CN102617756A - 肝素锂制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝素锂制备方法。它是将粗品肝素酶解后，进行去蛋白处理，在进行氧化脱色后利用树脂交换得肝素锂溶液，将肝素锂溶液实施沉淀、脱水、干燥得到肝素锂精品。本发明原料来源广泛，通用性强，活性收率高，工艺品质稳定，生产成本低廉，常温条件下可操作性强的肝素锂制备方法，以便于实现肝素锂的低投入、低成本、高回收率、可操作性强、工艺品质稳定的大批量制备。

Description

肝素锂制备方法

技术领域

本发明属于抗凝剂的制备技术，具体涉及一种肝素锂制备技术。

背景技术

肝素，在临床血液检验中以钠盐和锂盐为常见，具有独特的应用价值，肝素螯合力低，对水分子运动的影响小，对血液成分干扰少，不影响红细胞体积，不引起溶血，所以在多种以全血或血浆为标本的检验中，推荐使用肝素作为抗凝剂。适用于红细胞脆性试验、血气分析、红细胞压积实验、血流变及急诊生化测定。在对ph值、血气、电解质和钙离子的检测中，肝素是唯一可以使用的抗凝剂，而肝素锂在检测非锂离子时产生干扰的可能性最小，所以推荐使用肝素锂作为抗凝剂，目前在血液检验中，肝素锂正在逐步取代肝素钠。

肝素锂的制备，目前国内专利200510019846.0公开了离子平衡交换法制备肝素锂，该法部分工艺环节需要低温条件(10℃以下)操作，对物料及环境温度控制要求较高，硬件设施投入较大；该法在去蛋白工艺环节采用强酸性条件操作(PH1.5)，对肝素活性损失较大(肝素溶液在低PH值环境下很不稳定，极易降解失活)，影响最终活性收率和效价，可操作性不强；该法采用超滤浓缩分离技术，超滤设备昂贵，硬件投入较大；该法采用的离子平衡交换方式，是以高浓度锂离子不断介入的方式来实现肝素钠向肝素锂的转换，无法保证动态离子平衡转换的充分性和连续稳定性。国外制备肝素锂均采用离子交换法，该法需要选用精品肝素钠为原料，原料成本高，而且在离子交换过程中可引起PH急剧下降，严重影响产品的收率和效价，并且交换过程需要在低温提条件下进行，导致肝素锂生产硬件设施投入较大，生产成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝素锂制备方法，以解决上述问题。

本发明的技术方案为：肝素锂制备方法，它是以下列步骤制备：

1、粗品肝素酶解：将粗品肝素钠溶解，调PH值为7.5-9.0，升温至50-55℃，加入肝素酶解胰酶，保温4-5小时，调PH值9.0-11，升温至85℃～90℃后，冷却，过滤去除沉淀物，滤液用乙醇沉淀，收集沉淀物(A)；

2、去蛋白：步骤1所得沉淀物(A)用水溶解，搅拌，调PH至9-11，加入蛋白质絮凝沉淀剂，搅拌，静置，过滤去除沉淀，收集滤液(D)，滤液(D)调PH至11-13值，搅拌，静置，过滤去除沉淀，收集滤液(E)，滤液(E)调PH值至中性，用乙醇沉淀，收集沉淀物(B)；

3、氧化脱色：将步骤2所得沉淀物(B)用水溶解，用过氧化氢氧化24-48小时，调整PH至10.5-11.5后，过滤去除沉淀物，收集滤液(F)，滤液(F)调PH值至6.5-7.5，用乙醇沉淀，收集沉淀物(C)；

4、树脂交换：将步骤3所得沉淀物(C)用水溶解，加入LiCl，搅拌溶解，通过树脂柱进行离子交换，收集过柱流出液，得肝素锂溶液；

5、沉淀、脱水、干燥：将步骤4所得肝素锂溶液，过滤，用乙醇沉淀，收集沉淀物(G)，沉淀物(G)脱水，然后真空干燥，粉碎，得肝素锂精品。

步骤1中，所述肝素酶解胰酶选用胰蛋白酶、含胰蛋白酶的复合胰酶、中性胰蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种或含两种以上的组合。

步骤2中，所述蛋白质絮凝沉淀剂选用聚丙烯酸钠、聚合氯化铝、聚丙烯酸钙、聚合氯化铝、氯化钙中的一种或含两种以上的组合。

所述步骤5中，所述沉淀物(G)脱水是用无水乙醇实施脱水。

所述步骤1中，所述粗品肝素钠溶解是：用NaCL溶液将粗品肝素钠原料溶解，粗品肝素钠溶液质量浓度为8％-16％。

所述步骤1中，在粗品肝素钠溶液中加入肝素酶解酶的质量百分比是粗品肝素钠溶液质量的0.1-0.3％。

所述步骤4中，沉淀物(C)的水溶液的质量百分比浓度是8％-20％；在沉淀物(C)的水溶液中加入的氯化锂的质量百分比是沉淀物(C)水溶液质量的1.5％-8.5％；所用树脂为离子型交换树脂。

所述粗品肝素钠是市售商品原料，效价为65-105IU/mg不等。

本发明，以粗品肝素钠为原料，原料来源广泛，成本较低。此外，本发明，硬件设施投入小，环境温度要求不高，可实现工艺全程的常温条件下操作(除局部需要短时间加热的环节外)，树脂法动态离子交换过程温和，不会有活性损失，回收率达到95％以上，产品效价达到160IU/mg以上。与国内专利200510019846.0公开的离子平衡交换法制备肝素锂对比，本发明具有以下创新：(1)、本发明增加了粗品肝素的酶解工艺，粗品肝素多以肝素-蛋白质复合体的形式存在，通过对粗品肝素的酶解，可充分高效的使肝素-蛋白质复合体解离，让肝素有效物质游离释放出来，便于进一步提取，这是确保后期高活性收率的基本前提。(2)、在蛋白质去除工艺环节，国内专利200510019846.0，采用低温(10℃以下)低PH值(PH1.5)条件操作，肝素在酸性环境下很不稳定，其活性会有较大损失，采用低温环境只能延缓或相对减少肝素活性损失而已，不能完全保留肝素活性；而本发明采用在碱性环境下加入蛋白质絮凝沉淀剂的技术，可实现在高效去除蛋白质的同时，不会引起肝素的活性损失，无需低温条件，保证最终收率。(3)、在肝素钠向肝素锂的转换环节，国内专利200510019846.0，采用离子平衡交换，并配合超滤浓缩，以高浓度锂离子不断介入的方式来实现肝素钠向肝素锂的转换，无法保证动态离子平衡转换的充分性和连续稳定性；而本发明采用树脂交换法，利用锂离子、钠离子对树脂功能基团的优先吸附置换程度的差异，来实现以树脂为介导的锂-钠交换，从而实现肝素钠向肝素锂的转型，并且整个过程始终连续稳定的在常温、PH中性条件下进行，置换转型过程温和，转型充分，对肝素活性本体没有吸附残留，没有活性损失。树脂材料投入和使用维护成本也很低(树脂的使用，只须按厂家使用说明进行正常的预先处理和正常的使用操作即可)，适合大批量制备。(4)基于肝素在酸性条件下不稳定、在中性或碱性条件下非常稳定(甚至在碱性条件下能够耐受较高温度)等物质特性，本发明工艺全过程，始终让肝素处于中性或碱性条件下，可有效保留肝素活性，最大限度提高收率，并且无需低温环境，可避免为创造低温环境的硬件设施投入与使用维护，降低成本，可操作性强。

具体实施方式

实施例1：

步骤1：用1％-3％的NaCL溶液将粗品肝素钠原料(市售商品原料，效价65-105IU/mg不等)搅拌溶解，粗品肝素钠浓度为8％-16％(质量百分比浓度)，用5M的NaOH溶液调PH至7.5-9.0，升温至50-55℃，按粗品肝素钠溶液质量的0.1-0.3％加入肝素酶解胰蛋白酶，保温4-5小时，用5M的NaOH溶液调PH值至9.0-11，升温至85℃～90℃，冷却到常温，过滤去除沉淀物，滤液用0.8-1.5倍体积95％的乙醇沉淀4小时以上，收集沉淀物A；

步骤2：将沉淀物A用纯水搅拌溶解，溶解浓度为10％-20％(质量百分比)，用5M的NaOH溶液调PH至8.5-11，按沉淀物A水溶液质量的0.1％-5％加入蛋白质絮凝沉淀剂氯化钙，搅拌1-2小时，静置1小时以上，过滤去除沉淀，收集滤液，用5M的NaOH(或碳酸钠)溶液调PH值至11-13，搅拌均匀，静置30分钟以上，过滤去除沉淀，收集滤液，用6M的HCL溶液调PH值至中性，用0.8-1.5倍体积的95％乙醇沉淀4小时以上，收集沉淀物B；

步骤3：将沉淀物B用纯水溶解，溶解浓度为15％-30％(质量百分比浓度)，按沉淀物B水溶液质量的1％～4％加入纯度为30％的过氧化氢(可以分次加入)，氧化24-48小时，用5M的NaOH溶液调整PH至10.5-11.5，过滤去除沉淀物，收集滤液，用6M的HCL溶液调PH值至6.5-7.5，用0.8-1.5倍体积的95％乙醇沉淀4小时以上，收集沉淀物C；

步骤4：将所得沉淀物C用纯水溶解，溶解度为8％-20％(质量百分比浓度)，再按沉淀物C溶液质量的1.5％-8.5％加入氯化锂，搅拌溶解，通过已再生转型好的离子型树脂柱进行离子交换，交换流速10BV/h以下，收集过柱流出液，并用1-2倍量的纯水通柱，合并流出液，得肝素锂盐溶液；

步骤5：将所得肝素锂盐溶液，过滤，用0.8-3倍体积的95％乙醇沉淀4小时以上，收集沉淀物，用无水乙醇脱水两次，然后真空干燥，粉碎，得肝素锂精品。

实施例2

将步骤1中的肝素酶解胰酶选用含胰蛋白酶的复合胰酶；

将步骤2中的蛋白质絮凝沉淀剂选用聚合氯化铝；

其他步骤和实施例1相同，得到肝素锂精品。

实施例3

将步骤1中的肝素酶解胰酶选用中性胰蛋白酶；

将步骤2中的蛋白质絮凝沉淀剂选用聚丙烯酸钠；

其他步骤和实施例1相同，得到肝素锂精品。

实施例4

将步骤1中的肝素酶解胰酶选用碱性蛋白酶；

将步骤2中的蛋白质絮凝沉淀剂选用聚丙烯酸钠；

其他步骤和实施例1相同，得到肝素锂精品。

实施例5

将步骤1中的肝素酶解胰酶选用胰蛋白酶；

将步骤2中的蛋白质絮凝沉淀剂选用聚丙烯酸钙；

其他步骤和实施例1相同，得到肝素锂精品。

上述制备的肝素锂的质量指标如下表：

表明按本发明方法制备得到的肝素锂精品，均达到上述质量指标。

Claims (8)

1.一种肝素锂制备方法，它是以下列步骤制备：

1、粗品肝素酶解：将粗品肝素钠溶解，调PH值为7.5-9.0，升温至50-55℃，加入肝素酶解胰酶，保温4-5小时，调PH值9.0-11，升温至85℃～90℃后，冷却，过滤去除沉淀物，滤液用乙醇沉淀，收集沉淀物(A)；

2、去蛋白：步骤1所得沉淀物(A)用水溶解，搅拌，调PH至9-11，加入蛋白质絮凝沉淀剂，搅拌，静置，过滤去除沉淀，收集滤液(D)，滤液(D)调PH至11-13值，搅拌，静置，过滤去除沉淀，收集滤液(E)，滤液(E)调PH值至中性，用乙醇沉淀，收集沉淀物(B)；

3、氧化脱色：将步骤2所得沉淀物(B)用水溶解，用过氧化氢氧化24-48小时，调整PH至10.5-11.5后，过滤去除沉淀物，收集滤液(F)，滤液(F)调PH值至6.5-7.5，用乙醇，收集沉淀物(C)；

4、树脂交换：将步骤3所得沉淀物(C)用水溶解，加入LiCl，搅拌溶解，通过树脂柱进行离子交换，收集过柱流出液，得肝素锂溶液；

5、沉淀、脱水、干燥：将步骤4所得肝素锂溶液，过滤，用乙醇沉淀，收集沉淀物(G)，沉淀物(G)脱水，然后真空干燥，粉碎，得肝素锂精品。

2.如权利要求1所述肝素锂制备方法，其特征在于步骤1中，所述肝素酶解胰酶选用胰蛋白酶、含胰蛋白酶的复合胰酶、中性胰蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种或含两种以上的组合。

3.如权利要求1所述肝素锂制备方法，其特征在于步骤2中，所述蛋白质絮凝沉淀剂选用聚丙烯酸钠、聚合氯化铝、聚丙烯酸钙、聚合氯化铝、氯化钙中的一种或含两种以上的组合。

4.如权利要求1所述肝素锂制备方法，其特征在于所述步骤5中，所述沉淀物(G)脱水是用无水乙醇实施脱水。

5.如权利要求1或2所述肝素锂制备方法，其特征在于所述步骤1中，所述粗品肝素钠溶解是：用NaCL溶液将粗品肝素钠原料溶解，粗品肝素钠溶液质量浓度为8％-16％。

6.如权利要求5所述肝素锂制备方法，其特征在于在粗品肝素钠溶液中加入肝素酶解酶的质量百分比是粗品肝素钠溶液质量的0.1-0.3％。

7.如权利要求1所述肝素锂制备方法，其特征在于所述步骤4中，沉淀物(C)的水溶液的质量百分比浓度是8％-20％；在沉淀物(C)的水溶液中加入的氯化锂的质量百分比是沉淀物(C)水溶液质量的1.5％-8.5％。

8.如权利要求1所述肝素锂制备方法，其特征在于所述步骤4中，所用树脂柱为离子型交换树脂。