BR112021002996A2 - sacarose isomerases como suplementos alimentícios e nutricionais - Google Patents

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Petrus Jacobus Theodorus Dekker
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Abstract

“sacarose isomerases como suplementos alimentícios e nutricionais”. trata-se de sacarose isomerase que é usada como um suplemento nutricional ou que pode ser misturada com uma formulação de alimento/bebida em pó. quando um animal, incluindo um ser humano, consome sacarose, a sacarose isomerase atuará sobre a sacarose presente no alimento, e converterá a sacarose em outros açúcares. isso resulta na diminuição do índice glicêmico do alimento sem alterar a formulação do alimento.

Description

“SACAROSE ISOMERASES COMO SUPLEMENTOS ALIMENTÍCIOS E NUTRICIONAIS” Campo da invenção
[0001] Esta invenção se refere ao uso de sacarose isomerases como um suplemento nutricional tanto para seres humanos quanto para animais. As sacarose isomerases podem reduzir enzimaticamente a quantidade de sacarose em produtos alimentícios após serem consumidos, e, assim, diminuir o índice glicêmico de alimentos. Os suplementos de sacarose isomerase têm o benefício particular de diminuir os açúcares no sangue, diminuir o índice glicêmico de alimentos e/ou bebidas consumidas, e manter ou perder peso. Antecedentes da Invenção
[0002] As classificações de glicose muito alta no sangue na carga global de doença causam e podem levar à obesidade e diabetes tipo 2. Alimentos e bebidas contendo carboidratos rapidamente absorvidos como açúcar e amido podem levar a um aumento rápido em glicose sanguínea, seguido por um pico na liberação de insulina levando a uma diminuição rápida na glicose sanguínea. Alimentos e bebidas que não têm tais carboidratos geram um aumento inferior e mais lento em glicose sanguínea, sem o pico rápido em liberação de insulina. Essa resposta em glicose sanguínea é expressa como o Índice Glicêmico (GI) de um alimento, que é expresso em relação à resposta à ingestão de uma referência contendo glicose ou pão branco (definido em 100). Para muitos alimentos, o GI foi determinado. Dietas à base de alimentos com carboidrato que são digeridos, absorvidos e metabolizados mais lentamente (isto é, dietas de baixo GI)
demonstraram melhor sensibilidade à insulina que dietas de alto GI. Dietas de baixo GI são associadas a risco reduzido de diabetes tipo 2 e doença cardiovascular quando em comparação a dietas de alto GI. Foi sugerido um papel de dietas de baixo GI em comparação a dietas de alto GI na saciedade, manutenção de peso e prevenção de doenças relacionadas à dieta. A carga glicêmica (GL) é calculada ao multiplicar as gramas de carboidrato disponível no alimento pelo GI do alimento e, então, dividir por 100.
[0003] A sacarose é abundante na dieta e constitui ~35- 40 % de todos os carboidratos na dieta. Um desafio para aqueles que desejam diminuir a carga glicêmica, é que muitos alimentos e bebidas saborosos preferidos contêm altos teores de sacarose. Por exemplo, algumas barras de chocolate contêm até 30 gramas de sacarose (50 % em peso); uma lata (330 ml (330 cc)) de cola contém 39 gramas de sacarose; leite achocolatado tem 58 gramas de sacarose em 450 ml (450 cc); e sorvete contém frequentemente 28 % de sacarose em peso. No entanto, reduzir o teor de açúcar nesses alimentos impacta frequentemente de modo negativo a doçura, a sensação bucal e o caráter saboroso.
[0004] Substituir a sacarose em tais produtos por outros açúcares com baixo GI (por exemplo, tagatose, alulose ou palatinose), álcoois de açúcar (por exemplo, sorbitol, manitol ou xilitol), ou por adoçantes de alta potência (por exemplo, aspartame, sucralose ou estévia) levará a um produto final doce ou terá um efeito negativo em propriedades de textura e/ou sabor do alimento e bebida, e reduzindo, desse modo o caráter saboroso do produto. Portanto, tais substituições de sacarose não são usadas frequentemente em produtos alimentícios, e seu uso tem foco principalmente em bebidas adoçadas.
[0005] Isomaltulose está disponível para a indústria alimentícia junto à Beneo sob o nome comercial Palatinose™ e usada em alimentos como substituição de açúcar. Palatinose™ está completamente disponível no intestino delgado, mas é hidrolisada 4-5 vezes mais lentamente, levando a uma baixa resposta glicêmica e a níveis de insulina inferiores. Foi mostrado que a substituição de sacarose por Palatinose™ leva a picos de insulina inferiores e queima de gordura aumentada em exercício. Beneo comercializa Palatinose™ para controle de peso, seu caráter não cariogênico, desempenho de resistência em esportes melhorado, prevenção de diabetes gestacional, funcionamento cognitivo sustentado e aprimoramento do perfil metabólico em idosos (Beneo-institute, 2017 http://www.beneo.com/Expertise/BENEO- Institute/News_Papers/BENEO_paper_palatinose_US_201708v1_we b_USLetter_1.pdf).
[0006] Para trealulose (na literatura patentária também chamada de “Vitalose”), benefícios similares são previstos, uma vez que a mesma também é digerida mais lentamente pela sacarase intestinal, mas menos dados clínicos estão disponíveis. Níveis de glicose sanguínea e resposta à insulina são similares ou ainda levemente mais moderados que aqueles de isomaltulose (como relatado na Patente europeia EP2418971B1).
[0007] Um efeito inibitório desses açúcares sobre a atividade de sacarase/atividade de amilase no intestino delgado é sugerido na literatura (Kashimura & al, 2008 J.
Agric. Food Chem. 56: 5892-5898), mas ainda faltam provas sólidas para isso. Tal efeito inibitório pode desacelerar a conversão de sacarose e amido e, reduzir, desse modo, a carga glicêmica. Por conseguinte, o consumo de isomaltulose e/ou trealulose pode ter um benefício adicional sobre a redução da carga glicêmica, ao inibir atividade de sacarase/amilase no intestino, quando combinado com alimentos contendo amido.
[0008] Um problema com o uso de isomaltulose ou trealulose em alimentos e bebidas é que a doçura desses açúcares é muito inferior àquela de sacarose por uma grama. A substituição de sacarose por esses isômeros de sacarose exigiria, portanto, alterações drásticas na composição do alimento ou bebida. A doçura inferior deve ser compensada, por exemplo, por adição de adoçantes artificiais extras, que podem afetar o sabor do produto final. Ademais, a isomaltulose é relativamente dispendiosa em comparação à sacarose e, portanto, pode haver motivos econômicos para não adicionar a mesma no produto alimentício ou de bebida.
[0009] Portanto, há uma necessidade na sociedade por alimentos e bebidas saborosos e doces que não levarão a uma alta resposta glicêmica após consumo. Consumidores conscientes podem desejar prevenir o alto índice glicêmico e o aumento de açúcar no sangue após o consumo de alimentos/bebidas contendo sacarose. Além disso, a conversão de carboidratos de alto índice glicêmico em carboidratos de baixo índice glicêmico no estômago tem um benefício clinicamente significativo para controle glicêmico em pessoas com diabetes tipo 1 e tipo 2. A terapia de nutrição que diminui índice glicêmico pode reduzir a hemoglobina glicada (A1C) em pessoas com diabetes tipo 2 em 1,0 % a 2,0 % e, quando usada com outros componentes de cuidado de diabetes, pode melhorar adicionalmente resultados clínicos e metabólicos. Descrição Detalhada da Invenção
[0010] Constatou-se surpreendentemente que usar a enzima sacarose isomerase como um suplemento nutricional ou como parte de uma dieta médica ou suplemento de dieta médica diminuirá o teor de sacarose de alimentos e/ou bebidas doces quando consumidos juntamente com a enzima. A sacarose isomerase usada como suplemento nutricional ou como parte de um alimento ou bebida seca (como uma pré-mistura ou similares), portanto, diminuirá o índice glicêmico de tais alimentos no trato intestinal, sem afetar a composição e propriedades do alimento ou bebida antes do consumo. Consequentemente, a sacarose isomerase como um suplemento nutricional pode ser usada para reduzir o risco de diabetes tipo 2 e doença cardiovascular sem alterar os hábitos alimentares. Ademais, ao diminuir a carga glicêmica, a sacarose isomerase como suplemento nutricional pode se adaptar em programas para manutenção de peso e pode prevenir doenças relacionadas à dieta rica em açúcar. A sacarose isomerase como suplemento nutricional também pode ser útil para nutrição esportiva ao diminuir a ingestão de açúcares. A sacarose isomerase também pode ser incluída em um substituinte de refeição pronto para misturar para diabéticos ou pré-diabéticos que são aconselhados ou prescritos em uma dieta pobre em carboidrato, sem afetar o teor de carboidrato do substituinte de refeição.
[0011] Assim, uma modalidade desta invenção consiste em um método de redução de níveis de insulina em um animal, incluindo um ser humano, que consome um alimento ou bebida compreendendo sacarose, o método compreendendo administrar ao animal ou ser humano uma quantidade eficaz de um nutracêutico, suplemento dietético ou produto farmacêutico de sacarose isomerase antes do ou concomitante ao consumo do alimento ou bebida. Uma outra modalidade desta invenção consiste em um método de diminuição do índice glicêmico de um alimento ou bebida compreendendo sacarose consumida por um animal, incluindo um ser humano, que compreende administrar ao animal ou ser humano sacarose isomerase na forma de um nutracêutico, suplemento dietético ou produto farmacêutico. Uma outra modalidade desta invenção consiste no uso de sacarose isomerase para fabricar um suplemento nutricional, alimento ou bebida seco e/ou em pó, ou produto farmacêutico que diminui o índice glicêmico de um alimento ou bebida. Uma outra modalidade desta invenção consiste em sacarose isomerase como um suplemento nutricional que diminui o índice glicêmico de um alimento ou bebida.
[0012] Uma nova pesquisa sugere que a chave para resistência sustentada para atletas pode não estar no consumo dos denominados “carboidratos rápidos”, mas em “carboidratos mais lentos” que equilibram os açúcares no sangue em vez de fornecer uma descarga de energia na forma de glicose sanguínea. Para os propósitos desta invenção, “exercício de resistência” significa que o exercício é aquele que aumenta a respiração e a frequência cardíaca, como caminhar, correr, nadar ou pedalar ou similares. Assim, uma outra modalidade desta invenção consiste em um método para desacelerar ou sustentar a absorção de açúcar por um período de tempo para melhorar uma capacidade do atleta de realizar um exercício de resistência compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma sacarose isomerase a uma pessoa que realiza o exercício de resistência que também consome alimento ou bebida contendo sacarose durante o exercício de resistência. Ainda uma outra modalidade desta invenção consiste em um método de melhoria de resistência sustentada em um atleta compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma sacarose isomerase a uma pessoa envolvida em uma atividade de resistência atlética que também consome alimento ou bebida contendo sacarose. Uma outra modalidade desta invenção consiste no uso de sacarose isomerase para aumentar uma capacidade da pessoa de realizar um exercício de resistência.
[0013] Uma outra modalidade desta invenção consiste em um método de sustentação e/ou desaceleração de absorção de açúcar para sustentar liberação de energia e minimizar a elevação de glicose sanguínea e a denominada “queda” após uma refeição contendo sacarose compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma sacarose isomerase a uma pessoa saudável ou (pré)diabética que também consome alimento contendo sacarose. Isso é particularmente benéfico em uma situação em que uma pessoa consome uma refeição (como uma refeição do meio-dia) e quer permanecer alerta e evitar um período de sonolência algumas horas após o consumo.
[0014] Uma outra modalidade desta invenção consiste em um método de auxiliar um animal, incluindo um ser humano, a perder peso ou manter uma perda de peso compreendendo administrar ao animal ou pessoa uma quantidade eficaz de uma sacarose isomerase.
[0015] Em uma modalidade, a sacarose isomerase é usada em nutrição humana.
[0016] Em uma outra modalidade, a sacarose isomerase é usada para beneficiar um animal, de preferência, um animal de companhia (como gatos, cães, equinos e porcos domesticados tipicamente usados como animais de estimação) que podem consumir sacarose. Os animais de companhia são frequentemente propensos à obesidade e sofrem de suas consequências adversas. As sacarose isomerases desta invenção oferecem uma forma de combater diabetes, ganho de peso e transtornos metabólicos associados em animais de companhia sem recorrer a injeções de insulina dispendiosas e inconvenientes.
[0017] É preferencial que a sacarose isomerase seja tomada pelo menos uma vez por dia antes do consumo do alimento ou bebida contendo sacarose. Também é preferencial que a mesma seja tomada logo antes (isto é, menos de uma hora antes do consumo, e, com mais preferência, menos de 30 minutos antes do consumo. É particularmente preferencial que a mesma seja tomada imediatamente antes ou durante o consumo). Em uma outra modalidade, a sacarose isomerase é tomada dentro de 2 horas de ingestão de uma refeição. Descrição das Figuras
[0018] A Figura 1 é uma leitura de uma HPLC usada para separar açúcares como detalhado no Exemplo 1.
[0019] A sacarose isomerase é usada na produção industrial de isomaltulose a partir de sacarose. A título de conhecimento, não há descrição de uso de sacarose isomerase como um suplemento, em que a sacarose isomerase pode sobreviver tanto nos processos envolvidos na criação de um comprimido ou outra formulação adequada quanto no processo digestivo humano, de modo que ainda permaneça ativa no estômago e/ou trato digestivo. Embora as sacarose isomerases sejam conhecidas na técnica, sua atividade foi apenas observada no contexto de tampões de laboratório.
[0020] Uma sacarose isomerase converte sacarose (2-O-α- D-Glicopiranosil-D-frutose) nos açúcares de glicemia inferior isomaltulose (6-O-α-D-Glicopiranosil-D-frutose) e/ou trealulose (1-O-α-D-Glicopiranosil-D-frutose) (Mu & al (2014) Appl Microbiol Biotechnol 98: 6569-6582).
[0021] Como mostrado nos EXEMPLOS 4-6, constatou-se que uma outra enzima, glicosil transferase, que também atua em sacarose, apesar de ser através de um mecanismo diferente, estava inativa quando submetida a condições que imitam o sistema digestivo humano. Assim, não é previsível que enzimas que usam sacarose como um substrato serão adequadas para uso em suplementos nutricionais.
[0022] A sacarose isomerase desta invenção pode ser de qualquer fonte, desde que a mesma seja robusta o suficiente para sobreviver à formulação e ao processo digestivo bem o suficiente de modo que uma quantidade eficaz esteja disponível para atuar nos açúcares ingeridos. Há pelo menos 5 classes reconhecidas na técnica da sacarose isomerase (consulte Goulter et al 2012 Enz and Microb Technol 50:57- 64): Grupo I: inclui Serratia plymuthica e Protaminobacter rubrum Grupo II que inclui Erwinia rhapontici
Grupo III que inclui Enterobacter sp, Roaultella planticola e Klebsiella singaporensis Grupo IV que inclui Pantoea dispersa e Grupo V que inclui Pseudomonas mesoacidophilia e Rhizobium sp.
[0023] Exemplos de sacarose isomerases preferenciais incluem aquelas encontradas em: Protaminobacter rubrum, incluindo a enzima identificada como Uniprot:D0VX20, Pantoea dispersa, incluindo a enzima identificada como Uniprot:Q6XNK6, Raoultella planticola, incluindo a enzima identificada comoUniprot:Q6XKX6, Pseudomonas mesoacidophila, incluindo a enzima identificada como Uniprot:Q2PS28, Enterobacter incluindo a enzima identificada como Uniprot:B5ABD8; e Pectobacterium carotovorum incluindo a enzima identificada como Uniprot:S5YEW8.
[0024] Quando presentes, seus peptídeos sinal foram substituídos com uma Metionina (M) e isso resultou nas sequências proteicas retratadas em SEQ ID NO:1-6, respectivamente.
[0025] As sacarose isomerases preferenciais incluem aquelas identificadas nos Exemplos como Sis4, Sis10, Sis12, Sis14 e Sis15. Uma sacarose isomerase particularmente preferencial é Sis4.
[0026] A invenção como descrito aqui supera os problemas anteriores do uso de isomaltulose, trealulose ou qualquer outro substituinte de açúcar de baixa glicemia, em formulações de alimento e bebida. Ao suprir sacarose isomerase como ingrediente nutricional, a formulação de alimento ou bebida não precisa ser alterada e isomaltulose e/ou trealulose apenas são formadas durante a digestão no estômago ou trato intestinal superior.
[0027] Alimentos/bebidas contendo sacarose preferenciais relevantes para esta invenção incluem alimentos saborosos, como: • Sobremesas – sorvete, pudim, creme, iogurte • Confeitaria – doces, chocolate • Panificação – biscoitos, massas, tortas, roscas, cereais matinais • Bebidas – refrigerantes, bebidas energéticas, sucos de fruta, leite saborizado • Frutas e vegetais – milho, frutas tropicais, tâmaras, banana, beterraba, abóbora • Cremes – geleias, marmelada, creme de chocolate, manteiga de amendoim • Alimento para animais de companhia: na forma de guloseimas e petiscos mastigáveis
FORMULAÇÕES
[0028] As composições dietéticas e farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem estar em qualquer forma galênica que seja adequada para administrar ao corpo, especialmente, em qualquer forma que é convencional para administração oral, por exemplo, em forma sólida, como aditivos/suplementos para alimento ou ração, pré-mistura de alimento ou ração, alimento ou ração fortificada, comprimidos, pílulas, grânulos, drágeas, cápsulas e formulações efervescentes, como pós e comprimidos, ou em forma líquida como soluções emulsões ou suspensões como, por exemplo, bebidas pastas e suspensões oleosas. As pastas podem ser encapsuladas em cápsulas de invólucro duro ou mole, através do que as cápsulas apresentam, por exemplo, uma matriz de gelatina de peixe, suíno, aves domésticas ou bovino, proteínas vegetais ou ligninsulfonato. As composições dietéticas e farmacêuticas podem estar na forma de formulações de liberação controlada ou retardada. As composições da presente invenção não são administradas topicamente, como aplicação à passagem nasal.
[0029] As composições dietéticas e farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem conter adicionalmente hidrocoloides protetores (como gomas, proteínas, amidos modificados), ligantes, agentes formadores de filme, agentes/materiais encapsulantes, materiais de parede/invólucro, compostos de matriz, revestimentos, emulsificantes, agentes tensoativos, agentes solubilizantes (óleos, gorduras, ceras, lecitinas, etc.), adsorventes, carreadores, cargas, cocompostos, agentes dispersantes, agentes umectantes, auxiliares de processamento (solventes), agentes de fluxo, agentes mascaradores de sabor, agentes de aumento de peso, agentes gelificantes, agentes formadores de gel, antioxidantes e antimicrobianos.
[0030] Além disso, as composições de acordo com a presente invenção podem conter adicionalmente aditivos ou adjuvantes, excipientes ou diluentes farmacêuticos convencionais, incluindo, mas sem limitação, água, gelatina de qualquer origem, gomas vegetais, ligninsulfonato, talco, açúcares, amido, goma arábica, óleos vegetais, polialquileno glicóis, agentes saborizantes, conservantes,
estabilizantes, agentes emulsificantes, tampões, lubrificantes, corantes, agentes umectantes, cargas e similares.
DOSAGENS
[0031] A dosagem da enzima como um suplemento nutricional é 0,1 – 500 mg de proteína de sacarose isomerase pura por 100 g de sacarose ingerida, de preferência, 0,5 – 100 mg, 2 – 50 mg, 10 – 25 mg de sacarose isomerase por 100 g de sacarose ingerida. A dosagem variará obviamente dependendo de quanta sacarose é ingerida por dia ou por refeição ou por bebida. Por exemplo, se uma pessoa consome 75 gramas de sacarose adicionada por dia, que é uma quantidade comum em alguns países ocidentais, então, uma quantidade preferencial de enzima diária seria 7,5 – 20 mg de proteína de sacarose isomerase pura. Por exemplo, se uma pessoa beber uma bebida de 300 ml contendo 100 g/l de sacarose, uma quantidade preferencial de enzima seria 3-7,5 mg de proteína de sacarose isomerase pura, para ser tomada juntamente com a bebida.
[0032] Uma composição típica com sacarose isomerase pode conter dióxido de silício, (Micro)Celulose (por exemplo, Avicel PH102), estearato de magnésio, ácido esteárico, polivinil pirrolidona (por exemplo, Crospovidona) e/ou maltodextrina. Em cada comprimido de 300 mg, tal composição pode conter, por exemplo, 60 mg de uma formulação de enzima seca (por exemplo, contendo 7,5-20 mg de sacarose isomerase pura mais maltodextrina até 60 mg), 15 mg de crospovidona, 2,5 mg de estearato de magnésio e 222,5 mg de Avicel PH102.
[0033] Além disso, a composição pode ser um alimento seco, pó de refrigerante ou pó substituinte de refeição. Tal composição seco tem tipicamente uma atividade de água (Aw) de <0,5. Um pó de bebida energética esportiva isotônica pode conter até 90 g de carboidratos por 100 g de pó, dos quais 75 g podem ser açúcar (principalmente, sacarose e glicose). Adicionalmente, o pó conterá 2,15 g de sais minerais por 100 g (principalmente cloreto de potássio, citrato de potássio, citrato de sódio, cloreto de sódio e citrato de magnésio), além de algum ácido cítrico, saborizantes e corante. De preferência, a sacarose isomerase é adicionada em 7,5-20 mg de enzima seca pura por 100 g de tal pó.
ENZIMAS Homologia
[0034] Para o propósito desta revelação, é definido no presente documento que, para determinar a percentagem de homologia de sequência ou identidade de sequência de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal. De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Esse alinhamento pode ser realizado ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser realizado ao longo de um comprimento menor, por exemplo, ao longo de cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/bases ou aminoácidos. A identidade de sequência é a porcentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências ao longo da região alinhada relatada.
[0035] Uma comparação de sequências e determinação da porcentagem de identidade de sequência entre duas sequências pode ser feita com o uso de um algoritmo matemático.
O técnico versado na técnica estará ciente do fato de que vários programas de computador diferentes estão disponíveis para alinhar duas sequências e determinar a identidade entre duas sequências (Kruskal, J.
B. (1983) An overview of sequence comparison; em D.
Sankoff e J.
B.
Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). O percentual de identidade de sequência entre as duas sequências de aminoácidos ou entre as duas sequências de nucleotídeos pode ser determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, S.
B. e Wunsch, C.
D. (1970) J.
Mol.
Biol. 48, 443-453). Tanto as sequências de aminoácidos quanto as sequências de nucleotídeos podem ser alinhadas pelo algoritmo.
O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE.
Para os propósitos da presente revelação, foi usado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P.
Longden,I. e Bleasby,A.
Trends in Genetics 16, (6) pp. 276— 277, http://emboss.bioinformatics.nl/). É usado EBLOSUM62 para as sequências de proteínas para a matriz de substituição.
Para a sequência de nucleotídeos, é usado EDNAFULL.
Os parâmetros opcionais usados têm uma penalidade de abertura de lacunas de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,5. Um técnico no assunto compreenderá que todos estes parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagem total de identidade de duas sequências não é significativamente alterada quando são usados diferentes algoritmos.
[0036] Após o alinhamento pelo programa NEEDLE, conforme descrito acima, a percentagem de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da revelação é calculada como a seguir: Número de posições correspondentes no alinhamento apresentando um aminoácido idêntico ou nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após subtração do número total de lacunas no alinhamento. A identidade, conforme definida no presente documento, pode ser obtida do programa NEEDLE usando a opção NOBRIEF e é identificada na saída do programa como "identidade mais longa".
[0037] As sequências de proteínas e de ácidos nucleicos da presente revelação podem ser adicionalmente usadas como uma "sequência de consulta", para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Essas pesquisas podem ser realizadas com o uso dos programas BLASTN e BLASTX (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403—10. As pesquisas BLAST de nucleotídeos podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para a obtenção de sequências nucleotídicas homólogas a moléculas de ácido nucleico da revelação. As pesquisas BLAST de proteínas são realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para a obtenção de sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteínas da revelação. Para obter alinhamentos com lacuna para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-
3402. Quando são usados os programas BLAST e Gapped BLAST, podem ser usados os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN). Consulte a página principal do National Center for Biotechnology Information em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
[0038] Como usado no presente documento, os termos “variante”, “derivado”, “mutante” ou “homólogo” podem ser usados de modo intercambiável. Os mesmos podem se referir a polipeptídeos ou ácidos nucleicos. As variantes incluem substituições, inserções, deleções, truncamentos, transversões e/ou inversões, em uma ou mais localizações relativas a uma sequência de referência. Variantes podem ser feitas, por exemplo, por mutagênese de saturação de sítio, mutagênese de varredura, mutagênese de inserção, mutagênese aleatória, mutagênese de sítio dirigido e evolução direcionada bem como várias outras abordagens de recombinação. Polipeptídeos variantes podem diferir de um polipeptídeo de referência por um pequeno número de resíduos de aminoácido e podem ser definidos por seu nível de homologia/identidade de sequência de aminoácidos principal com um polipeptídeo de referência. De preferência, os polipeptídeos variantes têm pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou ainda pelo menos 99 % de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo de referência. Métodos para determinar porcentagem de identidade são conhecidos na técnica e descritos no presente documento. Em geral, as variantes retêm a natureza característica do polipeptídeo de referência, mas têm propriedades alteradas em alguns aspectos específicos. Por exemplo, uma variante pode ter um pH modificado ideal, uma capacidade de ligação ao substrato modificada, uma resistência modificada à degradação enzimática ou outra degradação, uma atividade aumentada ou diminuída, uma estabilidade de temperatura e oxidativa modificada, mas retém sua funcionalidade característica. Variantes incluem adicionalmente polipeptídeos com modificações químicas que alteram as características de um polipeptídeo de referência.
[0039] A respeito de ácidos nucleicos, os termos se referem a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo variante, que tem um grau especificado de homologia/identidade com um ácido nucleico de referência, ou que se hibridiza em condições rigorosas em um ácido nucleico ou no complemento do mesmo. De preferência, um ácido nucleico variante tem pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou ainda pelo menos 99 % de identidade de sequência de ácido nucleico com um ácido nucleico de referência. Métodos para determinar porcentagem de identidade são conhecidos na técnica e descritos no presente documento.
[0040] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos seguintes Exemplos
EXEMPLOS EXEMPLO 1 Sacarose isomerases
[0041] Seis proteínas relatadas como sacarose isomerases foram selecionadas a partir da base de dados Uniprot. As sequências se originaram a partir de Protaminobacter rubrum (Uniprot:D0VX20), Pantoea dispersa (Uniprot:Q6XNK6), Raoultella planticola (Uniprot:Q6XKX6), Pseudomonas mesoacidophila (Uniprot:Q2PS28), Enterobacter (Uniprot:B5ABD8) e Pectobacterium carotovorum (Uniprot:S5YEW8). Peptídeos sinal putativos foram previstos por software de previsão SignalP 4.1 para gram negativas (Petersen, Nature Methods, 8:785-786, 2011). Quando presentes, os peptídeos sinal foram substituídos com uma Metionina (M) e isso resultou nas sequências proteicas retratadas em SEQ ID NO:1-6.
[0042] As sequências proteicas (SEQ ID NO:1-6) foram expressas em E. coli como descrito no documento WO2017050652 (A1). As sequências de DNA sintéticas que codificam as sacarose isomerases putativas foram otimizadas por códon para expressão em E. coli de acordo com o algoritmo de DNA2.0 (tecnologia GeneGPS®). Para propósitos de clonagem, sequências de DNA contendo um sítio NdeI foram introduzidas na extremidade 5’ e uma sequência de DNA contendo um códon de parada e um sítio AscI foi introduzida na extremidade 3’. O DNA sintético que codifica as sacarose isomerases putativas foi clonado através dos sítios de restrição 5’NdeI e 3’AscI em um vetor de expressão de E. coli induzível por arabinose, contendo o promotor induzível por arabinose PBAD e o regulador araC (Guzman (1995) J.
Bact. 177:4121-4130), um gene resistente à canamicina Km(R) e a origem de replicação ori327 de pBR322 (Watson (1988) Gene. 70:399-403). O RV308 hospedeiro de E. coli (lacIq-, su-, ΔlacX74, gal IS II::OP308, strA, http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/ERP005879) com deleções adicionais em ampC e araB foi transformado usando células competentes químicas (células competentes Z, preparadas com o kit de transformação de E. coli Mix and Go!, Zymo Research, Irvine CA, EUA). Vários clones de SEQ ID NO:1-6 foram verificados por sequência e cultivados em 2xPY contendo 100 µg/ml de neomicina (O/N). A pré-cultura (volume de 1/100) foi usada para inocular a fermentação em meio de expressão de E. coli MagicMediaTM (Thermo Fisher Scientific Inc), e 100 µg/ml de neomicina (24 poços MTP, volume de 3 ml, vedação respirável, 550 RPM a 80 % de UR), após 4 horas de crescimento a 30 °C, as culturas foram induzidas com arabinose a 0,02 % (concentração final) e a incubação continuou a 30 °C por 48 horas. Os péletes celulares foram isolados por centrifugação de alta velocidade e congelados até uso adicional. O extrato livre de célula (CFE) foi preparado por ressuspensão dos péletes celulares congelados e incubação por 1 hora a 37 °C com 1,2 ml de tampão de lise (Tris-HCl a 50 mM, DNaseI a 0,1 mg/ml, lisozima a 2 mg/ml, MgSO4 a 25 µM). Detritos celulares foram removidos por centrifugação e o CFE foi armazenado a -20 °C até caracterização adicional. Glicano sacarases
[0043] As glicano sacarases usadas nesse estudo foram obtidas a partir de fornecedores comerciais (Sigma Aldrich para glicano sacarase de Leuconostoc mesenteroides; NZYTech para glicano sacarases de Streptococcus mutans)
[0044] Todas as enzimas usadas nesse estudo são mencionadas na Tabela 1 Tabela 1. Enzimas usadas nesse estudo. Sacarose isomerases As sequências são exibidas após essa Tabela ID da Uniprot SEQ ID No Organismo doador Nome Concentração estoque (mg/ml) D0VX20 1 Protaminobacter Sis10 2,2 rubrum* Q6XNK6 2 Pantoea dispersa Sis2 1,0 Q6XKX6 3 Raoultella Sis12 1,7 planticola Q2PS28 4 Pseudomonas Sis4 2,0 mesoacidophila* B5ABD8 5 Enterobacter Sis14 0,9 S5YEW8 6 Pectobacterium Sis15 0,7 carotovorum Glicano sacarases Identificador Fornecedor Organismo doador Nome Concentração estoque (mg/ml) D9909 Sigma Leuconostoc B-1299 1,0 mesenteroides SmGtf70B NZYTech Streptococcus 70B 1,0 mutans SmGtf70C NZYTech Streptococcus 70C 1,0 mutans SmGtf70D NZYTech Streptococcus 70D 1,0 mutans *P. rubrum deve ser mais provavelmente renomeada como Serratia plymuthica, e P. mesoacidophila foi atribuída como uma espécie Rhizobium (Goulter et al. (2012) Enzyme Microb. Technol. 50, 57-64).
[0045] SEQUENCE ID NOS 1-6: SEQ ID NO:1
MTIPKWWKEAVFYQVYPRSFKDTNGDGIGDINGIIEKLDYLKALGIDAIWINPHYDSPN TDNGYDIRDYRKIMKEYGTMEDFDRLISEMKKRNMRLMIDVVINHTSDQNEWFVKSKSS KDNPYRGYYFWKDAKEGQAPNNYPSFFGGSAWQKDEKTNQYYLHYFAKQQPDLNWDNPK VRQDLYAMLRFWLDKGVSGLRFDTVATYSKIPDFPNLTQQQLKNFAAEYTKGPNIHRYV NEMNKEVLSHYDIATAGEIFGVPLDQSIKFFDRRRDELNIAFTFDLIRLDRDSDQRWRR KDWKLSQFRQIIDNVDRTAGEYGWNAFFLDNHDNPRAVSHFGDDRPQWREPSAKALATL TLTQRATPFIYQGSELGMTNYPFKAIDEFDDIEVKGFWHDYVETGKVKADEFLQNVRLT SRDNSRTPFQWDGSKNAGFTSGKPWFKVNPNYQEINAVSQVTQPDSVFNYYRQLIKIRH DIPALTYGTYTDLDPANDSVYAYTRSLGAEKYLVVVNFKEQMMRYKLPDNLSIEKVIID
SNSKNVVKKNDSLLELKPWQSGVYKLNQ SEQ ID NO:2
MASPLTKPSTPIAATNIQKSADFPIWWKQAVFYQIYPRSFKDSNGDGIGDIPGIIEKLD YLKMLGVDAIWINPHYESPNTDNGYDISDYRKIMKEYGSMADFDRLVAEMNKRGMRLMI DIVINHTSDRHRWFVQSRSGKDNPYRDYYFWRDGKQGQAPNNYPSFFGGSAWQLDKQTD QYYLHYFAPQQPDLNWDNPKVRAELYDILRFWLDKGVSGLRFDTVATFSKIPGFPDLSK AQLKNFAEAYTEGPNIHKYIHEMNRQVLSKYNVATAGEIFGVPVSAMPDYFDRRREELN IAFTFDLIRLDRYPDQRWRRKPWTLSQFRQVISQTDRAAGEFGWNAFFLDNHDNPRQVS HFGDDSPQWRERSAKALATLLLTQRATPFIFQGAELGMTNYPFKNIEEFDDIEVKGFWN DYVASGKVNAAEFLQEVRMTSRDNSRTPMQWNDSVNAGFTQGKPWFHLNPNYKQINAAR EVNKPDSVFSYYRQLINLRHQIPALTSGEYRDLDPQNNQVYAYTRILDNEKYLVVVNFK
PEQLHYALPDNLTIASSLLENVHQPSLQENASTLTLAPWQAGIYKLN SEQ ID NO:3
MAPSVNQNIHVHKESEYPAWWKEAVFYQIYPRSFKDTNDDGIGDIRGIIEKLDYLKSLG IDAIWINPHYDSPNTDNGYDISNYRQIMKEYGTMEDFDNLVAEMKKRNMRLMIDVVINH TSDQHPWFIQSKSDKNNPYRDYYFWRDGKDNQPPNNYPSFFGGSAWQKDAKSGQYYLHY FARQQPDLNWDNPKVREDLYAMLRFWLDKGVSSMRFDTVATYSKIPGFPNLTPEQQKNF AEQYTMGPNIHRYIQEMNRKVLSRYDVATAGEIFGVPLDRSSQFFDPRRHELNMAFMFD LIRLDRDSNERWRHKSWSLSQFRQIISKMDVTVGKYGWNTFFLDNHDNPRAVSHFGDDR PQWREASAKALATITLTQRATPFIYQGSELGMTNYPFRQLNEFDDIEVKGFWQDYVQSG KVTATEFLDNVRLTSRDNSRTPFQWNDTLNAGFTRGKPWFHINPNYVEINAEREETRED SVLNYYKKMIQLRHHIPALVYGAYQDLNPQDNTVYAYTRTLGNERYLVVVNFKEYPVRY
TLPANDAIEEVVIDTQQQATAPHSTSLSLSPWQAGVYKLR SEQ ID NO:4
MEEAVKPGAPWWKSAVFYQVYPRSFKDTNGDGIGDFKGLTEKLDYLKGLGIDAIWINPH YASPNTDNGYDISDYREVMKEYGTMEDFDRLMAELKKRGMRLMVDVVINHSSDQHEWFK SSRASKDNPYRDYYFWRDGKDGHEPNNYPSFFGGSAWEKDPVTGQYYLHYFGRQQPDLN WDTPKLREELYAMLRFWLDKGVSGMRFDTVATYSKTPGFPDLTPEQMKNFAEAYTQGPN LHRYLQEMHEKVFDHYDAVTAGEIFGAPLNQVPLFIDSRRKELDMAFTFDLIRYDRALD RWHTIPRTLADFRQTIDKVDAIAGEYGWNTFFLGNHDNPRAVSHFGDDRPQWREASAKA LATVTLTQRGTPFIFQGDELGMTNYPFKTLQDFDDIEVKGFFQDYVETGKATAEELLTN VALTSRDNARTPFQWDDSANAGFTTGKPWLKVNPNYTEINAAREIGDPKSVYSFYRNLI SIRHETPALSTGSYRDIDPSNADVYAYTRSQDGETYLVVVNFKAEPRSFTLPDGMHIAE
TLIESSSPAAPAAGAASLELQPWQSGIYKVK SEQ ID NO:5
MAYSAETSVTQSIQTQKESTLPAWWKEAVFYQIYPRSFKDTNGDGIGDIRGIIEKLDYL KSLGIDAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYEKIMQEYGTMEDFDTLVSEMKKRNMRLMIDV VINHTSDQHPWFIQSKSSKENPYREYYFWRDGKDNQPPNNYPSFFGGSAWQKDDKTGQY YLHYFARQQPDLNWDNPKVRGDLYAMLRFWLDKGVSGMRFDTVATYSKIPGFPDLTPEQ QKNFAEQYTTGPNIHRYLQEMKQEVLSRYDVVTAGEIFGVPLERSSDFFDRRRNELDMS FMFDLIRLDRDSNERWRHKKWTLSQFRQIINKMDSNAGEYGWNTFFLDNHDNPRAVSHF GDDSPQWIEPSAKALATIILTQRATPFIFQGSELGMTNYPFKKLNEFDDIEVKGFWQDY VQTGKVSAEEFIDNVRLTSRDNSRTPFQWNDRKNAGFTSGKPWFRINPNYVEINADKEL IRNDSVLNYYKEMIKLRHKTPALIYGTYKDISPEDDSVYAYTRTLGKERYLVVINFTEK
TVRYPLPENNVIKSILIEANQNKTAEKQSTVLTLSPWQAGVYELQ SEQ ID NO:6
MATNHNEQDTKTVIAVNDGVSAHPVWWKEAVFYQVYPRSFKDSNGDGIGDLKGLTEKLD YLKTLGINAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYRKIMKEYGTMDDFDNLIAEMKKRDMRLMI DVVVNHTSNEHKWFVESKKSKDNPYRDYYIWRDGKDGTPPNNYPSFFGGSAWQKDNVTQ QYYLHYFGVQQPDLNWDNPKVREEVYDMLRFWIDKGVSGLRMDTVATFSKNPAFPDLTP EQLKNFAYTYTQGPNLHRYIQEMHQKVLAKYDVVSAGEIFGVPLEEAAPFIDQRRKELD MAFSFDLIRLDRAVEERWRRNDWTLSQFRQINNRLVDMAGQYGWNTFFLSNHDNPRAVS HFGDDRPEWRIRSAKALATLALTQRATPFIYQGDELGMTNYPFTSLSEFDDIEVKGFWQ DFVETGKVKPDVFLENVKQTSRDNSRTPFQWSNAEQAGFTTGTPWFRINPNYKNINAED QTQNPDSIFHFYRQLIALRHATPAFTYGAYQDLDPNNNEVLAYTRELNQQRYLVVVNFK
EKPVHYALPKTLSIKQTLLESGQKDKVAPNATSLELQPWQSGIYQLN Quantificação enzimática
[0046] SDS-PAGE seguido por coloração Coomassie foi usado para visualizar as enzimas presentes nas amostras. Para a quantificação das enzimas individuais, o foco foi em faixas da massa molecular corretas. A intensidade de coloração das faixas foi quantificada por software ImageQuant. A intensidade de coloração de proteína das faixas selecionadas foi comparada a quantidades conhecidas de albumina sérica bovina (BSA) executadas no mesmo gel, e calculada novamente para a solução estoque enzimática original. Identificação e quantificação de açúcar
[0047] O perfil de açúcar após a incubação de soluções contendo sacarose com as enzimas foi analisado usando a HPLC Dionex (sistema HPAEC BioLC, Dionex 5000) equipada com uma coluna CarboPac PA20. Após a incubação, as amostras são diluídas, filtradas e os componentes de açúcar separados usando o programa descrito na Tabela 2. Tabela 2: Método de HPLC usado para separar açúcares no Dionex. Etapa Tempo NaOH Comentário (min) (mM) 1 -15 25 Equilíbrio 2 0 25 Injeção 3 15 25 Ciclo isocrático 4 30 30 Gradiente leve 5 40 126 Lavagem de coluna (também com ácido acético)
Etapa Tempo NaOH Comentário (min) (mM) 6 50 25 Preparar para próximo ciclo
[0048] Picos em HPLC foram atribuídos e quantificados ao aumentar soluções puras de sacarose, glicose, frutose, isomaltulose, leucrose, trealulose e isomaltose (faixa de 2 a 75 mg/ml) obtidas junto à Merck Millipore. Um exemplo da separação dos diferentes açúcares usando essa técnica é mostrado na Figura 1. O fator de resposta para cada açúcar foi calculado a partir das áreas de pico integradas detectadas para as concentrações de açúcar e plotando um ajuste de curva linear da concentração versus a área de pico. O fator de resposta foi usado para o cálculo da quantidade absoluta do açúcar presente em cada amostra. A concentração de açúcar relativa em porcentagem foi calculada ao dividir a quantidade absoluta de cada açúcar medida na amostra pela quantidade total de todos os açúcares detectados na amostra e multiplicada por 100. Cálculo de índice glicêmico
[0049] O índice glicêmico (GI) nesses experimentos foi calculado ao considerar um GI dos diferentes açúcares; Sacarose: 65; Frutose: 15; Glicose: 100; Isomaltulose: 32; Trealulose: 32. Wolever (European Journal of Clinical Nutrition (2013) 67, 1229–1233) estabeleceu que um GI>70 é considerado alto, e um GI<55 é baixo, de acordo com a regulamentação canadense. O teor em porcentagem de cada açúcar no produto foi dividido por 100 e multiplicado por seu GI. Todos os números foram adicionados até calcular o GI dos produtos tratados diferentes.
Exemplo 2 Atividade de sacarose isomerases em pH diferente
[0050] Para testar a atividade das diferentes sacarose isomerases em sacarose em pH diferente, incuba-se uma sacarose a 20 %/tampão de fosfato de sódio a 250 mM com as diferentes enzimas em diluição de 10 % (0,07 – 0,21 mg de proteína/ml). O pH da solução foi ajustado para 4,5 e 6,0, e a incubação ocorreu por 6 horas a 37 °C, após isso, a reação foi interrompida por aquecimento a 99 °C por 5 minutos. A conversão de sacarose em diferentes açúcares foi quantificada usando o método de HPLC Dionex. Os resultados são retratados abaixo na Tabela 3 como porcentagem média da quantidade total de todos os açúcares detectados nas amostras após a incubação, obtidos a partir de experimentos com 2-4 preparações diferentes das respectivas enzimas. Tabela 3: Conversão de sacarose em vários açúcares em vários pHs usando sacarose isomerases
[0051] A partir da Tabela 3, torna-se evidente que todas as enzimas testadas têm capacidade de converter quase completamente sacarose tanto em pH 6,0 quanto em pH 4,5. A formação de produto é de alguma forma dependente da enzima, mas, com todas as enzimas de sacarose isomerase, os produtos mais proeminentes são isomaltulose e trealulose,
totalizando 60-100 % de açúcares totais na maioria das condições. Exemplo 3 Atividade de glicano sacarases em pH diferente
[0052] Para testar a atividade das diferentes glicano sacarases em sacarose em pH diferente, incuba-se uma sacarose a 20 %/tampão de fosfato de sódio a 250 mM com diferentes enzimas em diluição de 10 %. O pH da solução foi ajustado para 4,5 e 6,0, e a incubação ocorreu por 6 horas a 37 °C, após isso, a reação foi interrompida por aquecimento a 99 °C por 5 minutos. A composição de açúcar foi quantificada usando o método de HPLC Dionex. Os resultados são retratados abaixo na Tabela 4 como a porcentagem de açúcar total após a conversão, obtido a partir de experimentos com as respectivas enzimas. Uma vez que glicano pode existir de diferentes formas, é difícil quantificar usando o método de HPLC usado nesses experimentos. Portanto, a formação total de glicano foi calculada a partir da diferença no aumento em frutose e glicose, após a correção em relação ao teor de frutose e glicose da amostra pura em enzima adicionada. Portanto, os números indicados apenas são uma estimativa aproximada da quantidade total de glicano formado. Tabela 4: Conversão de sacarose em vários açúcares em vários pHs usando glicano sacarases
[0053] A partir da Tabela 4, torna-se evidente que algumas das glicano sacarases (70B e 70C) têm capacidade de converter quase toda a sacarose tanto em pH 6,0 quanto em pH 4,5, enquanto as outras mostram muito pouca atividade. A formação de produto é de alguma forma dependente da enzima, e o rendimento de glicano é máximo e aproximadamente 30- 40 % nessas condições. Outros açúcares que são formados por essas enzimas são principalmente leucrose e alguma isomaltulose. Exemplo 4 Atividade de sacarose isomerases em cola
[0054] A atividade das sacarose isomerases e glicano sacarases foi testada em refrigerante de cola (Coca-Cola®; supermercado local). Para esse experimento, as enzimas foram adicionadas novamente em diluição de 10 % nessa matriz, e incubadas por 130 minutos a 37 °C, após isso, a reação foi interrompida por aquecimento a 90 °C por 5 minutos. Aproximadamente 100 g/l de açúcar total são medidos na cola. Uma vez que a cola é muito ácida (pH 2,6), parte da sacarose é invertida em glicose e frutose, especialmente, durante a etapa de aquecimento, e a quantidade total de sacarose medida é provavelmente inferior, e a quantidade de frutose e glicose superior, então, presente na cola. Novamente, a conversão de sacarose em diferentes açúcares foi quantificada usando o método de HPLC Dionex. Os resultados são retratados abaixo como porcentagem média da quantidade total de todos os açúcares detectados nas amostras após a incubação. Como mostrado na Tabela 5 abaixo, 40-50 % de açúcar total podem ser convertidos nos açúcares de baixa glicemia isomaltulose e trealulose usando sacarose isomerases Sis14 e Sis15, levando a um baixo índice glicêmico. Sis14 parece ter uma preferência pela formação de isomaltulose, enquanto Sis15 tem uma preferência por formação de trealulose, como já observado no experimento com tampão do Exemplo 2. Sis2 não mostrou qualquer atividade em cola, enquanto Sis10, Sis12 e Sis4 mostraram 8-15 % de conversão. Tabela 5: conversão de açúcar em cola Índice % de cola Sacarose Frutose Glicose Isomaltulose Trealulose glicêmico Sis10 42 23 28 7 1 61 Sis2 49 23 28 0 0 63 Sis12 39 22 27 9 4 60 Sis4 35 22 28 5 10 59 Sis14 2 26 31 28 13 49 Sis15 2 24 28 18 28 48 Controle 50 23 27 0 0 63
[0055] Nenhuma das glicano sacarases mostrou atividade significativa em cola Exemplo 5: Atividade de sacarose isomerases em leite achocolatado em condições estomacais simuladas
[0056] A atividade das sacarose isomerases e glicano sacarases foi testada em leite achocolatado. Leite achocolatado desnatado (Friesland Campina) tem um pH neutro (pH 6,4) e contém aproximadamente 100 g/l de sacarose. Nesse experimento, 100 ml de leite achocolatado foram incubados sob agitação em 20 rpm em um banho de água ajustado a 37 °C, e o pH diminuiu em etapas pela adição de HCl. Pepsina de pó de mucosa gástrica porcina >250 u/mg de sólido (Sigma; P7000) foi adicionada em concentração final de 0,02 mg/ml, e sacarose isomerases foram adicionadas em 0,1 % (v/v), no início do experimento. Após a incubação por 0,5 hora, o pH foi definido como 4,0, após 1 hora, ajustado para pH 3,0 e, após 1,5 horas, para pH 2,0 por adição de HCl. Amostras de 1 ml foram retiradas após incubação de 5- 10 minutos (t=0), 1 hora (t=1) e 2 horas (t=2) e a atividade enzimática foi inativada imediatamente por aquecimento (99 °C por 5 minutos).
[0057] As amostras foram analisadas usando o método de HPLC como descrito acima, e os diferentes açúcares foram quantificados e expressos como porcentagem da quantidade total de todos os açúcares detectados nas amostras, e são mostradas abaixo na Tabela 6. Novamente, como também é observado no experimento com cola, as amostras mostraram conversão (química) de sacarose em glicose e frutose por aquecimento em pH baixo (especialmente prevalente nas amostras de t=2). Tabela 6: Conversão de açúcar em leite achocolatado % de Índice chocolate tempo Sacarose Frutose Glicose Isomaltulose Trealulose glicêmico Sis10 t=0 77 9 -2 17 0 54 t=1 54 12 0 33 1 48 t=2 14 24 20 40 1 46 Sis2 t=0 96 11 -3 -3 0 59 t=1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. t=2 62 23 14 1 0 58 Sis12 t=0 97 11 -3 -7 1 60 t=1 65 13 0 10 13 51 t=2 24 29 23 11 13 51 Sis4 t=0 82 10 -3 5 6 55 t=1 24 10 -2 22 46 37 t=2 4 15 6 33 42 35 Sis14 t=0 101 13 -4 -10 0 60 t=1 82 15 2 -1 2 58
% de Índice chocolate tempo Sacarose Frutose Glicose Isomaltulose Trealulose glicêmico t=2 15 41 41 0 2 58 Sis15 t=0 103 6 -4 -7 2 63 t=1 58 12 -2 7 24 48 t=2 20 28 23 8 21 50 Controle t=0 103 0 -3 0 0 64 t=1 86 13 1 0 0 59 t=2 43 31 27 0 0 59
[0058] A partir da Tabela 6, torna-se evidente que, especialmente, Sis4 tem capacidade de converter até 75 % de sacarose total em leite achocolatado em açúcares de baixa glicemia como isomaltulose e trealulose em condições estomacais simuladas. Sis10 pode converter especificamente ~40 % da sacarose em isomaltulose, enquanto Sis15 produz principalmente ~30 % do total de trealulose e Sis12 ~20 % do total de ambos os isômeros de sacarose. Sis2 e Sis14 não mostraram um efeito nesse experimento. Então, mesmo com uma dosagem enzimática muito inferior em condições que imitam digestão estomacal, a maioria dessas enzimas pode levar a uma diminuição do índice glicêmico de um produto alimentício regular como leite achocolatado.
[0059] Nenhuma das glicano sacarases mostrou atividade significativa em leite achocolatado nesse experimento. Exemplo 6: Atividade de sacarose isomerases em sorvete em condições estomacais simuladas
[0060] A atividade das sacarose isomerases e glicano sacarases foi testada em sorvete. O sorvete (Albert Heijn Roomijs de baunilha) tem um pH neutro (pH 6,5) e contém aproximadamente 230 g/kg de sacarose. O experimento foi realizado exatamente como foi descrito no Exemplo 4 incluindo a dosagem enzimática, adição de pepsina, ajuste de pH, tempos e quantidades de amostragem e análise de açúcar em HPLC.
[0061] Novamente, diferentes açúcares foram quantificados e expressos como porcentagem da quantidade total de açúcar detectado nas amostras. Os resultados da análise de açúcar são retratados abaixo na Tabela 7. Tabela 7: Conversão de açúcares em sorvete
[0062] A partir da Tabela 7, torna-se evidente que Sis4 tem capacidade de converter até 25-35 % de sacarose total em sorvete em açúcares de baixa glicemia, como isomaltulose e trealulose, em condições estomacais simuladas. Sis10 pode converter especificamente ~15 % da sacarose em isomaltulose, e, ademais, Sis12 e Sis15 produzem alguns isômeros de sacarose. Novamente, Sis2 e Sis14 não tiveram atividade nessas condições. Assim, mesmo com uma dosagem enzimática muito inferior em condições que imitam a digestão estomacal, a maioria dessas enzimas pode levar a uma diminuição do índice glicêmico de um produto alimentício regular, como sorvete.
[0063] Nenhuma das glicano sacarases mostrou atividade significativa em sorvete nesse experimento.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição de suplemento nutricional, farmacêutico ou nutracêutico caracterizada por compreender uma sacarose isomerase.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser adequada para seres humanos.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser adequada para animais de companhia.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma sacarose isomerase com pelo menos 60 % de identidade, de preferência, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidade, com qualquer uma das sequências de SEQ ID NO:1-6.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por compreender uma sacarose isomerase com pelo menos 60 % de identidade, de preferência, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % de identidade, com a SEQ ID NO: 4.
6. Método de diminuição do aumento de níveis de glicose sanguínea em um animal, incluindo um ser humano que ingere sacarose caracterizado por compreender administrar um suplemento nutricional, farmacêutico ou nutracêutico conforme definido na reivindicação 1 ao animal incluindo um ser humano em necessidade do mesmo.
7. Método de diminuição do índice glicêmico de um alimento ou ração que é consumido por um ser humano ou animal de companhia caracterizado por compreender administrar ao ser humano ou animal de companhia um suplemento nutricional, farmacêutico ou nutracêutico compreendendo uma sacarose isomerase conforme definida na reivindicação 1.
8. Método de perda de peso ou manutenção de perda de peso em um ser humano ou animal de companhia caracterizado por compreender administrar ao ser humano ou animal de companhia um suplemento nutricional, farmacêutico ou nutracêutico compreendendo uma sacarose isomerase conforme definida na reivindicação 1.
9. Uso de um suplemento nutricional, farmacêutico ou nutracêutico compreendendo uma sacarose isomerase caracterizado por ser para alcançar uma condição em um animal, incluindo um ser humano, selecionada a partir do grupo que consiste em: a) diminuir o aumento de níveis de açúcar no sangue; b) aumentar a resistência de um animal que pratica exercício de resistência; c) perder de peso ou manter a perda de peso; d) diminuir o índice glicêmico de alimento ou ração ingerido; e e) liberar energia sustentada e/ou prevenir ou minimizar uma elevação rápida de açúcar no sangue e a denominada “queda” após uma refeição contendo sacarose.
10. Mistura seca de alimento ou bebida caracterizada por compreender uma sacarose isomerase.
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