 6 4 59
Sis4 t=0 62 4 -1 7 28 51
t=1 63 8 4 2 22 54
t=2 13 29 31 5 22 52
Sis14 t=0 95 5 0 0 0 63
t=1 69 16 15 -1 1 62
t=2 44 27 29 0 1 62
Sis15 t=0 96 5 -2 0 0 62
t=1 82 6 0 4 8 58
t=2 37 25 29 3 6 60
대조군 t=0 95 5 0 0 0 62
t=1 93 6 1 0 0 62
t=2 16 39 45 0 0 61
표 7로부터, Sis4는 모의 위장 조건에서 아이스크림에 포함된 총 수크로스의 최대 25-35%를 이소말툴로스 및 트레할룰로스와 같은 저혈당 당으로 전환시킬 수 있음이 분명해졌다. Sis10은 수크로스의 약 15%를 특히 이소말툴로스로 전환시킬 수 있으며, 또한 Sis 12 및 Sis15는 약간의 수크로스 이성질체를 생성한다. 역시, Sis2 및 Sis14는 이러한 조건에서 활성이 없었다. 따라서, 위장 소화를 모의한 조건에서 훨씬 낮은 효소 용량으로도 이러한 효소의 대부분은 아이스크림과 같은 일반 식품의 당 지수를 낮출 수 있다.
이 실험에서 글루칸 수크라아제는 어느 것도 아이스크림에서 유의미한 활성을 나타내지 않았다.

Claims (10)

  1. 수크로스 이성질화 효소를 포함하는, 기능성 식품용(nutraceutical), 약학적(pharmaceutical) 또는 영양적 보충제(nutritional supplement) 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    인간에게 적합한 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    반려 동물에 적합한 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 1 내지 6의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60% 동일성(identity), 바람직하게는 90%, 95%, 98%, 99%, 100% 동일성을 갖는 수크로스 이성질화 효소를 포함하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    서열 번호 4와 적어도 60% 동일성, 바람직하게는 90%, 95%, 98%, 99%, 100% 동일성을 갖는 수크로스 이성질화 효소를 포함하는 조성물.
  6. 제 1 항의 기능성 식품용, 약학적 또는 영양적 보충제를 이를 필요로하는 인간을 포함하는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 수크로스를 섭취하는 인간을 포함하는 동물에서 혈당 수준(blood glucose level)의 증가를 낮추는 방법.
  7. 제 1 항에 따른 수크로스 이성질화 효소를 포함하는 기능성 식품용, 약학적 또는 영양적 보충제를 인간 또는 반려 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 반려 동물에 의해 섭취되는 식품 또는 사료의 당 지수(glycemic index)를 낮추는 방법.
  8. 제 1 항에 따른 수크로스 이성질화 효소를 포함하는 기능성 식품용, 약학적 또는 영양적 보충제를 인간 또는 반려 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 반려 동물의 체중을 감소시키거나 또는 체중 감소를 유지하는 방법.
  9. 수크로스 이성질화 효소를 포함하는 기능성 식품용, 약학적 또는 영양적 보충제의, 다음으로 구성된 군에서 선택된, 인간을 포함한 동물에서의 상태를 달성하기 위한 용도:
    a) 혈당 수준 증가의 저하;
    b) 지구력 운동을 수행하는 동물의 증가된 지구력;
    c) 체중의 감소 또는 감소된 체중의 유지;
    d) 섭취한 식품 또는 사료의 당 지수의 저하; 및
    e) 지속적 에너지 방출 및/또는 빠른 혈당 상승 및 수크로스-함유 식사 후 소위 식후 "딥(dip)"의 예방 또는 최소화.
  10. 수크로스 이성질화 효소를 포함하는 건조 식품 또는 음료 혼합물.
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