CN103030715A - 一种分离纯化肝素钠的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离纯化肝素钠的方法。猪肠粘膜经提取制得的肝素钠中含有大量蛋白质和核酸等杂质，给肝素钠的精制纯化带来一定的难题。传统的工艺方法通过盐解工艺或酶解工艺去除残留的杂质，对肝素钠提取质量要求高，去除效率比较低，后续氧化沉淀精制时间长，氧化剂(过氧化氢)使用量大，收率低。本发明方法采用酶解和沉淀剂去除肝素钠中残留的杂质，工艺设计合理，去除效率高，缩短了后续精制工时，提高了产品收率，降低了成本。

Description

一种分离纯化肝素钠的方法
技术领域
本发明涉及一种分离纯化肝素钠的方法，特别是一种肝素钠生产工艺方法。
背景技术
肝素钠是一种临床常用的抗凝血药物，主要从猪小肠粘膜中提取的粘多糖物质，具有显著地抗凝血和防止血栓形成的作用。近年来低分子肝素钠的涌现，使肝素钠的应用越来越广泛。传统的生产工艺方法是将粗提取的肝素钠(效价60-100U/mg)进行盐解或酶解，然后进行氧化脱色精制。其局限性在于，核酸及蛋白质类杂质去除程度低，对提取质量要求高(要求效价≥80U/mg)，生产周期长，产品效价低，收率低。
发明内容
本发明的目的提供一种新的酶解结合絮凝沉降生产肝素钠的工艺方法，克服了上述常规方法存在的问题，有效简化精制工序，可在更短的时间里生产出杂质含量低、单位效价高、收率好的肝素钠产品。
本发明的目的通过以下技术方案来达到，依次通过以下几个步骤来实现。
1、将肝素钠加入到反应罐中用水完全溶解，肝素钠与水的重量比为1∶6至1∶8；
2、调pH＝6.0-7.0，升温至50-55℃，按5-10g/亿单位加入胃蛋白酶，按10-20g/亿单位加入胰蛋白酶，酶解保温2-4小时；
3、调pH＝8.0-9.0，升温至80-90℃，静置20至40分钟，然后降温至50-55℃，按20％至30％(v/v)比例加入乙醇，调节pH＝11.0-12.0，静置直至分层；
4、虹吸酶解上清液，下层沉淀物离心后母液合并至上清液中，弃去固体分离物。
5、调pH＝6.0-7.0，升温至60-70℃，按0.3％-0.5％(w/v)比例加入絮凝沉淀剂1，搅拌均匀后，静置直至分层，虹吸上清，沉淀物离心后母液合并至上清液中，弃去固体分离物。
6、升温至40-50℃，调pH＝11.0-12.0，按0.3％-0.5％(w/v)比例加入絮凝沉淀剂2，静置直至分层，虹吸上清，沉淀物离心后母液合并至上清液中，弃去固体分离物。
7、将步骤6中的上清液用乙醇沉淀，之后用过氧化氢氧化脱色，脱水后烘干，即得分离纯化的肝素钠。
本技术方案的有益效果是：经酶解结合絮凝沉降工艺方法分离纯化的肝素钠，经过氧化氢一步氧化脱色并用乙醇沉淀精制后，活性效价的回收率≥85％，效价≥180U/mg，吸光度260nm≤0.1，280nm≤0.1。
第一，本技术方案中，酶解保温pH＝6.0-7.0，保温温度为50-55℃。酶解条件温和，在裂解核酸及蛋白杂质的同时，可有效保护肝素钠较少受蛋白酶的破坏。传统酶解保温pH＝8.0-9.0，此时胰蛋白酶的活性最好，但此时对肝素钠的分解作用增加，活性效价损失大。
第二，本技术方案中，酶解液降温至50-55℃后，按20％-30％(v/v)比例加入乙醇，可使静置分层效果更好，使上清液的比例增加。
第三，本技术方案中，酶解液中仍存在未变性的蛋白多肽等杂质，使用絮凝沉淀剂1进行处理，可有效分离酸性蛋白多肽杂质。
第四，本技术方案中，酶解液中仍存在与碱性蛋白相结合的核酸等杂质，使用絮凝沉淀剂2进行处理，可有效分离碱性蛋白核酸等杂质。
具体实施方式
以下实例详细说明了本发明：
1、向反应罐中加入800Kg水，边搅拌边将100Kg肝素钠(60U/mg)加入到反应罐中直至完全溶解。
2、调pH＝6.0，升温至55℃停止加热，加入600g胃蛋白酶及1200g胰蛋白酶，搅拌均匀后保温作用3小时。
3、调pH＝9.0，迅速升高温度至90℃，静置30分钟。降温至55℃，加入160L95％乙醇，调节pH＝11.0，静置12小时。
4、虹吸酶解上清液，下层沉淀物离心，合并母液至上清，弃去固体分离物。
5、将4中的料液调pH＝7.0，升高温度至70℃，加入2.4Kg絮凝沉淀剂1(碳酸钙)，搅拌均匀后，静置12小时。虹吸上清，沉淀物离心后，将母液合并至上清，弃去固体分离物。
6、将5中的料液升温至50℃，调pH＝11.0，加入絮凝沉淀剂2(羟基磷灰石)，静置12小时，虹吸上清，沉淀物离心后，将母液合并至上清，弃去固体分离物。
7、将6中的合并上清用95％乙醇沉淀至40％，之后用过氧化氢氧化脱色，脱水后烘干，得分离纯化的肝素钠30Kg。

Claims (6)

1.一种分离纯化肝素钠的方法，其特征是：
(1)、将肝素钠加入到反应罐中用水完全溶解，肝素钠与水的重量比为1∶6至1∶8；
(2)、调pH＝6.0-7.0，升温至50-55℃，按5-10g/亿单位加入胃蛋白酶，按10-20g/亿单位加入胰蛋白酶，酶解保温2-4小时；
(3)、调pH＝8.0-9.0，升温至80-90℃，静置20至40分钟，然后降温至50-55℃，按20％至30％(v/v)比例加入乙醇，调节pH＝11.0-12.0，静置直至分层；
(4)、虹吸酶解上清液，下层沉淀物离心后母液合并至上清液中，弃去固体分离物。
(5)、调pH＝6.0-7.0，升温至60-70℃，按0.3％-0.5％(w/v)比例加入絮凝沉淀剂1，搅拌均匀后，静置直至分层，虹吸上清，沉淀物离心后母液合并至上清液中，弃去固体分离物。
(6)、升温至40-50℃，调pH＝11.0-12.0，按0.3％-0.5％(w/v)比例加入絮凝沉淀剂2，静置直至分层，虹吸上清，沉淀物离心后母液合并至上清液中，弃去固体分离物。
(7)、将步骤(6)中的上清液用乙醇沉淀，之后用过氧化氢氧化脱色，脱水后烘干，即得分离纯化的肝素钠。
2.按照权利要求书1所述的方法，其特征为：酶解保温pH＝6.0-7.0，保温温度为50-55℃。
3.按照权利要求书1所述的方法，其特征为：酶解结束后按20％至30％(v/v)比例加入乙醇。
4.按照权利要求书1所述的方法，其特征为：絮凝沉淀剂1选自碳酸钙、氢氧化铝及壳聚糖或其混合物。
5.按照权利要求书1所述的方法，其特征为：絮凝沉淀剂2选自羟基磷灰石(HAP)和十二烷基磺酸钠(SDBS)或其混合物。
6.按照权利要求书1所述的方法，其特征为：步骤(4)和步骤(5)中沉淀物离心母液可直接合并至上清。
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