CN101429229A - 一种高纯度谷胱甘肽的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高纯度谷胱甘肽的生产方法，它包括以下步骤：发酵液离心得湿酵母细胞体、热水破壁、抽提液离心、调节pH使料液体系处于酸性环境中、微滤除去悬浮小颗粒杂质、阳离子交换树脂吸附、吸附树脂吸附、减压浓缩、结晶、洗晶和真空干燥，得到纯度98％以上的GSH。该方法从谷胱甘肽发酵液提取、分离和纯化GSH，采用了合理的抽提条件，最大限度使GSH从酵母细胞体中溶解出来，并避免在更高温度下氧化；抽提液在酸性环境下，可沉淀部分杂质，提高树脂吸附量，并能防止GSH氧化；利用阳离子交换树脂与吸附树脂结合的方法分离GSH，可使解析液直接结晶，从而达到98％以上的目标纯度，收率高，且能实现工业化生产。
Description
技术领域 本发明属于生物化工领域，具体涉及一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法，属于谷胱甘肽制备技术领域。
背景技术 谷胱甘肽是一种具有重要生理活性的三肽，即r-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(glutathione，GSH)。半胱氨酸上的巯基为其活性基团，但巯基容易引起两个分子谷胱甘肽的偶联，谷胱甘肽有两种形式：还原型(GSH)和氧化型(GSSG)，在生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数，谷胱甘肽还原酶能催化两型间的互变。谷胱甘肽的相对分子量为307.33，熔点189～193℃，晶体呈无色透明长柱状，等电点为2.83。它易溶于水，可溶于稀醇、液氨，不溶于醇、醚和丙酮。它广泛分布于动物、植物和油料种子中。它在细胞中的功能之一就是抵御各种毒素和致癌剂。有研究表明(孙洪刚，等.谷胱甘肽的代谢和应用.卫生职业教育.2004，10：126-127)：谷胱甘肽在小肠中能被完全吸收，并且某些上皮细胞能利用外源谷胱甘肽去毒，这说明膳食中的谷胱甘肽决定着人体中细胞免受损伤的程度。除作为抗毒剂外，谷胱甘肽还对一些巯基酶有激活作用，可作为保护酶和其它蛋白巯基的抗氧化剂，在生物氧化、氨基酸转运、保护血红蛋白等过程中起一定作用。另外，谷胱甘肽还具有抑制衰老、预防糖尿病、消除疲劳等作用。谷胱甘肽在强化食品风味的同时对人体有保健作用，它的应用前景明显优于其它类型的抗氧化剂和防腐剂。最近研究还发现谷胱甘肽具有抑制艾滋病的作用。因此，研究谷胱甘肽对人类的健康和生活具有重要的意义。
酵母的谷胱甘肽粗提液浓度非常低，而且在谷胱甘肽粗提液中常常含有很多杂质，如蛋白质、多糖、多肽、氨基酸、盐类等等。因此高纯度、高收率的谷胱甘肽工业化分离较困难。目前报道的有萃取法、铜盐法、离子交换法、电渗析法、金属亲和层析法、双水相分离等方法提取分离发酵液中的谷胱甘肽。
其中：萃取法制备GSH所使用的溶剂可以是水、有机酸溶液和稀醇等，但提取收率低，且造成严重的环境污染。
铜盐法污染大，影响产品纯度。
复旦大学的苑小林等人(苑小林，等.鲜酵母中谷胱甘肽(GSH)分离纯化的初步研究[J].药物生物技术，1998，5(2)：89～91)将对氨基苯汞乙酸连接到聚苯乙烯-二乙烯基苯载体上，形成含有机汞的化学亲和树脂，用于吸附GSH，回收率为83％，但在高浓度盐作用下，汞容易从树脂上断开，影响后续分离和产品纯度。
在国家专利(申请号200610040606.3)“一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法”中指出：采用谷胱甘肽发酵液离心得酵母细胞、调节pH、沸水破壁方法，提取细胞中的谷胱甘肽；使用001×7阳离子交换技术去除小分子物质，最终达到从发酵液中浓缩纯化谷胱甘肽的目的，制得分子量为307.33，蛋白质含量为23％、提取收率为80.5％的白色粉末状谷胱甘肽成品。但是，离子交换树脂不能彻底的去除料液中的杂质与色素，尚不能达到结晶浓度，且在解析过程利用盐酸解析，解析液pH很低，欲进行结晶，必须用碱调节pH，在溶液中产生盐份，在浓缩结晶过程形成干扰，不利于结晶。无法做到药用98％以上的纯度要求。另外在细胞破壁时温度控制95～100℃，温度过高会导致GSH氧化，影响收率。而且在我国部分地区由于海拔高，在常压下无法达到该温度，不便于生产操作。
到目前为止，谷胱甘肽的工业化分离纯化存在收率低、污染严重、浓缩和层析过程成本高等问题。如何提高收率、降低成本、减小对环境污染，是实现工业化生产的重点。
发明内容 本发明的目的在于提供一种高收率、能够保证产品纯度，且能实现工业化生产的高纯度谷胱甘肽的生产方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种高纯度谷胱甘肽的生产方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)发酵液离心：将发酵液下罐后离心，离心转速为3000～5000rpm，时间为5～10min，得到湿酵母细胞体；
(2)热水破壁：将1份湿酵母细胞体加入到6～10份沸水的抽提罐中，进行搅拌，搅拌转速为300～350rpm，当抽提液温度达到85～95℃时，保温10～15分钟后，停止抽提，将抽提液倒出，将抽提液水浴冷却至室温；
(3)抽提液离心：将抽提液离心，离心转速为3000～5000rpm，时间为5～10min，除去酵母渣，得到含有GSH的抽提液；
(4)调节pH：在离心后的抽提液中加入酸，使料液体系处于pH2.5～3.5的酸性环境中，可沉淀某些杂质，并使GSH处于稳定状态，防止氧化；
(5)微滤：利用0.1～1μm孔径的微滤设备对调节pH后的抽提液进行过滤，以除去悬浮的小颗粒杂质，得到清亮透明的滤液；
(6)阳离子树脂分离：将微滤后的料液在酸性环境的阳离子交换树脂上进行吸附，使GSH被吸附，然后用含有一价正离子的溶液解析，得到富含GSH的液体；
(7)吸附树脂分离：将经过阳离子交换树脂分离纯化后的富含GSH的液体在吸附树脂上再次进行吸附，然后用纯水洗脱，得到纯度很高的GSH液体；
(8)减压浓缩：在-0.07～-0.098Mpa的真空度与55～65℃温度下减压浓缩GSH溶液，使达到GSH含量在400mg/ml以上；
(9)结晶：在谷胱甘肽浓缩液中加入异丙醇或乙醇，使有机溶剂含量达到60％～80％，调pH值至2.90～3.0，在0～4℃环境进行结晶；
(10)洗晶：用体积百分比浓度为70％～90％的丙酮溶液对结晶体进行洗涤；
(11)真空干燥：在-0.07～-0.098Mpa的真空度下干燥，得到98％以上纯度的GSH。
上述步骤(1)中所述的发酵液，其发酵水平至少达到1650mg/L。
上述步骤(4)中，用于调节pH的酸选用盐酸、硫酸或硝酸。
上述步骤(6)中，用于解析的一价正离子溶液选用氢氧化钠、氯化钠或盐酸。
上述步骤(6)中，所述的阳离子树脂选用磺酸基团阳离子树脂。
上述步骤(7)中，所述的吸附树脂选用苯乙烯系弱极性大孔吸附树脂。
上述步骤(7)得到的GSH液体，先用截留分子量100～200的纳滤膜浓缩，以提高GSH的浓度并去除小分子杂质，再进行步骤(8)的减压浓缩。
本发明提供的上述高纯度谷胱甘肽的生产方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：
①本发明从谷胱甘肽发酵液提取、分离和纯化GSH，采用85～95℃时，保温10～15分钟抽提，可以最大限度使GSH从酵母细胞体中溶解出来，并避免GSH在更高温度下氧化。
②在抽提液中加入酸调pH到2.5～3.5的酸性环境，可沉淀抽提液中的部分杂质，在树脂吸附过程中减少了与谷胱甘肽形成竞争的杂质离子，提高了树脂对谷胱甘肽的吸附量，减轻分离压力，并能使GSH处于酸性的稳定环境，防止GSH氧化。
③本法利用阳离子交换树脂与吸附树脂结合的方法分离GSH，离子交换树脂上解析后的料液已被除去大部分杂质，再用吸附树脂进行吸附时，吸附树脂的吸附能力大大提高，然后用纯水洗脱，可直接除去料液中残留的杂质、盐份及色素，解析液可直接结晶，从而达到98％以上的目标纯度。
具体实施方式
实施例1：
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为3000rpm的离心机离心10min，得到湿酵母细胞1500g，湿酵母细胞中GSH含量为5.50g/kg。将1500g湿酵母细胞加入15L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为300rpm；当抽提液温度达到90℃时，保温10分钟后，停止抽提；将抽提液流水浴冷却，降温至室温。再次用转速为3000rpm的离心机离心10min，得到富含GSH的抽提液15L。在抽提液中加入盐酸调抽提液pH值为2.5的酸性环境，用0.1μm的微滤除去沉淀物，收集含有GSH的过滤液。上阳离子交换树脂(磺酸基团阳离子树脂)吸附，然后用0.5mol/L的氯化钠溶液解析，得到富含GSH的解析液8L，再上吸附树脂(苯乙烯系弱极性大孔吸附树脂)吸附，然后用纯水进行洗脱，可得到10L无色透明无盐份的高纯度的GSH溶液，在-0.07Mpa、65℃的条件下减压浓缩到400mg/ml的浓度，得到浓缩液20ml，往浓缩液中加入30ml乙醇溶液，用硫酸调pH2.90，在0℃环境结晶，然后将得到的结晶体用90％的丙酮洗涤，在-0.098Mpa的真空干燥设备中干燥，得到纯谷胱甘肽5.53g，提取收率为67％，得到纯度大于98％的白色疏松结晶型粉末。
实施例2：
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为5000rpm的离心机离心5min，得到湿酵母细胞1500g，湿酵母细胞中GSH含量为5.48g/kg。将1500g湿酵母细胞加入9L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为330rpm。当抽提液温度达到85℃时，保温15分钟后，停止抽提；将抽提液流水冷却，降温至室温。再次用转速为5000rpm的离心机离心5min，得到富含GSH的抽提液9L。其余条件依照实施例1，得到纯谷胱甘肽5.46g，提取收率为66.2％，得到纯度大于98％的白色疏松结晶型粉末。
实施例3：
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为3500rpm的离心机离心8min，得到湿酵母细胞1512g，湿酵母细胞中GSH含量为5.53g/kg。将1500g湿酵母细胞加入10L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为350rpm。当抽提液温度达到95℃时，保温12分钟后，停止抽提；将抽提液流水冷却，降温至室温。再次用转速为4500rpm的离心机离心6min，得到富含GSH的抽提液10L。其余条件依照实施例1，得到纯谷胱甘肽5.62g，提取收率为67.2％，得到纯度大于98％的白色疏松结晶型粉末。
实施例4：
依照实施例1得到抽提液后用硫酸调pH3.5，然后用1μm的微滤膜过滤除去已沉淀的杂质，再依照实施例1的方法，得到纯谷胱甘肽5.35g，提取收率为64.9％，得到纯度大于98％的白色疏松结晶型粉末。
实施例5：
依照实施例1得到抽提液后用硝酸调pH3.3，然后用0.8μm的微滤膜过滤除去已沉淀的杂质，微滤后将滤液上阳离子交换树脂(磺酸基团阳离子树脂)吸附，然后用0.5mol/L的盐酸溶液洗脱，得到富含GSH的溶液7.6L，再上吸附树脂(苯乙烯系弱极性大孔吸附树脂)吸附，然后用纯水进行洗脱，可得到10L无色透明无盐分的高纯度的GSH溶液，在-0.98Mpa、55℃的条件下减压浓缩到400mg/ml的浓度，得到浓缩液20ml，往浓缩液中加入80ml乙醇溶液，用硫酸调pH3.0，在4℃环境结晶，然后将得到的结晶体用70％的丙酮洗涤，在-0.07Mpa的真空干燥设备中干燥，得到纯谷胱甘肽5.66g，提取收率为68.6％，得到纯度大于98％的白色疏松结晶型粉末。
实施例6：
依照实施例1方法，将得到的10L无色透明无盐分的高纯度的GSH溶液，减压浓缩到400mg/ml的浓度，加入56ml异丙醇溶液，用盐酸调pH2.98，在3℃环境结晶，然后将得到的结晶体用75％的丙酮洗涤，在-0.085Mpa的真空干燥设备中干燥，得到纯谷胱甘肽5.59g。提取收率为67.7％，得到纯度大于98.5％的白色疏松结晶型粉末。
以上六个实施例均用5m3发酵液放大实验验证，在放大实验中为了节约成本，减压浓缩前先用纳滤浓缩，再用减压浓缩，最终收率均在64％以上，纯度均达到98％以上，可以实现工业化生产。
对比实施例1：
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为2000rpm的离心机离心10min，得到湿酵母细胞1500g，湿酵母细胞中GSH含量为5.50g/kg。将1500g湿酵母细胞加入15L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为300rpm；当抽提液温度达到98℃时，保温10分钟后，停止抽提；其它操作同实施例1，结果由于温度太高等原因而使溶解于水中的部分GSH氧化，仅得到纯谷胱甘肽3.81g，提取收率为46.2％。
对比实施例2：
将离心得到的1500g湿酵母细胞加入6L沸水中，其它操作同实施例1，结果由于溶剂量太小而未能使酵母细胞充分破碎，仅得到纯谷胱甘肽3.43g，提取收率为41.5％。
对比实施例3：
破壁离心后不用酸调节pH，其它操作同实施例1，结果得到谷胱甘肽4.12g，提取收率为49.9％，纯度为91％。
对比实施例4：
微滤时用2.5μm的微滤膜过滤，其余条件依照实施例1，结果该孔径的微滤膜不能完全截留悬浮颗粒，得到的过滤液不清亮，最终得到谷胱甘肽5.82g，提取收率为70.5％，但纯度仅为83.4％
对比实施例5：
阳离子交换树脂分离后再不用吸附树脂分离，其他操作同实施例1，结果浓缩后因杂质太多，无法结晶。
对比实施例6：
依照实施例1方法，将得到的结晶体用50％的丙酮溶液洗涤，最终得到谷胱甘肽3.49g，提取收率为42.3％。
Claims (7)
1.一种高纯度谷胱甘肽的生产方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)发酵液离心：将发酵液下罐后离心，离心转速为3000～5000rpm，时间为5～10min，得到湿酵母细胞体；
(2)热水破壁：将1份湿酵母细胞体加入到6～10份沸水的抽提罐中，进行搅拌，搅拌转速为300～350rpm，当抽提液温度达到85～95℃时，保温10～15分钟后，停止抽提，将抽提液倒出，将抽提液水浴冷却至室温；
(3)抽提液离心：将抽提液离心，离心转速为3000～5000rpm，时间为5～10min，除去酵母渣，得到含有GSH的抽提液；
(4)调节pH：在离心后的抽提液中加入酸，使料液体系处于pH2.5～3.5的酸性环境中，可沉淀某些杂质，并使GSH处于稳定状态，防止氧化；
(5)微滤：利用0.1～1μm孔径的微滤设备对调节pH后的抽提液进行过滤，以除去悬浮的小颗粒杂质，得到清亮透明的滤液；
(6)阳离子树脂分离：将微滤后的料液在酸性环境的阳离子交换树脂上进行吸附，使GSH被吸附，然后用含有一价正离子的溶液解析，得到富含GSH的液体；
(7)吸附树脂分离：将经过阳离子交换树脂分离纯化后的富含GSH的液体在吸附树脂上再次进行吸附，然后用纯水洗脱，得到纯度很高的GSH液体；
(8)减压浓缩：在-0.07～-0.098Mpa的真空度与55～65℃温度下减压浓缩GSH溶液，使达到GSH含量在400mg/ml以上；
(9)结晶：在谷胱甘肽浓缩液中加入异丙醇或乙醇，使有机溶剂含量达到60％～80％，调pH值至2.90～3.0，在0～4℃环境进行结晶；
(10)洗晶：用体积百分比浓度为70％～90％的丙酮溶液对结晶体进行洗涤；
(11)真空干燥：在-0.07～-0.098Mpa的真空度下干燥，得到98％以上纯度的GSH。
2.根据权利要求1所述的高纯度谷胱甘肽的生产方法，其特征在于该方法步骤(1)中所述的发酵液，其发酵水平至少应达到1650mg/L。
3.根据权利要求1所述的高纯度谷胱甘肽的生产方法，其特征在于该方法步骤(4)中，用于调节pH的酸选用盐酸、硫酸或硝酸。
4.根据权利要求1所述的高纯度谷胱甘肽的生产方法，其特征在于该方法步骤(6)中，用于解析的一价正离子溶液选用氢氧化钠、氯化钠或盐酸。
5.根据权利要求1所述的高纯度谷胱甘肽的生产方法，其特征在于该方法步骤(6)中，所述的阳离子树脂选用磺酸基团阳离子树脂。
6.根据权利要求1所述的高纯度谷胱甘肽的生产方法，其特征在于该方法步骤(7)中，所述的吸附树脂选用苯乙烯系弱极性大孔吸附树脂。
7.根据权利要求1所述的高纯度谷胱甘肽的生产方法，其特征在于该方法步骤(7)得到的GSH液体，先用截留分子量100～200的纳滤膜浓缩，以提高GSH的浓度并去除小分子杂质，再进行步骤(8)的减压浓缩。
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